تركيب وتوصيف وتطبيق مسابر نانوية لأكسيد الحديد فائق المغناطيسية للكشف عن السل خارج الرئة

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

لتحسين الاختبارات التشخيصية المصلية لمضدات السل المتفطرة، قمنا بتطوير مسبر نانوية لأكسيد الحديد فوق المغناطيسي ة للكشف عن السل خارج الرئة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lee, C. N., Chiu, L. H., Fang, C. L., Yeh, S. D., Zuo, C. S., Chen, S. C., Kuo, L. K., Wang, Y. M., Lai, W. F. T. Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection. J. Vis. Exp. (156), e58227, doi:10.3791/58227 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تم تصنيع مسبار تصوير جزيئي يتكون من جسيمات نانوية من أكسيد الحديد فوق المغناطيسي (SPIO) والأجسام المضادة لسطح السل المتفطرة (MtbsAb) لتعزيز حساسية التصوير للسل خارج الرئة (ETB). تم تصنيع مسبار نانوي SPIO واقترانه مع MtbsAb. وقد تميز المسبار النانوي SPIO-MtbsAb المنقى المنقى باستخدام TEM و NMR. لتحديد القدرة على استهداف المسبار، تم احتضان مسبر نانوSPIO-MtbsAb مع Mtb لفحوصات التصوير في المختبر وحقنها في الفئران التي تم تلقيحها في فحص الجسم الحي بالرنين المغناطيسي (MR). أظهر الحد من تعزيز التباين على التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) لخلايا Mtb و THP1 متناسبًا مع تركيز مسبار نانوSPIO-MtbsAb. بعد 30 دقيقة من حقن حقن النانو SPIO-MtbsAb الوريدي في الفئران المصابة بـ Mtb ، تم تعزيز شدة الإشارة في موقع الورم الحبيبي بمقدار 14 مرة في صور MR المرجحة T2 مقارنة ً بالفئران التي تتلقى حقن PBS. يمكن استخدام مسبر MtbsAb النانوية كطريقة جديدة للكشف عن ETB.

Introduction

على الصعيد العالمي، يمثل السل خارج الرئة نسبة كبيرة من حالات السل. ومع ذلك، غالباً ما يتم تفويت تشخيص ETB أو تأخيربسبب عرضه السريري الغادر والأداء الضعيف في الاختبارات التشخيصية. نتائج كاذبة تشمل مسحات البلغم السلبية لعصيات حمض سريع, عدم وجود الأنسجة الحبيبية على علم الأمراض الأنسجة, أو الفشل في ثقافة السل المتفطرة (Mtb). وبالنسبة للحالات النموذجية، يحدث ETB بشكل أقل تواتراً وينطوي على تحرير القليل من عصيات Mtb. بالإضافة إلى ذلك ، عادة ما يتم توطينها في مواقع يصعب الوصول إليها ، مثل الغدد الليمفاوية والجنبة والمناطق العظمية1. وهكذا ، فإن الإجراءات الغازية للحصول على عينات سريرية كافية ، مما يجعل التأكيد البكتريولوجي محفوفًا بالمخاطر وصعبًا ، ضرورية2و3و4.

اختبارات الكشف عن الأجسام المضادة المتاحة تجاريا لETB غير موثوق بها للكشف السريري بسبب مجموعة واسعة من الحساسية (0.00-1.00) وخصوصية (0.59-1.00) لجميع المواقع خارج الرئة مجتمعة5. وقد استخدمت اختبارات المناعة المرتبطة بالإنزيم (ELISPOT) للإنترفيرون-α، وبروتين الفيرات الثقافي (CFP)، والهدف المستضدي الإفرازي المبكر (ESAT) لتشخيص السل الكامن والنشط. ومع ذلك ، فإن النتائج تختلف بين مواقع الأمراض المختلفة لتشخيص ETB6،7،8. وبالإضافة إلى ذلك، PPD الجلد (مشتق البروتين المنقى) وQuantiFERON-السل كثيرا ما قدمت نتائج سلبية كاذبة9. QuantiFERON-TB-2G هو فحص تفاعل المناعة في الدم كله، والذي لا يتطلب عينة من الجهاز المصاب وهذا قد يكون أداة تشخيصية بديلة6،10،11. طرق التشخيص الأخرى المستخدمة عادة لالتهاب السحايا السل، مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل، لا تزال غير حساسة جدا لاستبعاد التشخيص السريري بثقة12،13. تظهر هذه الاختبارات التقليدية معلومات تشخيصية غير كافية لاكتشاف موقع العدوى خارج الرئة. وبالتالي، فإن طرائق التشخيص الجديدة مطلوبة سريرياً.

