Vivo에서 마우스 모델을 측정 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산 및 골 수 유래 수지상 세포에 의해 유도 된 Th1 차별화

Immunology and Infection

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Summary

여기, 우리가 순진한 CD4 T 세포 (T 세포) 활성화, 확산, 그리고 GM-CSF 골 (BM)에 의해 유도 된 Th1 차별화의 비보에 결정에 대 한 프로토콜을 제시-파생 된 모 수석 세포 (DCs). 또한,이 프로토콜 BM 및 T-세포 절연, DC 생성, 및 DC 및 T-세포 입양 전송을 설명합니다.

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Toribio-Fernandez, R., Zorita, V., Herrero-Fernandez, B., Gonzalez-Granado, J. M. An In Vivo Mouse Model to Measure Naïve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells. J. Vis. Exp. (138), e58118, doi:10.3791/58118 (2018).

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Abstract

순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산, 그리고 T 도우미 1 차별화의 정량화 (Th1) 세포 면역 반응에서 T 세포의 역할을 평가 하는 유용한 방법입니다. 이 프로토콜 granulocyte macrophage 식민지 자극 요소 (GM-CSF) 파생 된 모 수석 세포 (DCs)를 골 (BM) 창시자의 체 외에서 분화를 설명 합니다. Ovalbumin 펩 티 드 (OVAp)의 입양 전송 프로토콜에 대해서도 설명 합니다-로드 GM-CSF 파생 Dc 순진한 CD4 T 세포 OTII 유전자 변형 쥐에서 vivo에서 활성화, 확산, 및 Th1 분화를 분석 하기 위하여는 전송 된 CD4 T 세포입니다. 이 프로토콜 메서드의 순전히 vivo에서 특별히 조작 하거나 공부 셀 채우기를 선택 하는 무 능력에 의해 부과 된 제한 circumvents. 또한,이 프로토콜 변경 체 외에서 발생할 수 있는 기능적 요소와 세포 유형 및만 그대로 장기에 있는 다른 요인의 영향을 포함 하 여 피할 vivo에서 환경에서 연구를 수 있습니다. 프로토콜은 DCs에 변화를 생성 하기 위한 유용한 도구와 T 세포는 적응 면역 반응, 잠재적으로 제공 하는 원본 또는 수많은 면역 관련된 질병의 개발을 이해 하는 중요 한 결과 수정.

Introduction

CD4 T 세포와 항 원 제시 세포 (Apc) Dc 같은 미생물 병원 체1,2면제의 필요한 중재자는. 주변 림프 기관에 CD4 T 세포 APCs3,,45에 의해 제시 하는 특정 항 원 인식에 따라 활성화 됩니다. 활성화 된 CD4 T 세포 증식 하 고 올바른 적합 한 면역 반응6,7의 개발에 필요한 별개 특정 효과 기 Th 세포로 분화. 이러한 프로세스의 제어는 유해한 조직 손상8을 생산 하지 않고는 병원 체를 죽이 적절 한 적응형 방어를 생산을 위한 중요 한. Th 셀 식 또는 표면 분자, 녹음 방송 요인과 이펙터 cytokines의 생산에 따라 정의 되 고 병원 체1응답에 필수이 고 정확한 기능을 수행. Th1 세포 부분 집합의 세포 전사 인자 T 내기와 사이토카인 인터페론 γ (IFNγ) 표현 하 고 세포내 병원 체1에 대 한 호스트 방어에 참여. 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산, 및 Th1 차별화의 정량화는 T 세포 재생의 역할 면역 반응을 평가 하는 유용한 수단입니다.

이 프로토콜 활성화에 비보 분석의 체 외-용량 생성 BM 파생 Dc 활성화, 확산, 및 Th1 순진한 CD4 T 세포의 분화를 조절 하. 프로토콜 또한 순진한 CD4 T 세포 활성화, 격 증, 유도의 용량을 평가 하 고 Th1 분화 (그림 1). 이 다양 한 프로토콜을 특별히 조작 하거나 순전히 프로토콜 vivo에서 공부 셀 채우기 선택 못하는 circumvents. 다양 한 분자와 Dc에 치료의 효과 BM 유전자 변형된 쥐5 에서 사용 하거나 치료 또는 격리 된 BM 셀9유전자 조작에 의해 공부 될 수 있다. 마찬가지로, T 세포 응답 서로 다른 소스에서 또는 여러 가지 조작을3,,810후 입양 전송에 대 한 T 세포를 획득 하 여 탐험 수 있습니다.

이 프로토콜의 주요 장점은 두 가지입니다. T 세포 활성화, 확산, 및 Th1 차별화 흐름 cytometry 접근;와 분석 그리고이 vivo에서 학문, 따라서 averting 체 외에서 발생할 수 있는 변경 및 세포 유형 및 기타 요인에만 그대로 장기11에서 발견을 포함 하 여 결합.

