संयुक्त आनुवंशिक और रासायनिक कैप्सिड संशोधनों के एडीनोवायरस आधारित जीन स्थानांतरण वैक्टर परिरक्षण और लक्ष्यीकरण के लिए

Biology

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Summary

प्रोटोकॉल यहां वर्णित सक्षम बनाता है शोधकर्ताओं ने विशेष रूप से सरल रसायन विज्ञान द्वारा चयनित स्थलों पर एडीनोवायरस capsids संशोधित करने के लिए । परिरक्षण एडीनोवायरस वैक्टर कणों और retargetेड जीन स्थानांतरण वैक्टर उत्पंन किया जा सकता है, और वेक्टर मेजबान बातचीत का अध्ययन किया जा सकता है ।

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Jönsson, F., Hagedorn, C., Kreppel, F. Combined Genetic and Chemical Capsid Modifications of Adenovirus-Based Gene Transfer Vectors for Shielding and Targeting. J. Vis. Exp. (140), e58480, doi:10.3791/58480 (2018).

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Abstract

एडीनोवायरस वैक्टर आनुवंशिक टीकाकरण और oncolytic virotherapy के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं । हालांकि, वे कई अवांछित वेक्टर-मेजबान बातचीत करने के लिए प्रवण हैं, विशेष रूप से vivo डिलीवरी में बाद । यह एक आम सहमति है कि अवांछित वेक्टर द्वारा लगाया सीमाओं-मेजबान बातचीत केवल अगर वेक्टर सतह के परिभाषित संशोधनों को दूर किया जा सकता है प्रदर्शन कर रहे हैं । इन संशोधनों अवांछित बातचीत से कणों की परिरक्षण और नए लाइगैंडों की शुरूआत के द्वारा लक्ष्यीकरण शामिल हैं । यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल का लक्ष्य पाठक को परिरक्षित उत्पन्न करने में सक्षम बनाना है और यदि वांछित हो तो पुनः लक्षित मानव एडीनोवायरस जीन अंतरण वैक्टर या oncolytic वायरस. प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं सिंथेटिक पॉलिमर, कार्बोहाइड्रेट, लिपिड, या अन्य जैविक या रासायनिक moieties के विशिष्ट रासायनिक लगाव द्वारा एडीनोवायरस वेक्टर capsids की सतह को संशोधित करने के लिए सक्षम हो जाएगा । यह संयुक्त आनुवंशिक और रासायनिक कैप्सिड संशोधनों की अत्याधुनिक प्रौद्योगिकी का वर्णन करता है, जो एडीनोवायरस वैक्टर के वितरण में बाधाओं के बारे में समझ और काबू पाने की सुविधा के लिए दिखाया गया है । एक विस्तृत और जैविक रूप से सक्रिय वायरस या वायरस व्युत्पंन वैक्टर के साथ विशिष्ट रासायनिक प्रतिक्रियाओं के प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण कदम का विवरण टिप्पणी प्रदान की जाती है । प्रौद्योगिकी प्रोटोकॉल में वर्णित (स्वाभाविक रूप से अनुपस्थित) विलायक में cysteine अवशेषों के आनुवंशिक परिचय पर आधारित है एडीनोवायरस-व्युत्पंन वैक्टर के छोरों उजागर । इन cysteine अवशेषों एक विशिष्ट रासायनिक जेट कि, उच्च titers के लिए वैक्टर के उत्पादन के बाद कर सकते हैं प्रदान करते हैं, अत्यधिक विशिष्ट और कुशल आबंध पदार्थ वर्गों की एक विस्तृत विविधता से अणुओं के सदिश के लिए रासायनिक युग्मन के लिए शोषण किया जा कणों. महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल को आसानी से विभिंन (गैर thiol आधारित) एडीनोवायरस वेक्टर capsids के रासायनिक संशोधनों के एक व्यापक विविधता प्रदर्शन अनुकूलित किया जा सकता है । अंत में, यह संभावना है कि गैर लिफाफा वायरस आधारित जीन हस्तांतरण एडीनोवायरस के अलावा अन्य वैक्टर इस प्रोटोकॉल के आधार से संशोधित किया जा सकता है.

Introduction

एडिनोवायरस (Ad), परिवार Adenoviridae के सदस्यों, जिनमें से ७० से अधिक प्रकार अब तक पहचान की गई है (http://hadvwg.gmu.edu) गैर-ढंक डीएनए वायरस हैं । hemaglutination गुणों, जीनोम संरचना, और अनुक्रमण परिणाम के आधार पर, ७० विज्ञापन प्रकार सात प्रजातियों में विभाजित किया जा सकता है (मानव एडिनोवायरस A to G)1,2। मानव विज्ञापन जीनोम आकार में ३८ kb है और एक icosahedral nucleocapsid3द्वारा समझाया । उनके बहुतायत के कारण, कैप्सिड प्रोटीन hexon, penton बेस, और फाइबर सभी प्रमुख कैप्सिड प्रोटीन के रूप में भेजा जाता है । सबसे प्रचुर मात्रा में और सबसे बड़ा कैप्सिड प्रोटीन hexon रूपों 20 कैप्सिड पहलुओं, प्रत्येक 12 hexon homotrimers4,5से मिलकर । Penton, प्रत्येक icosahedral एज (शिखर) पर स्थित है, एक Penton आधार के pentamers के होते है और शीर्ष स्पाइक है कि ग्लाइकोसिलेटेड फाइबर ट्रिमर5,6से बनाया गया है के लिए आधार का प्रतिनिधित्व करता है । मूल विज्ञापन सेल प्रविष्टि मूल रूप से दो प्रमुख चरणों से बना है । सबसे पहले, फाइबर घुंडी प्राथमिक रिसेप्टर को बांधता है. प्रजातियों में से विज्ञापन प्रकार में ए, सी, ई, और एफ, यह coxsackie और एडीनोवायरस रिसेप्टर (कार) है । इस बातचीत के सेल सतह के स्थानिक निकटता में विरिअन लाता है, जिससे सेलुलर integrins और RGD के बीच बातचीत की सुविधा penton आधार में आकृति और फलस्वरूप सेलुलर प्रतिक्रियाओं उत्प्रेरण । दूसरा, cytoskeleton में परिवर्तन विरिअन के internalization के लिए सीसा और endosome7के लिए परिवहन । endosome में आंशिक विधानसभा पर, विरिअन कोशिका द्रव्य und अंततः प्रतिकृति के लिए नाभिक के लिए यात्रा करने के लिए जारी की है ।

जबकि विज्ञापन स्थानीय रूप से वितरित किया जा सकता है (जैसे, आनुवंशिक टीकाकरण के लिए), onco के लिए आवश्यक के रूप में खून के माध्यम से प्रणालीगत प्रसव-virotherapy कई बाधाओं का सामना । जबकि खून में घूम, इंजेक्शन virions है मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली की रक्षा प्रणाली मुठभेड़, वायरस के तेजी से बेअसर करने के लिए अग्रणी वैक्टर और विज्ञापन प्रतिपादन प्रणालीगत अनुप्रयोगों में अत्यंत अक्षम वैक्टर आधारित है । । । इसके अलावा, विज्ञापन की प्राकृतिक hepatotropism प्रणालीगत डिलीवरी में हस्तक्षेप करती है और विज्ञापन को उसके नए लक्ष्य कक्षों पर रीडायरेक्ट करने के लिए हल किया जाना चाहिए ।

सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के Germline इनकोडिंग प्राकृतिक आईजीएम एंटीबॉडी तेजी से पहचान और विरिअन8,9की सतह पर अत्यधिक दोहराव संरचनाओं बाँध । इन प्रतिरक्षा परिसरों तो शास्त्रीय और गैर शास्त्रीय मार्ग के पूरक प्रणाली को सक्रिय करने के लिए अग्रणी तेजी से पूरक-virions8के एक बड़े हिस्से की मध्यस्थता बेअसर । विज्ञापन virions के प्रमुख हटाने में जिसके परिणामस्वरूप एक दूसरा मार्ग मैक्रोफेज10 द्वारा मध्यस्थता और तीव्र विषाक्त और haemodynamic दुष्प्रभाव11,12के साथ जुड़ा हुआ है । विशेष रूप से विज्ञापन के मामले में, जिगर में रहने वाले Kupffer कोशिकाओं को बाइंड करने के लिए और phagocytically विशिष्ट मेहतर रिसेप्टर्स के माध्यम से विज्ञापन virions ले, जिससे उन्हें खून से नष्ट13,14,15 . विशिष्ट मेहतर रिसेप्टर्स भी जिगर sinusoidal endothelial कोशिकाओं पर पहचान की गई है (एलएसई कोशिकाओं)16, और एलएसई कोशिकाओं को भी वेक्टर उंमूलन17में योगदान करने लगते हैं, लेकिन किस हद तक अभी भी स्पष्टीकरण की जरूरत है । इसके अलावा, कुछ विज्ञापन प्रकार और उनके व्युत्पंन वैक्टर कुशलतापूर्वक मानव एरिथ्रोसाइट्स18 जो वे कार या पूरक रिसेप्टर CR119के माध्यम से बांध द्वारा तनहा हैं । ध्यान रहे, इस sequestering तंत्र का अध्ययन माउस मॉडल सिस्टम में मानव एरिथ्रोसाइट्स के विपरीत नहीं किया जा सकता, माउस एरिथ्रोसाइट्स कार व्यक्त नहीं करते हैं ।

