Utilisation de Autometallography pour localiser et semi-quantifier argent dans les tissus de cétacés

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Summary

Un protocole est présenté afin de localiser des Ag dans les tissus hépatiques et rénaux cétacés par autometallography. En outre, une nouvelle méthode de dosage, appelé le test de Ag histologique cétacé (CHAA) est élaboré pour estimer les concentrations Ag dans ces tissus.

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Li, W. T., Liou, B. Y., Yang, W. C., Chen, M. H., Chang, H. W., Chiou, H. Y., Pang, V. F., Jeng, C. R. Use of Autometallography to Localize and Semi-Quantify Silver in Cetacean Tissues. J. Vis. Exp. (140), e58232, doi:10.3791/58232 (2018).

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Abstract

Nanoparticules d’argent (AgNPs) ont été largement utilisés dans les produits commerciaux, y compris les textiles, cosmétiques et Articles de santé, en raison de ses forts effets antimicrobiens. Ils peuvent être libérés dans l’environnement et s’accumulent dans l’océan. Par conséquent, AgNPs constituent la principale source de contamination de l’Ag, et la sensibilisation du public de la toxicité environnementale de Ag augmente. Des études antérieures ont démontré la bioaccumulation (chez les producteurs) et le grossissement (chez les consommateurs/prédateurs) AG. Cétacés, comme les prédateurs de l’océan, peuvent ont été négativement touchés par les composés Ag/Ag. Bien que les concentrations de composés Ag/Ag dans les tissus cétacés peuvent être mesurées par spectrométrie de masse à plasma inductif (ICP-MS), l’utilisation de l’ICP-MS est limitée par son coût élevé du capital et de la nécessité de stockage/préparation du tissu. Par conséquent, une méthode d’autometallography (AMG) avec une analyse quantitative d’images en utilisant fixés au formol, paraffine de tissu (FFPE) peut-être constituer une méthode de traitement adjuvant peut localiser distribution Ag au niveau suborgan et estimation de la concentration d’Ag en cétacés tissus. Les signaux positifs de l’AMG sont principalement bruns à noirs granules de différentes tailles dans le cytoplasme de l’épithélium tubulaire rénale proximale, les hépatocytes et les cellules de Kupffer. Parfois, certains amorphe jaune doré à bruns signaux positifs de l’AMG sont notées dans le lumen et les membranes basales des tubules rénaux proximaux. Le dosage pour estimer la concentration de l’Ag est nommé le cétacé histologique Ag Assay (CHAA), qui est un modèle de régression établi par les données de l’analyse quantitative d’images de la méthode de l’AMG et ICP-MS. L’utilisation de AMG avec CHAA pour localiser et quantifier semi métauxlourds fournit une méthodologie pratique pour études spatio-temporelle et interspécifique.

Introduction

Nanoparticules d’argent (AgNPs) ont été largement utilisés dans les produits commerciaux, y compris les textiles, cosmétiques et Articles de soins de santé, en raison de leur grand effets antimicrobiens1,2. Par conséquent, la production de AgNPs et le nombre de produits contenant de l’AGP sont augmentés au fil du temps3,4. Cependant, AgNPs peut être rejetée dans l’environnement et s’accumulent dans l’océan5,6. Ils sont devenus la principale source de contamination de l’Ag, et la sensibilisation du public de la toxicité environnementale de Ag est en augmentation.

Le statut de l’AgNPs et Ag dans le milieu marin est complexe et en constante évolution. Des études antérieures ont indiqué que l’AgNPs peut rester comme particules, agrégats, dissolvent, réagissent avec les différentes espèces chimiques ou être régénérés à partir de7,ions Ag+ 8. Plusieurs types de composés Ag comme AgCl, ont été trouvés dans les sédiments marins, où ils peuvent être ingérés par les organismes benthiques et entrer dans la chaîne alimentaire9,10. Selon une étude précédente menée dans la région de Chi-ku Lagoon le long de la côte sud-ouest de Taïwan, les concentrations de l’Ag de sédiments marins sont extrêmement faible et similaire à l’abondance crustale, et celles du tissu de foie de poisson sont généralement inférieures à la détection limite (< 0,025 μg/g humide/humide)11. Toutefois, des études antérieures menées dans différents pays ont montré des concentrations relativement élevées de Ag dans le foie des cétacés12,13. La concentration de l’Ag dans le foie des cétacés est fonction de l’âge, ce qui suggère que la source des Ag dans leur corps est très probablement leurs proies12. Ces résultats suggèrent la bioamplification de l’Ag chez les animaux à des niveaux trophiques plus élevés. Cétacés, comme les prédateurs de l’océan, pourraient avoir subi les impacts négatifs sur la santé causés par Ag/Ag composés12,13,14. Plus important encore, comme les cétacés, les humains sont des mammifères et les impacts causés par des composés de Ag/Ag chez les cétacés peuvent également survenir chez les humains néfastes pour la santé. En d’autres termes, les cétacés pourraient être animaux sentinelles pour la santé du milieu marin et les êtres humains. Par conséquent, les effets sur la santé, la distribution tissulaire et la concentration de l’Ag chez les cétacés sont très préoccupante.