중요 한 염료의 사용 방사능의 사용을 피하고 있는 동안 세포의 확산을 추적 하는 널리 사용 되는 기술입니다. 이 시 약으로 확산의 측정 세포 분열 후 염료 희석을 기반으로 합니다. 또한, 이러한 염료 여러 파장에서 검출 될 수 있다 그리고 쉽게 여러 형광 항 체 또는 표식 함께 cytometry에 의해 분석 된다. 우리는 어떻게 T 세포 활성화, 확산, 및 Th1 차별화 cytometry에 의해 분석 될 수 있다 표시 하 여이 프로토콜의 유틸리티를 강조 표시 합니다.

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Protocol

실험 절차 Fundación 센트 나시오날 드에 의해 승인 되었다 Investigaciones Cardiovasculares 카를로스 3 세 (CNIC)와 스페인과 유럽 지침에 따라 지방의 Autónoma 드 마드리드. 마우스는 특정 병원 체 자유롭게 (SPF) 조건에서 자란 했다 그리고 이산화탄소 (CO2) 흡입에 의해 안락사 되었다.

1. 절연 Tibias 화관에서 마우스 골 수 세포의

참고: C57BL/6 congenic 마우스 스트레인 운반 차동 백혈구 마커는 Ptprc는, 야생-타입 C57BL 긴장 Ptprcb 대립 유전자, CD45.2 또는 Ly5.2로 알려진, 수행 하는 반면에, CD45.1 또는 Ly5.1로 일반적으로 인식 합니다. CD45.1 및 CD45.2 변종 cytometry 항 체를 사용 하 여 구분할 수 있습니다. CD45.1, CD45.2, 및 CD45.1/CD45.2 쥐 입양 전송, cytometry에 의해 뚜렷한 세포 인구의 추적을 허용에 대 한 셀 소스 또는 받는 사람으로 사용할 수 있습니다. 나이 우선적으로 사용-및 나이의 12 주 아래 섹스 일치 하는 남성 또는 여성 쥐.

  1. 화관과 Tibias의 준비
    1. 제도 동물 보호 위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 사용 하 여 마우스를 안락사
    2. 70% 에탄올과 동물 표면에 분사 하 여 뒷 다리 사지를 소독.
    3. 살 균가 위, 집게와 scalpels 사용 합니다. 메스로 피부에 상처를 만들고 후부 사지를 포함 하는 피부를 포함 하 여 마우스의 원심 부분에서 피부를 제거. 낮은 종 아리 근육 주위 피부 껍질과 다리에서 피부를 완전히 제거 (그림 2A, 2B).
    4. 메스를 사용 하 여 대 퇴 골에서 quadriceps 근육을 구분 합니다. 고관절 대 퇴 골 머리 깨지 않고 disarticulate. 메스 (그림 2C, 2D)를 사용 하 여 경골에서 근육을 제거 합니다. 뼈 끝을 깨지 않고 경골에서 대 퇴 골을 구분 합니다.
    5. 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 및 1% 페니실린/스 얼음 1 x 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체에 포함 된 배양 접시에서 뼈를 유지.
  2. 세포 격리
    참고: 모든 후속 단계는 문화 후드와 오염을 피하기 위하여 살 균 물자로 수행 되어야 합니다.
    1. 멸 균 페 트리 접시에 메스와 각 뼈의 인접 하 고 원심 끝을 잘라 신중 하 게.
    2. 완전 따뜻한 RPMI 매체 (RPMI + 10 %FBS, 2 mM EDTA, 1% 페니실린/스, 20 mM HEPES, 55 μ M 2-mercaptoethanol, 1mm 나트륨 pyruvate 및 2 m m L-글루타민)의 10 ml 전체 볼륨으로 반복적으로 뼈를 플러시. 1 mL 주사기에 부착 된 25g 바늘을 사용 하 여 양쪽에서 뼈를 플러시.
    3. 50 mL 원뿔 튜브 70 µ m 나일론 웹 필터 장착 하는 effluate를 전송 합니다. 신중 하 게 부드러운 교 반 및 pipetting 파편 및 셀 대기업을 분리 하십시오.
    4. 셀 서 스 펜 션 (RT) 실 온에서 10 분 동안 250 x g 에서 원심
    5. 감기-적혈구 세포의 용 해 버퍼 (0.15 M NH4Cl + 1 m m KHCO3 + 0.1 m m EDTA, 1 N HCl, 0.4 µ m 살 균 필터링, 및 4 ° C에서 저장과 7.2에 조정된 산도)의 1 mL에 셀 펠 릿을 resuspend. 떨고 수동 5 분 동안 얼음에 유지 합니다.
    6. 비활성화 하 고 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼 씻어 감기 버퍼 (버퍼링 하는 인산 염 (PBS) + 2 mM EDTA + 2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) x 1) 10 mL를 추가 합니다.
    7. 4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심
    8. 완전 한 RPMI 매체 및 4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에서 원심 분리기 25 mL로 세포 세척
    9. 완전 한 RPMI 매체의 5 mL에 셀 resuspend 세포 현 탁 액 trypan 블루와 함께 1: 1의 혼합 50 µ L. 현미경으로 세 실에 휴대폰 번호를 확인 합니다. 수식을 사용 하 여 셀 수를 계산: 셀/mL = [(비-얼룩진 셀 수/4) 2 x 10000 x]12.
      참고:이 방법은 수율 40 x 106 60 x 106 12 주 된 C57BL/6 마우스에 감염 되지 않은 8 당 골 수 세포 뼈.
    10. 4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심