يهدف التصوير الجزيئي إلى تصميم أدوات جديدة يمكنها فحص الأهداف الجزيئية المحددة لعمليات المرض مباشرة في الجسم الحي14و15. يمكن لأكسيد الحديد فائق الكثافة (SPIO)، وهو عامل تباين NMR مرجح T2، أن يعزز بشكل كبير خصوصية وحساسية التصوير بالرنين المغناطيسي (MR) (MRI)16،17. يمكن لطريقة التصوير الوظيفية الجديدة هذه رسم تغييرات الأنسجة بدقة على المستوى الجزيئي من خلال تفاعلات مستقبلات ليغاند. في هذه الدراسة ، تم تصنيع مسبار تصوير جزيئي جديد ، يتألف من جسيمات نانوية SPIO ، لاقترانه بجسم مضاد سطح Mtb (MtbsAb) لتشخيص ETB. SPIO nanoprobes هي طفيفة التوغل في الأنسجة والهيئات قيد الفحص18،19. وعلاوة على ذلك، يمكن لهذه النانوتحقيقات إظهار صور التصوير بالرنين المغناطيسي دقيقة في تركيزات منخفضة بسبب خصائصها شبه المغناطيسية. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر تحقيقات SPIO النانوية أقل ردود الفعل التحسسية لأن وجود الأيون الحديدي هو جزء من علم وظائف الأعضاء الطبيعي. هنا، تم تقييم حساسية وخصوصية مسبر SPIO-MtbsAb النانوية التي تستهدف ETB في كل من نماذج الخلايا والحيوانات. أظهرت النتائج أن المسابر النانوية قابلة للتطبيق كعوامل تصوير شديدة الحساسية لتشخيص ETB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتبع كل بروتوكول يتعلق بتجربة الحيوان إجراءات التشغيل القياسية لتربية الحيوانات المختبرية وفقًا للمعاهد الوطنية للمبادئ التوجيهية الصحية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية (الطبعة الثامنة، 2011) وتمت الموافقة عليها من قبل مؤسسة رعاية الحيوانات ولجنة الاستخدام.

1. SPIO تخليق الجسيمات النانوية

  1. إعداد الجسيمات النانوية المغناطيسية لأكسيد الحديد المغلفة dextran عن طريق التحريك بقوة خليط من dextran T-40 (5 مل؛ 50٪ ث / ث) ومائي FeCl3× 6H2O (0.45 g; 2.77 mmol) وFeCl2× 4H2O (0.32 غرام؛ 2.52 ملليمول) الحلول في درجة حرارة الغرفة.
  2. أضف NH4OH (10 مل؛ 7.5٪ v/v) بسرعة.
  3. مزيد من اثارة تعليق أسود لمدة 1 ساعة; في وقت لاحق، والطرد المركزي في 17300 × ز لمدة 10 دقيقة ومن ثم إزالة المجاميع.
  4. فصل المنتجات SPIO النهائي من Dextran T-40 غير المنضم ة بواسطة الكروماتوغرافيا الترشيح هلام20.
  5. تحميل خليط التفاعل (الحجم الإجمالي = 5 مل) في عمود 2.5 سم × 33 سم وelute مع محلول عازل يحتوي على 0.1 M Na خلات و 0.15 M NaCl في درجة الحموضة 7.0.
  6. جمع الجسيمات النانوية المغناطيسية أكسيد الحديد المغلفة dextran المغلفة في حجم الفراغ ومقالب eluates العمود للحديد وdextran في 330 و 490 نانومتر باستخدام حمض الهيدروكلوريك وطرق حمض الفينول / الكبريتيك20، على التوالي.

2. SPIO-MtbsAb التوليف

  1. توليف SPIO-مترافقED باستخدام أساليب ذكرت سابقا21،22.
  2. توليف SPIO-EDBE-succiic أنهيدريد (SA).
    1. حرّك محلولقلي (5 M NaOH؛ 10 مل)) من SPIO-EDBE وSA (1 غرام؛ 10 ميكرومول) في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة.
    2. دياليز الحل مع 20 تغييرات من 2 لتر من الماء المقطر باستخدام أنابيب الأغشية المسامية الجزيئية (12،000-14،000 ميغاواط قطع). 6 ساعة لكل تغيير.
  3. وأخيراً، إضافة 100 ميكرولتر من SPIO-EDBE-SA (4 ملغ/مل من Fe) إلى 400 ميكرولتر من 4.5 ملغ/مل MtbsAb لتوليف SPIO-MtbsAb باستخدام 1-هيدروكسي بنزوتريازول و (benzotriazol-1-yloxy) tripyrroliphosphonium سداسي فلوروفوسفات كمحفزات وتحريك الحل في درجة حرارة الغرفة
  4. وأخيرا، فصل الحلول من الأجسام المضادة غير المنضمة من خلال الكروماتوغرافيا الترشيح هلام.
  5. تحميل خليط التفاعل (5 مل) على 2.5 سم × عمود 33 سم وelute باستخدام المخزن المؤقت PBS. تأكيد Ab-nanoparticle complex (أي nanoprobe) باستخدام مجموعة فحص بروتين حمض البيسيندونينيك23.

