रोजगार दबाव गर्म पानी निष्कर्षण (PHWE) को स्नातक प्रयोगशाला में प्राकृतिक उत्पादों के रसायन विज्ञान का पता लगाने के लिए

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Chemistry

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Summary

यहां, हम एक दबाव गर्म पानी निष्कर्षण (PHWE) विधि है, जो एक संशोधित घरेलू एस्प्रेसो मशीन का इस्तेमाल करने के लिए प्रयोगशाला में प्राकृतिक उत्पादों के रसायन विज्ञान के लिए स्नातकों शुरू रोजगार । दो प्रयोग प्रस्तुत हैं: PHWE के eugenol और acetyleugenol से लौंग और PHWE की seselin और (+)-ऑस्ट्रेलियन पौधे से epoxysuberosin कोरिया.

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Ho, C. C., Deans, B. J., Just, J., Warr, G. G., Wilkinson, S., Smith, J. A., Bissember, A. C. Employing Pressurized Hot Water Extraction (PHWE) to Explore Natural Products Chemistry in the Undergraduate Laboratory. J. Vis. Exp. (141), e58195, doi:10.3791/58195 (2018).

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Abstract

एक हाल ही में विकसित दबाव गर्म पानी निष्कर्षण (PHWE) विधि जो एक अनसंशोधित घरेलू एस्प्रेसो मशीन का इस्तेमाल प्राकृतिक उत्पादों अनुसंधान की सुविधा के लिए भी एक प्रभावी शिक्षण उपकरण के रूप में आवेदन पाया है । विशेष रूप से, इस तकनीक को प्रयोगशाला में प्राकृतिक उत्पादों के रसायन विज्ञान के पहलुओं के लिए दूसरे और तीसरे वर्ष के स्नातकों को लागू करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इस रिपोर्ट में दो प्रयोग प्रस्तुत किए गए हैं: लौंग से eugenol और acetyleugenol की PHWE और seselin की PHWE और (+)-स्थानिकमारी वाले ऑस्ट्रेलियन पादप प्रजातियों से epoxysuberosin कोरिया. इन प्रयोगों में PHWE को रोजगार देकर, कच्चे तेल की लौंग निकालने, eugenol और acetyleugenol में समृद्ध, 4-9% w/डब्ल्यू में द्वितीय वर्ष के स्नातक और seselin और (+) द्वारा लौंग से प्राप्त किया गया था-epoxysuberosin की पैदावार में अलग थे १.१% w/w और ०.९% w/ C. तृतीय वर्ष के छात्रों द्वारा reflexa । पूर्व व्यायाम पारंपरिक भाप आसवन प्रयोग निष्कर्षण और जुदाई तकनीक के लिए एक परिचय प्रदान करने के लिए एक प्रतिस्थापन के रूप में विकसित किया गया था, जबकि बाद गतिविधि एक अनुकरण करने के प्रयास में निर्देशित-जांच शिक्षण विधियों विशेष रुप से प्रदर्शित प्राकृतिक उत्पादों के पूर्वेक्षण । यह मुख्य रूप से इस PHWE पारंपरिक निष्कर्षण तरीकों कि अक्सर समय की कमी के साथ असंगत है स्नातक प्रयोगशाला प्रयोगों के साथ जुड़े के सापेक्ष तकनीक की तेजी से प्रकृति से निकला । यह तेजी से और व्यावहारिक PHWE विधि कुशलतापूर्वक संयंत्र प्रजातियों में से एक सीमा से कार्बनिक अणुओं के विभिंन वर्गों को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अधिक परंपरागत तरीकों के सापेक्ष इस तकनीक का पूरक स्वरूप भी पहले से प्रदर्शित किया गया है.

Introduction

अलगाव और प्राकृतिक उत्पादों की पहचान वैज्ञानिक समुदाय और समाज के लिए बुनियादी महत्व के है और अधिक आम तौर पर । 1 पूर्वेक्षण, मूल्यवान कार्बनिक प्रकृति में पाया अणुओं के लिए खोज, नई दवा की खोज में एक अपरिहार्य प्रक्रिया रहता है और संभावित चिकित्सकीय एजेंटों । यह अनुमान है कि, से 1981-2014, ~ सभी अनुमोदित छोटे अणु दवा दवाओं के ७५% प्राकृतिक उत्पादों, प्राकृतिक उत्पाद-व्युत्पंन या प्राकृतिक उत्पाद-प्रेरित थे । 1 इसके अलावा, प्राकृतिक उत्पादों के पास भारी संरचनात्मक और रासायनिक विविधता । इस कारण से, वे भी मूल्यवान रासायनिक पाड़ों कि सीधे कार्बनिक संश्लेषण में या चिराल लाइगैंडों और उत्प्रेरक के विकास में इस्तेमाल किया जा सकता है प्रतिनिधित्व करते हैं । 2 , 3

परंपरागत रूप से, अपेक्षाकृत समय-थकावट, Soxhlet निष्कर्षण, और भाप आसवन जैसे गहन प्रक्रियाओं पौधों से माध्यमिक चयापचयों के अलगाव पर ध्यान केंद्रित अनुसंधान के मुख्य आधार किया गया है । 4 और आधुनिक निष्कर्षण तकनीक, त्वरित विलायक निष्कर्षण सहित, निष्कर्षण समय को कम करने और नवसिखुआ प्रोटोकॉल की स्थापना पर ध्यान केंद्रित किया है । 4 , २०१५ में 5 , एक मूल दबाव गर्म पानी निष्कर्षण (PHWE) विधि की सूचना दी थी । 6 यह तकनीक एक unmodifieded घरेलू एस्प्रेसो मशीन कार्यरत को तेजी से और विशेष रूप से सितारा फूल से एसिड की निकासी की सुविधा । एस्प्रेसो मशीनों को विशेष रूप से डिजाइन किया गया है और उचित जमीन कॉफी सेम से कार्बनिक अणुओं को निकालने के लिए इंजीनियर । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, इन उपकरणों के तापमान पर ९६ डिग्री सेल्सियस तक और आमतौर पर 9 बार के दबाव में गर्मी पानी । 7 इस के साथ मन में, यह शायद आश्चर्य की बात नहीं है कि एस्प्रेसो मशीनों को कुशलतापूर्वक संयंत्र सामग्री की एक सीमा से प्राकृतिक उत्पादों को निकालने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।