विज्ञापन के लिए जोखिम के बाद या तो विज्ञापन के साथ पिछले संक्रमण के लिए या प्रणालीगत अनुप्रयोगों में पहली डिलीवरी के बाद विज्ञापन वैक्टर के प्रभावी उपयोग के लिए एक और बाधा बढ़ाने के लिए निवेश के बाद अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा उत्पंन विशिष्ट विरोधी विज्ञापन एंटीबॉडी, और वे में चोरी हो जाना चाहिए कुशल प्रणालीगत वितरण ।

अंत में, कुछ विज्ञापन प्रकार के मजबूत hepatotropism (Ad5 सहित) गंभीर रूप से प्रणालीगत चिकित्सा में विज्ञापन के आवेदन में बाधा डालता है । hepatocyte transduction में जिसके परिणामस्वरूप यह tropism विज्ञापन hexon प्रोटीन20,21,22के साथ fx के संपर्क द्वारा मध्यस्थता रक्त जमावट कारक एक्स (fx) के लिए विरिअन के उच्च समानता के कारण है । FX हेपैटोसाइट्स20,23,24,25की सतह पर हेपरिन सल्फेट glycans (HSPGs) को विरिअन पुल । इस बातचीत के लिए एक महत्वपूर्ण कारक के लिए N की विशिष्ट सीमा और हे-sulfation जिगर की कोशिकाओं में HSPGs के24, जो अंय प्रकार के सेल पर HSPGs से अलग है लगता है । इस FX-मध्यस्थता मार्ग के अलावा, हाल के अध्ययनों से आगे अभी तक पहचान नहीं रास्ते का सुझाव है कि हेपैटोसाइट्स26,27,28के विज्ञापन transduction में परिणाम.

हाल ही में, यह दिखाया गया है कि FX केवल विज्ञापन के hepatocyte transduction में शामिल नहीं है, लेकिन यह भी बाध्यकारी द्वारा, विरिअन प्रणाली26पूरक द्वारा बेअसर के खिलाफ वायरस कण ढाल । hepatocyte transduction की कमी FX बंधन को रोकने के द्वारा, इसलिए, जंमजात प्रतिरक्षा प्रणाली के माध्यम से बढ़ती विज्ञापन बेअसर के अवांछित पक्ष प्रभाव पैदा होता है ।

वैक्टर और मेजबान जीवों के बीच जटिल बातचीत का एक गहरा ज्ञान इसलिए प्रणालीगत अनुप्रयोगों है कि मेजबान जीव द्वारा लगाया बाधाओं को दरकिनार के लिए और अधिक कुशल वैक्टर विकसित करने के लिए आवश्यक है ।

एक रणनीति है कि मूल रूप से चिकित्सकीय प्रोटीन के लिए इस्तेमाल किया गया है विज्ञापन वैक्टर के लिए अनुकूलित किया गया है कम से आंशिक रूप से ऊपर वर्णित बाधाओं को दूर । Antigenicity और चिकित्सकीय प्रोटीन यौगिकों के immunogenicity के लिए युग्मन से पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी)29,30कम किया जा सकता है । इसलिए, इस तरह के खूंटी या पाली के रूप में पॉलिमर के युग्मन आबंध [N-(2-hydroxypropyl) methacrylamid] (pHPMA) कैप्सिड सतह को ढाल वेक्टर अवांछित वेक्टर से मेजबान बातचीत । सामांयतः, बहुलक युग्मन लक्ष्य lysine पक्ष अवशेषों कि बेतरतीब ढंग से कैप्सिड सतह पर वितरित कर रहे है से ε-अमीन समूहों । समाधान में वेक्टर कणों, संलग्न पॉलिमर के हाइड्रोफिलिक प्रकृति के कारण, एक स्थिर पानी खोल कि प्रतिरक्षा कोशिका मान्यता या एंजाइमी क्षरण का खतरा कम कर देता है से घिरा हुआ है । इसके अलावा, PEGylated विज्ञापन वैक्टर विरोधी hexon एंटीबॉडी द्वारा बेअसर से बचने के लिए दिखाए गए इन विट्रो में और पूर्व में प्रतिरक्षित चूहों में vivo31. आनुवंशिक कैप्सिड संशोधनों के विपरीत, पॉलिमर के रासायनिक युग्मन उत्पादन और शोधन के बाद किया जाता है, न केवल पारंपरिक उत्पादक कोशिकाओं और उच्च titer वेक्टर शेयरों के उत्पादन के उपयोग के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी एक साथ के लिए कैप्सिड सतह पर अमीनो एसिड की हजारों की संशोधन । हालांकि, अमीन निर्देशित परिरक्षण पूरे कैप्सिड सतह भर में बेतरतीब ढंग से होता है, उच्च heterogeneities में जिसके परिणामस्वरूप और विशिष्ट capsomers के संशोधन के लिए अनुमति नहीं है. इसके अलावा, बड़े बहुलक moieties लाभकारी प्रभाव के लिए आवश्यक वायरस३२गतिविधि ख़राब ।

इन सीमाओं को दूर करने के लिए Kreppel एट अल. ३३ वेक्टर पुनः के लिए एक geneti-रासायनिक अवधारणा और de-लक्ष्यीकरण पेश किया । Cysteines आनुवंशिक रूप से फाइबर हाय-पाश३३, प्रोटीन IX३४, और hexon३५,३६की तरह विलायक उजागर पदों पर वायरस कैप्सिड में पेश किया गया । हालांकि स्वाभाविक रूप से नहीं होने वाली, cysteine-असर विज्ञापन वैक्टर सामांय उत्पादक कोशिकाओं में उच्च titers में उत्पादन किया जा सकता है । महत्वपूर्ण बात, कुछ capsomers में cysteines के सम्मिलन और एक एकल capsomer के भीतर विभिन्न स्थितियों में thiol समूह के अत्यधिक विशिष्ट संशोधनों के लिए अनुमति देता है-प्रतिक्रियाशील moieties. इस geneti-रासायनिक दृष्टिकोण विज्ञापन वेक्टर डिजाइन में कई बाधाओं को दूर करने के लिए दिखाया गया है । के संयोजन के लिए अमीन-आधारित PEGylation के निशान और thiol-आधारित युग्मन कैल्सीटोनिन के लिए फाइबर घुंडी उच्च पाश साबित किया गया है करने के लिए सफलतापूर्वक पुनः लक्षित संशोधित विज्ञापन वैक्टर कार की कमी कोशिकाओं को३३। चूंकि hexon सबसे अवांछित बातचीत में शामिल है (एंटीबॉडी बेअसर, रक्त जमावट कारक FX), thiol आधारित संशोधन रणनीतियों को भी hexon के लिए लागू किया गया । hexon के HVR5 के लिए युग्मन छोटे खूंटी moieties Ad वेक्टर कणों FX की उपस्थिति में SKOV-3 कोशिकाओं transduce करने के लिए रोका, जबकि बड़े खूंटी moieties बढ़ hepatocyte transduction14,३५. विज्ञापन वेक्टर कणों फाइबर घुंडी में उत्परिवर्तनों को लेकर कार बाध्यकारी बाधा और HVR7 में FX के बाध्यकारी बाधा (और स्थिति के लिए HVR1 में डाला cysteines असर-विशिष्ट PEGylation) एंटीबॉडी से बचने के लिए दिखाए गए थे-और पूरक-मध्यस्थता बेअसर, साथ ही मेहतर रिसेप्टर-मध्यस्थता infectivity की हानि के बिना ले । दिलचस्प है, प्राकृतिक FX ढाल की कमी के बावजूद, PEGylation फिर खूंटी आकार३६के एक समारोह के रूप में हेपैटोसाइट्स के transduction में सुधार हुआ । हालांकि, यह दिखाया गया है कि आबंध ढाल intracellular तस्करी प्रक्रियाओं पर असर पड़ता है । Prill एट अल. अपरिवर्तनीय बनाम pHPMA पर आधारित ढाल की तुलना में और प्रदर्शन किया है कि न तो ढाल और न ही सह बहुलक चार्ज के मोड सेल प्रविष्टि पर असर पड़ा था, लेकिन कण को प्रभावित नाभिक की तस्करी । सकारात्मक आरोप लगाया pHPMA सह के साथ एक प्रतिक्रियाशील ढाल को रोजगार कण के लिए कणों की तस्करी के लिए अनुमति दी पॉलिमर, इन विट्रो में और vivo३७में विज्ञापन वैक्टर के उच्च transduction क्षमता को बनाए रखने.

संक्षेप में, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि, यहां तक कि इस धारणा है कि सभी वेक्टर-मेजबान बातचीत जाना जाता था और माना जाता है के तहत, अत्यधिक कैप्सिड सतह संशोधनों के लिए प्रणालीगत वेक्टर डिलिवरी के साथ जुड़े बाधाओं को दूर करने के लिए आवश्यक हैं ।

यहां हम एडीनोवायरस वेक्टर capsids के परिरक्षण और/या एडीनोवायरस वेक्टर कणों और एडीनोवायरस-आधारित oncolytic वायरस के पुनर्लक्षितीकरण के लिए साइट-विशिष्ट रासायनिक संशोधनों को निष्पादित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इस तकनीक की अवधारणा चित्रा 1में उल्लिखित है । यह सिंथेटिक पॉलिमर के आबंध लगाव द्वारा अवांछित बातचीत से कुछ कैप्सिड क्षेत्रों की परिरक्षण की अनुमति देता है । इसी के साथ, यह लाइगैंडों को संलग्न करने और परिरक्षण और लक्ष्यीकरण संयोजित करने का एक साधन भी प्रदान करता है. सरल रसायन विज्ञान का प्रयोग, प्रयोगकर्ता पेप्टाइड्स सहित अणुओं की एक विस्तृत विविधता के साथ एडीनोवायरस वेक्टर सतह को संशोधित करने में सक्षम हो जाएगा covalently/प्रोटीन, कार्बोहाइड्रेट, लिपिड, और अन्य छोटे अणुओं. इसके अलावा, प्रोटोकॉल जैव सक्रिय वायरस के रासायनिक संशोधन के लिए एक सामांय अवधारणा प्रदान करता है, उनके जैविक अखंडता और गतिविधि के रखरखाव के अंतर्गत वैक्टर व्युत्पंन ।

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Protocol

नोट: निंनलिखित में, एक विज्ञापन वेक्टर के geneti-रासायनिक PEGylation के लिए एक प्रोटोकॉल के विस्तार के लिए वर्णित है । खूंटी moiety के विशिष्ट युग्मन सक्षम करने के लिए, एक Ad5 वेक्टर पहले से आनुवंशिक रूप से hypervariable पाश में hexon प्रोटीन में एक cysteine अवशेषों को शुरू करने के द्वारा संशोधित किया गया था के रूप में एक पिछले प्रकाशन३६में वर्णित है, और एक maleimide सक्रिय खूंटी यौगिक युग्मन यौगिक के रूप में प्रयोग किया जाता है ।

1. CsCL कदम ढाल द्वारा वेक्टर शुद्धि के लिए बफ़र्स की तैयारी

  1. ५० mm HEPES (४.७६ g/400 एमएल) और १५० mm NaCl (३.५०४ ग्राम/400 एमएल) को जोड़कर एडीनोवायरस बफर (Ad-बफ़र) की ४०० मिलीलीटर को डबल-आसुत जल (ddH2O) में तैयार करें । इस बफ़र के ३५० मिलीलीटर निंन तीन Ad-बफ़र वेरिएंट तैयार करने के लिए आवश्यक है ।
    1. एक प्रकार: विज्ञापन के १५० मिलीलीटर समायोजित-NaOH के साथ ७.६ पीएच के लिए बफर ।
    2. संस्करण B: 10 मिमी TCEP की एक अंतिम एकाग्रता जोड़ें [tris (2-carboxyethyl) phosphine), ०.१४३ g] करने के लिए ५० मिलीलीटर और इसे समायोजित करने के लिए पीएच ७.२ एचसीएल के साथ.
    3. संस्करण C: ०.५ mM TCEP (०.०२२ g) की १५० मिलीलीटर के लिए अंतिम एकाग्रता जोड़ें और यह एचसीएल के साथ पीएच ७.२ करने के लिए समायोजित करें ।
    4. ddH2ओ और विश्लेषणात्मक ग्रेड रसायनों में बफर तैयार करते हैं । CsCl बफ़र्स तैयार करने के लिए भिन्न A और भिन् न C के प्रत्येक १०० मिलीलीटर का उपयोग करें (देखें चरण १.२ और १.३; प्रत्येक के लिए आवश्यक) CsCl चरण ग्रैडिएंट (देखें चरण 3.2.6. and 3.2.18)
  2. CsCl चरण ग्रैडिएंट बफ़र तैयार कर रहा है (ρCsCl = १.४१ g/cm3) Ad-बफ़र में
    नोट: यह बफ़र दो भिन्न रूपांतरों में आवश्यक हो जाएगा:
    1. ५० मिलीलीटर ट्यूबों में CsCl के ठीक २७.४२ ग्राम के दो aliquots वजन ।
    2. ρCsCl = 1.41/TCEP बफर: हल CsCl में ४० एमएल के संस्करण सी की Ad-बफ़र ।
    3. ρCsCl = १.४१ बफर: समाधान CsCl में ४० मिलीलीटर की एक विज्ञापन बफर की ।
    4. जांच करें, और यदि आवश्यक हो, तो HCl के साथ पीएच को समायोजित करें । इसी विज्ञापन बफर वैरिएंट के साथ ठीक ५० मिलीलीटर तक भरें । सबसे अच्छा जुदाई परिणाम प्राप्त करने के लिए, सटीक CsCl एकाग्रता और पीएच महत्वपूर्ण हैं ।
    5. प्रत्येक ग्रैडिएंट बफ़र के 1 मिलीलीटर (१.४१ g) का वजन करके घनत्व (CsCl content) की जांच करें ।
  3. CsCl चरण ग्रैडिएंट बफ़र तैयार कर रहा है (ρCsCl = १.२७ g/cm3) Ad-बफ़र में
    नोट: यह बफ़र दो भिन्न रूपांतरों में आवश्यक है:
    1. ५० मिलीलीटर ट्यूबों में CsCl के ठीक १८.४६ ग्राम के दो aliquots वजन ।
    2. ρCsCl = 1.27/TCEP बफर: हल CsCl के ४० मिलीलीटर में Ad-बफ़र के संस्करण सी ।
    3. ρCsCl = १.२७ बफर: समाधान CsCl में ४० मिलीलीटर की एक विज्ञापन बफर की ।
    4. जांचें, और यदि आवश्यक हो, तो HCl के साथ पीएच समायोजित करें । अंत में, इसी विज्ञापन बफर संस्करण के साथ ठीक ५० मिलीलीटर तक भरें । सबसे अच्छा जुदाई परिणाम प्राप्त करने के लिए, सटीक CsCl एकाग्रता और पीएच महत्वपूर्ण हैं ।
    5. प्रत्येक ग्रैडिएंट बफ़र के 1 मिलीलीटर (१.२७ g) का वजन करके घनत्व (CsCl content) की जांच करें ।
  4. सभी बफ़र्स (विज्ञापन बफ़र्स और CsCl कदम ढाल बफ़र्स) निस्पंदन द्वारा (०.४५ µm मेष ताकना आकार का उपयोग कर) बाँझ बोतलों में निष्फल ।
  5. नसबंदी के बाद, TCEP के ऑक्सीकरण को रोकने के लिए, संतृप्त और के बारे में 30 एस के लिए आर्गन गैस के साथ sparging द्वारा आर्गन के साथ TCEP युक्त बफ़र्स ओवरले. आर्गन गैस लागू करते समय केवल बाँझ उपकरणों (जैसे, बाँझ पिपेट युक्तियाँ) का उपयोग करने के लिए ध्यान रखना, और आर्गन रोना अनुमति देने के लिए काफी बड़े बोतलों का उपयोग करें.
    नोट: सभी बफ़र्स तैयार किया जाना चाहिए ताजा और प्रकाश से सुरक्षित और कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है (विशेष रूप से CsCl चरण ग्रेडिएंट बफ़र्स जो केवल कुछ दिनों के लिए रखा जाना चाहिए) ।

2. युग्मन Moieties: भंडारण और तैयारी

नोट: Moeities युग्मन के लिए इस्तेमाल किया cysteines thiol-प्रतिक्रियाशील समूहों को सहन करने की जरूरत है । Maleimide-सक्रिय यौगिकों आनुवंशिक रूप से पेश cysteines के साथ स्थिर thioether बांड फार्म होगा । वैकल्पिक रूप से, ऑर्थो-pyridyldisulfide (OPSS)-सक्रिय यौगिकों का इस्तेमाल किया जा सकता है, जो वेक्टर कणों और युग्मन moiety के बीच प्रतिक्रियाशील डाइसल्फ़ाइड पुल बनाते हैं । Lyophilized malPEG-७५० के रूप में अच्छी तरह के रूप में सबसे अधिक अंय युग्मन एजेंट hydrolysis के प्रति संवेदनशील है और-८० डिग्री सेल्सियस पर Lyophilized चूर्ण के रूप में सूखी संग्रहित किया जाना चाहिए ।

  1. शीशियों के गल पर पानी संघनित्र के निर्माण को रोकने के लिए, बड़े ट्यूबों में शीशियों की दुकान (जैसे, ५० मिलीलीटर ट्यूब) सिलिका जेल मोतियों की एक तकिया से भरा है । एक पर्याप्त बड़े कंटेनर में इन ट्यूबों की दुकान भी एक सिलिका जेल मनका तकिया से भरा ।
  2. कसकर प्रत्येक ट्यूब और कंटेनर बंद करने से पहले, आर्गन गैस के साथ विनिमय हवा. इस ओपन ट्यूबों और कंटेनरों को एक desiccator में रखकर हासिल किया जा सकता है, जिसके बाद आर्गन गैस से हवा निकालकर और बदलकर रख सकते हैं । चूंकि आर्गन गैस हवा की तुलना में भारी है, ट्यूबों और कंटेनरों आर्गन गैस के साथ भर रहे हैं और अब एक दूसरे में रखा जा सकता है, प्रत्येक ढक्कन कसकर बंद के साथ.
  3. पर कंटेनरों की दुकान-८० ° c ।
  4. गल जाने पर, कंटेनरों को एक desiccator में सिलिका मोतियों पर रखें और धीरे से कमरे के तापमान तक उन्हें गर्म करें, फिर कंटेनर को खोलें ।
  5. जब एक युग्मन प्रतिक्रिया प्रदर्शन, हौसले से उपयुक्त विलायक में जरूरत के युग्मन सब्सट्रेट की राशि का समाधान । ध्यान रखना नहीं अंतिम युग्मन प्रतिक्रिया के लिए युग्मन समाधान के 10% से अधिक जोड़ने के लिए, खासकर अगर DMF या DMSO युग्मन सब्सट्रेट के लिए विलायक के रूप में प्रयोग किया जाता है ।

3. विज्ञापन वैक्टर प्रवर्धन, शुद्धिकरण और रासायनिक संशोधन:

  1. विज्ञापन वैक्टर का प्रवर्धन
    नोट: निम्न चरणों का पालन स्थानीय जैविक सुरक्षा नियमों के अनुसार एक सुरक्षा कैबिनेट का उपयोग किया जाना चाहिए ।
    1. Transfect एक प्रतिकृति कमी ∆ E1 विज्ञापन सदिश युक्त एक (या कई) आनुवंशिक रूप से cysteine अवशेषों (ओं) HEK २९३ कोशिकाओं में Kratzer और Kreppel३८द्वारा वर्णित के रूप में पेश किया ।
    2. ३८प्रोटोकॉल के अनुसार, एक अंतिम preparative संक्रमण 15-20 बड़े (15 सेमी) सेल कल्चर प्लेट्स (लगभग 1-2 x 107 कोशिकाओं/प्लेट) के लिए अनुक्रमिक reinfection द्वारा वेक्टर बढ़ाना ।
      नोट: इष्टतम रूप से, अंतिम reinfection समय पर किया जाना चाहिए ताकि कोशिकाओं शुद्धि और संशोधन के प्रदर्शन की सुबह पर पूर्ण cytopathic प्रभाव (सीपीई) दिखाएँ ( चित्रा 2देखें).
    3. अंतिम प्रवर्धन कदम के बाद, विज्ञापन बफर में resuspend कोशिकाओं + 10 मिमी TCEP (संस्करण बी)-८० डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है; हालांकि, वेक्टर कणों की इष्टतम उपज के लिए, एक तत्काल अनुवर्ती सेल lysis और वेक्टर शुद्धिकरण और संशोधन की सिफारिश की है ।
  2. विज्ञापन वैक्टर का शुद्धिकरण और रासायनिक संशोधन
    नोट: वैक्टर की शुद्धि एडीनोवायरस शुद्धि प्रोटोकॉल में वर्णित के अनुसार किया जाता है३८लेकिन गैर ऑक्सीकरण शर्तों के तहत । कोशिका कटाई और lysis के साथ ही वेक्टर शुद्धिकरण और रासायनिक संशोधन एक दिन के भीतर किया जा सकता है । फसल और लाइसे पहले वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार संक्रमित कोशिकाओं३८.
    1. प्लेटों परिमार्जन और 200-500 मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों के लिए supernatant स्थानांतरित करके कोशिकाओं को इकट्ठा ।
    2. ४०० x g पर 10 मिनट के लिए सेल समाधान स्पिन
    3. विज्ञापन के 4 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend-बफर + 10 मिमी TCEP (पीएच ७.२) (संस्करण बी) और एक बाँझ ५० एमएल ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । यदि सेल यील्ड कम है या केवल एक कमजोर सीपीई प्रेरित किया गया था, यह 2 मिलीलीटर में resuspend.
    4. (तरल नाइट्रोजन) और गल (एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी में स्नान) में ठंड के 3 चक्र द्वारा वेक्टर बचाव ।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर ५,००० x g पर 10 मिनट के लिए स्पिन ।
    6. जबकि केंद्रापसारक, दो समान CsCl कदम ढाल तैयार:
      1. सबसे पहले, निचले चरण के रूप में, ultracentrifuge ट्यूबों में १.४१ g/cm3 ρCsCl के विज्ञापन-बफर + ०.५ mM TCEP (pH ७.२, वैरिएंट सी) में 3 मिलीलीटर जोड़ें । ऊपरी चरण लोड करने से पहले ट्यूब पर निचले चरण के स्तर को चिह्नित करें ।
      2. ध्यान से १.२७ g/cm3 ρCsCl के विज्ञापन बफर में 5 मिलीलीटर के ऊपरी चरण ढेर + ०.५ mM TCEP (पीएच ७.२, संस्करण सी) बहुत धीरे से pipetting कम चरण पर ट्यूब की दीवारों के साथ 5 मिलीलीटर की मात्रा ।
        नोट: के बाद से TCEP के एक उच्च एकाग्रता युग्मन के दौरान malPEG के maleimide अवशेषों के साथ प्रतिक्रिया-७५० सकता है और कम युग्मन दक्षता के लिए सीसा, CsCl कदम ढाल द्वारा शुद्धि के लिए पहले से ही एक कम TCEP एकाग्रता के तहत प्रदर्शन की जरूरत है ।
    7. supernatant को CsCl ग्रेडिएंट पर लोड करें [या तो समान रूप से supernatant को दोनों ग्रेडिएंट पर विभाजित करें या कम वेक्टर यील्ड के मामले में (ऊपर देखें), supernatant को केवल एक स्तंभ पर लोड करे], और दोनों ग्रेडिएंट को समान रूप से विज्ञापन बफ़र के साथ शीर्ष पर भरें + 10 mM TCEP (pH 7 .2, संस्करण B) ।
    8. विपरीत ट्यूबों के वजन को समायोजित करने के लिए एक ०.० g वजन अंतर ।
    9. 4 ° c पर १७६,००० x g पर 2 ज के लिए Ultracentrifuge ।
    10. एक क्लैंप के साथ, एक स्टैंड के लिए ultracentrifugation ट्यूब को ठीक, निचले चरण स्तर निशान के आसपास क्षेत्र छोड़कर सुलभ । ट्यूब के ऊपर gooseneck लैंप लगाएं । निशान के चारों ओर, निचले और ऊपरी चरणों के बीच सीमा पर, एक अलग बैंड (वेक्टर virions) दिखाई जानी चाहिए (आंकड़ा 3सी 3) ।
    11. एक सुई और एक सिरिंज में वेक्टर बैंड आकांक्षी के साथ ट्यूब puncturing द्वारा वैक्टर लीजिए. स्थानांतरण एक 15 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए वेक्टर virions एकत्र ।
      नोट: विज्ञापन वेक्टर बैंड के ऊपर कमजोर बैंड अपूर्ण वेक्टर कणों होते है और आकांक्षा के लिए बचा जाना चाहिए । सेल मलबे और ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) EGFP-व्यक्त विज्ञापन वैक्टर ultracentrifuge ट्यूब के ऊपरी हिस्से में एकत्र करेगा ( चित्र 3 ए और बी) देखें । यह और निंनलिखित कदम युग्मन (कदम 3.2.16) को तेजी प्रदर्शन किया जाना चाहिए, के रूप में वैक्टर अब कम TCEP एकाग्रता के कारण संबंध डाइसल्फ़ाइड को समझदार हैं ।
    12. युग्मन सब्सट्रेट की राशि की गणना करने के लिए वेक्टर तैयारी में सभी cysteine अवशेषों के लिए सब्सट्रेट की कुशल पूर्ण बंधन के लिए आवश्यक, माप आयुध डिपो२६०:
      1. Kratzer और Kreppel द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार३८, भंवर एकत्र वेक्टर virions के 10 µ एल का एक मिश्रण, विज्ञापन बफर के ८९ µ एल, और 10% µ के 1 एसडीएस एल । एक कोरा जांच के रूप में, भंवर ९९ µ एल के विज्ञापन बफर और 1 µ एल के 10% एसडीएस ।
      2. virions को स्वभाव करने के लिए, 10 मिनट के लिए ५६ ° c दोनों पर मशीन ।
      3. २६०आयुध डिपो का निर्धारण ।
      4. गणना भौतिक सदिश titer प्रति µ l का उपयोग कर निंन समीकरण: आयुध डिपो२६० कमजोर पड़ने का एक्स फैक्टर x Empirically निर्धारित विलुप्त होने विज्ञापन के गुणांक (१.१ x 109 वेक्टर कण = 1 आयुध डिपो२६० इकाई/µ l) । इसलिए, 1:10 पतला एक सदिश के १.३६ के एक मापा आयुध डिपो२६० , करने के लिए गणना करेंगे: १.३६ x 10 x १.१ x 109 = लगभग १.५ x 10 10 वेक्टर कणों/µ एल
        नोट: यह titer केवल एक मोटा अनुमान है; हालांकि, यह stoichiometric परिकलन निम्न में उल्लिखित के लिए पर्याप्त सटीक है ।
    13. एक cysteine का परिचय द्वारा संशोधित प्रोटीन पर निर्भर करता है, एक कुशल युग्मन प्रतिक्रिया के लिए युग्मन सब्सट्रेट (ग्राम में) की राशि का निर्धारण, निम्न सामान्य समीकरण के अनुसार: वायरस titer एक्स मात्रा x cysteines एक्स की संख्या moiety x के अतिरिक्त moiety के आण्विक वजन/६,०२२ x 1023 = युग्मन सब्सट्रेट के ग्राम ।
      नोट: इस समीकरण में: 1) वायरस titer titer/µ एल, ऊपर वर्णित के रूप में२६० आयुध डिपो द्वारा निर्धारित, 2) µ में मात्रा के लिए मात्रा खातों की कामना की सदिश युग्मन प्रतिक्रिया में प्रयुक्त, 3) cysteines की संख्या में प्रोटीन की संख्या है जिसमें cysteine अवशेषों सदिश कण के अनुसार पेश किया गया था, 4) moiety के अतिरिक्त एक कुशल युग्मन प्रतिक्रिया (50x) के लिए आवश्यक moiety अतिरिक्त का कारक है, और 5) moiety के आणविक वजन डीए के रूप में पेश किया जाना चाहिए (नहीं केडीए).
    14. नए सिरे से उपयुक्त विलायक में की जरूरत यौगिक (या व्यवहार्य राशि) की राशि का समाधान ।
      नोट: के रूप में युग्मन सब्सट्रेट की राशि की जरूरत कम है और मुश्किल के लिए वजन लेकिन महंगा है, संभव यौगिक की न्यूनतम राशि वजन और युग्मन प्रतिक्रिया करने के लिए आवेदन के लिए एक उपयुक्त एकाग्रता में इसे भंग.
    15. एक उचित आकार ट्यूब (जैसे, 2 मिलीलीटर ट्यूब) के लिए वेक्टर समाधान स्थानांतरण और युग्मन यौगिक स्टॉक समाधान के लिए सदिश की गणना की मात्रा में जोड़ें ।
    16. धीरे कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए उपरि रोटेशन से समाधान मिश्रण ।
    17. 6 एमएल विज्ञापन बफर (पीएच ७.६, एक संस्करण) के साथ कुल मात्रा को वेक्टर समाधान भरें ।
      नोट: यह चरण किया जाना चाहिए समाधान करने से पहले यह सुनिश्चित करें कि वेक्टर समाधान, जो अभी भी पहले चरण ग्रैडिएंट से CsCl शामिल करने के लिए चरण ग्रैडिएंट करने के लिए लागू है, १.२७ g/एमएल के नीचे घनत्व है ।
    18. एक दूसरे CsCl बैंडिंग कदम में, वेक्टर प्रतिक्रियात्मक युग्मन moiety से शुद्ध:
      1. प्रत्येक के लिए निम्न चरणों का पालन करके दो बराबर CsCl चरण ग्रेडिएंट तैयार करें: 1) लोअर चरण: १.४१ g/cm3 ρCsCl के विज्ञापन में 3 मिलीलीटर-बफर (पीएच ७.६, संस्करण ए), 2) ऊपरी चरण लोड करने से पहले ट्यूब पर निचले चरण के निशान स्तर, और 3) ऊपरी चरण : विज्ञापन बफर (पीएच ७.६, एक संस्करण) में १.२७ g/cm3 ρCsCl की 5 मिलीलीटर ।
        नोट: युग्मन जगह ले ली है के बाद, TCEP के बिना बफ़र्स उपयोग किया जाता है, के रूप में कोई मुक्त thiol समूहों अब वेक्टर capsids पर मौजूद होना चाहिए ।
      2. supernatant को CsCl ग्रेडिएंट पर लोड करें और दोनों ग्रैडिएंट को समान रूप से विज्ञापन-बफ़र (pH ७.६, A) के साथ शीर्ष पर भरें ।
      3. विपरीत ट्यूबों के भार को समायोजित करने के लिए एक ०.० g वजन अंतर ।
    19. 4 ° c पर १७६,००० x g पर 2 ज के लिए Ultracentrifuge ।
    20. शीघ्र ही ultracentrifugation के अंत से पहले, equilibrate एक पीडी-10 कॉलम 5 विज्ञापन के 5 मिलीलीटर के साथ बार-बफर (पीएच ७.६, एक संस्करण) ।
    21. चरण 3.2.10 में किया गया के रूप में, निचले चरण स्तर निशान सुलभ आसपास के क्षेत्र छोड़ने खड़े करने के लिए ultracentrifugation ट्यूब को ठीक करें । ट्यूब के ऊपर gooseneck लैंप लगाएं । फिर, निचले और ऊपरी चरणों के बीच की सीमा के आसपास, एक अलग बैंड (वेक्टर virions) दृश्यमान होना चाहिए (चित्रा 3सी) ।
    22. एक सुई और एक सिरिंज में वेक्टर बैंड आकांक्षी के साथ ट्यूब puncturing द्वारा वैक्टर ले लीजिए, और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए वेक्टर हस्तांतरण । ध्यान रखना दोनों ढाल ट्यूबों के virions एक साथ एक २.५ मिलीलीटर कुल मात्रा या उससे कम के रूप में इकट्ठा । यदि एक छोटी मात्रा एकत्र की है, तो विज्ञापन बफर (एक संस्करण) के साथ एक २.५ मिलीलीटर कुल मात्रा प्राप्त करने के लिए भरें ।
    23. equilibrated पीडी-कॉलम पर २.५ मिलीलीटर लोड । प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
    24. कॉलम पर विज्ञापन बफर के 3 मिलीलीटर (एक संस्करण) जोड़ें और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा (शुद्ध वेक्टर virions युक्त) ।
    25. ग्लिसरॉल जोड़ें (३३३ µ एल) 10% की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए और उपयुक्त aliquots (जैसे, ४०० µ एल प्रत्येक) में विभाजित है, और आयुध डिपो२६० माप द्वारा aliquot निर्धारण के लिए 20 µ एल के एक titer शामिल हैं ।
    26. -८० डिग्री सेल्सियस पर वेक्टर समाधान स्टोर ।
    27. titer के ओडी२६० को मापने के द्वारा सदिश का निर्धारण 20 µ l वेक्टर समाधान, ७९ µ l के Ad-बफ़र (संस्करण A), और 1 µ l के 10% एसडीएस चरण 3.2.12 में वर्णित के रूप में । एक रिक्त के रूप में, का उपयोग करें ७९ µ एल के Ad-बफर (संस्करण a), 10 µ l का 10% ग्लिसरॉल, और 1 µ l के 10% एसडीएस.
    28. की गणना सदिश titer के रूप में: आयुध डिपो२६० एक्स कमजोर पड़ने के कारक x १.१ x 109 वेक्टर कणों/µ एल
      चरण 3.2.27 में तैयार के रूप में, गणना: आयुध डिपो२६० x 5 x १.१ x 109 वेक्टर कणों/µ l

4. एसडीएस द्वारा युग्मन का सत्यापन-PAGE:

नोट: यदि यौगिकों पर्याप्त उच्च आणविक भार के साथ विज्ञापन virions युग्मन के लिए उपयोग किया जाता है, युग्मन polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-पृष्ठ) द्वारा सत्यापित किया जा सकता है । सफल युग्मन फिर संशोधित विज्ञापन विरिअन प्रोटीन के अनुरूप प्रोटीन बैंड की एक पारी में परिणाम चाहिए, unmodified विज्ञापन विरिअन में प्रोटीन की तुलना में ( चित्रा 4देखें) ।

  1. सदिश की गणना titer (step 3.2.28) के अनुसार, पृथक 1-2 x 1010 वेक्टर कणों द्वारा एसडीएस-PAGE (8%) ।
  2. जेल की चांदी से दाग-धब्बे का विकास जेल३९ भी कमजोर प्रोटीन बैंड का पता लगाने के लिए:
    1. चांदी धुंधला के लिए तैयार बफ़र्स (१०० मिलीलीटर बफ़र के लिए आवश्यक मात्रा कोष्ठक में संकेत कर रहे हैं):
      1. ddH2ओ, ५०% MeOH (५० मिलीलीटर १०० MeOH), 12% AcOH (12 मिलीलीटर की १००% AcOH), और ०.०१८५% HCHO (५० µ एल के ३७% HCHO) को मिलाकर बफर 1 तैयार करें ।
      2. ५०% ेतोः (१००% ेतोः की ५० मिलीलीटर) को ddH2O के ५० मिलीलीटर में जोड़कर बफर 2 तैयार करें ।
      3. ०.१२७ g/L ना2एस23 (१२.७४४ मिलीग्राम) ddH2ओ के १०० मिलीलीटर को जोड़कर बफर 3 तैयार करें ।
      4. 2 g/L AgNO3 (०.२ g) और ०.०१८५% HCHO (५० µ L की ३७% HCHO) को १०० मिलीलीटर से ddH2ओ जोड़कर बफर 4 तैयार करें ।
      5. ६० g/l ना2CO3 (6 g), ०.०१८५% HCHO (५० µ L की ३७% HCHO), और २.५ mg/l ना 2 S2o3 (०.२५६ मिलीग्राम) को जोड़कर बफर 5 तैयार करें १०० मिलीलीटर की अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए ddH2हे.
      6. ddH2ओ, ५०% MeOH (१००% MeOH की ५० मिलीलीटर), और 12% AcOH (१००% AcOH की 12 मिलीलीटर) के ३८ मिलीलीटर को मिलाकर बफर 6 तैयार करें ।
      7. ddH2ओ, 30% MeOH (१००% MeOH की 30 मिलीलीटर), और 10% ग्लिसरीन (१००% ग्लिसरीन की 10 मिलीलीटर) के ६० मिलीलीटर मिश्रण से बफर 7 तैयार करें ।
      8. 10% ग्लिसरीन (१००% ग्लिसरीन के 10 मिलीलीटर) ddH2ओ के ९० मिलीलीटर के साथ मिश्रण से बफर 8 तैयार करें ।
  3. प्रदर्शन कर रहे चांदी के दाग
    1. 30 मिनट के लिए बफर 1 में जेल ठीक करें ।
    2. 15 मिनट के लिए बफर 2 में जेल धो लें ।
    3. 1 मिनट के लिए 3 बफर में जेल का इलाज ।
    4. 20 एस के लिए ddH2O में 3 बार जेल धो लें ।
    5. 20 मिनट के लिए बफर 4 में जेल व्याप्त ।
    6. 20 एस के लिए ddH2O में 2 बार जेल धो लें ।
    7. 5 बफर में जेल विकसित जब तक बैंड दिखाई दे रहे है (10 एस 10 मिनट के लिए) ।
    8. 2 मिनट के लिए ddH2ओ में जेल 2 बार धो लें ।
    9. 5 मिनट के लिए बफर 6 में विकास बंद करो ।
    10. 20 मिनट के लिए बफर 7 में जेल संरक्षण ।
    11. बफ़र 8 में जेल संग्रहीत है ।
      नोट: युग्मन दक्षता लक्षित capsomere के संशोधित और unmodifieded बैंड के ठहराव द्वारा निर्धारित किया जा सकता है ।

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Representative Results

चित्रा 2 सफल वेक्टर उत्पादन को इंगित करता है कि २९३ (HEK २९३) कोशिकाओं पर cytopathic प्रभाव (सीपीई) के उदाहरण से पता चलता है. कोशिकाओं को वायरस वेक्टर के साथ टीका के बाद आकृति विज्ञान (चित्रा 2c) 40-48 घंटे दिखाना चाहिए । कटाई के लिए सही timepoint कोशिका lysis और आनुवंशिक रूप से पेश thiol समूहों के ऑक्सीकरण को रोकने के द्वारा वायरस कणों को खोने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है । यदि वेक्टर कणों सेल lysis द्वारा माध्यम में जारी कर रहे हैं, आनुवंशिक रूप से शुरू thiols लगभग तुरंत ऑक्सीकरण हो जाएगा, और यह शुद्ध और रासायनिक उंहें संशोधित करने के लिए मुश्किल हो जाएगा ।

चित्रा 3 अनुकरणीय CsCl बैंड से पता चलता है । रासायनिक संशोधन से पहले निरंतर CsCl बैंडिंग के उद्देश्य से वायरस कणों से सेलुलर मलबे को दूर करने के लिए है । संशोधन ही तो CsCl में जगह ले सकता है । रासायनिक संशोधन के बाद दूसरी बैंडिंग के एक अतिरिक्त (प्रतिक्रिया व्यक्त) युग्मन moiety को दूर करने के लिए कार्य करता है । ध्यान दें, वायरस के एक सफल संशोधन ढाल में नहीं देखा जा सकता है और आगे आणविक विश्लेषण की आवश्यकता है, आदर्श एसडीएस द्वारा पृष्ठ ।

चित्रा 4 सफल कैप्सिड संशोधनों के ठेठ उदाहरण से पता चलता है । सबसे विशिष्ट capsomeres को युग्मित moieties एसडीएस में संबंधित capsomeres के चल रहे व्यवहार में बदल जाएगा पृष्ठ । एक unmodified नियंत्रण के साथ प्रत्यक्ष तुलना करके, युग्मन की सफलता सत्यापित किया जा सकता है, और densitometric विश्लेषण में मदद कर सकते है समग्र युग्मन दक्षता का निर्धारण (संशोधित capsomere के लिए स्थानांतरित और unmodifieded बैंड का प्रतिशत) ।

Figure 1
चित्रा 1: एडीनोवायरस वेक्टर capsids के संयुक्त आनुवंशिक और रासायनिक कैप्सिड संशोधनों को ढाल पॉलिमर और लक्ष्यीकरण लाइगैंडों के आबंध लगाव को सक्षम करें । Cysteine अवशेषों आनुवंशिक रूप से नए रासायनिक जेट के साथ वेक्टर कणों से लैस करने के लिए एडीनोवायरस वेक्टर capsids के चयनित, विलायक उजागर कैप्सिड छोरों पर पेश कर रहे हैं । वैक्टर पारंपरिक उत्पादक कोशिकाओं और प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पादन किया जा सकता है । उत्पादन के बाद, आनुवंशिक रूप से शुरू cysteine अवशेषों विशेष रूप से और covalently thiol-प्रतिक्रियाशील युग्मन moieties के साथ संशोधित कर रहे हैं (लाइगैंडों, ढाल पॉलिमर, कार्बोहाइड्रेट, छोटे अणुओं, फ्लोरोसेंट रंजक, आदि). युग्मन के लिए, maleimide-सक्रिय यौगिकों (जो वेक्टर कण सतह के साथ स्थिर thioether बांड फार्म) या pyridyldisulfide डेरिवेटिव (जो डाइसल्फ़ाइड पुलों के रूप में उत्तरदायी) नियोजित किया जा सकता है । युग्मन के बाद, वैक्टर सतत CsCl बैंडिंग से शुद्ध कर रहे है के लिए प्रतिक्रियात्मक अतिरिक्त युग्मन moieties दूर । खूंटी, पॉलीथीन ग्लाइकोल (परिरक्षण बहुलक); एल, लाइगैंडों (पदार्थ वर्गों की एक व्यापक विविधता से व्युत्पंन); -श, आनुवंशिक रूप से शुरू की cysteine अवशेषों की thiol कार्यशीलता । इस तकनीक का उपयोग करना, अणुओं की एक परिभाषित संख्या वेक्टर capsids करने के लिए युग्मित covalently जा सकता है, और युग्मन साइट का एक सटीक चयन संभव है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: वेक्टर उत्पादन के दौरान Cytopathic प्रभाव । पारंपरिक उत्पादक कोशिकाओं (यहां, २९३-HEK कोशिकाओं) रासायनिक संशोधन करने से पहले आनुवंशिक रूप से संशोधित वैक्टर के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । सीपीई की उपस्थिति कोशिकाओं फसल के लिए सबसे अच्छा timepoint इंगित करता है. (क) संक्रमण के दो घंटे बाद कक्ष, (ख) कोशिकाओं को संक्रमण के 24 घंटे बाद, और (ग) कोशिकाओं को ४० घंटे संक्रमण के बाद फसल कटाई से पहले । स्केल बार्स = 20 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 3
चित्रा 3: CsCl ढाल के अनुकरणीय परिणाम । (A, B) और उसके बाद (C) रासायनिक संशोधन से पहले ग्रैडिएंट CsCl । (क) एक एडीनोवायरस वेक्टर निरंतर CsCl घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा बैंडेड है । ऊपरी चरण हरी प्रकट होता है के बाद से वेक्टर दिखाया एक hCMV-प्रमोटर EGFP के लिए अभिव्यक्ति कैसेट चालित भालू । वेक्टर विरिअन ट्यूब के निचले तीसरे में एक एकल, सफेद बैंड के रूप में बैंडेड है । दो छोटे बैंड (ऊपर) अपूर्ण कणों से स्टेम, जो एकत्र नहीं किया जाना चाहिए । (ख) रासायनिक संशोधन से पहले एक cysteine असर EGFP-व्यक्त विज्ञापन वेक्टर । (ग) संशोधन के बाद एक ही सदिश । ट्यूब के निचले तीसरे में बैंड एकत्र और एक लवण कॉलम से शुद्ध किया जाएगा । B और C में पेन मार्क दो घनत्व की सीमा लेबल और वेक्टर बैंड है कि एकत्र किया जाएगा के स्थान की पहचान करने के लिए अनुमति देता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: SiIver-सना हुआ एसडीएस-युग्मन दक्षता का आकलन करने के लिए पृष्ठ. लेन में मेगावाट मार्कर 1. capsomeres penton आधार में शुरू की cysteines के साथ एक वेक्टर, और hexon संशोधित (लेन 2) या maleimide-सक्रिय खूंटी (पॉलीथीन ग्लाइकोल) के साथ संशोधित छोड़ा गया था एक आणविक वजन के साथ 5 केडीए (लेन 3). दोनों hexon और penton आधार एसडीएस के दौरान एक बदलाव-पृष्ठ, कैप्सिड प्रति मोनोमर के > ९०% के सफल संशोधन का संकेत है । hexon में एक cysteine अवशेषों के साथ एक वेक्टर संशोधित (लेन 4), 5 केडीए खूंटी (लेन 5), या के साथ 20 केडीए खूंटी (लेन 6) के साथ संशोधित छोड़ा गया था. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि hexon बैंड के बड़े बदलाव के कारण 20 केडीए खूंटी के 5 केडीए खूंटी (लेन 5) के मुकाबले उच्च आणविक भार में है. जेल विशिष्टता और युग्मन की क्षमता को दर्शाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

दक्षता जिसके द्वारा आनुवंशिक रूप से शुरू cysteines रासायनिक संशोधित किया जा सकता है आमतौर पर 80-99% है, और कुछ चर इस क्षमता को प्रभावित । सबसे पहले, यह सर्वोपरि है कि आनुवंशिक रूप से शुरू cysteines समय से पहले ऑक्सीकरण से गुजरना नहीं है । उत्पादक कोशिकाओं के घटते हुए वातावरण में अच्छी तरह से रक्षा करते हुए, उत्पादक कोशिकाओं से वेक्टर कणों को जारी करने के बाद और रासायनिक संशोधन के दौरान एक गैर ऑक्सीडेटिव वातावरण प्रदान करना अनिवार्य है । इस अंत करने के लिए, कम करने के लिए पुनर्अभिकर्ताओं 0.1-10 मिमी से सांद्रता पर इस्तेमाल किया जा सकता है, और यह है कि thiol समूहों, जो आसानी से maleimide-सक्रिय यौगिकों के साथ प्रतिक्रिया होगी शामिल नहीं है को कम करने का उपयोग करने के लिए आवश्यक है । दूसरा, जब maleimide सक्रिय यौगिकों का उपयोग कर, युग्मन प्रतिक्रिया के दौरान पीएच ७.३५ से अधिक नहीं होना चाहिए, के बाद से अधिक ७.४ के पीएच प्रतिक्रिया की विशिष्टता कम कर सकते हैं । तीसरा, किसी भी मामले में, अमीन-मुक्त बफ़र्स (जैसे, HEPES, पंजाब) प्रतिक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । नोट, cysteine-असर वेक्टर कणों के रूप में वर्णित डबल CsCl बैंडिंग द्वारा शुद्ध किया जा सकता है, तो HEPES में संग्रहीत/10% रासायनिक संशोधन करने से पहले ग्लिसरॉल । इस मामले में, 0.1-1 mM TCEP एक को कम करने एजेंट, या अधिमानतः, वैक्टर एक आर्गन वातावरण में संग्रहित किया जाना चाहिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । ढक्कन के साथ आर्गन भरा प्लास्टिक जार इस प्रयोजन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अतिरिक्त, संशोधन दक्षता capsids और साइट है जो यह युग्मित है करने के लिए मिलकर यौगिक के hydrodynamic व्यास से प्रभावित है । कई capsomeres जो विशिष्ट geneti-रासायनिक संशोधन के लिए लक्ष्य के रूप में कार्य कर सकते हैं कैप्सिड में ट्रिमर (फाइबर, hexon) या pentamers (penton आधार) के रूप में विद्यमान हैं । इसलिए, आनुवंशिक रूप से शुरू की cysteine, एक moiety एक मोनोमर को युग्मित अणु के स्थान पर निर्भर करता है sterically पड़ोसी मोनोमर को एक और अणु के युग्मन बाधा हो सकती है । geneti-रासायनिक कैप्सिड संशोधनों के लिए आदर्श स्थलों का चयन करते समय इस पर विचार किया जाना चाहिए ।

समस्या निवारण की सुविधा के लिए, बताए गए प्रोटोकॉल का अनुसरण करते समय कुछ समस्याएँ उत्पन्न हो सकती हैं. सबसे पहले, कम वेक्टर पैदावार (१०,००० निर्माता सेल प्रति सदिश कणों के नीचे) उत्पादक कोशिकाओं के उपइष्टतम संक्रमण से परिणाम हो सकता है । आदर्श रूप में, 100-300 MOI उत्पादक कोशिकाओं के संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । कृपया ध्यान दें कि दोनों भी उच्च और भी-कम वेक्टर इनोक्युलम के लिए मात्रा इष्टतम पैदावार उत्पंन करते हैं । यह निर्माता कोशिकाओं संक्रमण से पहले दिन बीतने के लिए आदर्श है । दूसरा, CsCl ढाल में धब्बा बैंड दिखाई दे सकते हैं । CsCl ढाल में बैंड के धब्बा उपस्थिति के लिए सबसे लगातार कारण CsCl समाधान है कि बहुत अंलीय है की एक पीएच है । कम एजेंट TCEP बहुत अंलीय है, और देखभाल के लिए ढाल पर वेक्टर लोड करने से पहले पीएच समायोजित लिया जाना चाहिए, के बाद से एडीनोवायरस वैक्टर आसानी से एक अंलीय वातावरण में बिखरे । तीसरा, कम युग्मन क्षमता (युग्मन के < ८०%) में वेक्टर सतह पर अशुद्ध वेक्टर तैयारी और/या thiol समूहों के समयपूर्व ऑक्सीकरण का सबसे लगातार परिणाम होता है । अशुद्धियों एसडीएस द्वारा पता लगाया जा सकता है-पृष्ठ और चांदी धुंधला । महत्वपूर्ण दोष होते हैं कि मामले में, वेक्टर उत्पादन पुनरारंभ करना चाहिए । इसके अलावा, कम युग्मन क्षमता की प्रतिक्रिया में नि: शुल्क गैर वेक्टर thiols की वजह से हो सकता है । इसलिए, यह सलाह दी जाती है कि ß-mercaptoethanol या dithiothreitol को कम करने के रूप में उपयोग न करें, क्योंकि दोनों में नि: शुल्क thiol समूह शामिल हैं । ध्यान दें, विलायक-सुलभ साइटों का चयन करने के लिए cysteine अवशेषों है कि आसानी से संशोधित किया जा सकता है शुरू करने के लिए, क्रिस्टल संरचनाओं इस्तेमाल किया जाना चाहिए; अंयथा, cysteines युग्मन भागीदार के लिए पहुंच योग्य नहीं हो सकता है । वेक्टर सतह पर thiols के समय से पहले ऑक्सीकरण रोधी और/या TCEP के कड़े प्रयोग से बचा जा सकता है ।

अंत में, गलत stoichiometric गणना भी कम युग्मन क्षमता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । निंनलिखित उदाहरण के ऊपर प्रस्तुत की जेनेरिक सूत्र वर्णन और stoichiometric गणना की सुविधा का मतलब है । उदाहरण में, एक cysteine hexon capsomere में पेश किया है । पहले CsCl कदम ढाल शुद्धि के बाद वेक्टर कणों के titer १.५ के रूप में निर्धारित किया जाता है x 10 µ एल प्रति10 वेक्टर कणों, और युग्मन moiety के रूप में, malPEG-७५० का इस्तेमाल होता है । प्रत्येक वेक्टर कैप्सिड में ७२० hexon प्रोटीन (२४० ट्रिमर) होते हैं, इसलिए titer के cysteines प्रति µ l इसीलिये रकम को ७२० x १.५ x 1010 = १.०८ x 1013 cysteines/µ एल. आदेश में सदिश कणों की १.५ मिलीलीटर को संशोधित करने के लिए, १.६२ x 1016 cysteines की कुल युग्मन moiety के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की जानी चाहिए । कुशल युग्मन, cysteine अवशेषों की कुल करने के लिए युग्मन यौगिक के एक 50x दाढ़ अतिरिक्त तक पहुंचने की सिफारिश की है: १.६२ x 1016 x ५० = ८.१ x 1017 malPEG के अणुओं-७५० को कुशलतापूर्वक जोड़े की जरूरत है १.५ x 1016 cysteines के लिए वेक्टर समाधान के १.५ मिलीलीटर पहले CsCl कदम ढाल द्वारा शुद्ध । MalPEG-७५० प्रदर्शित ७५० दा का एक आणविक भार; इसलिए, ६.०२२ x 10 malPEG के23 अणुओं-७५० वजन ७५० ग्राम इसलिए, के कुशल युग्मन के लिए १.६२ x 10 सदिश समाधान के १.५ मिलीलीटर में cysteine अवशेषों की एक 50x अतिरिक्त के साथ malPEG-७५०, ८.१ x 10 malPEG के17 अणुओं-७५० = (७५० x ८.१ x 1017)/(६,०२२ x 1023) = 1 x 10-3 जी = 1 मिलीग्राम malPEG-७५० की आवश्यकता है ।

प्रस्तुत विधि पूरक है और वेक्टर PEGylation की विधि से अधिक है । पारंपरिक, अमीन निर्देशित वेक्टर PEGylation साइट के लिए अनुमति नहीं है, परिरक्षण या लक्ष्यीकरण moieties के विशिष्ट लगाव है, जबकि geneti-रासायनिक युग्मन प्रौद्योगिकी यहां प्रस्तुत करने के लिए ठीक एडीनोवायरस वेक्टर moieties संलग्न किया जा सकता है निर्धारित पदों पर और निर्धारित प्रति संख्याओं में सतहों । इसलिए, यह दोनों परिरक्षण और एडीनोवायरस वेक्टर कणों के लक्ष्यीकरण के लिए उपयुक्त है ।

नोट के, इस प्रोटोकॉल भी एक पारंपरिक अमीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है निर्देशित PEGylation विज्ञापन वैक्टर ऊपर उल्लेख किया । उस स्थिति में, बफ़र्स से कम करने वाले एजेंट TCEP छोड़ा जा सकता है । stoichiometric गणना के लिए, कण प्रति सुलभ अमीन समूहों की संख्या १८,००० माना जा सकता है, और अमीन-प्रतिक्रियाशील युग्मन moieties के ठेठ दाढ़ ज्यादतियों 20-100 गुना कर रहे हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vector purification and chemical modification
Argon gas Air liquide local gas dealer
Liquid Nitrogen Air liquide local gas dealer
500 mL centrifuge tubes Corning 431123
Stericup Express Plus 0.22 µm Millipore SCGPU02RE
Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) Sigma-Aldrich C4706-10g
2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) Henke Sass Wolf 4020.000V0
Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) Henke Sass Wolf 4710009040
Caesium chloride 99.999% Ultra Quality Roth 8627.1
Silica gel beads Applichem A4569.2500
Methoxypolyethylene glycol maleimide - 750 (PEG mal-750) Iris Biotech store in silica gel beads at -80 °C
13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 344059 only open in hood
PD-10 size exclusion chromatography column GE Healthcare 17-0851-01 store at 4 °C
Hepes AppliChem A1069.1000
SDS Ultrapure AppliChem A1112,0500
Glycerol AppliChem A1123.1000
Name Company Catalog Number Comments
Material for cell-culture
DPBS PAN Biotech P04-36500
DMEM PAN Biotech P04-03590
Trypsin/EDTA PAN Biotech P10-0231SP
FBS Good PAN Biotech P40-37500
Penicillin/Streptomycin PAN Biotech P06-07100
Biosphere Filter Tips (various sizes) Sarstedt
Serological Pipettes (various sizes) Sarstedt
reaction tubes (various sizes) Sarstedt
TC plates 15cm Sarstedt 83.3903
Name Company Catalog Number Comments
Material for silver staining protocol
Methanol J.T.Baker 8045
Ethanol absolute AppliChem 1613,2500PE
Acetic Acid AppliChem A0820,2500PE
Formaldehyde 37% AppliChem A0877,0250
Ethanol absolute AppliChem A1613,2500PE
Sodium thiosulfate AppliChem 1,418,791,210
Silver nitrate AppliChem A3944.0025
Sodium carbonate AppliChem A3900,0500
Name Company Catalog Number Comments
Special Lab Equipment
Desiccator Nalgene 5311-0250
Megafuge 40 Heraeus
Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes Heraeus
Water bath Conventional
Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 Beckman Coulter
suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 Beckman Coulter
pH -Meter Conventional
Stand with clamps Conventional
Goose neck lamp Conventional
Over-head rotor Conventional
Thermal Block Conventional
Photometer (OD 260) Conventional

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References

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