3. مراقبة مورفولوجيا الجسيمات وقياس مستوى الاسترخاء

  1. فحص متوسط حجم الجسيمات، المورفولوجيا، وتوزيع الحجم باستخدام المجهر الإلكتروني للإرسال في جهد 100 كيلو فولت.
    1. قطرة يلقي التشتت المركب على شبكة النحاس 200 شبكة والهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة قبل تحميله على المجهر.
  2. قياس قيم وقت الاسترخاء(T1 و T2)من تحقيقات نانوباستخدام مقياس الاسترخاء NMR في 20 ميغاهرتز و 37.0 درجة مئوية ± 0.1 درجة مئوية.
    1. معايرة relaxometer قبل كل قياس.
    2. سجل القيم r1 و r2 من نقاط البيانات الثمانية التي تم إنشاؤها من خلال عكس الانتعاش وتسلسل نبض Carr-Purcell-Meiboom-Gill ، على التوالي ، لتحديد r1 و r2 relaxivities20.

4. تصوير الخلايا

  1. زراعة monocytes الإنسان THP-1 في RPMI 1640 مع 10٪ مصل الأبقار الجنينية، 50 ميكروغرام / مل كبريتات جنتاميكسين، 100 وحدة / مل بنسلين الصوديوم G، 100 ميكروغرام من كبريتات العقدتوموسين، و 0.25 ميكروغرام / مل الفطريات في حاضنة 5٪ CO2 في 37 درجة مئوية.
  2. تحضن SPIO-MtbsAb nanoprobes (2 mM) مع 106 وحدات تشكيل مستعمرة (CFU) من Mycobacterium bovis BCG preincubated مع 1 × 107 monocytes المنشط في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (1 مل) في 5٪ CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. أنابيب الطرد المركزي في 200 × ز وتجاهل supernatant. إعادة حل الكريات في الوسط (200 ميكرولتر).
  4. مسح العينات باستخدام تسلسل نبض صدى التدرج السريع (وقت التكرار (TR) = 500؛ صدى الوقت (TE) = 20؛ زاوية الوجه = 10 درجة) من خلال 3.0-T التصوير بالرنين المغناطيسي لتحديد خصوصية وحساسية nanoprobe21،22.

5. BCG (عصية كالميت - غيرين) التلقيح

  1. إعادة تشكيل لقاح lyophilized أو المخزون البكتيري في وسط Sauton ومن ثم تمييع المخزون مع المالحة حتى تفرق بشكل صحيح كما هو موضح سابقا24.
  2. تطعيم سلالة حية مخففة من M. bovis BCG ، التي تم الحصول عليها من ADIMMUNE (تايبيه ، تايوان) (سلالة كونوت ؛ ImmuCyst Aventis، باستور Mérieux) في حجم 0.1 مل / الماوس (أي 107 CFU) intradermally في الجلد الفصط الظهري الأيسر أو الأيمن من الفئران، كما هو موضح سابقا23. حقن المالحة في الفئران والسيطرة السلبية. مراقبة الحيوانات يوميا بعد تلقيح BCG.
  3. التضحية بالحيوانات بعد شهر واحد من تلقيح البكتيريا باستخدام القتل الرحيم ثاني أكسيد الكربون. حصاد الأنسجة من موقع التلقيح intradermal. إصلاح الأنسجة في 10٪ formalin وتضمينها في البارافين للأقسام التسلسلية في 5-10 ميكرومتر. بقع الأنسجة وصمة عار مع بقع هيماتوكسيلين / إيوسين وزيل نيلسن للبكتيريا سريعة الحمض24 ومع برلين الأزرق للحديد الحديدي25.

6. في التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي

  1. حقن الكيتامين (80 ملغ/كغ من وزن الجسم) وإكسيلازين (12 ملغم/كغ وزن الجسم) تحت الجلد في الفئران للتخدير الحيواني.
  2. حقن مسابر SPIO-TbsAb (2 nmol/200 μL) في عروق ذيل الفئران. صور MR الفئران قبل ومباشرة بعد حقن التحقيق ثم كل 5 دقائق لمدة 30 دقيقة للحصول على T2 المرجح سريع تدور صدى الصور (TR = 3000; TE = 90؛ مجال الرؤية = 8).
  3. تحليل كمي لجميع الصور MR باستخدام كثافة الإشارة (SI)، وهو قياس المناطق المحددة من الاهتمام في مواقع مماثلة من مركز الورم الحبيبي Mtb والعضلات الخلفية المجاورة لمنطقة الحبيبية.
  4. حساب التحسينات إشارة النسبية باستخدام قياس SI قبل (SIpre؛ التحكم) و 0-3 ح بعد حقن (SIpost) من عوامل التباين باستخدام الصيغة