बाद में स्थलीय संयंत्र प्रजातियों की एक किस्म को शामिल अध्ययन इस PHWE तकनीक की क्षमता को कुशलतापूर्वक एक अपेक्षाकृत व्यापक ध्रुवीय सीमा पार प्राकृतिक उत्पादों को निकालने का प्रदर्शन किया है । 6 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 इसके अलावा, इस तरह के aldehydes, epoxides, glycosides, और संभावित epimerizable stereogenic केंद्रों के रूप में कुछ संवेदनशील कार्यात्मक समूहों, यौगिकों शामिल निष्कर्षण प्रक्रिया से आम तौर पर अप्रभावित थे । अधिक परंपरागत तरीकों के सापेक्ष इस तकनीक का पूरक स्वरूप भी प्रदर्शित किया गया है. 12 , 16 इस PHWE विधि भी प्राकृतिक उत्पादों, जो उपंयास प्राकृतिक उत्पाद डेरिवेटिव और जटिल अणु संश्लेषण में अधिक आम तौर पर तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया है की बहु ग्राम मात्रा को अलग करने के लिए नियोजित किया गया है । 8 , 11 , 17

यह पहचान की थी कि इस नए PHWE विधि एक उपयोगी शिक्षण उपकरण है कि स्नातक प्रयोगशाला में शामिल किया जा सकता है के रूप में सेवा कर सकता है । यह मुख्य रूप से इस तकनीक का तेजी से प्रकृति के सापेक्ष पारंपरिक निष्कर्षण तरीकों कि अक्सर समय की कमी के साथ असंगत है स्नातक प्रयोगशाला प्रयोगों के साथ जुड़े । नतीजतन, इस तकनीक supplanted पारंपरिक स्नातक रसायन विज्ञान प्रयोगशाला तस्मानिया के विश्वविद्यालय में भाप आसवन रोजगार लौंग से eugenol के निष्कर्षण पर ध्यान केंद्रित प्रयोग । 9 , 18 उस समय से, इस प्रयोग के रूपांतरों अंय विश्वविद्यालयों और एक संशोधित प्रयोग के द्वारा अपनाया गया है लौंग के PHWE पर ध्यान केंद्रित अब सिडनी विश्वविद्यालय में स्नातक रसायन विज्ञान प्रयोगशाला कार्यक्रम में सुविधाएं (वी. के.इंफ्रा ).

आदेश में व्यावहारिकता और शिक्षण प्रयोजनों के लिए इस नए PHWE दृष्टिकोण को रोजगार की व्यवहार्यता प्रदर्शित करने के लिए, दो प्रोटोकॉल इस अध्ययन के भाग के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । इस रिपोर्ट के पहले भाग में eugenol और acetyleugenol के PHWE पर एक प्रयोग पर प्रकाश डाला गया है जो लौंग से द्वितीय वर्ष स्नातक प्रयोगशाला कार्यक्रम का हिस्सा है सिडनी विश्वविद्यालय में (चित्रा 1) । यह प्रयोग मौलिक व्यावहारिक कौशल विकसित करते हुए छात्रों को प्राकृतिक उत्पादों के रसायन विज्ञान से मिलवाने का कार्य करता है । दूसरा हिस्सा स्थानिक ऑस्ट्रेलियाई संयंत्र प्रजातियों कोरिया reflexa जो तीसरे वर्ष के तस्मानिया विश्वविद्यालय (चित्रा 2) में स्नातक प्रयोगशाला कार्यक्रम का हिस्सा है की PHWE पर एक प्रयोग सुविधाएं । यह प्रयोग प्राकृतिक उत्पादों को अनुकरण करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, पूर्वेक्षण और कोर प्रयोगशाला तकनीकों को सुदृढ़ । 11

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Protocol

नोट: यह सलाह दी जाती है कि सभी प्रक्रियाओं एक धुएं हुड में प्रदर्शन कर रहे हैं । छात्रों को प्रयोगशाला में हर समय उचित व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनना चाहिए और प्रत्येक एजेंट के साथ जुड़े सुरक्षा डाटा शीट (एसडीएस) का उपयोग करने से पहले परामर्श किया जाना चाहिए ।