2. DC 분화, 성숙 및 항 원 로드

  1. BM 셀 수확
    1. 6 잘 초 저-첨부 매체, 일반적으로 잘 당 5 mL의 mL 당 106 세포 표면 접시에 완전 한 문화 씨앗 차별화 된 대 식 세포는 문화 판에 연결 됩니다. 후 12 h, 주로 포함 monocytes, 6 잘 플레이트, 준수 대 식 세포와 오래 된 6 잘 플레이트를 폐기 시키려면 상쾌한 전송.
    2. 세포 분화를 촉진 하는 비 부착 한 세포 상업적으로 재조합 murine GM-CSF 37 ° C와 5% 이산화탄소 (CO2)에서 얻은 20 ng/mL를 포함 하는 완전 한 RPMI 매체의 당 일반적으로 5 mL에 mL 당 5 x 105 셀에서 문화 및 매일 관찰 합니다.
    3. 3 일 마다 중단된 셀 아래로 회전 5 mm EDTA PBS에 부착 세포를 수집 하 고 스핀 다운. 결합 하 고 5 × 105 셀/mL 신선한 매체 20 ng/mL rm-GM-CSF를 포함에서 resuspend.
    4. 8 일에 위와 같이 부착 및 분리 된 세포를 수집 하 고 조직 문화 치료 비 멸 균 페 트리 접시, 유도 높은 MHC-II에에서 24 h에 대 한 중간 포함 20 ng/mL GM-CSF에서에서 5 x 105 셀/mL와 20 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) resuspend CD80 그리고 CD86 식.
    5. Cytometry 단계 2.2에에서 표시 된에 의해 확인 DC 차별화.
  2. Cytometry 분화 및 성숙 분석 흐름.
    1. 4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심 이 단계를 두 번 반복 합니다.
    2. 마우스 Fc 수용 체 차단 (안티 마우스 CD16/CD32 IgG2b 항 체 순화) 제조업체의 지침에 따라 4 ° C에서 15 분에서 resuspended 셀 펠 릿을 배양 하 여 블록 Fc 수용 체.
    3. 4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심
    4. 각 프로브에 대 한 흐름 cytometry 버퍼 (PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA x 1) 4 ° c.의 300 µ L 250000 셀 resuspend
    5. 96 잘 접시에 잘 당 셀 솔루션의 30 µ L를 전송 합니다.
    6. 4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심
    7. 상쾌한 삭제 하 고 포함 하는 항 체의 30 µ L 추가 버퍼를 각 제조업체의 표시를 따라 잘. 4 ° c.에 20 분에 대 한 항 체와 세포를 품 어
      참고: 일반적으로 고용 마커 Dc, monocytes, 대 식 세포는 CD11b, CD64, CD115, CD11c, MHCII, CD80 그리고 CD86 (그림 3).
    8. 4 ° C에서 5 분 동안 250 x g 에서 샘플 원심 및 죽은 세포 (예를 들어, propidium 요오드 화물, 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 또는 아민 반응성 염료를 제외 마커를 포함 하는 흐름 cytometry 버퍼의 당 200 µ L에서 resuspend ) 제조 업체의 권장된 농도13에.
    9. 교류 cytometry 튜브 샘플을 전송 하 고 죽은 세포를 제외 하 고 0, 3, 6, 9 일에 교류 cytometry 분석을 수행 하 여 세포 분화를 모니터링 합니다.
  3. DC 항 로드 합니다.
    1. 8 일에 4 ° C에서 5 분 동안 250 x g 에서 샘플 원심 및 200 µ L 매체에 산 탄을 resuspend (RPMI + 10 %FBS 항생제 없이). 이 단계를 두 번 반복 합니다.
    2. 10 µ g/mL OVAp (323-339;와 Dc를 품 어 ISQAVHAAHAEINEAGR) 1 x 107 Dc에서에서 매체의 1 mL 당 (RMPI + 1 %FBS) 37 ° c.에 적어도 30 분 동안 플라스틱 튜브에 OVAp 로드 Dc를 사용 하 여 부정적인 제어 조건으로.
    3. 4 ° C에서 5 분 동안 250 x g 에서 샘플 원심 고 200 µ L 완전 한 RPMI 매체에 산 탄을 resuspend. 이 단계를 두 번 반복 합니다.
    4. 4 ° C에서 5 분 동안 250 x g 에서 샘플 원심 및 200 µ L 매체에 산 탄을 resuspend (RPMI + 10 %FBS) 2 x 106 셀/mL에.