    [(سيبوست - سيبري)/سيبري] × 100

    حيث سيبري هو SI من الآفة على المسح قبل تعزيز وSIpost هو SI من الآفة على مسح ما بعد تعزيز21،22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SPIO-MtbsAb توليف nanoprobe وتوصيف
تم تصميم الجسيمات النانوية SPIO لاقتران مع MtbsAb. استقر اكستراين على سطح الجسيمات النانوية SPIO كان عبر هابيكلوروهيدرين. تم دمج الجسيمات النانوية SPIO في وقت لاحق مع EDBE لتنشيط المجموعات الوظيفية الأمين الأولية في نهايات dextran. SA ثم تم الاقتران لتشكيل SPIO-EDBE-SA. SPIO-MtbsAb نانوبروبير شكلت في الخطوة الأخيرة من خلال اقتران MtbsAb مع SPIO-EDBE-SA في وجود وكلاء اقتران. توضح صورة TEM للتحقيقات النانوية SPIO-MtbsAb(الشكل 1)أن تحقيقات نانو SPIO-MtbsAb كان لها مظهر مشتت بشكل جيد. وكان متوسط حجم جوهر المسبار النانوي SPIO-MtbsAb 3.8 ± 0.4 نانومتر (حساب الجسيمات 200).

في حل مائي، كانت قيم الاسترخاء، ص1 و صمن nanoprobes 23 ± 3 و 151 ± 8 mM-1s-1، على التوالي، في 20 ميغاهرتز و 37.0 درجة مئوية ± 0.1 درجة مئوية. وكانت نسبة r1/r2 من تحقيقات نانوSPIO-MtbsAb مماثلة لتلك التي من ريسوفيست. ومع ذلك ، ص1 و ص2 من Resovist (26 و 164 مم- 1ق-1، على التوالي) كانت أعلى إلى حد ما من تلك التي من SPIO - MtbsAb nanoprobes.

في المختبر SPIO-MtbsAb توصيف nanoprobe والتصوير
أولاً، اكتشفنا M. bovis BCG، وهي بكتيريا حمضية سريعة، من خلال تلطيخ زيل-نيلسن(الشكل 2A). تم عزل البكتيريا ثم استزراعها بمسابر تحتوي على الحديد الحديدي ، ويمكن التعرف عليها من خلال تلطيخ برلين الأزرق(الشكل 2B). تم تحديد درجة استهداف Mtb من مسبار نانوSPIO-MtbsAb من خلال التصوير بالرنين المغناطيسي المرجح T2؛ وكان التعزيز السلبي يتناسب مع كمية المسابير المرفقة بالخلية البكتيرية. حدث الانخفاض في SI في وجود النانو والمسابر بطريقة تعتمد على التركيز(الشكل 2C). في 2 و 1 و 0.5 متر مربع ، أظهرت المجابير النانوية المترافقة مع Mtb SIs من 97.67 ± 3.05 و 131.67 ± 4.51 و 257.33 ± 5.03 ، على التوالي ، وكلها أعلى SI من 90.75 ± 2.47 ل1 مم بروفيل غير متم. بالمقارنة مع PBS (SI = 1073.43 ± 13.62)، لم يلاحظ أي انخفاض في الإشارة تقريبًا في مجموعة السل فقط (SI = 957.33 ± 12.53). وهكذا، استهدفت تحقيقات SPIO على وجه التحديد عصيات Mtb؛ وعلاوة على ذلك ، على تعزيز الصور MR ، انخفض SI مع زيادة في كمية الجسيمات النانوية SPIO.

وبالمثل، لوحظت التخفيضات في SI على الصور المعززة MR 1 ساعة بعد زراعة أحاديات THP-1 مع النانوابر. ولوحظ انخفاض كبير في SI من مجموعة السل عندما تم استخدام 1 mM (SI = 225.33 ± 8.58) و 2 mM (SI = 104 ± 2.16) تركيزات من المجابير النانوية بالمقارنة مع المجموعات تدار مع PBS فقط (SI = 1005.33 ± 16.74) أو لا تدار مع نانوبر obe (SI = 991 ± 8.98). وكان انخفاض التصوير بالرنين المغناطيسي SI في مجموعات Mtb لـ 1 و 2 مم من النانو مماثلاً للاختزال في مجموعة نانوبروبر 1 م M وحدها (SI = 112.33 ± 3.68). وفقا للنتائج المذكورة أعلاه، يمكن أن تساعد تحقيقات نانوSPIO-MtbsAb في رصد الاتجار أحادي ة الخلايا الـ THP-1 التي يتم تنشيطها بمسبار النانو.

في vivo SPIO-MtbsAb تصوير nanoprobe
بعد تصوير الخلية، حددنا فعالية التصوير بالرنين المغناطيسي في الجسم الحي لETB. تم حقن مسابر نانوSPIO-MtbsAb عن طريق الوريد للفئران المصابة بـ Mtb. ولوحظت إشارة MR يمكن اكتشافها بوضوح في منطقة Mtb الحبيبية 0.5 ساعة بعد الحقن؛ ومع ذلك، لوحظ أعلى SI إلى الخلفية بعد 1 ساعة من الحقن. لوحظ انخفاض كبير في إشارات الرنين المغناطيسي في منطقة Mtb الحبيبية(الشكل 3). تم قياس SI قبل (SIpre) وبعد (SIpost) حقن عامل التباين. بعد ساعة واحدة من حقن المسبار، كان تعزيز T2 المرجح للحد من الإشارة في مناطق Mtb granulamatous(الشكل 3B)أعلى بنحو 14 مرة من ذلك في مواقع التحكم(الشكل 3A; -1.68% ± 1.32% و -23.43% ± 7.24%; p < 0.001).