Bien que les concentrations de composés Ag/Ag dans les tissus cétacés peuvent être mesurées par spectrométrie de masse à plasma inductif (ICP-MS), l’utilisation de l’ICP-MS est limitée par son coût en capital élevé (instrument et entretien) et les exigences pour le stockage de tissus /PREPARATION12,15. En outre, il est généralement difficile de recueillir des échantillons de tissus complète dans toutes les enquêtes sur des cas de cétacés échoués en raison de difficultés logistiques, une pénurie de main-d'oeuvre et un manque de ressources connexes12. Les échantillons de tissus congelés pour analyse par ICP-SM ne se trouvant pas facilement à cause de l’espace limité de réfrigération, et les échantillons de tissus congelés peuvent être ignorés en raison de l' équipement de réfrigération cassé12. Ces obstacles précités entravent les enquêtes sur les niveaux de contamination dans les tissus de cétacés par ICP-MS analyse en utilisant des échantillons de tissus congelés. En revanche, formol fixe des échantillons de tissus sont relativement faciles à recueillir au cours de l’autopsie des cétacés morts-brin. Par conséquent, il est nécessaire de développer une méthode facile à utiliser et peu coûteuse pour détecter/mesure des métaux lourds dans les tissus de cétacés à l’aide de formol fixé des échantillons de tissus.

Bien que les concentrations de métaux alcalins et alcalino-terreux et distributions de suborgan peuvent être modifiées au cours de la formaline-fixes, paraffine (FFIP) processus, seulement des effets moindre sur les métaux de transition, tels que Ag, été noté16. Par conséquent, tissu FFPE a été considéré comme une ressource d’échantillon idéal pour localisation métal et mesures16,17. Autometallography (AMG), un processus histochimique, peut amplifier les métaux lourds comme taille jaune d’or à des signaux positifs AMG noirs sur coupes tissulaires FFPE, et ces métaux lourds amplifié peut être visualisée sous microscopie optique18, 19 , 20 , 21. par conséquent, la méthode AMG fournit des informations sur les distributions de suborgan des métaux lourds. Il peut fournir des informations supplémentaires importantes pour étudier les voies métaboliques de métaux lourds dans les systèmes biologiques parce qu’ICP-MS ne peut mesurer la concentration de métaux lourds à l’orgue de niveau18. En outre, logiciel d’analyse des images numériques, comme ImageJ, a été appliquée à l’analyse quantitative des tissus histologiques sections22,23. Le jaune doré taille variable à des signaux positifs AMG noirs des coupes de tissu FFPE peut être quantifié et utilisée pour estimer les concentrations de métaux lourds. Bien que la concentration absolue en Ag ne peut être déterminée directement par la méthode AMG avec analyse quantitative d’images, il peut être estimée par un modèle de régression basé sur les données obtenues par l’analyse quantitative d’images et l’ICP-MS, ce qui porte le nom de cétacés test de Ag histologique (CHAA). Compte tenu des difficultés de mesure des concentrations d’Ag par ICP-MS analyse chez les cétacés échoués plus, CHAA est une méthode de traitement adjuvant utile pour estimer les concentrations d’Ag dans les tissus de cétacés, qui ne peuvent être déterminées par l’analyse des ICP-MS à cause du manque de surgelés échantillons de tissus. Cet article décrit le protocole d’une technique histochimique (méthode AMG) pour localiser le Ag au niveau suborgan et un test nommé CHAA pour estimer les concentrations d’Ag dans les tissus du foie et les reins des cétacés.

Figure 1
Figure 1 : organigramme illustrant la création et l’application de test de Ag histologique cétacé (CHAA) pour estimer les concentrations Ag. CHAA = cétacé test histologique d’Ag, FFIP = fixés au formol, paraffine, ICP-MS = spectrométrie de masse à plasma inductif. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Protocol

L’étude a été réalisée conformément aux lignes directrices internationales, et l’utilisation d’échantillons de tissus de cétacés a été autorisée par le Conseil de l’Agriculture de Taïwan (recherche permis 104-07.1-SB-62).

1. tissu préparation des échantillons pour analyse par ICP-SM

Remarque : Les tissus du foie et des reins ont été prélevés de fraîchement morts et modérément autolysée échoués cétacés24, y compris 6 cétacés échoués de 4 espèces différentes, 1 Grampus griseus (Gg), 2 Kogia spp (Ko), 2 Lagenodelphis hosei (Lh), 1 Stenella attenuata (Sa). Chaque cétacés échoués ont un numéro d’identification individuelle. La préparation d’échantillons de tissus pour analyse par ICP-SM suivi la méthode établie dans le laboratoire de M.H. Chen, et laboratoire de M.H. Chen effectué l’analyse des ICP-MS11,13,25.