3. OTII 마우스에서 순진한 CD4 T 세포의 고립

참고:이 방법은 12 주 된 C57BL/6 마우스에 감염 되지 않은 8 당 약 100 x 106 spleenocytes를 생성합니다. 남성과 여성 모두 사용할 수 있습니다. CD4 T 세포는 비장 또는 림프절;에서 고립 될 수 있다 CD4 T 세포는 각각 대략 25% 및이 기관에 있는 세포의 50%를 위한 계정. 무 균 조건에서 다음 단계를 수행 합니다.

  1. 사 타 구니, 겨드랑이, 상 완, 자 궁 경부, 그리고 mesenteric 림프절과 비장 OTII 유전자 변형 마우스 (그림 4)에서 분리 하 고 플라스틱 페 트리 접시 포함 하는 완전 한 RPMI 매체의 10 mL 그들을 전송.
  2. 완전 한 RPMI 매체의 2 mL와 함께 셀 여과기를 헹 구 고 50 mL 튜브에서 제거. 전송 림프절과 비장 70 µ m 셀 스 트레이너를 50ml 튜브에 배치. (그림 5) 주사기 플런저를 사용 하 여 균질 하 고 매체 추가 최대 15 mL.
  3. 4 ° C에서 5 분 동안 250 x g 에서 샘플 원심 하 고 완전 한 RPMI 매체의 15 mL에 펠 릿을 resuspend. 이 단계를 두 번 반복 합니다.
  4. 비장 세포 현 탁 액 셀 펠 릿 resuspend 및 단계 1.2.5에서 붉은 혈액 세포를 lyse.
  5. 4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g 에 세포 현 탁 액을 원심
  6. 완전 한 RPMI 매체와 실시간에 5 분 동안 250 x g 에서 원심 분리기 25 mL로 세포 세척
  7. 중간의 5 mL에 셀 resuspend Trypan 파랑 세포 현 탁 액 1: 1의 50 µ L를 혼합. 현미경 아래 세 챔버를 사용 하 여 셀 수를 결정 합니다. 수식을 사용 하 여 셀 수를 계산: 셀/mL = [(비-얼룩진 셀 수/4) 2 x 10000 x]12.
  8. 2.2.2 단계를 반복 합니다.
  9. 제조업체의 지침에 따라 셀 CD4 T 세포의 부정적인 선택 나중에 얼음에 30 분을 CD8α, IgM, B220, CD19, MHCII (난 Ab), CD11b, CD11c, CD44, CD25, DX5 biotinylated 항 체의 1:800 희석을 품 어.
  10. 제조업체의 지침에 따라와 streptavidin 입히는 자기 microbeads의 필요한 금액을 계산 하 고 CD4 T 세포는 자기 세포 구분 및 적절 한 사용 하 여 격리 셀 수와 구슬의 용량에 따라, 분리의 열 있습니다.
  11. 완전 한 RPMI 매체의 5 mL에 셀 resuspend 고 단계 3.7에서에서 설명한 대로 라이브 셀을 계산 하는 동안 얼음에 그들을 유지.
  12. 2 x 105 셀을 추출 하 고 수집 된 셀 사용 하 여 안티 CD4, CD3, B220, CD8 항 체 희석 제조 업체 추천을 사용 하 여 교류 cytometer에서 형광 항 체의 순도 확인 하십시오.
  13. 격리 된 순진한 CD4/OTII T 세포 얼룩, 500 µ L 버퍼 (PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA x 1) 106 셀 resuspend. 준비 하는 500 µ L 버퍼 (PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA x 1) 포함 된 중요 한 셀 추적 염료의 최종 제조업체 권장 농도 더블. 천천히 세포 현 탁 액을 세포 추적 솔루션을 추가 하 여 두 솔루션을 혼합. 37 ° c.에 5 분에 대 한 셀을 품 어
  14. 완전 한 RPMI 매체와 4 ° c.에서 5 분 동안 250 x g에서 원심 분리기의 5 mL로 세포 세척 이 단계를 두 번 반복 합니다. 1 x 107셀/mL에서 완전 한 RPMI 매체의 1 mL에 셀 resuspend

4. Vivo에서 활성화, 확산 및 Th1 차별화 분석 결과

참고: 중요 한 셀 추적 염료 carboxyfluorescein diacetate succinimidyl 에스테 르 (CFSE) 및 다른 succinimidyl 에스테 르 기반 염료, 기쁘게 생각 하 고 다른 파장에서 형광을 방출, 널리 이용 된다 림프 톨 확산을 평가 하기 위해 흐름에 의해 그들의 높은 형광 강도, 긴 수명, 낮은 다양성, 및 낮은 독성14cytometry.