التقييم النسيجي والمناعي للتحقيقات النانوية SPIO-MtbsAb
تم تطوير ورم حبيبي تحت الجلد بعد شهر واحد من العدوى في الفئران C57BL/6. لوحظ الأوعية الدموية الجديدة داخل هذه الآفات جنبا إلى جنب مع الخلايا اللمفاوية والظهارة الضامة المجاميع. وقد نمت الورم الحبيبي المنظم تدريجيا(الشكل 4A). كما تم تحديد ارتباط آفات السل بإشارات التصوير بالرنين المغناطيسي SPIO-MtbsAb من خلال التفاعل المناعي الكيميائي للمستضد السطحي Mtb مع مكافحة MtbsAb. تم الكشف عن التعبير الإيجابي MtbsAb في المناطق الحبيبية(الشكل 4B)، مع تلطيخ العصيات الحمضي السريع إيجابيًا في موقع الآفة(الشكل 4C). تم استخدام برلين الأزرق ، وهو بقعة الحديد الحديدي الإيجابي ، لتحديد حساسية المسابير إلى Mtb. تم العثور على مسبار SPIO أزرق إيجابي في برلين في نفس موقع MtbsAb(الشكل 4D). تم عرض جميع الأزواج المشتركة في الشكل 4A-D.

Figure 1
الشكل 1: متوسط الحجم الأساسي للتحقيقات النانوية SPIO-MtbsAb في TEM. كان متوسط حجم جوهر مسبار النانو SPIO-MtbsAb 3.8 ± 0.4 نانومتر ، مقاسًا باستخدام تحليل صور TEM (حساب الجسيمات 200). مقياس شريط = 15 نانومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من دراستنا السابقة26. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التوصيف المختبري للمسبار النانوي SPIO-MtbsAb. يتم التعرف على العصيات الحمضية السريعة من خلال (A) Ziehl-Neelsen تلطيخ و (B)اقتران الحديد الحديدي من nanoprobe إلى البكتيريا التي تم تحديدها من خلال تلطيخ برلين الأزرق. (C)التصوير بالرنين المغناطيسي T2 المرجح عرض تعزيز سلبي بعد يتم احتضان المجابير النانوية SPIO-MtbsAb مع Mtb. القضاء على SI تحدث جرعة تعتمد على بعد دمج nanoprobes مع Mtb: (1) 90.75 ± 2.47 (1.0 mM Probe)؛ (2) 97.67 ± 3.05 (Mtb + 2.0 mM التحقيق)؛ (3) 131.67 ± 4.51 (Mtb +1.0 mM التحقيق)؛ (4) 257.33 ± 5.03 (Mtb + 0.5 mM التحقيق)؛ (5) 957.33 ± 12.53 (Mtb +0 mM التحقيق)؛ (6) 1073.43 ± 13.62 (PBS). لم يلاحظ أي انخفاض في الإشارة يمكن اكتشافه في مجموعة التحكم في برنامج تلفزيوني. (D)الجرعة التي تعتمد على تعزيز سلبي في الخلايا المنخفضة THP-1 1 ساعة بعد حضانة مع nanoprobes. أشرطة المقياس في (C) و (D) هي 5 مم. وقد تم تعديل هذا الرقم من دراستنا السابقة26. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: في vivo SPIO-MtbsAb نانوالمسبر في آفات ETB تحت الجلد من الماوس C57BL/6. (أ)السيطرة و(ب)Mtb المناطق الحبيبية. تم العثور على انخفاض كبير 14 أضعاف في إشارات MR في المناطق المحببة Mtb مقارنة مع مناطق التحكم 1 ساعة بعد إدارة التحقيق (-1.68% ± 1.32% مقابل -23.43% ± 7.24%, p < 0.001). يتم إعطاء النتائج كوسيلة ± SDs. استخدمت المقارنات الإحصائية اختبارات t للطالب ذات الذيلين. ع < 0.05 واعتبر أن تكون كبيرة. وقد تم تعديل هذا الرقم من دراستنا السابقة26. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الارتباطات بين علم الأنسجة، والكيمياء المناعية، والحمض السريع، وتلطيخ برلين الأزرق. الأنسجة من المناطق المحببة Mtb في الغالب مما يدل على الخلايا الليمفاوية والضظامة الظهارية. الأوعية الدموية الجديدة والتجميع الوفير للخلايا الليمفاوية والضمالة الظهارية لوحظت في هذه الآفات. (أ)الأورام الحبيبية المنظمة التي تظهر لتتطور تدريجيا. (ب)تلطيخ المناعة الكيميائية التي تظهر التعبير MtbsAb في الآفات الحبيبية، في حين أن(C)العصيات الحمضية السريعة منتشرة داخل نفس المناطق. (د)تم العثور على برلين الأزرق تلطيخ المسابير SPIO في مناطق MtbsAb colocalized. برلين الأزرق تلطيخ للحديد الحديدي يوضح اقتران التحقيق إلى Mtb. القضبان مقياس هي 100 ميكرون. وقد تم تعديل هذا الرقم من دراستنا السابقة26. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