  1. Recueillir des tissus hépatiques et rénaux pour analyse par ICP-SM de cétacés échoués et stockez-les à −20 ° C jusqu'à l’utilisation.
  2. Recueillir paire assortie de foie et les tissus rénaux des mêmes échoués cétacés pour l’analyse de l’AMG (voir étape 2).
  3. Découper la couche externe de l’échantillons de tissus prélevés pour l’analyse de l’ICP-MS avec un bistouri en acier inoxydable. Couper la partie intérieure des échantillons tissulaires en petits cubes (environ 1 cm3) et les placer dans des sacs zip lock en plastique. Normalement, chaque sac contient 10 g de tissus.
  4. Stocker les sacs de plastique contenant des échantillons de tissus à −20 ° C pour les procédures suivantes.
  5. Mettre les cubes de3 cm 1 échantillons dans un gel sec système (-50 ° C, pompe à vide avec un déplacement d’au moins 98 L/min, 0,002 mBar) au moins 72 h à complètement sec en pesant à la constante.
  6. Homogénéiser les cubes séchés en poudre avec un homogénéisateur pour la digestion de tissu ultérieures.
  7. Environ 0,3 g d’échantillons lyophilisés homogénéisés dans des flacons de 30 mL en polytétrafluoroéthylène (PTFE) et mélangez-les avec 10 mL d’acide nitrique à 65 % w/w.
  8. Mettre les fermetures sur les bouteilles PTFE, mais laissez les fermetures dévissés.
    Remarque : Ceci permet la fumée brune à se former dans les bouteilles PTFE et les reflux à l’intérieur de la bouteille pour la digestion jusqu'à ce que la fumée brune disparaît et devient claire.
  9. Chauffer les échantillons digérés avec une plaque chauffante, de 30 ° C à 110/120 ° C (selon la fumée brune faisant état) dans les bouteilles PTFE pendant 2 à 3 semaines jusqu'à ce que le gaz brunâtre dans les bouteilles PTFE devient incolore et le liquide contenu dans les bouteilles PTFE devient translucide gree Nish pale jaune ou tout à fait clair.
    Remarque : Effectuez le processus de chauffage sous hotte chimique.
  10. Chauffer les échantillons digérés à 120 ° C et l’acide nitrique dans les bouteilles PTFE évaporer à seulement 0,5 à 1 mL de restes.
    Remarque : Effectuez le processus de chauffage sous une hotte chimique et toujours surveiller l’augmentation de la température pour s’assurer qu’aucun gaz brunâtre ne fuit par les fermetures des bouteilles PTFE.
  11. Serrer les fermetures et les refroidir à température ambiante pendant environ 1 h.
  12. Place de l’entonnoir avec filtre papers sur les fioles jaugées de 25 mL et laver le liquide restant avec 1 M HNO3 pour un volume final de 25 mL.
    Remarque : Laver la bouteille au moins trois fois et la fermeture.
  13. Valider la qualité analytique des analyse par ICP-SM en employant les matériaux de référence, y compris LOURDAUD-2 (aiguillat foie) et dortoir-2 (aiguillat musculaire).
  14. Utilisez les doublons de chaque échantillon à analyser et réanalysés des matériaux de référence standard pour l’analyse de l’ICP-MS.
  15. L’Ag les concentrations moyennes de chaque échantillons analytiques et présenter les données comme concentration par voie sèche (μg/g de poids sec).