1. लौंग के PHWE: eugenol और acetyleugenol का अलगाव

  1. लौंग से eugenol और acetyleugenol का निष्कर्षण
    1. एक २५० मिलीलीटर चोंच में सजाये पिसे लौंग (१२.५ ग्राम) को रखें ।
    2. जोड़ें रेत (१२.५ ग्राम) लौंग को पीसने और अच्छी तरह से मिश्रण ।
    3. एक portafilter (नमूना डिब्बा) ले लीजिए और पूरे लौंग रेत मिश्रण के साथ टोकरी लोड । छेड़छाड़ के साथ सैंपल को हल्के से सेक लें ।
      नोट: मिश्रण बहुत अधिक या तरल पदार्थ के माध्यम से प्रवाह नहीं होगा सेक नहीं है ।
    4. एस्प्रेसो मशीन में portafilter स्थिति और यह नीचे एक साफ २५० मिलीलीटर चोंच जगह है । एक 30% इथेनॉल/एच2ओ समाधान एस्प्रेसो मशीन के पानी के टैंक को जोड़ने अगर यह आधे से भी कम भरा है ।
    5. एस्प्रेसो मशीन का उपयोग करने के लिए निकालने के १०० मिलीलीटर इकट्ठा ।
      नोट: यदि मशीन से भरा हुआ प्रतीत होता है एक प्रशिक्षक से परामर्श करें ।
    6. portafilter टपकता समाप्त करने के लिए अनुमति दें और फिर एस्प्रेसो मशीन से इसे दूर ।
      सावधानी: grinders और आसपास के धातु क्षेत्रों गर्म हो जाएगा ।
    7. एक रंग का प्रयोग, लौंग को हटा portafilter से grinds और अपशिष्ट बिन में छोड़ दें ।
    8. सिंक में एक नल के नीचे एच2ओ के साथ portafilter से अवशिष्ट ठोस बाहर कुल्ला और यह प्रयोग करने के लिए अगले व्यक्ति के लिए वापस ।
    9. एक बर्फ स्नान में लौंग निकालने ठंडा जब तक तापमान कम से कम 30 डिग्री सेल्सियस तक कम हो गया है ।
    10. एक २५०-एमएल विभाजक कीप में निकालें प्लेस, hexane के 30 मिलीलीटर जोड़ने और धीरे से हिला ।
    11. प्लेस एक अंगूठी एक प्रतिक्रिया खड़े करने के लिए फिट दबाना में अलग कीप और जलीय और कार्बनिक परतों को अलग करने की अनुमति तो जलीय (कम) परत वापस २५० मिलीलीटर चोंच में इकट्ठा ।
      नोट: यह परतों के लिए 10 मिनट के लिए अलग से ले जा सकते हैं । छात्रों को बाहर ले जाने के विलायक अनुकूलन TLCs की सलाह दी जाती है, जबकि पहले जुदाई के लिए इंतज़ार कर रहे हो (१.२ कदम देखें) ।
    12. स्थानांतरण कार्बनिक (ऊपर) परत (जो उत्पाद शामिल हैं) के लिए एक साफ २५० मिलीलीटर शंकु कुप्पी, और फिर नीचे (जलीय) परत वापस विभाजक कीप में डालना ।
    13. hexane (2x 30 एमएल) के साथ एक और दो बार जलीय परत निकालें ।
    14. एक निष्कर्षण के बाद कार्बनिक (ऊपर) परतों एक ही कुप्पी में गठबंधन ।
    15. तीसरे तरल तरल निष्कर्षण के बाद, विभाजक कीप में संयुक्त कार्बनिक निकालने डालो, और जोरदार मिलाते हुए एच2ओ के १०० मिलीलीटर के साथ धो लो । एक साफ २५०-एमएल शंकु कुप्पी और सूखी में कार्बनिक (शीर्ष) परत लीजिए MgSO4 जोड़कर और कुप्पी घूमता ।
    16. एक गिलास कीप में समाहित बांसुरी फिल्टर कागज के माध्यम से आगामी मिश्रण फ़िल्टर एक पूर्व में तौला २५०-एमएल गोल नीचे कुप्पी ।
      नोट: ठोस अवशेष (हाइड्रेटेड MgSO4) को कचरे में छोड दिया जा सकता है ।
    17. एकत्र निस्पंदन से विलायक (hexane) एक रोटरी वाष्पीकरण (जल स्नान तापमान: ६० डिग्री सेल्सियस, वैक्यूम दबाव: ३५० mbar) का उपयोग कर लुप्त हो जाना और फिर से परिणामी तेल युक्त कुप्पी तौलना ।
  2. पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) विलायक प्रणाली का अनुकूलन
    नोट: एक समूह के रूप में, छात्रों को 100:0 एसीटोन से एक विलायक प्रणाली: cyclohexane 0:100 एसीटोन: cyclohexane प्रशिक्षक द्वारा eugenol से acetyleugenol की अधिकतम संकल्प प्रदान करता है कि अनुपात की पहचान करने के लिए आवंटित किया जाएगा ।
    1. शुद्ध eugenol और acetyleugenol के टीएलसी संदर्भ समाधान प्राप्त करें ।
      नोट: विशुद्ध eugenol और acetyleugenol के आवश्यक टीएलसी संदर्भ समाधान लैब सेशन से पूर्व लैब टेक्नीशियन द्वारा तैयार किए गए थे ।
    2. एक टीएलसी प्लेट पर, एक आधारभूत ~ १.५ सेमी नीचे से एक नरम पेंसिल के साथ चिह्नित करें । तीन समान रिक्ति वाले बिंदुओं को चिह्नित करें ।
    3. एक टीएलसी एक लेन में शुद्ध eugenol टीएलसी संदर्भ समाधान की एक बूंद हाजिर करने के लिए का उपयोग करें, तीसरी गली में शुद्ध acetyleugenol टीएलसी संदर्भ समाधान के एक स्थान और दूसरी गली में प्रत्येक के एक स्थान (सह स्पॉट) ।
    4. टीएलसी देखने कैबिनेट में एक यूवी लैंप (२५४ एनएम) के तहत थाली को देखने के द्वारा टीएलसी प्लेट पर eugenol और acetyleugenol की उपस्थिति के लिए जांच करें ।
      नोट: जहां टीएलसी संदर्भ समाधान देखा गया प्लेट पर छोटे (1-2 मिमी चौड़ा) काले धब्बे होना चाहिए । यदि कोई धब्बे हैं या धब्बे बेहोश दिखाई देते हैं, तब तक उपयुक्त टीएलसी समाधान का एक और स्थान लागू करें जब तक कि यूवी प्रकाश के अंतर्गत एक काला स्थान न मनाया जाए ।
    5. एक साफ, सूखी टीएलसी जार के लिए आवंटित विलायक मिश्रण के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि जार में विलायक ऊंचाई ~ 1 सेमी से अधिक नहीं है ।
    6. चिमटी का प्रयोग, टीएलसी जार में तैयार टीएलसी प्लेट जगह है । जार के ढक्कन बंद करें ।
      नोट: विलायक टीएलसी प्लेट के आधार रेखा से नीचे झूठ होगा ।
    7. विलायक टीएलसी प्लेट की यात्रा करने की अनुमति दें । विलायक प्लेट के ऊपर से ~ 1 सेमी है एक बार, चिमटी के साथ जार से टीएलसी प्लेट निकालें और एक पेंसिल के साथ विलायक सामने की रेखा को चिह्नित करें ।
    8. विलायक टीएलसी प्लेट (~ 1 मिनट) तो एक यूवी लैंप (२५४ एनएम) के तहत टीएलसी प्लेट देखने से लुप्त होने की अनुमति दें । एक पेंसिल का प्रयोग, टीएलसी प्लेट पर मनाया काले धब्बे चक्र ।
    9. eugenol और acetyleugenol के प्रतिधारण कारक (आरएफ) की गणना द्वारा यौगिक द्वारा यात्रा की दूरी विलायक द्वारा यात्र की दूरी के अनुसार विभाजित करके ।
    10. eugenol और acetyleugenol (ΔRf) के लिए Rf मानों के बीच अंतर की गणना करें ।
    11. बाकी वर्ग के साथ परिणाम साझा करें । अन्य विलायक अनुपात के साथ अन्य छात्रों द्वारा अधिग्रहीत अवधारण मूल्यों रिकॉर्ड.
    12. जो विलायक प्रणाली कच्चे eugenol समाधान और बाद में शुद्धीकरण कदम का विश्लेषण करने के लिए सबसे अच्छा होगा की पहचान करें ।
      नोट: सबसे अच्छा टीएलसी विलायक अनुपात सबसे बड़ा ΔRf मान द्वारा eugenol और acetyleugenol चिह्नित के बीच सबसे बड़ी जुदाई प्रदान करेगा । यदि ΔRएफ विलायक संरचना के खिलाफ साजिश रची है, ग्राफ एक घंटी वक्र के समान होना चाहिए ।
  3. तरल-तरल निष्कर्षण द्वारा eugenol और acetyleugenol की जुदाई
    1. hexane जोड़ें (10 एमएल) क्रूड eugenol-युक्त निकालने के लिए कदम 1.1.17 से प्राप्त की, और एक २५०-एमएल विभाजक कीप में आगामी समाधान डालना ।
    2. hexane (10 मिलीलीटर) के साथ गोल नीचे कुप्पी कुल्ला और यह विभाजक कीप करने के लिए जोड़ें ।
    3. तरल तरल निष्कर्षण के माध्यम से 3 एम जलीय NaOH (2 x 25 मिलीलीटर) के साथ hexane समाधान निकालें । लीजिए और प्रत्येक निष्कर्षण से एक २५० मिलीलीटर शंकु कुप्पी में जलीय नीचे परतों गठबंधन । एक ५० मिलीलीटर शंकु कुप्पी और सूखी में कार्बनिक परत MgSO4 जोड़कर और कुप्पी घूमता ले लीजिए ।
      चेतावनी: NaOH संक्षारक है । त्वचा के साथ किसी भी संपर्क से बचें ।
      नोट: Acetyleugenol कार्बनिक परत में रहता है, जबकि eugenol क्षारीय जलीय निकालने (नीचे परतों) में अब है ।
    4. बाद में टीएलसी विश्लेषण के लिए कार्बनिक परत (कार्बनिक समाधान एक) को बनाए रखने ।
    5. शंकु कुप्पी कि एक बर्फ पानी के स्नान में कदम 1.3.3 से क्षारीय जलीय अंश शामिल घूमता और धीरे से एक सफेद पायस का गठन किया है जब तक 10 मीटर जलीय एचसीएल जोड़ें; कांगो लाल कागज के साथ अपनी अंलता की जांच करें, एक पिपेट का उपयोग करने के लिए पीएच कागज पर समाधान की एक बूंद हस्तांतरण (यह नीले रंग की बारी चाहिए) ।
      चेतावनी: एचसीएल राक है । त्वचा के साथ किसी भी संपर्क से बचें । एचसीएल के अलावा जोरदार bubbling हो सकता है, एचसीएल को ध्यान से जोड़ा जाना चाहिए, शंकु कुप्पी को बर्फ पर रखते हुए ।
      नोट: एचसीएल (एक जलीय घोल के 10 मीटर) की कुल 20-30 मिलीलीटर की आवश्यकता होगी ।
    6. hexane (2 x 30 एमएल) के साथ दूधिया जलीय पायस निकालें, एक २५० मिलीलीटर में तरल तरल निष्कर्षण का उपयोग कर कुप्पी को अलग करना । सुनिश्चित करें कि जलीय निकालने के तापमान कमरे के तापमान पर या नीचे hexane जोड़ने से पहले है । दो hexane अर्क एक साफ १०० एमएल शंकु कुप्पी में जुडा है ।
      नोट: eugenol अब संयुक्त कार्बनिक (शीर्ष) परतों (कार्बनिक समाधान ख) में होगा ।
    7. MgSO4 जोड़ें शुष्क कार्बनिक समाधान B.
    8. विश्लेषण जैविक समाधान एक, कार्बनिक समाधान बी, शुद्ध eugenol टीएलसी संदर्भ और टीएलसी द्वारा acetyleugenol टीएलसी संदर्भ अनुकूलित टीएलसी विलायक पिछले सत्र में पहचान की अनुपात का उपयोग कर ।
    9. फ़िल्टर कार्बनिक समाधान अलग पूर्व में बांसुरी फिल्टर कागज के माध्यम से A और B-२५०-एमएल दौर नीचे कुप्पी । अपशिष्ट में ठोस अवशेषों (हाइड्रेटेड MgSO4) को त्यागें ।
    10. एक रोटरी वाष्पीकरण (जल स्नान तापमान: ६० डिग्री सेल्सियस, वैक्यूम दबाव: ३५० mbar) का उपयोग कर गोल नीचे की कुप्पी से विलायक निकालें ।
    11. प्रत्येक दौर-नीचे कुप्पी में diethyl ईथर (5 मिलीलीटर) जोड़ें और शुद्ध acetyleugenol (कार्बनिक समाधान एक) और eugenol (कार्बनिक समाधान बी) एक unlabelित, तौला शीशी में एक कीप का उपयोग कर हस्तांतरण ।
    12. शीशी में आगे diethyl ईथर (5 मिलीलीटर) के साथ कुप्पी कुल्ला । विलायक एक रोटरी वाष्पीकरण (जल स्नान तापमान: ५० डिग्री सेल्सियस, वैक्यूम दबाव ८०० mbar) एक शीशी लगाव के साथ का उपयोग कर लुप्त हो जाना । उपज रिकॉर्ड और शीशी उचित लेबल ।
    13. विश्लेषण जैविक समाधान एक, कार्बनिक समाधान बी, शुद्ध eugenol टीएलसी संदर्भ और टीएलसी द्वारा acetyleugenol टीएलसी संदर्भ अनुकूलित टीएलसी विलायक पिछले सत्र में पहचान की अनुपात का उपयोग कर ।
      नोट: जलीय समाधान निपटान के लिए सिंक नीचे डाला जा सकता है । Hexane और ईथर अपशिष्ट गैर chlorinated कार्बनिक अपशिष्ट बोतलों में से निपटारा किया जाना चाहिए ।

2. PHWE of कोरिया reflexa : अलगाव की seselin और (+)-epoxysuberosin

  1. सत्र 1. PHWE ऑफ कोरिया reflexa
    1. एक बिजली मसाला चक्की में कोरिया reflexa पत्तियों (10 ग्राम) पीस और फिर एक २५० मिलीलीटर चोंच के लिए जमीन संयंत्र सामग्री हस्तांतरण ।
      नोट: पीस 20-30 सेकंड लेना चाहिए ।
    2. संयंत्र सामग्री युक्त चोंच को मोटे रेत के ~ 2 जी जोड़ें ।
    3. मिश्रण और portafilter (नमूना डिब्बे) की टोकरी में पैक । नमूना छेड़छाड़ के साथ सेक ।
      नोट: नमूना भी कसकर पैक नहीं है ।
    4. जोड़ें ~ ३५% इथेनॉल/एच2ओ समाधान एस्प्रेसो मशीन टैंक के लिए ३०० मिलीलीटर ।
    5. एस्प्रेसो मशीन में portafilter स्थिति और यह नीचे एक साफ २५० मिलीलीटर चोंच जगह है ।
    6. लीजिए ~ निकालने के १०० मिलीलीटर, ~ 1 मिनट के लिए रुको और फिर एक और १०० मिलीलीटर इकट्ठा ।
      चेतावनी: मशीन और अर्क इस बिंदु पर गर्म हो जाएगा ।
    7. बर्फ स्नान में इस मिश्रण को ठंडा और एक रोटरी वाष्पक (जल स्नान तापमान: ~ ४० डिग्री सेल्सियस) का उपयोग कर इथेनॉल लुप्त हो जाना ।
    8. एक विभाजक कीप के लिए जलीय निकालने स्थानांतरण और एथिल एसीटेट (4x ५० एमएल) के साथ निकालने ।
      नोट: इमल्शन को निकालने के बीच अलग होने की अनुमति देने के लिए समय की आवश्यकता हो सकती है ।
    9. MgSO4 जोड़कर और कुप्पी घूमता, एक sintered ग्लास कीप का उपयोग कर फिल्टर, और एक रोटरी वाष्पीकरण (जल स्नान तापमान: ~ ३५ ° c) का उपयोग कर के कच्चे तेल निकालने प्रदान करने के लिए लुप्त कार्बनिक निष्कर्षों का मिश्रण ।
    10. एक 1एच परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रम प्राप्त (सहायता के लिए प्रशिक्षक देखें) । 11
    11. प्रदर्शन क्रूड निकालने के टीएलसी विश्लेषण करने के लिए एक उपयुक्त विलायक प्रणाली है कि निकाले गए है यौगिकों को अलग करने का निर्धारण ।
      नोट: टीएलसी विश्लेषण १.२ चरण में उल्लिखित कार्यविधियों के लिए सादृश्य द्वारा किया जाता है ।
  2. सत्र 2. seselin की जुदाई और (+)-epoxysuberosin द्वारा फ्लैश कॉलम क्रोमैटोग्राफी11,19
    नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल कार्बनिक यौगिकों के विभाजन के लिए फ्लैश कॉलम क्रोमैटोग्राफी का उपयोग शामिल है. एक फ्लैश सिलिका जेल कॉलम पैक करने के लिए कैसे प्रदर्शित करने के लिए एक प्रशिक्षक से परामर्श करें ।
    1. (व्यास में ~ 30 मिमी) स्तंभ प्लेस एक प्रतिक्रियात्मक खड़े करने के लिए फिट क्लैंप में । कॉलम के नीचे एक १००-एमएल शंकु कुप्पी रखें ।
    2. इस कॉलम को सिलिका जेल (६० माइक्रोन फ्लैश ग्रेड) के साथ भरें ~ 10 सेमी के स्तर तक और फिर कॉलम में hexanes (~ १०० mL) जोड़ें ।
    3. कॉलम में एक ग्लास डाट प्लेस, क्लैंप से कॉलम निकालें और एक घोल प्राप्त करने के लिए हिला । दबाना में कॉलम प्लेस और फिर मिश्रण बसने के लिए अनुमति देते हैं ।
    4. स्तंभ का टैप खोलें और, किसी संपीड़ित एयर लाइन से अनुलग्न गैस एडेप्टर का उपयोग करके, सिलिका जेल के बिस्तर के ऊपर ~ 2 mm विलायक छोड़ने के लिए स्तंभ को खाली करें । गैस अनुकूलक निकालें फिर नल बंद ।
    5. शंकु कुप्पी (~ 5 मिलीलीटर) में एकत्र hexanes का उपयोग एक रबर पट के साथ लगे एक पाश्चर पिपेट के साथ कॉलम की दीवारों से किसी भी सिलिका जेल को धोने के लिए करें ।
    6. दोहराएँ चरण 2.2.4 तब स्तंभ के लिए रेत की एक छोटी परत (~ 1 सेमी) जोड़ें.
    7. कदम 2.1.9 से क्रूड निकालने वाली कुप्पी को dichloromethane (~ 1mL) जोड़ें । ध्यान से स्तंभ पर आगामी समाधान लोड एक पाश्चर पिपेट एक रबर पट के साथ लगे का उपयोग कर । स्तंभ के नल खोलें और adsorb सिलिका जेल पर नमूना की अनुमति दें ।
    8. दोहराएं चरण 2.2.7 एक और दो बार ।
    9. ध्यान से कॉलम में hexanes (~ 20 एमएल) जोड़ें । दोहराएँ चरण 2.2.4.
    10. ध्यान से जोड़ें (~ १८० एक 15% एथिल एसीटेट/hexanes समाधान की मिलीलीटर) । स्तंभ का टैप खोलें और, किसी संपीड़ित एयर लाइन से अनुलग्न एक गैस एडेप्टर का उपयोग करके, सिलिका जेल के बिस्तर के ऊपर ~ 2 mm विलायक को छोड़ने के लिए स्तंभ खाली करें, 10-मिलीलीटर परीक्षण ट्यूबों में अंशों को एकत्रित करना ।
      नोट: यह seselin को अलग-थलग करने की अनुमति देगा ।
    11. परीक्षण ट्यूब एक २५० मिलीलीटर दौर नीचे कुप्पी में seselin युक्त अंश का मिश्रण है और एक रोटरी वाष्पीकरण (जल स्नान तापमान: ~ ३५ डिग्री सेल्सियस) का उपयोग कर लुप्त हो जाना ।
      नोट: टीएलसी विश्लेषण यह निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है और १.२ चरण में उल्लिखित कार्यविधियों के लिए सादृश्य द्वारा किया जाता है ।
    12. ध्यान से जोड़ें (~ ७५ एक 25% एथिल एसीटेट/hexanes समाधान की मिलीलीटर) । स्तंभ का टैप खोलें और, किसी संपीड़ित एयर लाइन से अनुलग्न एक गैस एडेप्टर का उपयोग करके, सिलिका जेल के बिस्तर के ऊपर ~ 2 mm विलायक को छोड़ने के लिए स्तंभ खाली करें, 10-मिलीलीटर परीक्षण ट्यूबों में अंशों को एकत्रित करना ।
      नोट: यह अनुमति देगा (+)-epoxysuberosin अलग किया जा करने के लिए ।
    13. परीक्षण ट्यूब युक्त भिन्न (+)-epoxysuberosin एक २५० मिलीलीटर दौर नीचे कुप्पी में और एक रोटरी वाष्पीकरण (जल स्नान तापमान: ~ ३५ डिग्री सेल्सियस) का उपयोग कर लुप्त हो जाना ।
      नोट: टीएलसी विश्लेषण यह निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है और १.२ चरण में उल्लिखित कार्यविधियों के लिए सादृश्य द्वारा किया जाता है ।
    14. अलग यौगिकों के नमूने एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग कर विश्लेषण कर रहे हैं । 11
      नोट: एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोगों एक प्रयोगशाला तकनीशियन द्वारा प्रदर्शन कर रहे हैं.

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Representative Results

लौंग के PHWE । तरल-तरल निष्कर्षण चरण निष्पादित करने का प्रयास करते समय, छात्रों को अक्सर पायस का सामना करना पड़ा (नमकीन पानी आमतौर पर प्रभावी नहीं था) । इस स्तर पर, छात्रों के मिश्रण को अलग कीप में खड़े होने की अनुमति के निर्देश दिए गए थे, जबकि वे eugenol और acetyleugenol के जुदाई पर टीएलसी द्वारा eluent संरचना के प्रभाव का पता लगाया । यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि hexane या तो हेप् या dichloromethane तरल-तरल निष्कर्षण कदम में से प्रतिस्थापित किया जा सकता है । 9 छात्रों एसीटोन और cyclohexane के एक टीएलसी विलायक अनुपात आवंटित किया गया और eugenol और acetyleugenol के शुद्ध मानकों के साथ प्रदान की और फिर टीएलसी विश्लेषण (चित्रा 3) प्रदर्शन किया । उनके परिणाम एक व्हाइटबोर्ड पर सारणीबद्ध थे, और अवधारण कारक (आरएफ) और इष्टतम eluent पर विलायक संरचना के प्रभाव एक समूह चर्चा (तालिका 1) में विचार किया गया । इष्टतम विलायक छात्रों द्वारा की पहचान की रचनाएं आम तौर पर 0.1-0.2 के बीच एक ΔRएफ के साथ 5-20% एसीटोन/cyclohexane से लेकर ।

टीएलसी eluent अनुकूलन के बाद, छात्रों को अपने eugenol निकालने के लिए लौट आए । कच्चे लौंग निकालने (eugenol और acetyleugenol के मुख्य रूप से शामिल) 4-9% डब्ल्यू में अलग था/ इस प्रयोग के दूसरे सत्र में छात्रों ने दो प्रमुख कार्बनिक अणुओं के विभिन्न अम्ल-आधार गुणों का दोहन कर उन्हें तरल-तरल निष्कर्षण से अलग किया. आमतौर पर, eugenol 45-65% की उपज में अलग किया गया था और कच्चे तेल निकालने के w/जबकि acetyleugenol 5-10% w की एक उपज में अलग किया गया था/ छात्रों को तो अनुकूलित eluent का उपयोग (के रूप में ऊपर उल्लिखित पहचान) टीएलसी द्वारा शुद्ध संदर्भ नमूनों को उनके अर्क की तुलना द्वारा अपने तरल तरल निष्कर्षण की सफलता का निर्धारण (चित्रा 3) । छात्रों को भी अपने कच्चे लौंग निकालने का विश्लेषण किया है, और उनके शुद्ध eugenol और acetyleugenol नमूनों के प्रदर्शन द्वारा रूपान्तर-अवरक्त (स्विचेज) रूपांतरण स्पेक्ट्रोस्कोपी । 9 विलायक या पानी चोटियों खराब निष्पादित काम-अप प्रक्रियाओं (या गरीब नमूना तैयारी) के कारण कभी-कभार आईआर स्पेक्ट्रा में मनाया गया ।

उंनत छात्रों को अपने पृथक कच्चे तेल के लगभग आधे से तरल-तरल निष्कर्षण के लिए प्रतिबद्ध ऊपर वर्णित है और अंय भाग के अधीन फ़्लैश कॉलम क्रोमैटोग्राफी (अधिक जानकारी का समर्थन जानकारी में प्रदान की जाती है) । हालांकि एक चार घंटे के सत्र में तरल तरल निष्कर्षण और फ़्लैश कॉलम क्रोमैटोग्राफी कदम पूरा करने के बजाय महत्वाकांक्षी इस प्रयोग के उपक्रम उंनत छात्रों के अधिकांश के लिए प्राप्त किया गया दिख सकता है । फ्लैश कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा acetyleugenol से eugenol की पूरी जुदाई शायद ही कभी उनके करीबी प्रतिधारण कारकों (चित्रा 4) के कारण प्राप्त किया गया था । हालांकि, छात्रों को आम तौर पर शुद्ध eugenol युक्त कुछ अंश एकत्र कर रहे थे । उंनत छात्रों को तो अपनी रिपोर्ट के भाग के रूप में दो अलग शुद्धि तकनीक पर टिप्पणी करने को कहा गया ।

PHWE की कोरिया reflexa । छात्रों ने प्रयोगशाला अनुदेशकों की न्यूनतम सहायता से कोरिया reflexa के PHWE का प्रदर्शन किया । तरल-तरल निष्कर्षण चरण इमल्शन आमतौर पर गठन के दौरान और छात्रों को अक्सर एक गिलास रॉड के साथ मिश्रण के आवधिक आंदोलन के साथ विभाजक कीप (~ ०.२५ ज) में खड़ा करने के लिए मिश्रण की अनुमति के लिए आवश्यक थे । क्रूड निकालने की क्रोमेटोग्राफिक शुद्धि के छात्रों द्वारा चार घंटे के प्रयोगशाला सत्र के भीतर आराम से पूरा किया गया । Seselin और (+)-epoxysuberosin को १.१% w/w तक की पैदावार में पृथक किया गया और ०.९% w/w, दोनों यौगिकों के क्रमशः और पृथक नमूनों का विश्लेषण किया गया 1H और 13C एनएमआर और स्विचेज स्पेक्ट्रोस्कोपी (चित्रा 2) । जबकि छात्रों ने स्विचेज स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोगों और एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए तैयार नमूनों की जांच की, लेब टेक्नीशियन ने एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी प्रयोगों का प्रदर्शन किया. छात्रों द्वारा प्राप्त परिणाम पहले से प्रकाशित काम के अनुरूप थे । 11

हालांकि इस रिपोर्ट में प्रस्तुत नहीं किया गया है, व्यवहार में, यह प्रयोग भी एक दूसरा हिस्सा है कि चुनौतियों के छात्रों निष्कर्षण एक संयंत्र प्रजातियों कि PHWE रोजगार का अध्ययन नहीं किया गया है प्रदर्शन करने के लिए सुविधाओं (अधिक जानकारी का समर्थन में प्रदान की जाती है सूचना) ।

Figure 1
चित्र 1. लौंग के PHWE । 9 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. PHWE की कोरिया reflexa । 11 कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 . एक प्रतिनिधि टीएलसी थाली एक छात्र द्वारा तैयार किया । (10% एसीटोन/cyclohexane रेफरेंस). लेन 1 (ङ): eugenol मानक; लेन 2 (क्रूड): क्रूड लौंग निकालें; लेन 3 (क): acetyleugenol मानक) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एसीटोन/cyclohexane (% v/ मतलब एसिटाइल-eugenol R एसिटाइल-eugenol R (σ) mean eugenol R eugenol R (σ) निकृष्ट ΔR टीएलसी िरा की संख्या
0 ०.०६ ०.०८ ०.०४ ०.०६ ०.०२ 12
5 ०.३४ ०.११ ०.२७ ०.०९ ०.०७ 15
10 ०.४५ ०.०७ ०.३४ ०.०५ ०.१२ 20
20 ०.५१ ०.०७ ०.४१ ०.०६ ०.१० 20
30 ०.५८ ०.१० ०.४९ ०.१२ ०.१० 19
४० ०.६३ ०.०८ ०.५६ ०.०८ ०.०७ 16
५० ०.७६ ०.०८ ०.७३ ०.०८ ०.०३ 17
६० ०.७७ ०.१३ ०.७३ ०.१५ ०.०४ 12
७० ०.८४ ०.१३ ०.८१ ०.१३ ०.०३ 11
८० ०.९० ०.०६ ०.८७ ०.०८ ०.०२ 10
९० ०.८८ ०.०६ ०.८७ ०.०५ ०.०१ 11
१०० ०.८७ ०.१३ ०.८६ ०.१४ ०.०२ 6

तालिका 1. अवधारण कारकों की तालिका Rfपर eluent रचना के प्रभाव की रूपरेखा

Figure 4
चित्र 4 . प्रतिनिधि छात्रों द्वारा तैयार टीएलसी प्लेटें। वाम: एक टीएलसी तरल तरल निष्कर्षण कदम (10% एसीटोन/cyclohexane रेफरेंस) के परिणाम का विश्लेषण प्लेट । लेन 1 (ङ): eugenol संदर्भ मानक; लेन 2 (LEB): eugenol कार्बनिक निकालने से युक्त; लेन 3 (क): acetyleugenol संदर्भ मानक; लेन 4 (लेन): acetyleugenol-कार्बनिक निकालने युक्त । ठीक है: एक टीएलसी प्लेट फ्लैश कॉलम क्रोमैटोग्राफी कदम के परिणाम का विश्लेषण (10% एसीटोन/cyclohexane रेफरेंस) । टीएलसी प्लेट पर संख्या परीक्षण-ट्यूब अंश संख्या से संबंधित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

भाप आसवन द्वारा लौंग से eugenol अलग करने के लिए शास्त्रीय प्रक्रिया दशकों के लिए सिडनी विश्वविद्यालय में मध्यवर्ती रसायन विज्ञान प्रयोगशाला कार्यक्रम का हिस्सा रहा है, लेकिन २०१६ (चित्रा 1) में PHWE पद्धति को रोजगार आधुनिकीकरण किया गया । 9 , 18 यह एक संख्या लाभ प्रदान की है । सबसे पहले, प्रयोगशाला के वातावरण में घरेलू एस्प्रेसो मशीनों का उपयोग तुरंत मोहित और एक गैर के आवेदन-शास्त्रीय, वैकल्पिक पद्धति के लिए एक पारंपरिक वैज्ञानिक अध्ययन प्रभाव illustrating द्वारा छात्रों लगे । इसके अलावा, इस नई विधि निष्कर्षण पूरा करने के लिए लिया गया समय कम और प्रयोग के इस नए चलना में अतिरिक्त अभ्यास के निगमन सक्षम होना चाहिए । विशेष रूप से, यह अनुमति दी पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) (और उंनत छात्रों के लिए फ़्लैश कॉलम क्रोमैटोग्राफी) पेश किया जाएगा ।

लौंग के PHWE पर ध्यान केंद्रित प्रयोग द्वितीय वर्षीय स्नातक रसायन विज्ञान के छात्रों के लिए एक परिचयात्मक प्रयोगशाला अनुभव के रूप में डिजाइन किया गया था और इस कारण यह अर्थप्रकाशक शिक्षण विधियों सुविधाएं । 9 यह अधिक नुस्खे, नुस्खा शैली प्रक्रिया कार्बनिक रसायन विज्ञान में कुछ हद तक सीमित अनुभव के साथ छात्रों को कुशलतापूर्वक लौंग से eugenol की निकासी पूरा करने के लिए अनुमति देता है । इस प्रयोग में, अम्लीय यौगिकों के एसिड बेस निष्कर्षण जैसे अवधारणाओं, क्रोमैटोग्राफी के लिए उपयुक्त eluent संरचना की पहचान करने के लिए टीएलसी का उपयोग, और एक रोटरी वाष्पन का इस्तेमाल शुरू कर रहे हैं या पर लाइन पूर्व लैब वीडियो का एक संयोजन द्वारा प्रबलित प्रशिक्षण और व्यक्ति प्रदर्शनों में । पूरक दो सत्रों के दौरान किए गए घटकों में, मध्यस्थ रसायन विज्ञान की उन्नत स्ट्रीम में छात्रों को भी कॉलम क्रोमैटोग्राफी द्वारा eugenol और acetyleugenol अलग और निकाले घटकों की पहचान निर्धारित टीएलसी का उपयोग कर । दूसरे सत्र में छात्रों को गंभीर रूप से दो जुदाई तरीकों की तुलना सकता है । सामांय में, छात्रों को ंयूनतम अनुदेश के साथ आवंटित २ ४ घंटे की अवधि के भीतर समग्र प्रयोग पूरा करने में सक्षम थे ।

प्रयोग PHWE और seselin के अलगाव और (+) पर ध्यान केंद्रित- कोरिया reflexa से epoxysuberosin अधिक अनुभवी छात्रों को तीसरे साल के स्नातक रसायन विज्ञान के छात्रों के लिए विकसित किया गया था । विशेष रूप से, यह सीखने की कवायद अनुसंधान प्रयोगशाला में उद्भव अध्ययन का एक परिणाम था । 11 प्रयोग की पहली पुनरावृत्ति २०१५ में तस्मानिया विश्वविद्यालय में तीसरे वर्ष के स्नातक रसायन विज्ञान प्रयोगशाला कार्यक्रम में शामिल किया गया था । संशोधन और पुन: मूल्यांकन के दो साल बाद, यह प्रयोग एक तीसरे वर्ष के स्नातक वर्ग द्वारा २०१७ में तीसरी बार के लिए किया गया था ।

यह प्रयोग विशेष रूप से एक निर्देशित जांच आधारित गतिविधि है कि प्राकृतिक उत्पादों अनुसंधान प्रयोगशालाओं में कार्यरत दृष्टिकोण के कुछ अनुकरण करने का प्रयास के रूप में बनाया गया था और ंयूनतम लिखित निर्देश सुविधाएं । यह एक छात्र है सीखने का अनुभव निर्देश और प्रयोगशाला प्रशिक्षक छात्रों की सहायता के रूप में वे आवश्यकता के रूप में दिशा प्रदान करके प्रयोग के माध्यम से काम में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । इस प्रयोग में, छात्रों क्रोमैटोग्राफी में महत्वपूर्ण प्रयोगशाला कौशल विकसित करने और संरचना elucidation प्रदर्शन करने के लिए स्पेक्ट्रोस्कोपी एनएमआर रोजगार । इस प्रयोगशाला अनुभव की अवधारणा को पुष्ट करता है जो कक्षा में छात्रों के लिए प्रस्तुत किया जाता है और यह पहले से अध्ययन करने के लिए प्राकृतिक उत्पादों के एक अधिक प्रतिनिधि अनुभव प्रदान करने के लिए संयंत्र सामग्री पर अध्ययन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है के पूर्वेक्षण । C. reflexa एक स्थानिक ऑस्ट्रेलियाई संयंत्र प्रजातियों है, तथापि, इस नमूने इस प्रयोग में अंय स्थलीय संयंत्र प्रजातियों से उपयुक्त पत्ती सामग्री के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक प्राकृतिक विज्ञान के स्कूल-रसायन विज्ञान, तस्मानिया विश्वविद्यालय और रसायन विज्ञान के स्कूल, वित्तीय सहायता के लिए सिडनी विश्वविद्यालय के स्वीकार करते हैं । B.J.D. और जे जे अनुसंधान प्रशिक्षण कार्यक्रम छात्रवृत्ति के लिए ऑस्ट्रेलियाई सरकार का धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
espresso machines Breville/Sunbeam Breville espresso machine model 800ES / Sunbeam EM3820 Café Espresso II
rotary evporators Buchi and Heidolph
cloves (plant material) Dijon Food Pty Ltd Cloves must be ground in a food processor for students.
Correa reflexa (plant material) sample obtained in Tasmania Sample collected from mature shrubs in the Thomas Crawford Reserve at the University of Tasmania
sand Ajax 1199
ethanol Redoc Chemicals E95 F3
hexanes Ajax 251
magnesium sulfate Ajax 1548
diethyl ether Merck 1009215000
silica on aluminium TLC plates Merck 1055540001
eugenol Merck 1069620100
eugenyl acetate Aldrich W246905
acetone Redox Chemicals Aceton13
cyclohexane ChemSupply CA019
silica gel 60 Trajan 5134312 40 - 63um (230-400mesh)
Congo red paper ChemSupply IS070-100S
32% hydrochloric acid Ajax 256

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References

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