على غرار الدراسات ذات الصلة ، أظهرت النتائج التي توصلنا إليها فيما يتعلق بتحقيقات نانوSPIO-MtbsAb خصوصية كبيرة لـ Mtb27،28. تم العثور على الورم الحبيبي Mtb تحت الجلد 1 شهر بعد حقن السل في نماذج الماوس. وشملت النتائج النموذجية لعلم الأنسجة الحبيبي السل تسلل الخلايا الليمفاوية، وجود الضامة الظهارية، والأوعية الدموية الجديدة. تناثرت العصيات السريعة الحمض في آفات السل، مما يؤكد نتائج الكيمياء المناعية MtbsAb. هذا يشير إلى رد فعل مناعي بين مستضد سطح Mtb و MtbsAb. وقد سلط اللون الأزرق في برلين الضوء على نفس المناطق مع MtbsAb، مما يؤكد خصوصية التحقيقات للاقتران مع Mtb سريع الحمض.

وتجدر الإشارة إلى أن مدى تعزيز التباين السلبي على التصوير بالرنين المغناطيسي لخلايا Mtb وTHP1 أحادية الخلايا كان متناسباً مع تركيز مسبار نانوSPIO-MtbsAb. عندما تدار الفئران التي تحمل Mtb الأورام الحبيبية SPIO-MtbsAb nanoprobes، لوحظ انخفاض إشارة 14 أضعاف في موقع الورم الحبيبي على صور الرنين المغناطيسي T2 المرجح مقارنة بموقع معارض مع حقن PBS. وهذا يشير إلى تراكم كبير من عامل التباين. تظهر النتائج إمكانية الحصول على استهداف محدد لعامل التباين ، مما قد يقلل من متطلبات الجرعة للتشخيص السريري.

تشير النتائج التي توصلنا إليها إلى أن هذه المجابير النانوية تتراكم حجم ًا قابلًا للكشف في آفات Mtb الحبيبية. ويمكن تأكيد هذه النتائج من خلال تطوير مسبار نانوي SPIO باستخدام hMtbsAb المضادة. كما تم تطبيق نواة أكسيد الحديد المغناطيسي في SPIO للحث على تقصير T2 في عوامل التباين التصوير بالرنين المغناطيسي، وتشير النتائج إلى نهج عملي وغير باضع للكشف عن سلوكيات الخلايا مماثلة لتطبيقات التشخيص السريري.

هنا ، نقدم البروتوكول المكون من جزأين: الأقسام من 4 إلى 6 هي تصوير الخلية والحيوان. وتغطي هذه التقنيات زراعة الخلايا والتجارب الحيوانية والتصوير البصري. الأقسام من 1 إلى 3 هي مُجسات تحقيق. ستساعد بعض الخطوات الهامة على تكرار التجربة. الخطوة الحاسمة من SPIO تخليق الجسيمات النانوية هو إعداد الجسيمات النانوية المغناطيسية أكسيد الحديد المغلفة dextran; فمن الأهمية بمكان لتحريك بقوة ومزيج تماما T-40 dextran، مائي FeCl3-6H2O، وFeCl2-4H2O الحلول في درجة حرارة الغرفة. الخطوة الحاسمة للقسم 2، SPIO-MtbsAb التوليف،هو اقتران MtbsAb إلى SPIO-EDBE-SA لتوليف SPIO-MtbsAb. لاختيار المحفزات المناسبة وتحريك الحل بشكل كاف في درجة حرارة الغرفة أمر بالغ الأهمية أيضا. والخطوة الحرجة للقسم 3، مراقبة مورفولوجيا الجسيمات وقياس مستوى الاسترخاء، هو معايرة relaxometer قبل كل قياس. من أجل حساب حجم المجسات بدقة ، فإن معايرة relaxometer أمر بالغ الأهمية أيضًا.