  1. Adoptively 정 맥 (i.v.) 1 x 106 라이브 중요 한 셀 추적 염료 얼룩이 순진한 CD4/OTII T 셀 마우스 당 PBS의 100 µ L에 전송 합니다. 레이블이 T 세포 adoptively 꼬리 정 맥 또는 복고풍 궤도 주입15;으로 옮겨질 수 있다 두 경우 모두에서 세포 림프 기관 (그림 6A)에 홈 것입니다.
  2. 도전 받는 사람 마우스 1 일 후 adoptively 100000 LPS 성숙 OVAp 로드 Dc 올리십시오 (그림 6B)에 피하 주사 (s.i.)로 전송 하 여.
  3. 받는 사람 마우스에서 오 금 림프절을 수확 하 고 이전 3.1 및 3.2에 설명 된 동일한 단계를 수행 하는 단일 셀 정지의 획득까지 그들을 처리 합니다. 이렇게 하루 2 사후 예방 접종 CD4/OTII T 세포 활성화를 측정 하 고 확산 플러스 Th1 차별화를 측정 하는 5 일에.
  4. 하루에 2 T 세포 활성화를 분석 하려면 얼룩 CD4, CD69와 CD25 형광 항 체와 세포 (선택적으로 CD45.1와 CD45.2) C69의 비율을 결정 하 고+CD25+ T 세포 CD4 인구. Cytometry (그림 7)에 의해 분석.
  5. 5 일에 T 세포 증식을 확인 하려면 셀 c d 4와 선택적으로 CD45.1와 CD45.2에 대 한 적절 한 형광 항 체를 사용 하 여 얼룩. CD4 인구에서 중요 한 셀 추적 염료 신호 감퇴 cytometry (그림 8) 분석. 중요 한 셀 추적 염료와 각 형광 피크에 나누어 세포의 비율, 총 셀에 나누어 세포의 백분율을 표시 하는 세포에 의해 받은 셀 분할 수 등이 연구에 여러 매개 변수를 확인할 수 있습니다. 인구입니다.
  6. 하루 5, Th1 차별화 플레이트 1 µ M ionomycin과 10 ng/mL phorbol 12 myristate 13 아세테이트 (PMA) 인큐베이터에서 37 ° C에서 6 시간을 포함 하는 완전 한 RPMI 매체의 200 µ L에서 96 잘 접시의 당 400000 셀을 결정 합니다. 마지막 4 h 3-10 µ g/mL brefeldin 매체에 cytokine 분 비를 차단 하는 추가 합니다.
  7. 250 x g 4 ° c.에 5 분에 대 한 번호판을 원심 96 잘 접시의 급속 한 반전으로는 상쾌한을 삭제 합니다.
  8. 2.2.2 단계를 반복 합니다.
  9. 버퍼 (PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA x 1) 포함 된 항 체의 CD4 하 고 CD45.1 및 CD45.2 제조 업체 권장 희석에서 30 µ L에 4 ° C에서 15 분 동안 배양 하 여 세포 막 얼룩. 버퍼 (PBS + 2 mM EDTA + 2% BSA x 1)의 150 µ L을 추가 하 여 셀을 세척 하 고 250 x g 4 ° C에서 5 분에 대 한 번호판을 원심 상쾌한 삭제.
  10. 1000 x g 5 분 및 4 ° c.에 대 한 번호판 실시간 원심 분리기에서 20 분 동안 2 %paraformaldehyde/1% 자당의 100 µ L을 추가 하 여 셀을 수정 폐기는 상쾌한.
  11. 세포내 permeabilization 버퍼 (1 x PBS + 0.1 %BSA, 0.01 M HEPES, 0.3% 사포닌)의 50 µ L을 추가 하 여 세포를 permeabilize, 4 ° c.에 30 분 동안 품 어
  12. 실시간 삭제는 상쾌한에서 1000 x g 에서 PBS와 5 분 동안 원심 분리기의 150 µ L를 추가 합니다.
  13. 버퍼 (PBS + 0.1% 사포닌)에서 IFNγ 항 체 안티 fluorophore 활용의 30 µ L을 추가 하 여 세포내 cytokines 얼룩이 실시간에서 30 분 동안 품 어
  14. 버퍼 (PBS + 0.1% 사포닌)의 150 µ L을 추가 하 여 셀을 씻어. RT에서 1000 x g 에 5 분 동안 접시를 원심 및 삭제는 상쾌한. 이 단계를 두 번 반복 합니다.
  15. Cytometry (그림 8)에 의해 세포 인구를 분석 합니다.

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Representative Results

그림 1 에서는이 프로토콜에서 설명 하는 단계를 보여 줍니다. 그림 2 에서는 분리와 마우스 BM 세포의 문화를 보여 줍니다. 이러한 문화에 GM-CSF와 LPS의 추가 허용 한다 생체 외에서 생성 하 고 Dc. 그림 3 의 성숙 분화의 흐름 cytometry 분석과 취득된 Dc OVAp 로드 GM-CSF BM 파생 된 Dc의 성숙 보여 줍니다. 그리고 고립 된 중요 한 셀 추적 염료 얼룩이 CD4/OTII T 세포 adoptively 마우스에 게 전송 됩니다. 그림 4 는 CD4/OTII T 세포의 절연에 사용 되는 림프절의 위치를 보여줍니다. 그림 5 50 mL 튜브 70 µ m 나일론 필터 장착 및 림프절과 비장 균질 하는 데 사용 하는 주사기 플런저를 보여준다. 그림 6 i.v. 주입 CD4/OTII T 세포의 복고풍-궤도 총으로는 노상 강도에 OVAp 로드 GM-CSF BM 파생 된 Dc의 사우스 캐롤라이나 주입을 보여줍니다. CD4/OTII T 세포 GM-CSF Dc 마이그레이션할 오 금 림프절 GM-CSF Dc OVAp의 프레 젠 테이 션에 의해 순진한 CD4/OTII T 세포를 활성화 하는 반면 다른 림프 기관에 배포 합니다. 순진한 CD4/OTII T 세포 확산 그리고 Th1 표현 형으로 구분 합니다. 그림 7 에 순진한 막 CD69의 분석에서 CD4/OTII T 세포 활성화의 정량화와 CD25 식을 보여 줍니다. 그림 8 CD4/OTII T 세포 확산의 정량화를 보여줍니다. 그림 9 는 Th1 표현 형으로 CD4/OTII T 세포 분화의 정량화를 보여 줍니다.

Figure 1
그림 1: 프로토콜 스키마. 1) BM 셀 마우스 화관 tibias에서 격리 합니다. GM-CSF BM을 생성 하기 위해 GM-CSF와 문화 2) BM 세포 파생-Dc. 3) 확인 DC 분화 및 성숙 GM-CSF BM 파생-Dc LPS와 함께. 4) DC 성숙을 확인 합니다. 5) Dc OVAp 로드 합니다. 6) CD4/OTII T 세포 형태 마우스 비장을 격리 합니다. 중요 한 셀 추적 염료와 7) 얼룩 CD4/OTII T 세포. 8) 절연 순도 격리 된 CD4/OTII T 세포의 중요 한 세포 추적 염료 얼룩 확인 합니다. 9) adoptively 받는 사람 마우스 격리 된 CD4/OTII T 세포 i.v. 전송. 10). adoptively 받는 사람 마우스 OVAp 로드 및 성숙 Dc 사우스 캐롤라이나를 전송. 11) CD4/OTII T 세포 활성화를 확인 합니다. 12) CD4/OTII T 세포 증식 및 분화를 확인 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 마우스 화관 및 tibias 골 격리 프로세스. (A) 피부 절 개를가 위로. (B) 다리에서 피부 제거. (C) 절 개를가 위로 근육. (D)에서 메스와 사지 근육의 제거. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: GM-CSF BM 파생 된 Dc의 성숙의 cytometry 분석 흐름. MHCII, CD80, 및 LPS 활성화 (+ LPS) CD86 식 표면 및 비 활성화 (-LPS) GM-CSF BM 파생 Dc. 숫자는 임의 단위 (거리) 평균 형광 강도 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 사 타 구니, 겨드랑이, 상 완, 자 궁 경부, 그리고 mesenteric 림프절 및 생쥐에서 비장 위치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 림프절과 비장 균질에 대 한 실험 설정. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 입양 전송 CD4/OTII T 세포와 OVAp 로드 GM-CSF BM-파생-Dc. 역 궤도 총으로 CD4/OTII T 세포의 (A) 정 맥 주사. (B)는 노상 강도에 GM-CSF BM 파생 Dc OVAp 로드의 피하 주사 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: T 세포 활성화 비보의 정량화. Cytometry 플롯과 그래프 분석 및 정량화 CD69의 막 식의 CD4 T 세포에서 보여주는 흐름. CD45.1/CD45.2 마우스 했다 마우스 CD45.1/CD4/OTII와 CD45.1/CD4/OTII 셀 OVAp 로드 GM-CSF BM의 사우스 캐롤라이나 입양 전송 되기 전에 24 h adoptively 전송된 i.v.-파생-Dc. T 세포 활성화는 2 일 게시물-DC에서 측정 했다 cytometry에 이전 후 표시 된 항 원에 항 체 형광 태그와 얼룩. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8: T 세포 확산 비보의 정량화. Cytometry 플롯 및 그래프 분석 및 정량화 CD4 T 세포 확산에 얼룩이 감소 중요 한 셀 추적 염료의 흐름. CD45.2 마우스 마우스 CD45.1/CD4/OTII 셀 OVAp 로드 GM-CSF BM의 사우스 캐롤라이나 입양 전송 되기 전에 24 h adoptively 전송된 i.v. 했다-파생-Dc. T 세포 확산 5 일 포스트-DC에서 측정 했다 cytometry와 얼룩 후에 이전에 형광 항 체를 가리킨다. T 세포 증식 또는 사단 봉우리는 그래프에 표시 된 대로의 수를 계산 하 여 각 부문 피크 셀의 비율, 세포 증식의 비율을 측정 하 여 확인할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 9
그림 9: T 세포 Th1 표현 형에서 비보에향해 분화의 정량화. 흐름 cytometry 플롯 그래프 분석 및 IFNγ 표현 CD4 T 세포의 비율의 정량화. CD45.2 마우스 마우스 CD45.1/CD4/OTII 셀 OVAp 로드 GM-CSF BM의 사우스 캐롤라이나 입양 전송 되기 전에 24 h adoptively 전송된 i.v. 했다-파생-일 게시물-DC에서 Dc. T 세포 분화를 측정 했다 cytometry와 얼룩 후에 이전에 형광 항 체를 가리킨다. T 세포 Th1 표현 형으로 분화 proliferating CD4 T 세포만 오가는 총 CD4 T 세포의 비율으로 표현 하는 IFNγ 세포로 결정 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이 프로토콜은 활성화, 확산, 그리고 순진한 CD4 T 세포의 분화를 조절 하는 BM 파생 된 Dc의 용량 특성에 대 한 수 있습니다. 또한, 그것은 또한 사용할 수 있습니다 변조 CD4 T 세포의 민감성을 평가 하기 위해 BM 파생 DCs에 의해. 이 프로토콜 측정 vivo에서이러한 이벤트에는 변경 될 수 있습니다.

조사 가설에 따라 T 세포와 Dc의 여러 가지 조합은 사용할 수 있습니다. 예를 들어 하나에 노크 또는 특정 유전자 또는 CD4 T 세포 활성화, 확산, 또는 Th1 차별화의 특정 자극의 효율을 떨어뜨리는 결과 분석할 수 있습니다. Dc 또는 CD4 T에이 절차를 수행할 수 있습니다 세포 또는 세포 유형 모두에. 따라서, 야생-타입 또는 유전자 변형 쥐에서 CD4 T 세포와 야생-타입 마우스를 파생 하는 Dc와 결합할 수 있습니다.

이 프로토콜은 cytometry 및 CD45.1 및 CD45.2에 대 한 항 체를 사용 하 여 다른 세포 인구의 구별을 적용할 수 있습니다. 실제로, CD45.1/CD45.1 및 CD45.2/CD45.2 마우스 사용할 수 있습니다 사용 하는 셀 형식의 소스로 또는 받는 사람으로 조합에 입양 전송. 예를 들어 CD45.2/CD45.2 마우스 DC 생성에 대 한 BM의 원점 수 CD4 T 세포 CD45.1/CD45.1/OTII 마우스에서 얻을 수 있습니다. 이 실험에서 두 세포 유형 adoptively CD45.1/CD45.2 마우스를 전송할 수 있습니다. 또한, CD45.1/CD45.1에서 CD4/OTII T 세포 하나 마우스 타입과 CD45.2/CD45.2 타입 2 마우스는 동일 하거나 다른 CD45.1/CD45.2 유형 3 받는 사람을 하나 종류의 동작을 비교 하 고 경쟁에서 두 CD4 T 세포 인구를 입력에 결합 될 수 있다 고 비 경쟁 조건, 각각.

이 방법은 GM-CSF BM 파생 된 Dc의 생성을 설명합니다. 그러나, 대체 프로토콜 DC 성숙과 차별화;에 대 한 사용할 수 있습니다. 예를 들어 papain LPS 또는 GM-CSF, CD4 T 세포 적응 면역 활성화 phenotypically 별개 Dc의 능력의 연구 허용 대신 fms 관련 된 티로신 키 니 아 제 3 ligand (Flt3-L) 대신 사용할 수 있습니다. 항 원 로드 및 프레 젠 테이 션에 대 한 Dc 같은 의도로 수 직접 쥐에서 분리. 조합 다른 사람으로이 프로토콜의9 조작을 허용 순의 CD4/OTII T 세포 바이러스 감염16 받는 사람 마우스에 그들의 입양 전송 되기 전에. BM 레트로 바이러스 프로토콜에 사용 하기 전에 dc 제어 셀 수정의 효과 연구를9 로 불리고 수 수 있습니다.

또한,이 프로토콜 형광 단백질을 표현 하는 셀을 사용 하 여 intravital 현미경 연구17 적용할 수 있습니다. 예를 들어 GFP 또는 체리 표현 GFP 또는 체리/OTII CD4 쥐를 쥐와 CD4/OTII 마우스를 넘어 수 있습니다. 이러한 마우스 CD4 T 세포의 원본으로 사용할 수 있습니다 그리고 vivo에서 실험 필요에 따라 체리 또는 GFP 표현 쥐에서 BM 파생 Dc와 결합 될 수 있다.

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Disclosures

저자 공개할 게 없다

Acknowledgments

우리는 영어 편집 닥터 사이먼 바 틀을 감사합니다. 이 연구는 Instituto de에서 교부 금에 의해 지원 되었다 건배 카를로스 3 세 (ISCIII) (PI14/00526; PI17/01395; CP11/00145; CPII16/00022), 미겔 세르 프로그램과 Fundación 라몬 Areces; 함께 Fondo Europeo 드 개발 지역 (페더)에서 공동 자금. CNIC 경제 산업성, 산업 및 경쟁력 (MEIC), 그리고 프로 CNIC 재단에서 지원 하 고는 세 베로 오 초아 센터의 우수 (SEV-2015-0505). RTF Fundación 라몬 Areces CNIC, VZG ISCIII, BHF Instituto de에 의해 의해 의해 설립 Investigación Sanitaria 병원 12 드 Octubre (imas12)와 ISCIII 미겔 세르 프로그램 및 imas12에 의해 JMG-G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ethanol VWR Chemicals 20,824,365 5 L
Scissors Fine Science Tools (F.S.T.) 14001-12
Forceps Fine Science Tools (F.S.T.) 11000-13
Fine Forceps Fine Science Tools (F.S.T.) 11253-20
Scalpel Fine Science Tools (F.S.T.) 10020-00 Box of 100 blades
Fetal Bovine Serum SIGMA F7524
Penicillin/streptomycin LONZA DE17-602E
Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) GIBCO 21875-034
Sterile Petri dishes Falcon 353003
25-gauge needle BD Microlance 3 300600
1 ml syringe Novico N15663
15 ml conical tubes Falcon 352096
50 ml conical tubes Falcon 352098
70 μm nylon web filter BD Falcon 352350
Red blood lysis buffer SIGMA R7757 100 Ml
EDTA SIGMA ED2SS-250
Bovine Serum Albumin SIGMA A7906 100 g
Trypan blue SIGMA 302643-25G
Culture-plates Falcon 353003
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) Cambrex BE17-737E
Beta-mercaptoethanol Merck 8-05740-0250
Sodium pyruvate LONZA BE13-115E
L-glutamine LONZA BE17-605E
Recombinant murine Granulocyte Macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) Prepotech 315-03
lipopolysaccharide (LPS) SIGMA-ALDRICH L2018
96-well-plate Costar 3799
v450 anti-mouse CD11b antibody BD Biosciences 560455
PE anti-mouse CD64 antibody BioLegend 139303
PE anti-mouse CD115 antibody BioLegend 135505
FITC anti-mouse CD11c antibody BioLegend 117305
FITC anti-mouse MHCII antibody BioLegend 125507
APC anti-mouse CD86 antibody BioLegend 105011
APC anti-mouse CD80 antibody BioLegend 104713
Flow Cytometry tubes Zelian 300800-1 PS 12X75 5mL
OTII Ovoalbumine peptide InvivoGen 323-339
anti-mouse biotinylated CD8α antibody Tonbo Biosciences 30-0081-U500
anti-mouse biotinylated IgM antibody BioLegend 406503
anti-mouse biotinylated B220 antibody Tonbo Biosciences 30-0452-U500
anti-mouse biotinylated CD19 antibody Tonbo Biosciences 30-0193-U500
anti-mouse biotinylated MHCII (I-Ab) antibody BioLegend 115302
anti-mouse biotinylated CD11b antibody Tonbo Biosciences 30-0112-U500
anti-mouse biotinylated CD11c antibody BioLegend 117303
anti-mouse biotinylated CD44 antibody BioLegend 103003
anti-mouse biotinylated CD25 antibody Tonbo Biosciences 30-0251-U100
anti-mouse biotinylated DX5 antibody BioLegend 108903
streptavidin-coated magnetic microbeads MACS Miltenyi Biotec 130-048-101
Magnetic cell separator MACS Miltenyi Biotec 130-090-976 QuadroMACS Separator
Separation columns MACS Miltenyi Biotec 130-042-401
PE anti-mouse CD4 antibody BioLegend 100408
APC anti-mouse CD3 antibody BioLegend 100235
FITC anti-mouse CD8 antibody Tonbo Biosciences 35-0081-U025
Cell Violet Tracer Thermofisher C34557
APC anti-mouse CD25 antibody Tonbo Biosciences 20-0251-U100
Alexa647 anti-mouse CD69 antibody BioLegend 104518
PerCPCY5.5 anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 65-0453
APC anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 20-0453
PECY7 anti-mouse CD45.1 antibody Tonbo Biosciences 60-0453
FITC anti-mouse CD45.2 antibody Tonbo Biosciences 35-0454
Ionomycin SIGMA-ALDRICH I0634
Phorbol 12 Myristate 13 Acetate (PMA) SIGMA P8139
Brefeldin A (BD GolgiPlug) BD 555029
Paraformaldehyde Millipore 8-18715-02100
Intracellular permeabilization buffer eBioscience 00-8333
APC anti-mouse IFNg antibody Tonbo Biosciences 20-7311-U100
Fc-block (anti-mouse CD16/CD32) Tonbo Biosciences 70-0161-U100
B6.SJL CD45.1 mice The Jackson Laboratory 002014
BD LSRFortessa™ Cell Analyzer BD Biosciences 649225
DAPI Solution Thermofisher 62248

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References

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