2. tissu préparation des échantillons pour l’analyse de l’AMG

  1. Recueillir des tissus hépatiques et rénaux paire assortie pour l’analyse de l’AMG d’un cétacé échoué et fixez-les dans 10 % de formol tamponné neutre jusqu'à l’utilisation.
    Note : Stocker les échantillons de tissus dans des bouteilles en plastique de 10 % de formol tamponné neutre (NBF, pH 7,0) pendant 24 à 48 heures. Le volume de FBN doit être au moins 10 fois supérieur au volume de tissu.
  2. Taillez le formol fixé le foie et les tissus du rein avec lames jetables microtome en acier inoxydable et mettre les sections de tissu coupé dans des cassettes avec des étiquettes.
    Remarque : La taille de chaque sections de tissu doit être environ 2 cm x 1 cm et l’épaisseur de chaque section de tissu ne doit pas dépasser 3 mm. mettre les tissus du foie et des reins, de la même personne dans la même cassette.
  3. Déshydrater les parés des sections de tissu avec un processeur de tissus grâce à une série d’éthanol graduée (70 % pendant 1 h, 80 % pendant 1 h, 95 % pendant 1 h, 95 % pendant 2 h, 100 % pour 1 h x 2 plats de coloration et 100 % pendant 2 h), xylène (pour 1 h et 2 h dans les différents plats de coloration) et y plonger les échantillons de tissus déshydratés en paraffin (pour 1 h et 2 h dans les différents plats de coloration).
  4. Placer les échantillons de tissus déshydratés dans le fond des moules en acier de l’histologie et l’incorporer les échantillons de tissus déshydratés avec paraffine.
  5. Faites refroidir le formol fixé des blocs de tissus inclus en paraffine (FFIP) sur plaque froide jusqu'à ce que la paraffine se solidifie. Tailler les blocs FFIP avec le microtome jusqu'à ce que la surface du tissu est exposée.
  6. Faites refroidir les blocs FFIP à −20 ° C pendant 10 min. Section les blocs FFIP à 5 µm par microtome.
  7. Remplir un bain d’eau avec de l’eau bidistillée à 45 ° C. Soulevez les rubans des sections de tissu et les faire flotter à la surface de l’eau chaude à l’aide de pinces et pinceaux.
  8. Séparer les rubans des sections de tissu avec des pincettes. Placez une section sur une lame de microscope.
  9. Placer les lames de microscope sur une diapositive plus chaud et laisser sections sécher pendant la nuit à 37 ° C.
  10. Mettre les lames de microscope dans les racks de diapositive et les Déparaffiner en les trempant dans 3 différents plats de coloration de pure xylène (environ 200 à 250 mL) pour 8, 5 et 3 min.
  11. Hydrater les coupes de tissus dans les racks de diapositive en les trempant dans différents plats de coloration des solutions éthanol graduées (deux fois plus d’éthanol à 100 %, éthanol à 90 % une fois et éthanol à 80 % une fois [1 min chaque]) et les rincer à l’eau bidistillée.
    Remarque : Ces solutions sont environ 200 à 250 mL dans les différents plats de coloration. Pour chaque lavage, 30sec est suffisant.
  12. Bien rincer le tissu des sections en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 0,5 % Triton X-100, lavage avec du PBS pour plusieurs fois et puis les rincer à l’eau bidistillée.
    Remarque : Ces solutions sont environ 200 à 250 mL dans les différents plats de coloration. Car chacun était, 30sec est suffisant.
  13. Préparer une quantité égale de trois composantes (initiateur, animateur et activateur) fournie par le kit de mise en valeur argent dans noir et mélanger soigneusement.
    Remarque : Les solutions de modérateur et activateur sont collantes, s’il vous plaît utiliser pipeter avec ouvertures pointe large (ou couper les pointes pour créer des ouvertures plus larges). Pour chaque diapositive, 300 μL de solution mixte (en fonction de la taille de la section de tissu) est généralement suffisant. Par conséquent, si 10 diapos sont utilisés, le montant de chaque composant (initiateur, animateur et activateur) est 1000 μL (solution mixte est 3000 μL de 10 lames).
  14. Incuber les sections de tissu dans la mélange de la solution pendant 15 minutes dans l’obscurité à température ambiante. Couvrir entièrement les coupes de tissus sur les lames avec la mélange de la solution. Un temps d’incubation plus longs peut conduire à des faux positifs AMG signaux.
  15. Laver les lames avec de l’eau bidistillée et leur tache à l’hématoxyline pendant 10 s comme contre-colorant.
  16. Laver les lames avec l’eau courante, séchez-les et fixez-les avec milieu de montage.
  17. Examiner les diapositives sous un microscope optique.
  18. Capture au hasard dix images histologiques avec une lentille d’objectif X 40 de chaque section de tissu à l’aide d’une caméra numérique connectée avec les logiciels d’imagerie.

3. semiquantitative analyse pour les valeurs positives AMG d’Images histologiques

Remarque : AMG valeur positive indique le pourcentage de l’espace avec des signaux positifs AMG.

  1. Logiciel d’analyse image (ImageJ) permet d’analyser les images histologiques.
  2. Ouvrez l’image histologique en appuyant sur fichier | Ouvert.
  3. Diviser l’image choisie en trois couches de couleur (rouge, bleu et vert) en appuyant sur Image | Type | RGB pile.
  4. Quantifier les signaux positifs de l’AMG à l’aide de la couche bleue. Nucléaires faux signaux positifs sont généralement diminués sous la couche bleue lorsque tache l’hématoxyline est appliqué pour le contre-colorant nucléaire (Figure 2).
  5. Mesurer le pourcentage de l’espace avec des signaux positifs dans chaque image histologique avec l’outil seuil AMG (Image | Ajuster | Seuil de).
  6. Régler manuellement la valeur de la limite du seuil pour chaque image histologique (de 90 à 110) basée sur les présences de fausses positifs zones noyaux et/ou les globules rouges.
    Remarque : mise en défaut, des signaux positifs de l’AMG devraient être surlignés en rouge.
  7. Presse analyser | Définir des mesureset cochez la case de Zone de Fraction pour spécifier que la fraction de domaine est enregistrée.
  8. Presse analyser | Mesure. La zone pourcentage positive de chaque image histologique est affichée dans la colonne % zone de la fenêtre de résultats .
  9. En moyenne les zones pourcentage positifs de 10 images histologiques de chaque section de tissu et qualifier le résultat de la valeur positive de l’AMG pour chaque section de tissu.