في هذه الدراسة، تم استخدام M. bovis BCG وأرنب المضادة للMtb. واعتبر النشاط المتبادل لمصادر الأبقار والأرانب معتدلاً، على الرغم من أن البيانات أثبتت أن MtbsAb-sPIO المترافق كشفت عن تفاعلات قوية مع M. bovis BCG. وقد أشارت النتائج التي توصلنا إليها إلى أن مسابر النانو SPIO تستهدف السل على وجه التحديد. وأظهرت حضانة نانوبر والبكتيريا Mtb طريقة تعزيز سلبية تعتمد على الجرعة، في حين أن الانخفاض في تعزيز لوحظ لSPIO nanoprobes على التصوير بالرنين المغناطيسي كان مرتبطا مع وجود جزيئات SPIO. وبناءً على بياناتنا، سيكون من الترحيب بإجراء مزيد من الأبحاث لاستكشاف نهج اقتران الأجسام المضادة الممكنة لتعزيز خصوصية المسبار النانوي.

الدراسات السابقة تثبت أن SPIO يظهر الحد الأدنى من السمية الخلوية دون تغيير نشاط الخلية في تركيز المستخدمة في هذه الدراسة29،30. بالاتفاق مع البحوث السابقة، أظهرت نتائجنا تأثير الحد الأدنى من تحقيقات نانو SPIO إلى خلايا THP-1. تم احتضان خلايا THP-1 مع تحقيقات نانوية SPIO مع اقتران البكتيريا لمدة ساعة واحدة. وقدم SI انخفاضاً كبيراً في مجموعات Mtb بتركيز 1 مم أو 2 مم مسبر نانوية، مقارنة بمجموعة المكافحة دون معالجة نانوبر أو PBS وحده. تدعم النتيجة سلامة مسبار SPIO النانوي ، والمزيد من الدراسات التي تطبق الأحمال البكتيرية الأخرى للتحقق من حساسية المسبار النانوي موضع ترحيب.

كان أحد قيود دراستنا هو أننا لم نقيس التوزيع الحيوي للمسبار النانوي SPIO-MtbsAb في الفئران. وعلاوة على ذلك، لم نحقق في نصف عمر الأوعية الدموية وترسب الكبد من النانو، والتي قد تغير من الوقت تعريض من المجسات إلى خلايا THP-1 الموجودة في الآفات Mtb. وثمة ما يبرر إجراء مزيد من البحوث بشأن التحلل البيولوجي. وعلاوة على ذلك، لا يمكن للتصوير بالرنين المغناطيسي أن يفرق ما إذا كانت مسبر نانو SPIO يمكن أن ترتبط على وجه التحديد بالبكتيريا أو الخلايا الأحادية أو ما إذا كانت هذه المجسات قد أُبتدع.

في الختام ، وضعنا بروتوكولًا واضحًا وعمليًا لإعداد وتوصيف مسبر نانوSS-MtbsAb المتوافقة بيولوجيًا. هذه النانو تحقيقات هيدروفيلية وتتفرق بشكل جيد في ظل الظروف الفسيولوجية. فهي السامة للخلايا الحد الأدنى في تركيزات منخفضة. أيضا، هذه SPIO-MtbsAb nanoprobes تمكين استهداف والكشف عن العدوى Mtb، كما يتضح من خلال دراساتنا في المختبر والجسم الحي. وهكذا، يمكن تطبيق مسبر نانوS-MtbsAb كعوامل تباين التصوير بالرنين المغناطيسي للكشف عن ETB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا أحد من المؤلفين لديه أي مصلحة ملكية في المواد التي تم فحصها في هذه الدراسة.

Acknowledgments

ويشكر المؤلفون على الدعم المالي المقدم من وزارة الاقتصاد في تايوان (يمنح NSC-101-2120-M-038-001، MOST 104-2622-B-038-007، MOST 105-2622-B-038-004) لأداء هذا العمل البحثي. تم تحرير هذه المخطوطة من قبل والاس التحرير الأكاديمي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(benzotriazol-1-yloxy) tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Sigma-Aldrich
1-hydroxybenzotriazole Sigma-Aldrich
dextran(T-40) GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrin, 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine) Sigma-Aldrich
ferric chloride hexahydrate Fluka
ferrous chloride tetrahydrate Fluka
Human monocytic THP-1
M. bovis BCG Pasteur Mérieux Connaught strain; ImmuCyst Aventis
MRI GE medical Systems 3.0-T, Signa
NH4OH Fluka
NMR relaxometer Bruker NMS-120 Minispec
Sephacryl S-300 GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25 GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM molecular porous membrane tubing, 12,000 -14,000 MW cut off Spectrum Laboratories Inc
TB surface antibody- Polyclonal Antibody to Mtb Acris Antibodies GmbH BP2027
transmission electron microscope JEOL JEM-2000 EX II

