एक क्रोमेटिन Immunoprecipitation परख पुरानी लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया में उपंयास NFAT2 लक्ष्य जीन की पहचान करने के लिए

Cancer Research

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Summary

क्रोनिक लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL) पश्चिमी दुनिया में सबसे आम ल्यूकेमिया है । NFAT प्रतिलेखन कारकों विकास और कई प्रकार के सेल में सक्रियण के महत्वपूर्ण नियामकों हैं । यहां, हम NFAT2 के उपंयास लक्ष्य जीन की पहचान करने के लिए मानव CLL कोशिकाओं में क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) के उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।

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Fuchs, A. R., Märklin, M., Heitmann, J. S., Futterknecht, S., Haap, M., Wirths, S., Kopp, H. G., Hinterleitner, C., Dörfel, D., Müller, M. R. A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia. J. Vis. Exp. (142), e58270, doi:10.3791/58270 (2018).

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Abstract

क्रोनिक लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL) घातक बी सेल क्लोन के विस्तार की विशेषता है और पश्चिमी देशों में सबसे आम ल्यूकेमिया का प्रतिनिधित्व करता है । CLL रोगियों के बहुमत रोग के एक indolent पाठ्यक्रम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपने ल्यूकेमिया कोशिकाओं के एक anergic phenotype, एक बी सेल बाहरी उत्तेजना के लिए अप्रतिसादी रिसेप्टर की चर्चा करते हुए दिखाते हैं । हमें हाल ही में पता चला है कि प्रतिलेखन फैक्टर NFAT2 CLL में anergy का एक महत्वपूर्ण नियामक है । विभिंन रोगों में एक प्रतिलेखन कारक की भूमिका के विश्लेषण में एक प्रमुख चुनौती अपने विशिष्ट लक्ष्य जीन की पहचान है । यह विकारी तंत्र और संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेप के elucidation के लिए बहुत महत्व का है । क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) एक क्लासिक के लिए प्रोटीन डीएनए बातचीत और, इसलिए, स्तनधारी कोशिकाओं में प्रतिलेखन कारकों के प्रत्यक्ष लक्ष्य जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रदर्शन तकनीक है । यहां, चिप मानव CLL कोशिकाओं में NFAT2 का सीधा लक्ष्य जीन के रूप में LCK की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । डीएनए और जुड़े प्रोटीन crosslinked formaldehyde का उपयोग कर रहे है और बाद में sonication द्वारा लगभग 200-500 आधार जोड़े (बीपी) के डीएनए टुकड़ों में बाल काटना । पार से जुड़े डीएनए NFAT2 के साथ जुड़े टुकड़े तो चुनिंदा एक αNFAT2 एंटीबॉडी का उपयोग कर सेल मलबे से immunoprecipitated हैं । शुद्धि के बाद, जुड़े डीएनए टुकड़े मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qRT-पीसीआर) के माध्यम से पता चला रहे हैं । स्पष्ट संवर्धन के साथ डीएनए अनुक्रम NFAT2 द्वारा vivo मेंलक्षित कर रहे हैं, जो जीनोम के क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं । डीएनए की उचित कतरन और आवश्यक एंटीबॉडी के चयन इस विधि के सफल आवेदन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं । इस प्रोटोकॉल लक्ष्य जीन के साथ NFAT2 के प्रत्यक्ष बातचीत के प्रदर्शन के लिए आदर्श है । इसकी प्रमुख सीमा कठिनाई बड़े पैमाने पर बरकरार जीवों में एकाधिक प्रतिलेखन कारकों के लक्ष्य जीन का विश्लेषण परख में चिप को रोजगार है ।

Introduction

क्रोनिक लिम्फोसाईटिक ल्यूकेमिया (CLL) पश्चिमी देशों में वयस्कों में सबसे आम ल्यूकेमिया का प्रतिनिधित्व करता है, CD19, CD23 के विशिष्ट संचय का प्रदर्शन, और CD5 परिपक्व बी कोशिकाओं1व्यक्त. अधिकांश रोगियों को एक indolent रोग पाठ्यक्रम है, जो कई वर्षों के लिए विशिष्ट उपचार जरूरत नहीं है प्रदर्शन । इसके विपरीत, कुछ रोगियों तेजी से प्रतिरक्षा के साथ तत्काल चिकित्सीय हस्तक्षेप की आवश्यकता होती है प्रगति दिखाने के कीमोथेरेपी या अंय लक्षित उपचार2,3। सक्रिय टी कोशिकाओं के नाभिकीय कारक (NFAT) कई कोशिका प्रकार में विभिन्न विकासात्मक और सक्रियण प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने वाले प्रतिलेखन कारकों में से एक परिवार है4,5,6. हम हाल ही में indolent रोग7के साथ रोगियों से CLL कोशिकाओं में NFAT2 के व्यक्त और संवैधानिक सक्रियण का प्रदर्शन किया । यहां, यह बी सेल रिसेप्टर anergy7बुलाया उत्तेजना के लिए एक अप्रतिसादी राज्य को नियंत्रित करता है । यह प्रदर्शित करने के लिए कि NFAT2 बाँध को लिम्फोसाइट-विशिष्ट प्रोटीन tyrosine कळेनासे (LCK) प्रवर्तक और मानव LCK कोशिकाओं में CLL अभिव्यक्ति को विनियमित करता है, एक विशिष्ट क्रोमेटिन immunoprecipitation परख (चिप) विकसित और कार्यरत था.

चिप कई तकनीकों में से एक है जीन अभिव्यक्ति8में प्रतिलेखन कारकों की भूमिका की जांच । जीन अभिव्यक्ति कसकर इस प्रक्रिया9,10,11,12में एक अपूरणीय भाग लेने के प्रतिलेखन कारकों के साथ कई नियामकों द्वारा एक बहुत ही जटिल तरीके से किया जाता है । प्रतिलेखन एक स्थानिक और लौकिक संदर्भ में जीन अभिव्यक्ति विनियमन कारकों कई प्रजातियों में पहचान की गई है (विकास और भेदभाव के लिएजैसे, )13,14,15, 16,17,18. प्रतिलेखन कारकों को शामिल जटिल नियंत्रण तंत्र में त्रुटियाँ कैंसर19,20सहित रोग प्रक्रियाओं की एक किस्म के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसलिए, प्रतिलेखन कारकों की पहचान और उनके संबंधित लक्ष्य उपंयास चिकित्सकीय रास्ते21,22की पेशकश हो सकती है । इस पेचीदा क्षेत्र की जांच करने के लिए कई तरीकों चिप की तरह उपलब्ध हैं, electrophoretic गतिशीलता पारी परख (EMSA), विभिंन डीएनए पुल नीचे परख और रिपोर्टर-परख8,11,12, 23 , 24.

प्रदर्शित करने के लिए कि एक निश्चित प्रतिलेखन कारक vivo में जीनोम के विशिष्ट क्षेत्रों के साथ सूचना का आदान प्रदान, चिप एक आदर्श तकनीक25है । इस प्रयोजन के लिए, डीएनए और जीवित कोशिकाओं में जुड़े प्रोटीन यूवी विकिरण या formaldehyde (पार से जुड़ा हुआ चिप, XChIP) का उपयोग कर पार कर रहे हैं । यह कदम तथाकथित देशी चिप (NChIP)26में बेहतर डीएनए और प्रोटीन रिकवरी प्राप्त करने के लिए छोड़ा जाता है । डीएनए-प्रोटीन परिसरों बाद sonication द्वारा लगभग 200-500 आधार जोड़े (बीपी) के टुकड़ों में कतरनी और सेल मलबे से immunoprecipitated ब्याज की प्रतिलेखन कारक के खिलाफ एक विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर रहे हैं । जुड़े डीएनए टुकड़े तो शुद्ध और पीसीआर, आणविक क्लोनिंग, और अनुक्रमण द्वारा विशेषता है । वैकल्पिक तकनीक का उपयोग करें microarrays (चिप पर चिप) या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (चिप-Seq) immunoprecipitated डीएनए का विश्लेषण करने के लिए ।

चिप पहले १९८४ में Gilmour और फूल द्वारा शुरू की गई थी जब वे covalently पार से लिंक डीएनए और जीवित जीवाणु27में प्रोटीन बंधे के लिए यूवी प्रकाश का इस्तेमाल किया । कोशिका lysis और बैक्टीरियल आरएनए पोलीमरेज़ के immunoprecipitation पर, ज्ञात जीन की विशिष्ट जांच में vivo वितरण और आरएनए पोलीमरेज़ के घनत्व को मैप करने के लिए उपयोग किया गया । विधि बाद में एक ही जांचकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया गया था Drosophila28में गर्मी सदमे प्रोटीन जीन पर eukaryotic आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय के वितरण का विश्लेषण । XChIP परख और Varshavsky और सहकर्मियों जो पहले formaldehyde पार इस्तेमाल से परिष्कृत किया गया गर्मी सदमे प्रोटीन के साथ हिस्टोन H4 के संघ का अध्ययन जोड़ने के29,30जीन । NChIP दृष्टिकोण है, जो एक बेहतर डीएनए और प्रोटीन की वजह से स्वाभाविक रूप से बरकरार epitopes की वसूली का लाभ वहन करती है और, इसलिए, अधिक से अधिक एंटीबॉडी विशिष्टता, पहले Hebbes और १९८८31में सहयोगियों द्वारा वर्णित किया गया था ।

अंय तकनीकों की तुलना में चिप का लाभ डीएनए का विश्लेषण करने के लिए प्रोटीन बातचीत वास्तव में है, कि एक प्रतिलेखन कारक की वास्तविक बातचीत vivo में जांच की जा सकती है और कोई जांच या कृत्रिम शर्तों buffers या जैल द्वारा बनाई गई है कार्यरत,११,१२. अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ चिप के संयोजन से, कई लक्ष्यों को एक साथ पहचाना जा सकता है ।

इस तकनीक की प्रमुख सीमाएं हैं25बरकरार जीवों में बड़े पैमाने पर परख करने के लिए सीमित प्रयोज्यता । अंतर जीन अभिव्यक्ति पैटर्न के विश्लेषण भी चिप तकनीक का उपयोग कर चुनौतीपूर्ण हो सकता है अगर संबंधित प्रोटीन केवल कम स्तर पर या संकीर्ण समय खिड़कियों के दौरान व्यक्त कर रहे हैं । एक और संभावित सीमित कारक एक उचित एंटीबॉडी की उपलब्धता है चिप11के लिए उपयुक्त ।

चिप प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qRT-पीसीआर) द्वारा एक प्रतिलेखन कारक के लक्ष्य जीन की पहचान में vivo के लिए नियोजित किया जा सकता है । विशेष रूप से, लक्ष्य के लिए CLL में NFAT2 के उपंयास लक्ष्य जीन की पहचान थी । चिप क्योंकि अपनी क्षमता के लिए चुना गया था सीधे मानव CLL रोगी कोशिकाओं में प्राकृतिक परिस्थितियों में अलग लक्ष्य जीन के प्रवर्तक क्षेत्रों के लिए NFAT2 के बंधन का प्रदर्शन ।

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Protocol

मानव सामग्री के साथ किए गए सभी प्रयोगों को यूनिवर्सिटी ऑफ Tübingen की एथिक्स कमेटी द्वारा अनुमोदित किया गया और लिखित सूचित सहमति उन सभी रोगियों से प्राप्त की गई जिन्होंने इस अध्ययन के लिए नमूनों का योगदान किया.

1. अलगाव और Jurkat कोशिकाओं की उत्तेजना

नोट: प्रोटोकॉल ऑप्टिमाइज़ करने के लिए, Jurkat सेल लाइन का उपयोग करें जो NFAT2 के उच्च स्तर को व्यक्त करने के लिए जाना जाता है । सभी कदम एक लामिना प्रवाह हुड के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं ।

  1. ५० मिलीलीटर RPMI १६४० 10% FCS और 1% पेनिसिलिन/streptomycin के साथ एक पानी स्नान में ३७ ° c करने के लिए वार्मिंग से पूरक तैयार ।
  2. संस्कृति Jurkat कोशिकाओं के लिए 1-2 d में एक सेल संस्कृति कुप्पी में ३७ ° c और 5% कं2 में 20 RPMI १६४० के पूरक 10% FCS और 1% पेनिसिलिन/streptomycin के घनत्व के लिए लगभग 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल (कोशिकाओं के साथ गिना जाता है Trypan नीले दाग और एक माइक्रोस्कोप के तहत Neubauer चैंबर) और उंहें २०० x जीपर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा फसल
  3. supernatant को एक पिपेट के साथ निकालें और RPMI १६४० के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं को resuspend 10% FCS और 1% पेनिसिलिन/streptomycin के साथ पूरक । इसके बाद, एक पारंपरिक trypan नीले दाग और माइक्रोस्कोप के तहत एक Neubauer चैंबर के साथ कोशिकाओं की गणना ।
  4. 5 मिनट के लिए १.३ कदम से कोशिकाओं को २०० x जी में केंद्रापसारक और आकांक्षा से supernatant हटा दें । फिर, कोशिकाओं के घनत्व में 2 x 107 कोशिकाओं/एमएल RPMI १६४० में 10% FCS और 1% पेनिसिलिन/streptomycin के साथ पूरक है और एक नया पारंपरिक 5 मिलीलीटर ट्यूब में pipetting द्वारा 1 मिलीलीटर स्थानांतरण resuspend ।
  5. जोड़कर कोशिकाओं को उत्तेजित ३२.४ एनएम phorbol 12-myristate 13-एसीटेट (पमा) र १ µ m ionomycin । फिर ३७ डिग्री सेल्सियस पर 16 ज के लिए कोशिकाओं की मशीन और 5%2 ट्यूब के ढक्कन के साथ सह खोला (संदूषण से बचने के लिए, हवा के लिए एक सील फिल्म पारगंय इस्तेमाल किया जा सकता है) ।

2. अलगाव और मानव रोगियों से प्राथमिक CLL कोशिकाओं की उत्तेजना

नोट: मरीज के नमूनों का अधिग्रहण किया और उत्तेजित के रूप में पहले7वर्णित थे । सभी कदम एक लामिना प्रवाह हुड के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं ।

  1. रोगियों से रक्त आकर्षित करने के लिए और एक घनत्व ढाल जुदाई प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक उपकरण तैयार: 21-जी सुई, tourniquet, एनएच4-हेपरिन-रक्त संग्रह सीरिंज (जैसे, एस-monovettes), 1x पंजाबियों, और घनत्व ढाल मध्यम (घनत्व १.०७७ G/ .
  2. venipuncture पर, CLL रोगियों (सीए. ४० मिलीलीटर रक्त प्रति मरीज) से सिरिंजों में रक्त ड्रा । फिर ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूबों में रक्त का हस्तांतरण । धो 10 मिलीलीटर पंजाबियों और पूल रक्त-पंजाबियों-५० एमएल ट्यूबों में निलंबन के साथ सिरिंज (ट्यूबों की संख्या को समायोजित रक्त की मात्रा के लिए) ।
  3. एक ताजा ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में घनत्व ढाल मध्यम के 15 मिलीलीटर तैयार । इसके बाद, खून की परत ३५ एमएल-पंजाबियों-घनत्व ढाल माध्यम पर ध्यान से निलंबन । इस प्रयोजन के लिए, एक सपाट कोण पर ट्यूब पकड़ और धीरे-पिपेट रक्त-पंजाबियों-निलंबन ५० एमएल शंकु ट्यूब की निचली दीवार के खिलाफ । के रूप में रक्त की अधिक-पंजाबियों-निलंबन ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में जमा है, ट्यूब के कोण एक सही कोण तक बढ़ा । रक्त-पंजाबियों की मात्रा-निलंबन के अनुसार यह कदम दोहराएं ।
  4. ५६० x g पर 20 मिनट के लिए केंद्रापसारक प्रदर्शन (ब्रेक के बिना), तो mononuclear कोशिका चरण है जो परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMCs) शामिल निकालने । ऐसा करने के लिए, एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ घनत्व ढाल जुदाई के सफेद चरण इकट्ठा और यह एक नया ५० एमएल शंकु ट्यूब के लिए स्थानांतरण ।
  5. सेल-पंजाब के साथ ५० मिलीलीटर के लिए निलंबन भरें और 5 मिनट के लिए ३६० x gपर केंद्रापसारक आकांक्षा द्वारा supernatant को हटा दें । २७५ x gपर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक के साथ इस कदम को दोहराएँ फिर, एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में पंजाब के 5-10 मिलीलीटर में एक मरीज की कोशिकाओं पूल ।
  6. १.३ में वर्णित के रूप में कक्षों की गणना ।
    नोट: यह अलग PBMCs में CLL कोशिकाओं के अनुपात पर निर्भर करता है, अगर कोशिकाओं को इस प्रक्रिया या एक बी सेल अलगाव के लिए सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे, चुंबकीय कोशिका छंटाई (एमएसीएस) के माध्यम से किया जाना है । बी सेल अलगाव की सिफारिश की है, लेकिन छोड़ा जा सकता है अगर CLL कोशिकाओं के अनुपात कुल लिम्फोसाइटों के ९५% से ऊपर है (प्रवाह cytometry के माध्यम से निर्धारित) । CLL रोगियों का रक्त स्थिर होता है और निर्माता के निर्देशों के अनुसार लीजड ड है. फिर CD19 के साथ एक दाग-FITC और CD5-पीई एंटीबॉडी निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया जाता है और कोशिकाओं प्रवाह cytometry के माध्यम से विश्लेषण कर रहे हैं । एक अनुकरणीय रोगी चित्रा 1में दिखाया गया है, जिसमें CLL कोशिकाओं का अनुपात ८९.०३% है । इस प्रकार, एक बी कोशिका अलगाव इस रोगी में प्रदर्शन किया जाना है । शारीरिक बी कोशिकाओं के अनुपात (उदाहरण में ३.७२%) नगण्य है ।
  7. कोशिकाओं को धो लें पूर्व गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) RPMI १६४० 10% FCS के साथ पूरक के 10 मिलीलीटर के साथ, 1% पेनिसिलिन/streptomycin, १०० मिमी गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट और ५० मिमी β-mercaptoethanol 5 मिनट के लिए २०० x जी पर और आकांक्षा द्वारा supernatant को हटा दें ।
  8. कोशिकाओं को समायोजित करने के लिए 2 x 107 कोशिकाओं/एमएल RPMI १६४० में 10% FCS के साथ पूरक, 1% पेनिसिलिन/streptomycin, १०० मिमी गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट और ५० मिमी β-mercaptoethanol (३७ डिग्री सेल्सियस) और एक 5 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन की 1 मिलीलीटर भरें ।
    नोट: अ ß य-mercaptoethanol ऑक्सीडेटिव तनाव को प्रभावहीन करने के लिए कार्यरत है ।
  9. ३२.४ एनएम पमा और १ µ m ionomycin जोड़कर कोशिकाओं को उत्तेजित करना । फिर ३७ डिग्री सेल्सियस पर 16 ज के लिए कोशिकाओं की मशीन और 5%2 ट्यूब के ढक्कन के साथ सह खोला (संदूषण से बचने के लिए, हवा के लिए एक सील फिल्म पारगंय इस्तेमाल किया जा सकता है) ।
    ध्यान दें: तनाव के स्तर को कम करने के लिए कोशिकाओं को ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 में 1 ज के लिए विश्राम किया जा सकता है पहले उत्तेजना के 16 ज ।

3. निर्धारण, सेल Lysis, और क्रोमेटिन बाल काटना

नोट: मरीज के नमूनों और Jurkat कोशिकाओं तय कर रहे है और पहले7वर्णित के रूप में संशोधनों के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चिप किट के साथ लीजड ड । निर्धारण एक लामिना प्रवाह हुड के तहत किया जाता है ।

  1. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब के साथ 1 मिलीलीटर की ३७% formaldehyde, एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब की 1 मिलीलीटर के साथ १.२५ एम glycine, एक 5 एमएल ट्यूब के साथ 4 एमएल के पंजाबियों और कोशिकाओं के निर्धारण के लिए बर्फ के साथ एक बॉक्स ।
  2. चरण १.५ या २.९ में संबंधित मशीन समय के लिए कोशिकाओं की उत्तेजना के बाद, 5 एमएल ट्यूबों के लिए २०० x जी में ५ मिलीलीटर ट्यूब स्पिन और 5 मिलीलीटर ट्यूबों में पंजाब के ५०० µ एल में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड ।
  3. कक्षों में ३४० µ m formaldehyde (१३.५ µ l का ३७% formaldehyde) जोड़ें । द्वारा संक्षिप्त मिश्रण के बाद ध्यान से pipetting ऊपर और नीचे २.५ मिनट (Jurkat कोशिकाओं) या 5 मिनट के लिए निलंबन गर्मी (रोगी नमूना) कमरे के तापमान पर ।
    नोट: लंबे समय तक निर्धारण समय इष्टतम कतरनी आश्वासन देने के लिए प्राथमिक कोशिकाओं के लिए आवश्यक है ।
  4. १२५ mM glycine (५७ µ l की १.२५ M glycine) को जोड़ने के लिए निर्धारण और एक और 5 मिनट के लिए मशीन को रोकने के लिए । इसके तुरंत बाद बर्फ पर कोशिकाओं रखो और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ५०० x g पर केंद्रापसारक । आकांक्षा द्वारा supernatant को हटा दें ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए २०० x g पर बर्फ ठंडा पंजाबियों के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें और आकांक्षा द्वारा हर बार supernatant निकालें ।
    नोट: निर्धारण के बाद प्रोटोकॉल को रोका जा सकता है । फिक्स्ड सेल-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए । परीक्षण करने के लिए, यदि निम्न प्रोटोकॉल में उपयोग करने के लिए लक्षित एंटीबॉडी का epitope निर्धारण के माध्यम से मास्क नहीं है, अतिरिक्त नमूने एसडीएस-पृष्ठ जेल ट्रो और पश्चिमी ब्लाट के माध्यम से विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है । इन कदमों के साथ प्रदर्शन कर रहे हैं १०० µ जी प्रोटीन के निर्माता के निर्देशों के अनुसार. सभी αNFAT2 एंटीबॉडी 1:1000 के एक कमजोर पड़ने पर उपयोग किया जाता है, 1:10000 के एक कमजोर पड़ने पर GAPDH एंटीबॉडी. उचित और अनुपयुक्त एंटीबॉडी के साथ Jurkat कोशिकाओं से निश्चित नमूनों की एक अनुकरणीय छवि चित्रा 2में दिखाया गया है ।
  6. वाणिज्यिक उपलब्ध lysis बफर 1 के 5 मिलीलीटर में सेल गोली pipetting ऊपर और नीचे से resuspend । फिर, एक शेखर पर बर्फ पर नमूने प्लेस और उंहें 10 मिनट के लिए गर्मी जबकि मिलाते हुए ।
    नोट: lysis करने से पहले, कोशिकाओं को तरल नाइट्रोजन में 10 एस के लिए विघटित कर सकते हैं । यह Jurkat कोशिकाओं के लिए उपयोगी है लेकिन प्राथमिक रोगी नमूनों में परहेज किया जाना चाहिए । विघटन के लिए, 5 मिलीलीटर ट्यूबों को 5 एस के लिए एक विशिष्ट कंटेनर में 5-10 मिलीलीटर तरल नाइट्रोजन में रखें । सुरक्षा चश्मा और उपयुक्त सुरक्षा दस्ताने पहनें ।
  7. बाद में, 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ५०० x g पर ट्यूबों के केंद्रापसारक और pipetting द्वारा supernatant ध्यान से हटा दें ।
  8. Homogenize में कोशिकाओं को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध lysis बफर 2 के ऊपर और नीचे और बर्फ पर 10 मिनट के लिए गर्मी जबकि मिलाते हुए pipetting के 5 मिलीलीटर में । फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ५०० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक और pipetting द्वारा supernatant ध्यान से हटा दें ।
  9. ५०० µ l (Jurkat कोशिकाओं) या १४० µ l (रोगी नमूनों) कतरनी बफर 1 1x चिढ़ाना अवरोध करनेवाला (5 µ l या १.४ µ एल, क्रमशः) और बर्फ पर 10 मिनट के लिए मिश्रण की मशीन में सेल गोली resuspend ।
  10. क्रोमेटिन बाल काटना के लिए, स्थानांतरण १४० सेल के µ एल-निलंबन से कदम ३.९ sonicator ट्यूबों में (हवा के बुलबुले के उत्पादन से बचें और इस कदम को दोहराने यदि आवश्यक नमूना मात्रा के कारण). ध्यान केंद्रित अल्ट्रा में ट्यूबों प्लेस-sonicator के तापमान पर 7 डिग्री सेल्सियस और 10 मिनट के लिए कतरनी (सेल लाइन) या ७.५ मिनट (रोगी के नमूनों) के साथ एक औसत घटना शक्ति ९.३७५ डब्ल्यू 200-500 बीपी डीएनए अंशों को प्राप्त करने के लिए ।
  11. अंत में, छोटे केंद्रापसारक में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १५७०० x g पर केंद्रापसारक और एक नया १.५ मिलीलीटर ट्यूब में supernatant इकट्ठा ।
  12. उचित टुकड़ा आकार के लिए परीक्षण करने के लिए, १.५% TBE agarose जेल में जेल-ट्रो के माध्यम से कतरनी क्रोमेटिन के 20 µ एल का विश्लेषण । अच्छी और बुरी गुणवत्ता की Jurkat कोशिकाओं से कतरनी क्रोमेटिन की एक अनुकरणीय छवि चित्रा 3में दिखाया गया है । इस बिंदु पर, प्रोटोकॉल संभावित रूप से रोका जा सकता है । कतरनी क्रोमेटिन-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए ।

4. क्रोमेटिन Immunoprecipitation

नोट: क्रोमेटिन immunoprecipitation7संशोधनों के साथ निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चिप किट के साथ किया गया था ।

  1. immunoprecipitations की संख्या की गणना (७० µ एल (Jurkat कोशिकाओं) या 15 µ एल (रोगी नमूनों) की कतरनी क्रोमेटिन प्लस एक एंटीबॉडी) और एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में एक लेपित मोतियों की वर्षा के प्रति प्रोटीन के 20 µ एल तैयार । ४० µ में मोतियों की माला धोएं 1 मिनट के लिए ऊपर और नीचे pipetting द्वारा 1x चिप बफर १ के एल, एक चुंबकीय रैक में मोती आराम दो और pipetting द्वारा supernatant हटा दें । कुल में चार बार यह चरण निष्पादित करें । अंत में, 1x चिप बफर 1 के साथ मूल मात्रा में मोतियों resuspend ।
  2. स्वयं immunoprecipitation के लिए, αNFAT2 एंटीबॉडी (7A6) के 10 µ g का उपयोग अपने बाउंड लक्ष्य अनुक्रम के साथ NFAT2 को कैप्चर करने के लिए करें । एक आईजीजी-नियंत्रण के रूप में एक खरगोश आईजीजी एंटीबॉडी (DA1E) के २.५ µ जी का उपयोग करें । 1 तालिकामें संकेत के रूप में ताजा १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में प्रतिक्रियाओं को तैयार ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए निर्धारण के दौरान epitope मास्क नहीं है जिसका उच्च समानता के साथ एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । Polyclonal एंटीबॉडी यह काफी अधिक उचित प्राप्त परिणामों की व्याख्या करने के लिए मुश्किल बना भिन्नता का एक अतिरिक्त स्तर परिचय.
  3. 6 rpm पर एक घूर्णन व्हील पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात ४.२ कदम से मिश्रण गर्मी ।
  4. अगले दिन पर 5 के लिए ट्यूबों स्पिन छोटे केंद्रापसारक में ७,००० x जी में, उंहें 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक में मशीन और आकांक्षा से supernatant हटा दें । प्रत्येक वॉश बफ़र्स 1, 2, 3 और 4 लगातार के साथ एक बार मोतियों को धो लें ।
  5. ऐसा करने के लिए, धोने बफर के ३५० µ एल में मोती resuspend और 5 मिनट के लिए उंहें 4 डिग्री सेल्सियस पर 6 rpm पर एक घूर्णन व्हील पर मशीन ।
  6. इसके बाद, 5 के लिए ट्यूबों स्पिन छोटे केंद्रापसारक में ७००० x g पर एस । फिर, उंहें एक चुंबकीय रैक में 1 मिनट के लिए जगह है, supernatant को हटाने और अगले धोने बफर जोड़ें ।
  7. पिछले धोने के कदम के बाद, pipetting द्वारा supernatant हटाने के लिए, १०० µ में मोतियों को ले 1 बफर के एल और उंहें 30 मिनट के लिए 6 rpm पर एक घूर्णन पहिया पर गर्मी ।
  8. ट्यूबों शीघ्र ही स्पिन (5 छोटे केंद्रापसारक में ७००० x जी पर एस) और उंहें 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक में जगह है ।
  9. इसके बाद supernatant को pipetting करके एक नई १.५ एमएल ट्यूब पर ट्रांसफर करें और रेफरेंस बफर 2 के 4 µ l को जोड़ें ।
  10. इनपुट नियंत्रण बनाने के लिए, कतरनी क्रोमेटिन के 1 µ l को ९९ µ l के साथ मिलाकर रेफरेंस बफ़र 1 और 4 µ l का रेफरेंस बफर 2 (इस सेटअप में, प्रति रोगी तीन ट्यूबों हैं: एक इनपुट नियंत्रण, एक आईजीजी-नियंत्रण और एक αNFAT2 नमूना) ।
  11. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब शेखर में ६५ डिग्री सेल्सियस और १३०० rpm पर 4 एच के लिए नमूनों की मशीन । जोड़ें १००% isopropanol, भंवर के १०० µ एल और 5 के लिए नमूने स्पिन छोटे केंद्रापसारक में ७००० x जी पर एस ।
  12. अच्छी तरह से भंवर द्वारा उपलब्ध चुंबकीय मोती resuspend, हर नमूने के लिए मोतियों की 10 µ एल जोड़ने और 6 rpm पर एक घूर्णन व्हील पर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए गर्मी ।
  13. मशीन के बाद, 5 के लिए ट्यूब स्पिन छोटे केंद्रापसारक में ७००० x जी पर और उंहें एक चुंबकीय रैक में 1 मिनट के लिए जगह है । आकांक्षा द्वारा supernatant को हटा दें ।
  14. धो १०० µ एल में मोतियों को resuspend 1 । मिश्रण और 6 rpm पर एक घूर्णन व्हील पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए गर्मी के लिए ट्यूबों पलटना ।
  15. 5 के लिए ट्यूब स्पिन छोटे केंद्रापसारक में ७००० x जी पर, उंहें एक चुंबकीय रैक में 1 मिनट के लिए जगह है और pipetting द्वारा supernatant हटा दें । चरण 4.13-4.14 धो बफ़र 2 के साथ दोहराएँ ।
  16. इसके बाद, आकांक्षा द्वारा धोने बफर हटाने, रेफरेंस बफर के ५५ µ एल में मोतियों को फिर से सस्पेंड और घूर्णन व्हील पर कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए 6 rpm पर elute के लिए गर्मी में उपजी डीएनए । अंत में, 5 के लिए ट्यूबों स्पिन छोटे केंद्रापसारक में ७००० x जी पर, उंहें एक चुंबकीय रैक में 1 मिनट के लिए जगह है और नए १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में supernatant हस्तांतरण ।
    नोट: यहां प्रोटोकॉल संभावित रूप से रोका जा सकता है । eluted डीएनए तो-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए ।

5. CLL कोशिकाओं में NFAT लक्ष्य जीन का पता लगाने ।

  1. तालिका 2में दर्शाया गया के रूप में प्रत्येक नमूने के लिए डुप्लिकेट में qRT-पीसीआर प्रतिक्रिया आचरण ।
    नोट: लक्ष्य जीन का पता लगाने के लिए एक मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qRT-पीसीआर) एक वास्तविक समय पीसीआर साधन के साथ एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध qRT-पीसीआर मिश्रण का उपयोग कर आयोजित किया जाता है ।
  2. प्रतिक्रियाओं और आरटी-पीसीआर साधन के लिए सफेद ९६-well reaction प्लेट का उपयोग करें । सायक्लिंग शर्तों निंनानुसार हैं: ९५ ° c 30 s के लिए, [९५ ° c के लिए 5 s, ६० ° c 30 s के लिए] x ४० चक्र.
    नोट: इनपुट के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने (पतला या पतला 1:10, 1:100 और 1:1000 nuclease में मुक्त पानी) रिश्तेदार संवर्धन की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है । Jurkat कक्षों में, IL-2 एक सकारात्मक नियंत्रण३२के रूप में इस्तेमाल किया गया था । CD40L, बी कोशिकाओं में NFAT2 का एक अच्छी तरह से ज्ञात लक्ष्य, NFAT2३३,३४में CLL के एक उपंयास लक्ष्य जीन के लिए एक उदाहरण के रूप में CLL कोशिकाओं और LCK में एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । CD40L, आईएल-2 और LCK प्रमोटर क्षेत्र के लिए प्राइमरों विशिष्ट रिएजेंट और उपकरणों की तालिका में वर्णित हैं ।

6. सामान्यीकरण और डेटा विश्लेषण

नोट: ब्याज के प्रवर्तक क्षेत्रों (IL-2, CD40L या LCK) के लिए सापेक्ष संवर्धन सामान्यीकरण के लिए आईजीजी-नियंत्रण का उपयोग कर की गणना की है.

  1. सबसे पहले, इनपुट सीरियल कमजोर पड़ने के लिए सीटी (दहलीज चक्र) मूल्यों का निर्धारण, आईएल-2, CD40L और qRT-पीसीआर डेटा से मूल्यांकन सॉफ्टवेयर के माध्यम से LCK प्रवर्तक क्षेत्र ।
  2. इनपुट के धारावाहिक कमजोर पड़ने के माध्यम से सांद्रता के लिए एक मानक वक्र को परिभाषित करें । के साथ इस मानक वक्र हर नमूने के प्रत्येक डुप्लिकेट के लिए आईएल-2, CD40L और LCK प्रमोटर क्षेत्र के लिए एकाग्रता की गणना ।
  3. इसके बाद, डुप्लिकेट का माध्य परिकलित करें । उसके बाद, आईजीजी immunoprecipitation नमूना एक संदर्भ के रूप में सेट करें । इस नमूने के लिए सापेक्ष संवर्धन १.० के रूप में परिभाषित करें और अन्य नमूना (NFAT2 immunoprecipitation से) इस संदर्भ के लिए तुलना करें ।
  4. अंत में, आईजीजी संदर्भ की एकाग्रता द्वारा नमूनों की एकाग्रता विभाजित करके सापेक्ष संवर्धन की गणना.

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Representative Results

चित्रा 1 एक CLL रोगी के एक अनुकरणीय प्रवाह cytometry विश्लेषण से पता चलता है CD19-FITC और CD5-पीई एंटीबॉडी के साथ दाग के बाद प्रदर्शन किया । चित्रा 1a लिम्फोसाइटों के गेटिंग दिखाता है, CLL रोगियों के रक्त में कोशिकाओं के बहुमत का प्रतिनिधित्व । चित्रा 1b CD19+/CD5+ CLL कोशिकाओं है, जो इस उदाहरण में लिम्फोसाइटों का ८९.०३% प्रतिनिधित्व के अनुपात से पता चलता है । CD19+/CD5- बी कोशिकाओं का अनुपात संबंधित रोगी में ३.७२% है ।

चित्रा 2 एसडीएस पृष्ठ और पश्चिमी दाग द्वारा मूल्यांकन के रूप में अलग समय अवधि के लिए तय Jurkat कोशिकाओं में एंटीबॉडी प्रदर्शन के उदाहरण से पता चलता है । विभिंन निर्माताओं से अलग एंटीबॉडी विश्लेषण किया गया । चित्रा 2a विभिंन निर्माताओं से αNFAT2-एंटीबॉडी (क्लोन 7A6) के प्रदर्शन को दिखाता है एक हरी फ्लोरोसेंट विरोधी माउस एंटीबॉडी के साथ पता चला । निर्माता 1 के एंटीबॉडी निर्धारण (बैंड ए) और यहां तक कि जब Jurkat कोशिकाओं २.५ मिनट या 5 मिनट (बैंड बी या सी, क्रमशः) के लिए तय किए गए बिना अपने epitope के लिए बाध्यकारी दिखाया । निर्माता 2 से αNFAT2-एंटीबॉडी (क्लोन 7A6), दूसरी ओर, Jurkat कोशिकाओं में भी एक कमजोर प्रदर्शन (बैंड डी) तय नहीं दिखाया । निर्धारण पर, इस निर्माता के एंटीबॉडी भी कमजोर परिणाम हासिल (बैंड ई (२.५ ंयूनतम निर्धारण) और एफ (5 ंयूनतम निर्धारण)) । चित्रा बी एक अलग एक लाल फ्लोरोसेंट विरोधी खरगोश एंटीबॉडी के साथ पता चला निर्माता से αNFAT2-एंटीबॉडी (क्लोन D15F1) के प्रदर्शन से पता चलता है । यह एंटीबॉडी भी (बैंड ए) फिक्स्ड नमूनों में कमजोर प्रदर्शन किया है और एक बैंड के अभाव निर्धारण (बैंड बी (२.५ ंयूनतम निर्धारण) और सी (5 मिनट निर्धारण) द्वारा अपनी epitope के मास्किंग इंगित करता है) ।

चित्रा 3 जेल ट्रो द्वारा मूल्यांकन के रूप में अच्छी और खराब गुणवत्ता के विभिन्न निर्धारण और कतरनी समय के बाद प्राप्त Jurkat कोशिकाओं से कतरनी क्रोमेटिन के उदाहरण से पता चलता है. बैंड ए और बी (0 ंयूनतम निर्धारण या २.५ ंयूनतम निर्धारण, क्रमशः) दिखाने के अच्छी गुणवत्ता कतरनी क्रोमेटिन, जो 200-500 बीपी के डीएनए टुकड़ा आकार जो एक ठेठ धब्बा के रूप में एक agarose जेल पर पाया जा सकता है की विशेषता है । गरीब गुणवत्ता की कतरनी क्रोमेटिन, दूसरी ओर, लगभग पूर्ण या अपेक्षित डीएनए धब्बा (बैंड सी) के रूप में अच्छी तरह से एक बड़ा या अपेक्षित टुकड़ा आकार सीमा (बैंड डी-एफ) से छोटे में एक धब्बा के पूर्ण अभाव द्वारा मांयता प्राप्त किया जा सकता है । धब्बा का पूरा अभाव शुरू सामग्री की अपर्याप्त मात्रा के उपयोग को इंगित करता है । छोटे डीएनए टुकड़ों का पता लगाने के लिए अत्यधिक डीएनए कतरनी संकेत (बैंड ई), जबकि बड़ा डीएनए टुकड़े अपर्याप्त बाल काटना करने के लिए संकेत ।

चित्रा 4 Jurkat कोशिकाओं के साथ एक ठेठ प्रयोग के परिणाम से पता चलता है. LCK एक संभावित NFAT2 लक्ष्य के रूप में विश्लेषण किया गया था । आईएल-2 जो टी कोशिकाओं में NFAT2 का एक अच्छी तरह से परिभाषित लक्ष्य जीन एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । एक आईजीजी नियंत्रण एंटीबॉडी सामांय के लिए उपयोग किया गया था । चित्रा 4a इष्टतम IL-2 सकारात्मक नियंत्रण के महत्वपूर्ण संवर्धन द्वारा प्रलेखित परिणामों के साथ एक प्रयोग से पता चलता है । इस प्रयोग से यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि हाला डीएनए में LCK दृश्यों का एक महत्वपूर्ण संवर्धन किया गया है जिसका प्रदर्शन यह है कि LCK Jurkat कोशिकाओं में सीधा NFAT2 लक्ष्य है । चित्रा 4b लापता निर्धारण या एक उप इष्टतम कतरनी की वजह से गरीब गुणवत्ता डीएनए के साथ प्रदर्शन एक प्रयोग से पता चलता है IL-2 सकारात्मक नियंत्रण में संवर्धन की एक कम डिग्री के कारण ।

चित्रा 5 प्राथमिक मानव CLL कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया एक प्रयोग के परिणाम से पता चलता है. CD40L जो बी कोशिकाओं में एक ज्ञात NFAT2 लक्ष्य सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा की है और LCK प्रयोगात्मक लक्ष्य के रूप में विश्लेषण किया गया था । चित्रा 5 सकारात्मक नियंत्रण में CD40L डीएनए के संवर्धन के एक काफी स्तर के साथ एक प्रयोग से पता चलता है । LCK डीएनए के भी मजबूत संवर्धन से, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि LCK भी प्राथमिक मानव CLL कोशिकाओं में एक सीधा NFAT2 लक्ष्य है । चित्रा 5b एक खराब गुणवत्ता डीएनए अपर्याप्त कतरनी के कारण सबसे अधिक होने की संभावना के साथ प्रदर्शन किया प्रयोग से पता चलता है । CD40L डीएनए का कोई पर्याप्त संवर्धन सकारात्मक नियंत्रण में पाया जा सकता है प्रयोगात्मक डेटा प्रतिपादन अर्थहीन है ।

Figure 1
चित्रा 1: CLL रोगियों का अनुकरणीय प्रवाह cytometry विश्लेषण । (क) CLL रोगियों के नमूने CD19-FITC और CD5-पीई एंटीबॉडी और लिम्फोसाइटों के साथ दाग के बाद प्रवाह cytometry के माध्यम से विश्लेषण किया गया gated थे. (ख) तत्पश्चात्, CD19+/CD5+ CLL कोशिकाओं और CD19+/CD5- बी कोशिकाओं के अनुपात का निर्धारण किया गया. यहां, CD19+/CD5+ CLL कोशिकाओं लिम्फोसाइटों के ८९.०३% के लिए खाते हैं, जबकि CD19+/CD5- बी कोशिकाओं लिम्फोसाइटों के ३.७२% का प्रतिनिधित्व करते हैं । एक अनुकरणीय रोगी दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: एसडीएस-पृष्ठ और पश्चिमी-ब्लाट द्वारा मूल्यांकन किए गए निश्चित Jurkat कक्षों में एंटीबॉडी प्रदर्शन के उदाहरण । (a) Jurkat कोशिकाओं 0 मिनट के लिए तय किया गया (बैंड ए और डी), २.५ मिनट (बैंड बी और ई), या 5 मिनट (सी और एफ) और αNFAT2-एंटीबॉडी (क्लोन 7A6) से विभिंन निर्माताओं (बैंड एक-सी = निर्माता 1, बैंड डी एफ = निर्माता 2) की तुलना में था । निर्माता 1 के एंटीबॉडी एक बेहतर समग्र प्रदर्शन दिखाया, उच्च समानता के साथ बाध्यकारी भी निर्धारित नमूनों को (बैंड ए सी और बैंड डी-एफ तुलना) । (ख) किसी भिन्न निर्माता से αNFAT2-एंटीबॉडी (क्लोन D15F1) का प्रयोग किया गया. इस एंटीबॉडी ने फिक्स्ड नमूनों (band a) में केवल एक खराब प्रदर्शन दिखाया और epitope निर्धारण पर मास्क लगाया गया । इसलिए, एंटीबॉडी का कोई बंधन (बैंड बी और सी) निर्धारण के बाद पता लगाया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: जेल ट्रो द्वारा मूल्यांकन Jurkat कोशिकाओं से अच्छे और गरीब कतरनी गुणवत्ता के क्रोमेटिन के उदाहरण । Jurkat कोशिकाओं को ठीक किया गया और अलग समय अवधि के लिए बाल काटना । निर्धारण 0 मिनट (बैंड ए और डी), २.५ मिनट (बैंड बी और ई), या 5 मिनट (सी और एफ) के लिए किया गया था । बाल काटना 10 मिनट के लिए या तो प्रदर्शन किया (बैंड ए सी) या 20 मिनट (डी बैंड एफ) था । अच्छी कतरनी गुणवत्ता के क्रोमेटिन 200-500 बीपी का डीएनए टुकड़ा आकार जो संबंधित क्षेत्र (बैंड ए और बी) में एक धब्बा के रूप में पता लगाया जा सकता है की विशेषता है । गरीब गुणवत्ता के क्रोमेटिन एक लगभग पूर्ण या डीएनए के पूर्ण अभाव के कारण शुरू सामग्री (बैंड सी) या एक छोटे या बड़े आकार क्षेत्र में एक धब्बा द्वारा अनुपयुक्त कतरनी की स्थिति की वजह से एक अपर्याप्त राशि के लिए धब्बा द्वारा मांयता प्राप्त किया जा सकता है ( बैंड डी एफ) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: qRT-पीसीआर द्वारा मूल्यांकन Jurkat कोशिकाओं की चिप । (क) Jurkat कोशिकाओं में LCK और इल-२ प्रवर्तक को NFAT2 बाँधता है. NFAT2 एंटीबॉडी के साथ उपजी LCK और आईएल-2 प्रवर्तक क्षेत्रों के सापेक्ष संवर्धन qRT-पीसीआर द्वारा विश्लेषण के रूप में दिखाया गया है । तीन स्वतंत्र चिप-प्रयोगों मतलब ± SEM के रूप में दिखाया गया है (छात्र टी परीक्षण, * p < ०.०५; * * p < ०.०१ * * * p < ०.००१) । (ख) खराब गुणवत्ता वाले कतरनी क्रोमेटिन के साथ नमूनों से डीएनए का उपयोग किया गया. लक्ष्य अनुक्रम के लिए NFAT2 का कोई प्रासंगिक बाइंडिंग का पता लगाया जा सका । एक ऐसी ही तस्वीर का पता लगाया जा सकता है अगर कोई निर्धारण या NFAT2 एंटीबॉडी के साथ मशीन समय अपर्याप्त था । तीन स्वतंत्र चिप-प्रयोगों मतलब ± SEM के रूप में दिखाया गया है (छात्र टी परीक्षण, * p < ०.०५; * * p < ०.०१ * * * p < ०.००१) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: qRT-पीसीआर द्वारा मूल्यांकन प्राथमिक मानव CLL कोशिकाओं की चिप । (क) NFAT2 विशेष रूप से रोग के एक indolent पाठ्यक्रम के साथ रोगियों से प्राथमिक मानव CLL कोशिकाओं में LCK और CD40L प्रवर्तकों के लिए बांधता है । आरेख qRT-पीसीआर द्वारा विश्लेषण के रूप में NFAT2 एंटीबॉडी के साथ उपजी LCK और CD40L प्रवर्तक क्षेत्रों के सापेक्ष संवर्धन से पता चलता है. तीन स्वतंत्र चिप-प्रयोगों मतलब ± SEM के रूप में दिखाया गया है (छात्र टी परीक्षण, * p < ०.०५; * * p < ०.०१ * * * p < ०.००१) । (ख) खराब गुणवत्ता वाले कतरनी क्रोमेटिन के साथ रोगी के नमूनों से डीएनए का उपयोग किया गया. संबंधित लक्ष्य अनुक्रम के लिए NFAT2 का कोई बंधन नहीं देखा जा सकता है । तीन स्वतंत्र चिप-प्रयोगों मतलब ± SEM के रूप में दिखाया गया है (छात्र के टी परीक्षण, * p < ०.०५; * * p < ०.०१ * * * p < ०.००१) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

आइटम प्रति आईपी मात्रा (µ एल)
5% BSA 6
१०० एक्स चिढ़ाना अवरोध करनेवाला 3
5 एक्स चिप बफर 1 ५६
कतरनी क्रोमेटिन x (15 µ l या ७० µ l)
प्रोटीन एक लेपित चुंबकीय मोती 20
चिप seq ग्रेड पानी १८५-x-y
एंटीबॉडी (αNFAT2 या आईजीजी-control) y (१.०९ µ l या 1 µ l)
कुल २७०

तालिका 1: क्रोमेटिन immunoprecipitation के लिए शेड्यूल pipetting । क्रोमेटिन immunoprecipitation प्रतिक्रियाओं को तैयार करके प्रदर्शन किया गया के रूप में तालिका में संकेत दिया ।

आइटम मात्रा (µ l) प्रति qRT-पीसीआर
immunoprecipitated डीएनए 9
qRT-पीसीआर मिक्स 10
प्राइमरी फॉरवर्ड (LCK/CD40L/IL-2) ०.५
प्राइमरी रिवर्स (LCK/CD40L/IL-2) ०.५
कुल 20

तालिका 2: qRT-पीसीआर pipetting के लिए अनुसूची । qRT-पीसीआर को टेबल में दर्शाते हुए प्रतिक्रियाओं को तैयार करके प्रदर्शन किया गया ।

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Discussion

एक सफल चिप परख प्रदर्शन के महत्वपूर्ण कदम एक उपयुक्त एंटीबॉडी और क्रोमेटिन बाल काटना प्रक्रिया25के अनुकूलन का चयन कर रहे हैं । αNFAT2 एंटीबॉडी का चयन इस प्रोटोकॉल के विकास के दौरान विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण साबित हुआ । जबकि वहां कई αNFAT2 एंटीबॉडी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और पश्चिमी सोख्ता और अंय अनुप्रयोगों के लिए इन काम करता है ठीक के बहुमत रहे हैं, क्लोन 7A6 केवल एंटीबॉडी जो सफलतापूर्वक चिप7के लिए इस्तेमाल किया जा सकता था । यहां तक कि विभिंन निर्माताओं से माना जाता समान 7A6 एंटीबॉडी चिप में अपने प्रदर्शन के संबंध में महत्वपूर्ण मतभेदों का प्रदर्शन किया । एक प्रमुख चुनौती XChIP प्रोटोकॉल25में प्रयुक्त निर्धारण प्रक्रिया द्वारा लक्ष्य प्रोटीन epitopes के संभावित व्यवधान है ।

XChIP में उचित परिणाम प्राप्त करने के लिए क्रोमेटिन बाल काटना प्रक्रिया भी महत्वपूर्ण है । agarose जेल ट्रो द्वारा मूल्यांकन के रूप में 200-500 बीपी का एक टुकड़ा आकार इस NFAT2 चिप प्रोटोकॉल7में इष्टतम होना पाया गया । अनुपयुक्त बाल काटना की कमी में जिसके परिणामस्वरूप शर्तों डीएनए शुरू सामग्री या डीएनए टुकड़े छोटे या बड़े आकार के आम तौर पर जब यह परख प्रदर्शन करने के लिए इष्टतम परिणाम का नेतृत्व । फ्रोजन और गल PBMCs का उपयोग करते समय उप-श्रेष्ठतम बाल काटना भी देखा गया । इसलिए, PBMCs के गल जाने से डीएनए की कम पैदावार हुई है और साथ ही साथ डीएनए के अत्यधिक कतरनी-टुकड़ों में वृद्धि हुई है ।

चिप किट और चिप ग्रेड एंटीबॉडी की एक व्यापक विविधता की उपलब्धता को चुनौती दे रहा है, लेकिन यह भी एक व्यापक संदर्भ में तकनीक का उपयोग करने की संभावना प्रदान करता है । इस प्रकार, प्रतिलेखन कारकों की विविधता अलग सेल प्रकार में जांच की जा सकती है । उदाहरण के लिए, NFAT परिवार के अंय सदस्यों (NFAT1 और NFAT4) हाल ही में चिप३५,३६,३७का उपयोग कर जांच की गई है ।

चिप यहां इस्तेमाल किया किट भी हमारी आवश्यकताओं के अनुरूप संशोधित किया जाना था । पहले, निर्धारण के समय इस्तेमाल एंटीबॉडी द्वारा मांयता प्राप्त epitope के मास्किंग से बचने के लिए और इष्टतम कतरनी सक्षम करने के लिए समायोजित किया गया था । अलग धुलाई चरणों के दौरान कोशिकाओं की हानि को कम करने के लिए lysis और बाल काटना के लिए इस्तेमाल किया बफ़र्स की मात्रा भी बदल गया था । इसके अतिरिक्त, बाल काटना शर्तों 200-500 बीपी की सीमा में डीएनए टुकड़े प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया । के रूप में वे तुलनीय और अधिक लागत प्रभावी साबित कर दिया है कि चिढ़ा अवरोधक और आईजीजी नियंत्रण एंटीबॉडी अंय व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रिएजेंट के साथ विमर्श किया गया । यह डीएनए के वर्षण के साथ हस्तक्षेप के रूप में निर्माता द्वारा प्रदान की वाहक शामिल कदम छोड़ा गया था । अंत में, डीएनए elute करने के लिए इस्तेमाल किया बफर की मात्रा qRT-पीसीआर में इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक पर्याप्त मात्रा उपज के लिए अनुकूलित किया गया था ।

वहां कई अंय विभिंन कंपनियों से उपलब्ध किट है और वहां भी एक किट के बिना चिप प्रदर्शन करने की संभावना है । हालांकि, परीक्षण और स्थापना बहुत चुनौतीपूर्ण हैं, के रूप में वहाँ कई कारकों पर विचार किया जा करने के लिए कर रहे हैं, विभिन्न निर्धारण और कतरनी तरीकों के साथ विश्लेषित कोशिकाओं और प्रोटीन की अनुकूलता की तरह. उल्लेख किट के रूप में यह अच्छी तरह से हमारी प्रयोगशाला में स्थापित किया गया था ।

इस विधि का एक प्रमुख प्रतिबंध अपने सीमित मॉडल जीवों में बड़े पैमाने पर जांच करने के लिए लागू है क्योंकि उचित एंटीबॉडी की पहचान की है या प्रत्येक व्यक्ति प्रतिलेखन कारक के लिए उत्पंन किया है । जीन के विश्लेषण जो केवल निंन स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं, कोशिकाओं की एक छोटी संख्या में या एक प्रतिबंधित समय खिड़की के दौरान भी चिप का उपयोग कर चुनौतीपूर्ण हो सकता है ।

जबकि चिप सोने के मानक बरकरार eukaryotic कोशिकाओं25में अपनी संबंधित लक्ष्य जीन के साथ एक दिया प्रतिलेखन कारक की एक सीधी बातचीत का प्रदर्शन है, वहां अंय तकनीकों के एक नंबर के लिए प्रोटीन और डीएनए के बीच एक बातचीत की जांच है . EMSA सेल lystates24में कम बहुतायत डीएनए बंधन प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक उपयोगी तरीका है । यह भी एक व्यवस्थित डीएनए जांच उत्परिवर्तन विश्लेषण के माध्यम से एक विशेष प्रोटीन के बंधन संबध विशेषताएं इस्तेमाल किया जा सकता है । चिप की तुलना में EMSA का एक प्रमुख लाभ तथ्य यह है कि यह आम तौर पर काफी कम समय लेने के लिए संबंधित परख स्थापित है । डीएनए पुल-नीचे परख, microplate कब्जा और जांच परख और रिपोर्टर परख अंय तकनीकों के लिए प्रोटीन का विश्लेषण-डीएनए23बातचीत कर रहे हैं ।

अधिक हाल के घटनाक्रम यह जीनोम को microarray प्रौद्योगिकी (चिप पर चिप)३८,३९,४० या अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (चिप-Seq के साथ अपने संयोजन के द्वारा व्यापक दृष्टिकोण को चिप परख लागू संभव बना दिया है )४१,४२,४३.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgements

यह काम DFG ग्रांट म्यू 3340/1-1 और ड्यूश Krebshilfe ग्रांट ११११३४ (दोनों M.R.M. को संमानित किया) द्वारा समर्थित किया गया था । उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए हम एलके Malenke को धन्यवाद देते हैं) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 X PBS Sigma Aldrich D8537
1.5 mL tube shaker Themomixer comfort Eppendorf 5355 000.011 Can be substituted with similar instruments
10X Bolt Sample Reducing Agent Thermo Scientific B0009
20X Bolt MES SDS Running Buffer Thermo Scientific B0002
37 % Formaldehyde p.a., ACS Roth 4979.1
4X Bolt LDS Sample Buffer Thermo Scientific B0007
Anti-NFAT2 antibody Alexis 1008505 Clone 7A6
Anti-NFAT2 antibody Cell Signaling 8032S Clone D15F1
Anti-NFAT2 antibody ChIP Grade Abcam ab2796 Clone 7A6
big Centrifuge Eppendorf 5804R Can be substituted with similar instruments
CD19-FITC mouse Anti-human BD Biosciences 555412 Clone HIB19
CD5-PE mouse Anti-human CD5 BD Biosciences 555353 Clone UCHT2
Density gradient medium Biocoll (Density 1,077 g/ml) Merck L 6115
DNA LoBind Tube 1.5 mL eppendorf 22431021
FBS superior Merck S0615
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur Can be substituted with similar instruments
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100X) Thermo Scientific 78440
iBlot 2 Gel Transfer Device Thermo Scientific IB21001
iBlot 2 Transfer Stacks, nitrocellulose, regular size Thermo Scientific IB23001
iDeal ChIp-seq kit for Histones Diagenode C01010059
Ionomycin calcium salt Sigma Aldrich I3909
IRDye 680LT Donkey anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5 mg LI-COR Biosciences 926-68023
IRDye 800CW Goat anti-Mouse IgG (H + L), 0.1 mg LI-COR Biosciences 925-32210
LI-COR Odyssey Infrared Imaging System LI-COR Biosciences B446
LightCycler 480 Multiwell Plate 96, white Roche 4729692001 Can be substituted with other plates in different real-time PCR instruments
Lysing Solution OptiLyse B Beckman Coulter IM1400
M220 AFA-grade water Covaris 520101
M220 Focused-ultrasonicator Covaris 500295
Magnetic rack, DynaMag-15 Magnet Thermo Scientific 12301D Can be substituted with similar instruments
MEM Non-Essential Amino Acids Solution 100X Thermo Scientific 11140050
Microscope Axiovert 25 Zeiss 451200 Can be substituted with similar instruments
microTUBE AFA Fiber Pre-Slit Snap-Cap 6x16mm Covaris 520045
Neubauer improved counting chamber Karl Hecht GmbH &            Co KG 40442012 Can be substituted with similar instruments
NH4 Heparin Monovette Sarstedt 02.1064
Nuclease-free water Promega P1193
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15-well Thermo Scientific NP0323BOX
Odyssey® Blocking Buffer (TBS) 500 mL LI-COR Biosciences 927-50000
Penicillin/Streptomycin 100X Merck A2213
PerfeCTa SYBR Green FastMix Quanta Bio 95072-012
PMA Sigma Aldrich P1585
Primer CD40L promotor region forward Sigma Aldrich 5’-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3’
Primer CD40L promotor region reverse Sigma Aldrich 5’-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3’
Primer IL-2 promotor region forward Sigma Aldrich 5’-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3’
Primer IL-2 promotor region reverse Sigma Aldrich 5’-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3’
Primer LCK promotor region forward Sigma Aldrich 5’-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3’
Primer LCK promotor region reverse Sigma Aldrich 5’-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3’
Rabbit mAb IgG XP Isotype Control Cell Signaling # 3900S Clone DA1E
Real-time PCR instrument Roche LightCycler 480 Can be substituted with similar instruments
Roller mixers Phoenix Instrument RS-TR 5
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement Thermo Scientific 61870010
Safety-Multifly-needle 21G Sarstedt 851638235
SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard Thermo Scientific LC5925
Shaker Duomax 1030 Heidolph Instruments 543-32205-00 Can be substituted with similar instruments
small Centrifuge Thermo Scientific Heraeus Fresco 17 Can be substituted with similar instruments
Sodium Pyruvate Thermo Scientific 11360070
ß-Mercaptoethanol Thermo Scientific 21985023
Tris Buffered Saline (TBS-10X) Cell Signaling #12498
Trypan Blue solution Sigma Aldrich 93595-50ML

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References

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