Figure 2
Figure 2 : la présence du nucléaires faux signaux positifs sous des couches de couleurs différentes (contre-colorant : coloration hématoxyline). Représentant nucléaires faux signaux positifs sont indiqués par les flèches jaunes. PPA = pourcentage positif des zones. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

4. mise en place du test Ag histologique cétacés (CHAA) par le modèle de régression

Remarque : L’analyse suivante est exécutée dans le prisme 6.01 pour Windows.

  1. Évaluer la corrélation entre les résultats de l’ICP-MS et les valeurs positives de AMG.
  2. Ouvrez le logiciel, créez un nouveau fichier de projet et choisissez XY et corrélation.
  3. Données d’entrée y compris les résultats des valeurs positives ICP-MS et AMG.
  4. Appuyez sur l’analyse et choisissez corrélation à la rubrique Analyse XY pour analyser la force du lien entre les résultats de l’ICP-MS et les valeurs positives d’AMG par analyse de corrélation de Pearson.
    Remarque : Les résultats de l’ICP-MS et les valeurs positives AMG doivent être corrélés entre eux ; dans le cas contraire, le modèle de régression suivantes ne devrait pas être développé.
  5. Statistiquement, comparez les modèles de régression, y compris la régression linéaire, régression quadratique, cubique régression et la régression linéaire passant par origine, par le biais de logiciels de statistiques pour12,26,27.
    Remarque : Si le modèle de régression génère une concentration d’Ag irréaliste, le modèle de régression doit être abandonnée12.
  6. Revenir à la Table de données (panneau de gauche), puis appuyez sur analyse | Régression non-linéaire (ajustement de la courbe) à la rubrique Analyse XY | OK.
  7. Dans la fenêtre Paramètres : régression non linéaire, choisir le modèle de régression différentes dans la page monter et ensuite comparer les modèles de régression différentes dans la page comparer.
  8. Dans la page comparer, choisir les méthodes de comparaison, y compris le test de F extra somme des carrés et le critère d’information d’Akaike (AIC). Selon les résultats des méthodes de comparaison, utiliser un modèle de régression approprié relativement à la CHAA.
  9. Estimer les concentrations d’Ag des tissus hépatiques et rénaux cétacés avec des concentrations inconnues de Ag en utilisant la CHAA.
  10. Évaluer l’exactitude et la précision de la CHAA pour le foie et les tissus du rein. La différence entre la précision et l’exactitude est illustrée à la Figure 3.
  11. Précision : Calculer la moyenne écart-type (SD) des différences entre les concentrations de Ag connues et estimées.
  12. Précision : Effectuer des mesures répétées (au moins en triple) de valeurs positives AMG de coupes sériées dans les mêmes tissus FFIP. Calculer la moyenne SD des mesures des tissus du foie ou des reins, des différences entre les concentrations de Ag connues et estimées
    Remarque : Les méthodes d’évaluation de l’exactitude et la précision sont représentés dans la Figure 4.

Figure 3
Figure 3 : la différence entre l’exactitude et la précision. Précision veut dire comment fermer la mesure à la valeur vraie (c.-à-d., concentration Ag déterminée par ICP-MS) ; précision signifie la répétabilité de la mesure (c'est-à-dire, la cohérence entre les mesures répétées des valeurs positives AMG provenant des sections de tissu en triple). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : le schéma décrivant les méthodes d’évaluation de l’exactitude et la précision. CHAA = test de Ag histologique cétacé ; FFIP = fixés au formol, paraffine ; ICP-MS = spectrométrie de masse à plasma inductif ; IA = chacune des concentrations Ag déterminées par ICP-MS de chaque échantillon de tissu assortie paire ; Bi = chacune des concentrations Ag estimées par CHAA de chaque échantillon de tissu assortie paire ; Ci, Di et Ei = chacune des concentrations de l’Ag estimées par CHAA d’échantillons en triple de chaque échantillon de tissu assortie paire ; i = 1 à n. S’il vous plaît voir les données brutes de l’exactitude et la précision des tests dans la section des résultats représentatifs. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

5. estimation des Concentrations d’Ag par CHAA.

  1. Recueillir les tissus du foie et des reins de cétacés échoués et fixez-les dans 10 % de formol tamponné neutre.
  2. Traiter les tissus fixés au formol régulièrement (voir étape 2).
  3. Estimer les concentrations d’Ag des tissus hépatiques et rénaux cétacés avec des concentrations inconnues de Ag par CHAA (voir étapes 3 et 4).

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Representative Results

Des images représentatives des signaux positifs dans les tissus hépatiques et rénaux cétacés AMG sont indiquées à la Figure 5. Les signaux positifs AMG incluent variablement taille brun à noirs granules de différentes tailles dans le cytoplasme de l’épithélium tubulaire rénale proximale, les hépatocytes et les cellules de Kupffer. Occasionnellement, amorphe jaune doré à bruns signaux positifs de l’AMG sont notées dans le lumen et les membranes basales des tubules rénaux proximaux. Il y a une corrélation positive entre les résultats de l’ICP-MS et les valeurs de positivité AMG dans le foie et les tissus du rein, et la régression linéaire passant par origine est préférable selon le test F extra somme des carrés et les AIC12,26, 27. Dans l’essai de précision, la moyenne du SDs de la CHAA pour le foie et les reins sont 3.24 et 0,16, respectivement. Dans le test de la précision, la moyenne SDs de la CHAA pour le foie et les reins sont 2.8 et 0,35, respectivement. Les données brutes de l’exactitude et la précision des tests sont résumées dans le tableau 1. Les valeurs positives d’AMG, les concentrations de Ag estimées par CHAA et concentrations Ag mesurées par ICP-MS dans les tissus du foie et des reins de ces six cétacés échoués sont résumées dans le tableau 2.

Figure 5
Figure 5 : des images histologiques représentatives des signaux positifs AMG dans les tissus du foie et les reins des cétacés (contre-colorant : coloration hématoxyline). (A) des signaux positifs de l’AMG dans le tissu hépatique cétacé sont réparties uniformément (Grampus griseus (Gg) ; code de domaine : TP20111116 ; AG concentration mesurée byinductively couplé plasma spectroscopie de masse (ICP-MS) : 21.82 μg/g de poids sec). (B) des signaux positifs de l’AMG sont bruns à noirs granules de divers sizesin le cytoplasme des hépatocytes (flèches rouges) et des cellules de Kupffer (têtes de flèche rouge) (Gg ; domaine code : TP20111116). (C) quelques signaux positifs AMG de brun à noirs granules apparaissent dans le cytoplasme des hépatocytes (flèches rouges) (Kogia spp (Ko) ; code de domaine : TC20110722 ; AG la concentration mesurée par ICP-MS : 3,86 μg/g de poids sec). (D) des signaux positifs l’AMG dans le tissu rénal cétacés sont principalement situés dans le cortex rénal (Gg; code de domaine : TP20111116 ; AG la concentration mesurée par ICP-MS : 0,42 µg/g de poids sec). La ligne pointillée noire est placée à la jonction entre le cortex rénal et de la moelle. (E) magnification supérieure de la Figure 5 (rectangle rouge en pointillés). Les signaux positifs de l’AMG dans le cortex rénal sont bruns à noirs granules de différentes tailles dans le cytoplasme de l’épithélium des tubules rénaux proximaux (flèches rouges). Amorphe jaune doré à bruns signaux positifs de l’AMG sont indiqués dans les lumens (flèche rouge) et les membranes basales des tubules rénaux proximaux (tête de flèche jaune). N’à AMG minime des signaux positifs sont indiqués dans les glomérules (flèche verte) et les tubules rénaux distaux (vert tête de flèche) (Gg ; domaine code : TP20111116). (F) des granules bruns épars de différentes tailles sont indiqués dans la thecytoplasm de l’épithélium des tubules rénaux proximaux (flèches rouges) (Ko ; code de domaine : TC20110722 ; AG la concentration mesurée par ICP-MS : 0,05 μg/g de poids sec). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Essai de précision
Nombre de champ Foie Rein
CHAA * ICP-MS SD CHAA * ICP-MS SD
TP20111116 16,82 21.82 4,99 0,64 0,42 0,22
TC20110611 10.12 2,77 0,96 0,11 0.05 0,35
TC20110722 2.70 3.86 1.15 0,01 0.05 0,04
TD20110608 0,76 0,06 7.35 0,02 0.05 0,06
TP20110830 13.97 14,93 4.28 0,69 1.04 0,24
IL20110101 6,00 1,73 0,72 0,38 0,14 0,03
Moyenne écart-type 3.24 Moyenne écart-type 0,16
Precison test
Nombre de champ Foie Rein
CHAA * ICP-MS SD CHAA * ICP-MS SD
TP20111116 20.90 21.82 4.08 0,21 0,42 0,44
16.11 0,22
17.75 0,14
TD20110608 1.52 0,06 1.71 0.00 0.05 0,02
2.40 0.00
1.12 0.00
TP20110830 13.12 14,93 2.70 0,45 1.04 0,59
12,50 0,26
11 h 35 0,33
Moyenne écart-type 2,83 Moyenne écart-type 0,35
* Les équations de régression de la CHAA pour le foie et les reins ont été respectivement Y = 2.249 × X (R2 ajusté = 0,74) et Y = 0.07288 × X (R2 ajusté = 0,69).

Tableau 1 : les résultats représentatifs des tests exactitude et de précision pour l’analyse histologique cétacé de Ag (CHAA). CHAA = cétacé test histologique d’Ag, ICP-MS = spectrométrie de masse à plasma inductif, SD = écart-type.

Nombre de champ Espèces Foie Rein
AMG CHAA * ICP-MS AMG CHAA * ICP-MS
TP20111116 GG 7.48 16,82 21.82 8,82 0,64 0,42
TC20110611 Ko 4,50 10.12 2,77 1.52 0,11 0.05
TC20110722 Ko 1.20 2.70 3.86 0,11 0,01 0.05
TD20110608 LH 0,34 0,76 0,06 0,21 0,02 0.05
TP20110830 LH 6.21 13.97 14,93 9.43 0,69 1.04
IL20110101 Sa 2,67 6,00 1,73 5.26 0,38 0,14
* Les équations de régression de la CHAA pour le foie et les reins ont été respectivement Y = 2.249 × X (R2 ajusté = 0,74) et Y = 0.07288 × X (R2 ajusté = 0,69).

Tableau 2 : valeurs positives de l’AMG, des concentrations de Ag (μg/g, poids sec) estimée par test de Ag histologique cétacé (CHAA), et Ag (μg/g, poids sec) dosé par ICP-MS de foie et des reins tissus de six cétacés échoués. GG = Grampus griseus, Ko = Kogia spp., Lh = Lagenodelphis hosei, Sa = Stenella attenuata.

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Discussion

Le but de l’étude de l’article est d’établir une méthode de traitement adjuvant pour évaluer la distribution Ag aux niveaux suborgan et pour estimer les concentrations d’Ag dans les tissus de cétacés. Les protocoles actuels comprennent 1) Détermination des concentrations de l’Ag dans les tissus cétacés par ICP-MS, analyse 2) AMG paire assortie d’échantillons de tissus avec des concentrations connues de Ag, 3) mise en place du modèle de régression (CHAA) pour estimer les concentrations d’Ag par des valeurs positives AMG, 4) évaluation de l’exactitude et la précision de CHAA et 5) des concentrations d’Estimation d’Ag par CHAA.

Dans cette étude, les données d’ICP-MS ont été significativement et positivement corrélées avec celles des valeurs positives AMG, ce qui laisse supposer que la concentration d’Ag dans les tissus de cétacés peut être estimée par la valeur positive de l’AMG. La CHAA, qui repose sur la valeur positive d’AMG et le modèle de régression, a donc été élaborée pour estimer les concentrations d’Ag dans les tissus du foie et les reins des cétacés. Généralement, un modèle de régression à plusieurs paramètres (p. ex., un modèle de régression plus complexe) s’insère bien dans les données, mais il n’est pas déterminée que celui plus complexe est réellement meilleur que celui plus simple. Par conséquent, le meilleur modèle de régression doit être choisi par analyse statistique26,27. Les résultats de l’analyse statistique indiquent que le modèle de régression linéaire est suffisant pour estimer la concentration de Ag basée sur la valeur positive de AMG12.

Dans CHAA pour tissu rénal, la SD moyenne (0,35) de l’essai de précision était supérieure à celle de l’essai de précision (0.16). À l’inverse, en CHAA pour le tissu hépatique, la SD moyenne (2.8) de l’essai de précision était inférieur à celui de l’essai de précision (3.24). D’après ce résultat, il est suggéré que la répartition inégale des signaux positifs AMG et les concentrations relativement faibles de Ag dans les tissus rénaux cétacés interfère négativement avec la précision de CHAA pour tissu rénal. Par conséquent, la CHAA pour tissu rénal peut être exacte mais imprécise. Toutefois, la répartition uniforme des signaux positifs AMG et les concentrations relativement élevées de Ag dans les tissus du foie cétacés suggèrent que la CHAA pour le tissu hépatique est une méthode fiable pour estimer les concentrations d’Ag dans les tissus du foie cétacés. En outre, si plus de tissus avec des concentrations connues de Ag déterminées par ICP-MS sont disponibles, un modèle de régression plus précise et exacte d’enrichir pour estimer la concentration en Ag.

Bien que les protocoles actuels offrent une méthode de traitement adjuvant pour étudier des Ag dans les tissus animaux, on notera quelques limitations sur la méthode de l’AMG. Tout d’abord, faussement positifs signaux AMG peuvent présenter en raison de l’interférence d’autres métaux lourds, comme le mercure, le bismuth et le zinc28. Par conséquent, les résultats de la méthode AMG devront être interprétées avec d’autres méthodes spécifiques, tels que l’ICP-MS, pour surveiller la composition réelle des métaux lourds,28. Deuxièmement, il est difficile de détecter un métal lourd distribué de façon homogène, car elle peut engendrer plus lumineux amorphe AMG des signaux positifs, qui ne peuvent pas être identifiés par la visualisation sous examen microscopique. En outre, les signaux positifs AMG amorphes et lumineux sont difficiles à analyser avec le logiciel d’analyse image parce que la couleur des signaux positifs AMG peut être semblable à celle de l’arrière-plan (e.g., des signaux positifs de AMG amorphes trouvent dans le lumière des tubules rénaux proximaux). Par conséquent, des signaux positifs de l’AMG ne peut pas être mis en évidence après l’ajustement de la valeur seuil du seuil dans le logiciel d’analyse de l’image. En troisième lieu, parce que les valeurs positives de l’AMG sont basés sur le pourcentage de la superficie des signaux positifs d’AMG, il est possible que les valeurs de la haute concentration de métaux lourds peuvent être sous-estimés.

Les échantillons FFPE sont relativement faciles à recueillir et stocker, et notre étude précédente a démontré que la méthode actuelle d’AMG peut amplifier avec succès des échantillons FFPE stockés pendant plus de 15 ans12. Le mécanisme de l’AMG n’est pas affecté par les espèces animales différentes, car il a été énormément utilisé dans diverses espèces animales20,29,30,31. Bien que l’article actuel se concentre sur les cétacés, les protocoles décrits ici peuvent également être utilisés dans différentes espèces animales. En outre, le coût de la méthode AMG avec ICP-MS est relativement faible (par rapport au laser-ICP-MS à ablation) et donc les protocoles actuels sont précieux pour les chercheurs ou pays ne disposant pas de suffisamment de recherche financement pour étudier la répartition et concentration de métaux lourds dans les tissus animaux. En conclusion, l’utilisation d’AMG avec analyse quantitative pour localiser et quantifier semi métauxlourds fournit une méthodologie pratique pour études spatio-temporelle et interspécifique.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions le Taiwan Cetacean Stranding Network pour le prélèvement d’échantillons et de stockage, y compris le Taiwan Cetacean Society, Taipei ; le laboratoire de recherche cétacés (Prof. privilège-Siang Chou), l’Institut d’écologie et de biologie évolutive, Université nationale de Taïwan, Taipei ; le Musée National des sciences naturelles (Dr Chiou-Ju Yao), Taichung ; et la biologie Marine & Cetacean Research Center, National Cheng-Kung University. Nous remercions également le Forestry Bureau, le Conseil de l’Agriculture, le Yuan exécutif pour leur permis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HQ Silver enhancement kit Nanoprobes #2012
Surgipath Paraplast Leica Biosystems 39601006 Paraffin
100% Ethanol Muto Pure Chemical Co., Ltd 4026
Non-Xylene Muto Pure Chemical Co., Ltd 4328
Silane coated slide Muto Pure Chemical Co., Ltd 511614
Cover glass (25 x 50 mm) Muto Pure Chemical Co., Ltd 24501
Malinol Muto Pure Chemical Co., Ltd 20092
GM Haematoxylin Staining Muto Pure Chemical Co., Ltd 3008-1
10% neutral buffered formalin solution Chin I Pao Co., Ltd ---
Tip (1000 μL) MDBio, Inc. 1000
PIPETMAN Classic P1000 Gilson, Inc. F123602
15 ml Centrifuge Tube GeneDireX, Inc. PC115-0500
Dogfish liver National Research Council of Canada DOLT-2
Dogfish muscle National Research Council of Canada DORM-2
Inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) PerkinElmer Inc. PE-SCIEX ELAN 6100 DRC
FreeZone 6 liter freeze dry system Labconco 7752030 For freeze drying
BRAND® SILBERBRAND volumetric flask Merck Z326283
30 mL standard vial, flat interior with 33 mm closure Savillex Corporation 200-030-12 For diagestion
Nitric acid, superpur®, 65.0% Merck 1.00441 For diagestion
Hot Plate/Stirrers Corning® PC-220 For diagestion
High Shear lab mixer Silverson SL2T For homogenization
Sterile polypropylene sample jar (250mL) Thermo Scientific™ 6186L05 For homogenization
Digital camera Nikon Corporation DS-Fi2
Light microscope Nikon Corporation ECLIPSE Ni-U
Shandon™ Finesse™ 325 manual microtome Thermo Scientific™ A78100001H
Accu-Cut® SRM™ 200 rotary microtome Sakura 1429
Microtome blade S35 FEATHER® 207500000
Slide staining dish and cover Brain Research Laboratories #3215
Steel staining rack Brain Research Laboratories #3003
Shandon embedding center Thermo Scientific™ S-EC
Shandon Citadel® tissue processor Thermo Scientific™ 69800003
Slide warmer Lab-Line Instruments 26005
Water bath Shandon Capshaw 3964
Filter paper Merck 1541-070
Prism 6.01 for windows GraphPad Software Statistic software
ImageJ National Institutes of Health
Stainless steel tissue embedding mould Shenyang Roundfin Trade Co., Ltd RD-TBM003 For paraffin emedding

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