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Small, P. M., et al. Treatment of tuberculosis in patients with advanced human immunodeficiency virus infection. New England Journal of Medicine. 324, 289-294 (1991).
  2. Alvarez, S., McCabe, W. R. Extrapulmonary tuberculosis revisited: a review of experience at Boston City and other hospitals. Medicine. 63, Baltimore. 25-55 (1984).
  3. Ozbay, B., Uzun, K. Extrapulmonary tuberculosis in high prevalence of tuberculosis and low prevalence of HIV. Clinics in Chest Medicine. 23, 351-354 (2002).
  4. Ebdrup, L., Storgaard, M., Jensen-Fangel, S., Obel, N. Ten years of extrapulmonary tuberculosis in a Danish university clinic. Scandinavian Journal of Infectious Diseases. 35, 244-246 (2003).
  5. Steingart, K. R., et al. A systematic review of commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Postgraduate Medical Journal. 83, 705-712 (2007).
  6. Liao, C. H., et al. Diagnostic performance of an enzyme-linked immunospot assay for interferon-gamma in extrapulmonary tuberculosis varies between different sites of disease. Journal of Infection. 59, 402-408 (2009).
  7. Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell based assay for extrapulmonary tuberculosis. Archives of Internal Medicine. 167, 2255-2259 (2007).
  8. Kim, S. H., et al. Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients. The American Journal of Medicine. 122, 189-195 (2009).
  9. Pai, M., Zwerling, A., Menzies, D. Systematic review: T-cell-based assays for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update. Annals of Internal Medicine. 149, 177-184 (2008).
  10. Kobashi, Y., et al. Clinical utility of a T cell-based assay in the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Respirology. 14, 276-281 (2009).
  11. Paluch-Oles, J., Magrys, A., Kot, E., Koziol-Montewka, M. Rapid identification of tuberculosis epididymo-orchitis by INNO-LiPA Rif TB and QuantiFERON-TB Gold In Tube tests: case report. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 66, 314-317 (2010).
  12. Kaneko, K., Onodera, O., Miyatake, T., Tsuji, S. Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by polymerase chain reaction (PCR). Neurology. 40, 1617 (1990).
  13. Bhigjee, A. I., et al. Diagnosis of tuberculous meningitis: clinical and laboratory parameters. International Journal of Infectious Diseases. 11, 348-354 (2007).
  14. Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. Suppl 1-7 (2003).
  15. Weissleder, R., Mahmood, U. Molecular imaging. Radiology. 219, 316-333 (2001).
  16. Gupta, A. K., Gupta, M. Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 26, 3995-4021 (2005).
  17. Talelli, M., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles encapsulated in biodegradable thermosensitive polymeric micelles: toward a targeted nanomedicine suitable for image-guided drug delivery. Langmuir. 25, 2060-2067 (2009).
  18. Cho, W. S., et al. Pulmonary toxicity and kinetic study of Cy5.5-conjugated superparamagnetic iron oxide nanoparticles by optical imaging. Toxicology and Applied Pharmacology. 106-115 (2009).
  19. Mahmoudi, M., Simchi, A., Milani, A. S., Stroeve, P. Cell toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Journal of Colloid and Interface Science. 336, 510-518 (2009).
  20. Chen, T. J., et al. Targeted folic acid-PEG nanoparticles for noninvasive imaging of folate receptor by MRI. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 87, 165-175 (2008).
  21. Chen, T. J., et al. Targeted Herceptin-dextran iron oxide nanoparticles for noninvasive imaging of HER2/neu receptors using MRI. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 14, 253-260 (2009).
  22. Weissleder, R., et al. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with MR imaging. Radiology. 175, 494-498 (1990).
  23. Wang, J., Wakeham, J., Harkness, R., Xing, Z. Macrophages are a significant source of type 1 cytokines during mycobacterial infection. Journal of Clinical Investigation. 103, 1023-1029 (1999).
  24. Angra, P., Ridderhof, J., Smithwick, R. Comparison of two different strengths of carbol fuchsin in Ziehl-Neelsen staining for detecting acid-fast bacilli. Journal of Clinical Microbiology. 41, 3459 (2003).
  25. Woods, A. E., Ellis, R. Laboratory Histopathology- A Complete Reference. 1st edn. Churchill Livingstone. 6-11 (1994).
  26. Lee, C. N., et al. Super-paramagnetic iron oxide nanoparticles for use in extrapulmonary tuberculosis diagnosis. Clinical Microbiology and Infection. 18, 149-157 (2012).
  27. Lee, H., Yoon, T. J., Weissleder, R. Ultrasensitive detection of bacteria using core-shell nanoparticles and an NMR-filter system. Angewandte Chemie International Edition. 48, 5657-5660 (2009).
  28. Fan, Z., et al. Popcorn-shaped magnetic core-plasmonic shell multifunctional nanoparticles for the targeted magnetic separation and enrichment, label-free SERS imaging, and photothermal destruction of multidrug-resistant bacteria. Chemistry. 19, 2839-2847 (2013).
  29. Nishie, A., et al. In vitro imaging of human monocytic cellular activity using superparamagnetic iron oxide. Computerized Medical Imaging and Graphics. 31, 638-642 (2007).
  30. von Zur Muhlen, C., et al. Superparamagnetic iron oxide binding and uptake as imaged by magnetic resonance is mediated by the integrin receptor Mac-1 (CD11b/CD18): implications on imaging of atherosclerotic plaques. Atherosclerosis. 193, 102-111 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics