Combinée de Modifications chimiques et génétiques de la capside des vecteurs de transfert de gènes axée sur les adénovirus pour le blindage et le ciblage

Biology

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Summary

Le protocole décrit ici permet aux chercheurs de modifier précisément capsides adénovirus dans certains sites de chimie simple. Particules de vecteurs adénovirus blindé et vecteurs de transfert de gène reciblées peuvent être générés et interactions hôte vecteur peuvent être étudiées.

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Jönsson, F., Hagedorn, C., Kreppel, F. Combined Genetic and Chemical Capsid Modifications of Adenovirus-Based Gene Transfer Vectors for Shielding and Targeting. J. Vis. Exp. (140), e58480, doi:10.3791/58480 (2018).

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Abstract

Vecteurs adénovirus sont des outils puissants pour virothérapie génétique de vaccination et oncolytiques. Cependant, ils sont sujettes à des interactions hôte-vecteur indésirables multiples, surtout après la livraison de in vivo . C’est un consensus que les limites imposées par l’interaction hôte-vecteur non désirés ne peuvent être surmontés si les modifications définies de la surface de vecteur sont effectuées. Ces modifications incluent le blindage des particules à partir des interactions non désirées et le ciblage de l’introduction de nouveaux ligands. Le protocole présenté ici vise à permettre au lecteur de générer blindé et, si vous le souhaitez, reciblé vecteurs de transfert de gène humain adénovirus ou virus oncolytiques. Le protocole permettra aux chercheurs de modifier la surface des capsides vecteurs adénovirus par un lien chimique spécifique des polymères synthétiques, glucides, lipides ou autres moitiés biologiques ou chimiques. Il décrit la technologie de pointe des modifications combinées capside génétiques et chimiques, qui auraient dû être divulgués afin de faciliter la compréhension et le franchissement des barrières pour en vivo livraison des vecteurs adénovirus. Une description détaillée et commentée des étapes cruciales pour la réalisation de réactions chimiques spécifiques avec biologiquement actives virus ou virus dérivés des vecteurs est fournie. La technologie décrite dans le protocole est basée sur l’introduction de génétique de la cystéine (naturellement absent) résidus en boucles exposés au solvant de vecteurs adénovirus-dérivé. Ces résidus de cystéine fournissent une réactivité chimique spécifique, après la production de vecteurs à des titres élevés, exploitables pour le très spécifique et efficace de couplage covalent chimique des molécules d’une grande variété de classes de substance au vecteur particules. Ce qui est important, ce protocole peut s’adapter facilement pour effectuer une large variété de modifications chimiques (non thiol dotés) différentes, des capsides vecteurs adénovirus. Enfin, il est probable que vecteurs de transfert de gène de base de virus non enveloppés, autres que les adénovirus peuvent être modifiées de la base du présent protocole.

Introduction

Adénovirus (Ad), membres de la famille des Adenoviridae, sont des virus à ADN non enveloppés de laquelle plus de 70 types jusqu'à présent ont été identifiés (http://hadvwg.gmu.edu). Selon les propriétés hemaglutination, structure du génome et résultats du séquençage, les types de 70 après JC se divisent en sept espèces (adénovirus humain A à G)1,2. Le génome humain des Ad est taille 38 Ko et encapsulé par une nucléocapside icosaédrique3. En raison de leur abondance, la capside protéine hexon, base de penton et fibre sont tous appelés protéines de capside majeure. La capside protéine hexon plus abondante et la plus grande forme 20 facettes de la capside, composés chacun de 12 hexon homotrimers4,5. Penton, situé sur chaque bord icosaédrique (sommet), se compose de pentamères d’une base de penton et représente le point de départ pour la pointe de vertex qui est construite de glycosylée fibre trimères5,6. L’entrée de cellule Ad natif est essentiellement composée de deux grandes étapes. Tout d’abord, le bouton de la fibre se lie au récepteur primaire. Types de publicité de l’espèce A, C, E et F, c’est le récepteur coxsackie et adénovirus (voiture). Cette interaction apporte le virion dans la proximité spatiale de la surface des cellules, ce qui facilite les interactions entre les intégrines cellulaires et RGD-motif dans la base de penton et par conséquent induisant des réponses cellulaires. En second lieu, les modifications du cytosquelette conduisent à internalisation du virion et transport de l' endosome7. Après un démontage partiel de l’endosome, le virion est libéré dans le cytoplasme und se rend finalement au noyau pour la réplication.

Alors que l’Ad peut être remis localement (e.g., pour la vaccination génétique), délivrance systémique par l’intermédiaire de la circulation sanguine selon les exigences de l’onco-virothérapie fait face à plusieurs obstacles. Tout en circulant dans le sang, les virions injectées rencontrent le système de défense du système immunitaire de l’hôte, conduisant à une neutralisation rapide les vecteurs de la base de virus et rendre les vecteurs de base Ad extrêmement inefficace dans les applications systémiques. En outre, l’hépatotropisme naturelle des Ad interfère avec délivrance systémique et doit être résolue pour rediriger Ad vers ses nouvelles cellules de cible.

Codé en lignée germinale des anticorps IgM naturelles du système immunitaire inné rapidement reconnaissent et lient des structures hautement répétitives sur la surface du virion8,9. Ces complexes immuns activent ensuite les voies classiques et non classiques du système du complément, conduisant à une neutralisation rapide médiée par le complément d’une grande partie des virions8. Une deuxième voie entraînant retrait majeur des virions Ad est médiée par les macrophages10 et associée aiguë toxique et hémodynamiques effets secondaires11,12. Dans le cas de la publicité en particulier, Kupffer, cellules résidant dans la foie se lient aux et phagocytically relever les Ad virions par charognard spécifique récepteurs, ainsi leur élimination du sang13,14,15 . Les récepteurs scavenger spécifiques ont également été identifiées sur les cellules endothéliales sinusoïdales hépatiques (cellules LSE)16, et LSE cellules semblent également contribuer à vecteur élimination17, mais à quelle mesure doit encore être précisée. En outre, certains types de publicité et de leurs vecteurs dérivés sont efficacement piégées par les érythrocytes humains18 auxquels ils lient par voiture ou le récepteur du complément CR119. À noter, ce mécanisme séquestrant ne peut être étudié dans le système de modèle de souris comme en contraste avec les érythrocytes humains, les érythrocytes de souris n’expriment pas de voiture.

Des anticorps spécifiques anti-Ad générés par le système immunitaire adaptatif après exposition aux Ad, soit en raison d’infections antérieures avec Ad ou après la première livraison dans les applications systémiques lever un obstacle supplémentaire à l’usage effectif des vecteurs de l’Ad, et ils devraient être éludés dans délivrance systémique efficace.

Enfin, la forte hépatotropisme de certains types de publicité (y compris Ad5) sévèrement entrave demande d’Ad en thérapie systémique. Ce tropisme résultant dans la transduction des hépatocytes est en raison de la forte affinité du virion Ad de facteur de coagulation de sang X (FX), médiée par l’interaction de FX avec les Ad hexon protéines20,21,22. FX comble le virion à héparine sulfate glycanes (HSPGs) sur la surface des hépatocytes20,23,24,25. Un facteur crucial pour cette interaction semble être l’étendue exacte des N - et O-sulfatation des HSPGs dans les cellules hépatiques24, qui se distingue de la HSPGs sur d’autres types de cellules. En plus de ce mécanisme médié par FX, des études récentes suggèrent davantage les voies non encore identifiée qui aboutissent à la transduction Ad des hépatocytes26,27,28.

Récemment, il a été démontré que FX n’est pas impliquée dans la transduction des hépatocytes de Ad, mais aussi en se liant, le virion protège la particule de virus contre la neutralisation par le système de complément26. Réduction de la transduction de l’hépatocyte en empêchant la liaison de FX, par conséquent, créerait indésirable effet secondaire d’augmenter Ad neutralisation via le système immunitaire inné.

Une connaissance approfondie des interactions complexes entre les vecteurs et les organismes hôtes est donc nécessaire de développer les vecteurs plus efficaces pour les applications systémiques qui contournent les obstacles imposés par l’organisme de l’hôte.

Une stratégie qui a été initialement utilisée pour les protéines thérapeutiques a été adaptée pour les vecteurs d’Ad pour au moins partiellement surmonté les obstacles décrits ci-dessus. Antigénicité et l’immunogénicité de protéines thérapeutiques composés pourraient être réduits en accouplant au polyéthylène glycol (PEG)29,30. Par conséquent, le couplage covalent des polymères tels que le PEG ou poly [N-(2-hydroxypropyl) methacrylamid] (pHPMA) à la capside surface protège le vecteur de l’interaction hôte-vecteur non désirés. Communément, couplage polymer cible les groupes ε-aminé de résidus de lysine secondaires qui sont distribuées au hasard sur la surface de la capside. Particules de vecteur en solution sont, en raison de la nature hydrophile des polymères ci-joint, entourés d’une coquille d’eau stable qui réduit le risque de la reconnaissance des cellules immunitaires ou une dégradation enzymatique. En outre, vecteurs de PEGylated Ad apparaissaient d’éluder la neutralisation par les anticorps anti-hexon in vitro et dans des souris préalablement vaccinés en vivo31. Contrairement à la modification génétique capside, couplage chimique des polymères est effectué après la production et de purification, qui permet non seulement pour l’utilisation de cellules producteur classiques et des stocks de vecteur de titre élevé, mais aussi pour la production simultanée modification de milliers d’acides aminés sur la surface de la capside. Cependant, axés sur l’amine blindage se produit au hasard sur toute la surface de l’ensemble capside, résultant en des hétérogénéités hautes et ne permettant pas de modification des capsomères spécifiques. En outre, les fractions de polymère grand requises pour des effets bénéfiques altérer virus bioactivité32.

Pour surmonter ces limitations, Kreppel et al. 33 a introduit un concept de geneti chimiques pour vecteur re - et dépointage. Cystéines ont été génétiquement introduits dans la capside du virus aux positions exposés au solvant comme fibre HI-boucle33, protéine IX34et hexon35,,36. Bien que pas les vecteurs de Ad naturelle, cystéine-roulement peuvent être produites à des titres élevés dans les cellules normales de producteur. Ce qui est important, insertion des cystéines dans certains capsomères et dans différents postes au sein d’un seul capsomer permet des modifications très spécifiques des portions réagissant au groupe thiol. Cette approche geneti-chimique a été démontrée à surmonter les nombreux obstacles en dessin vectoriel Ad. La combinaison de base d’amines PEGylation dépointage et couplage thiol-basée de la transferrine sur la manette de la fibre que HI-boucle a fait ses preuves avec succès reciblez modifié vecteurs d’Ad pour voiture-deficient cellules33. Puisque hexon est impliqué dans des interactions plus indésirables (anticorps neutralisants, facteur de coagulation sanguine FX), stratégies axées sur le thiol modification donnèrent aussi leur hexon. Couplage des petites portions de PEG à HVR5 de hexon empêché particules vecteur Ad pour transduce SKOV-3 cellules en présence de FX, tandis que grandes portions de PEG augmenté hépatocyte transduction14,35. Particules de vecteur ad porteuses de mutations dans le bouton de fibre inhibant la liaison de la voiture et HVR7 inhibiteur liaison des FX (et roulement inséré cystéines dans HVR1 pour position spécifique PEGylation) se sont avérés éluder et complément-médiée par les anticorps de neutralisation, ainsi que l’absorption du piégeur médiée par les récepteurs sans perte d’infectiosité. Fait intéressant, malgré un manque du bouclier naturel de FX, PEGylation amélioré encore transduction des hépatocytes en fonction de la taille de cheville36. Cependant, il a été montré que covalent blindage a d’incidence sur les processus de trafic intracellulaires. Prill et al. comparé irréversible par rapport aux boucliers bioresponsive basé sur pHPMA et démontré que ni le mode de blindage ni co-polymère frais avait une incidence sur l’entrée de la cellule mais affecte traite des particules dans le noyau. Employant un bouclier bioresponsive avec pHPMA chargés positivement copolymères autorisés pour trafic de particules dans le noyau, en conservant l’efficacité élevée de transduction Ad vecteurs in vitro et in vivo37.

En résumé, ces données indiquent que, même en supposant que toutes les interactions-hôte-vecteur ont été connues et examinées, modifications de surface capside excessive sont nécessaires pour surmonter les obstacles liés à la prestation de vecteur systémique.

Ici, nous fournissons un protocole pour effectuer des modifications chimiques in sites des capsides vecteurs adénovirus pour blindage et/ou le reciblage des particules vecteurs adénovirus et virus oncolytiques axée sur les adénovirus. Le concept de cette technologie est décrite à la Figure 1. Il permet le blindage de certaines régions de la capside des interactions indésirables par covalente des polymères synthétiques. En même temps, il fournit également un moyen d’attacher des ligands et combiner le blindage et le ciblage. À l’aide de chimie simple, les expérimentateurs pourront modifier par covalence surface de vecteurs adénovirus avec une grande variété de molécules comprenant des peptides/protéines, glucides, lipides et d’autres petites molécules. En outre, le protocole prévoit un concept général la modification chimique des vecteurs de virus dérivé biologiquement actives au titre du maintien de leur intégrité biologique et activité.

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Protocol

Remarque : dans ce qui suit, un protocole pour PEGylation geneti-chimique d’une annonce vectorielle est décrite en détail. Pour activer le couplage spécifique de la portion de PEG, un vecteur Ad5 a été préalablement génétiquement modifié en introduisant un résidu cystéine dans la protéine hexon au hypervariables boucle 5 tel que décrit dans une précédente publication36et une cheville maléimide activé composé est utilisé comme composé de couplage.

1. préparation des tampons pour la Purification de vecteurs par gradient de CsCL étape

  1. Préparer 400 mL de tampon d’adénovirus (Ad-tampon) en ajoutant 50 mM HEPES (4,76 g/400 mL) et 150 mM NaCl (3,504 g/400 mL) d’eau bidistillée (ddH2O). 350 mL de ce tampon est nécessaire pour préparer les trois variantes d’Ad-tampon suivants.
    1. Variante a : régler 150 mL d’Ad-tampon à pH 7,6 avec NaOH.
    2. Variante b : ajouter une concentration finale de 10 mM PTCE [tris(2-carboxyethyl)phosphine), 0,143 g] à 50 mL et ajustez-la à pH 7.2 avec HCl.
    3. Variante c : ajouter une concentration finale de 0,5 mM TCEP (0,022 g) dans 150 mL et ajustez-la à pH 7.2 avec HCl.
    4. Préparer les tampons FD2O et produits chimiques de qualité analytique. 100 mL chacun de la variante A et la variante C permet de préparer les tampons CsCl (consultez les étapes 1,2 et 1,3 ; 50 mL de chaque) nécessaires pour les gradients d’étape CsCl (voir étapes 3.2.6. et 3.2.18).
  2. Préparation du tampon gradient de CsCl étape (ρCsCl = 1,41 g/cm3) dans un tampon-Ad
    NOTE : Cette mémoire tampon est nécessaires dans deux variantes :
    1. Peser les deux parties aliquotes d’exactement 27,42 g de CsCl en tubes de 50 mL.
    2. ΡCsCl = 1,41/PTCE tampon : résoudre CsCl dans 40 mL de la variante C de l’Ad-tampon.
    3. ΡCsCl = 1,41 tampon : résoudre CsCl dans 40 mL de la variante A de l’Ad-tampon.
    4. Vérifier et si nécessaire, ajuster le pH avec HCl. remplissage jusqu'à 50 mL exactement avec la variante Ad-tampon correspondante. Pour obtenir les meilleurs résultats de séparation, la concentration exacte de CsCl et le pH sont cruciales.
    5. Vérifier la densité (CsCl contenu) par pesée (1,41 g) 1 mL de chaque tampon dégradé.
  3. Préparation du tampon gradient de CsCl étape (ρCsCl = 1,27 g/cm3) dans un tampon-Ad
    NOTE : Cette mémoire tampon est nécessaire en deux variantes :
    1. Peser les deux parties aliquotes d’exactement 18,46 g de CsCl en tubes de 50 mL.
    2. ΡCsCl = 1,27/PTCE tampon : résoudre CsCl dans 40 mL de la variante C de l’Ad-tampon.
    3. ΡCsCl = 1,27 tampon : résoudre CsCl dans 40 mL de la variante A de l’Ad-tampon.
    4. Vérifier et si nécessaire, ajuster le pH avec du HCl. Enfin, remplir jusqu'à 50 mL exactement avec la variante Ad-tampon correspondante. Pour obtenir les meilleurs résultats de séparation, la concentration exacte de CsCl et le pH sont cruciales.
    5. Vérifier la densité (CsCl contenu) par pesée (1,27 g) 1 mL de chaque tampon dégradé.
  4. Stériliser tous les tampons (Ad-tampons et tampons gradients de CsCl étape) par filtration (avec des pores de 0,45 µm maillage) dans des bouteilles stériles.
  5. Après la stérilisation, pour éviter l’oxydation de TCEP, saturer et superposer les tampons contenant PTCE d’argon par barbotage les tampons avec gaz argon pour environ 30 s. Prendre soin de n’utiliser que des dispositifs stériles (e.g., stérile Pipetter conseils) lorsqu’on applique le gaz argon et utilisation de bouteilles assez grand pour permettre le lard argon.
    Remarque : Tous les tampons doivent être préparés frais et protégé de la lumière et peuvent être conservés à 4 ° C pendant plusieurs jours (surtout les CsCl étape gradients tampons qui ne devraient être maintenus pendant plusieurs jours).

2. couplage moitiés : Stockage et préparation

Remarque : Moeities utilisés pour le couplage de cystéines devons garder groupes thiol réactif. Composés maléimide activé seront forment des liaisons thioéther stable avec les cystéines génétiquement introduites. Par ailleurs, ortho-pyridyldisulfide (EO)-composés activés peuvent être utilisés, qui forment des ponts disulfures bioresponsive entre les particules de vecteur et la portion de couplage. MalPEG-750 lyophilisée ainsi que la plupart d’autres réactifs de couplage sont sensibles à l’hydrolyse et doivent être stockés à secs sous forme de poudre lyophilisée à-80 ° C.

  1. Pour éviter l’accumulation de condensation de l’eau à la décongélation des flacons, conserver les flacons dans les plus grands tubes (e.g., tubes de 50 mL) rempli d’un coussin de billes de gel de silice. Conserver ces tubes dans un récipient plu adéquat aussi rempli d’un coussin de billes de gel de silice.
  2. Avant de bien fermer chaque tube et les conteneurs, échanger des air avec gaz argon. Ceci peut être réalisé en plaçant le tube ouvert et les contenants dans un dessicateur, suivi par le retrait et le remplacement de l’air avec le gaz argon. Gaz argon étant plus lourd que l’air, tubes et contenants sont remplis de gaz argon et peuvent maintenant être placés les uns les autres, avec chaque couvercle bien fermé.
  3. Ranger des contenants à-80 ° C.
  4. Lorsque la décongélation, placez les conteneurs sur les perles de silice dans un dessicateur lentement réchauffer à température ambiante, puis ouvrez le conteneur.
  5. Lors d’une réaction de couplage, fraîchement régler la quantité de substrat nécessaire dans le solvant approprié de couplage. Prendre soin de ne pas pour ajouter plus de 10 % de solution de couplage à la réaction de couplage final, surtout si la DMF ou le DMSO est utilisé comme solvant pour le substrat de couplage.

3. amplification, de Purification et de Modification chimique des vecteurs Ad :

  1. Amplification des vecteurs Ad
    Remarque : Les étapes suivantes doivent être exécutés à l’aide d’une armoire de sécurité selon les règles de sécurité biologique locale.
    1. Transfecter un vecteur de Ad ∆E1 déficient de réplication contenant un (ou plusieurs) ou des résidus cystéine génétiquement introduits dans des cellules HEK 293 tel que décrit par Kratzer et Kreppel38.
    2. Selon le protocole38, amplifier le vecteur de réinfections séquentielles jusqu'à une finale infection préparative des plaques de culture cellulaire 15-20 grand format (15 cm) (environ 1-2 x 107 cellules/plaque).
      Remarque : Dans l’idéal, la réinfection dernier devrait chronométrée afin que les cellules présentent l’effet complet cytopathogène (ECP) dans la matinée du rendement de purification et de modification (voir Figure 2).
    3. Après l’étape d’amplification finale, cellules resuspendues dans le tampon de Ad + 10 mM TCEP (variante B) peuvent être congelés à-80 ° C ; Toutefois, pour un rendement optimal des particules de vecteur, un suivi immédiat de la cellule lysis et vecteur de purification et de modification est recommandé.
  2. Modification chimiques et purification de vecteurs Ad
    NOTE : La Purification de vecteurs est effectuée selon le protocole de purification des adénovirus décrit dans38mais dans des conditions non oxydant. Moisson et lysis de cellules comme vecteur purification et chimique des modifications peuvent être effectuées dans la journée. Récolter et lyser les cellules infectées selon le protocole décrit précédemment38.
    1. Prélever des cellules en grattant les plaques et en transférant le surnageant à tubes à centrifugation 200-500 mL.
    2. Faites tourner la solution cellulaire pendant 10 min à 400 g.
    3. Resuspendre le culot dans 4 mL de tampon de Ad + 10 mM TCEP (pH 7,2) (variante B) et transférez dans un tube stérile de 50 mL. Si le rendement des cellules est faible ou seulement un faible CPE a été induit, il resuspendre dans 2 mL.
    4. Sauver le vecteur par 3 cycles de gel (dans l’azote liquide) et dégel (dans un bain d’eau de 37 ° C).
    5. Tourner pendant 10 min à 5 000 x g à 4 ° C.
    6. Pendant la centrifugation, préparer deux gradients d’étape CsCl égales :
      1. Tout d’abord, comme la phase inférieure, ajouter 3 mL de 1,41 g/cm3 ρCsCl en Ad-tampon + 0,5 mM TCEP (pH 7,2, variante C) dans les tubes ultracentrifugeuse. Marquer le niveau de la phase inférieure sur le tube avant de charger la phase supérieure.
      2. Empilez soigneusement la phase supérieure de 5 mL de 1,27 g/cm3 ρCsCl Ad-tampon + 0,5 mM TCEP (pH 7,2, variante C) par pipetage très lentement le volume de 5 mL le long des parois du tube sur la phase inférieure.
        NOTE : Depuis lors de l’attelage une forte concentration de PTCE pourrait réagir avec le résidu de la maléimide de malPEG-750 et conduire à l’efficacité réduite d’attelage, purification par CsCl gradient d’étape doit être déjà effectuée en vertu d’une diminution de la concentration TCEP.
    7. Charger le surnageant sur le gradient de CsCl [soit tout aussi diviser le surnageant sur les deux gradients ou, dans le cas d’un rendement faible vector (voir ci-dessus), charger le surnageant sur une seule colonne] et remplir les deux gradients également vers le haut avec tampon Ad + 10 mM TCEP (pH 7 .2, variante B).
    8. Ajuster le poids des tubes opposées à une différence de poids 0,0 g.
    9. Ultracentrifugeuse pendant 2 h à 176 000 x g à 4 ° C.
    10. Avec une pince, fixer le tube d’ultracentrifugation à un stand, laissant la zone autour du niveau repère phase accessible. Placez la lampe col de cygne au-dessus du tube. Autour de la marque, à la frontière entre les phases inférieures et supérieures, une bande distincte (les virions de vecteur) doit être visible (Figure 3 a-3 C).
    11. Recueillir les vecteurs de percer le tube avec une aiguille et qui aspirent à la bande de vector dans une seringue. Transférer virions vecteur recueillies dans un tube de 15 mL.
      NOTE : Des bandes plus faibles au-dessus de la bande de vecteur Ad contiennent des particules de vecteur incomplète et doivent être évitées pour l’aspiration. Les débris cellulaires et les green fluorescent protein (EGFP) exprimant EGFP Ad-vecteurs recueillera dans la partie supérieure de l’ultracentrifugeuse tube (voir Figure 3 a et 3 b). Cela et les étapes suivantes jusqu'à l’accouplement (étape 3.2.16) doivent être effectuées rapidement, comme les vecteurs sont maintenant sensibles au disulfure de collage en raison de la faible concentration de TCEP.
    12. Pour calculer la quantité de substrat de couplage permettant une liaison complète efficace du substrat à tous les résidus de cystéine dans la préparation de vecteur, mesurer OD260:
      1. Selon le protocole décrit par Kratzer et Kreppel38, vortex, un mélange de 10 µL des virions collecté vector, 89 µL de tampon de Ad et 1 µL de SDS de 10 %. Sonde de vierge, vortex 99 µL de tampon de Ad et 1 µL de SDS de 10 %.
      2. Pour dénaturer les virions, incuber les deux à 56 ° C pendant 10 min.
      3. Déterminer OD260.
      4. Calculer le titre vecteur physique par µL à l’aide de l’équation suivante : OD260 x facteur de dilution x coefficient d’extinction empiriques de Ad (1,1 x 10 particules vecteurs de9 = OD 1260 unité/µL). Par conséquent, un mesurée de l’OD260 de 1,36 d’un vecteur dilué 01:10, calculerait à : 1,36 x 10 x 1.1 x 109 = environ 1,5 x 1010 vecteur particules/µL.
        Remarque : Ce titre est seulement une estimation sommaire ; Toutefois, il est suffisamment précis pour les calculs stoechiométriques décrites dans ce qui suit.
    13. Selon la protéine modifiée par l’introduction d’une cystéine, déterminer la quantité de substrat de couplage (en grammes) pour une réaction de couplage efficace, selon l’équation générale suivante : titre de Virus x Volume x nombre de cystéines x excès de portion x Moléculaire poids de portion / 6 022 x 1023 = grammes de substrat de couplage.
      Remarque : dans cette équation : titre virus 1) est le titre/µL, déterminée par OD260 comme décrit ci-dessus, volume 2) comptes pour le volume en µL d’aspirait vecteur utilisé dans la réaction de couplage, 3) le nombre de cystéines est le nombre de protéines dans lequel la cystéine résidu a été introduit par particule vecteur, 4) excès de fraction est le facteur de nécessaire excès portion pour une réaction de couplage efficace (50 x) et 5) il convient d’introduire le poids moléculaire de la portion comme Da (pas kDa).
    14. Fraîchement résoudre la quantité du composé (ou montant possible) dans le solvant approprié.
      Remarque : Comme la quantité de substrat de couplage nécessaire est faible et difficile à peser, mais cher, peser la quantité minimale de composé possible et dissoudre dans une concentration appropriée pour application à la réaction de couplage.
    15. Transférer la solution de vector dans un tube de taille appropriée (par exemple, le tube 2 mL) et ajouter le montant calculé du composé en solution stock de couplage au vecteur.
    16. Mélanger délicatement la solution par rotation aérienne pendant 1 h à température ambiante.
    17. Remplissez ensuite la solution de vecteur pour le volume total de 6 mL avec Ad-tampon (pH 7,6, variante A).
      Remarque : Cette étape doit être exécutée avant que la solution est appliquée sur le gradient de l’étape pour s’assurer que la solution de vector, qui contient encore CsCl depuis le premier gradient de l’étape, a une densité inférieure à 1,27 g/mL.
    18. Dans un second temps de baguage CsCl, purifier le vecteur de la portion de couplage n’a pas réagi :
      1. Préparer deux gradients d’étape CsCl égales en effectuant les étapes suivantes pour chaque : phase 1) inférieure : 3 mL de 1,41 g/cm3 ρCsCl en Ad-tampon pH 7,6 (variante A) 2) marquer niveau de phase inférieure sur le tube avant de charger la phase supérieure et phase 3) supérieure : 5 mL de 1,27 g/cm3 ρCsCl en Ad-tampon (pH 7,6, variante A).
        Remarque : Après que l’accouplement a eu lieu, tampons sans PTCE servent, comme aucun groupe thiol libre ne devrait être maintenant présent sur les capsides vector.
      2. Chargez le surnageant sur le gradient de CsCl et remplir les deux gradients également vers le haut avec Ad-tampon (pH 7,6, variante A).
      3. Ajuster les poids des tubes opposées à une différence de poids 0,0 g.
    19. Ultracentrifugeuse pendant 2 h à 176 000 x g à 4 ° C.
    20. Peu avant la fin de l’ultracentrifugation, Equilibrer une colonne PD-10 5 fois avec 5 mL d’Ad-tampon (pH 7,6, variante A).
    21. Comme à l’étape 3.2.10, fixer le tube d’ultracentrifugation se laissant autour du niveau repère phase accessible. Placez la lampe col de cygne au-dessus du tube. Encore une fois, près de la frontière entre les phases inférieures et supérieures, une bande distincte (les virions de vecteur) doit être visible (Figure 3).
    22. Recueillir les vecteurs de percer le tube avec une aiguille et qui aspirent à la bande de vector dans une seringue et transférer le vecteur dans un tube de 15 mL. Prenez soin de recueillir les virions de deux tubes dégradés ensemble en un volume total de 2,5 mL ou moins. Si un volume plus petit est recueilli, remplir pour obtenir un volume total de 2,5 mL avec le tampon de l’Ad (variante A).
    23. Charger les 2,5 mL sur la colonne de PD équilibrée. Jeter le cheminement.
    24. Ajouter 3 mL de tampon d’Ad (variante A) sur la colonne et recueillir le cheminement (contenant les virions vecteur purifiée).
    25. Ajouter glycérol (333 µL) pour obtenir une concentration finale de 10 % et diviser en parties aliquotes appropriés (par exemple, 400 µL chaque) et comprennent une partie aliquote de 20 µL pour la détermination du titre par mesure260 OD.
    26. Stocker la solution de vecteur à-80 ° C.
    27. Déterminer le titre de vecteur en mesurant l' OD260 de 20 µL de solution de vecteur, 79 µL de tampon de Ad (variante A) et 1 µL de SDS de 10 % comme indiqué au point 3.2.12. Comme un vide, utilisez 79 µL de tampon Ad (variante A), 10 µL de glycérol à 10 % et 1 µL de SDS de 10 %.
    28. Calculer le titre vector comme : OD260 x facteur de dilution x 1,1 x 109 vecteur particules/µL.
      Tel qu’établi à l’étape 3.2.27, calculer : OD260 x 5 x 1,1 x 109 vecteur particules/µL

4. vérification du couplage par SDS-PAGE :

Remarque : Si les composés avec des masses moléculaires suffisamment élevées sont utilisés pour le couplage à des virions Ad, couplage peut être vérifiée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE). Couplage réussi puis devrait entraîner un déplacement de la bande de protéine correspond à la protéine modifiée du virion Ad, comparée à la protéine dans le virion Ad non modifié (voir Figure 4).

  1. Selon le titre calculé du vecteur (étape 3.2.28.), séparer les 1-2 x 1010 particules de vecteur par SDS-PAGE (8 %).
  2. Développer le gel par coloration à l’argent du gel39 pour détecter les bandes de protéines même faible :
    1. Préparer les mémoires tampons pour coloration à l’argent (les montants nécessaires pour 100 mL de tampon sont indiqués entre parenthèses) :
      1. Préparer le tampon 1 en mélangeant 38 mL de ddH2O, 50 % MeOH (50 mL de MeOH 100), 12 % AcOH (12 mL 100 % AcOH), et% 0.0185 HCHO (50 µL de 37 % HCHO).
      2. Préparer le tampon 2 en ajoutant 50 % EtOH (50 mL 100 % EtOH) à 50 mL de ddH2O.
      3. Préparer, tampon 3 en ajoutant 0,127 g/L Na2S2O3 (12,744 mg) pour 100 mL de ddH2O.
      4. Préparer le tampon 4 en ajoutant 2 g/L AgNO3 (0,2 g) et 0.0185 % HCHO (50 µL de 37 % HCHO) dans 100 mL de ddH2O.
      5. Préparer le tampon 5 en ajoutant 60 g/L Na2CO3 (6 g), 0.0185 % HCHO (50 µL de 37 % HCHO) et de 2,5 mg/L Na2S2O3 (0,256 mg) FD2O pour obtenir un volume final de 100 mL.
      6. Préparer le tampon 6 en mélangeant 38 mL de ddH2O, 50 % MeOH (50 mL 100 % MeOH) et 12 % AcOH (12 mL 100 % AcOH).
      7. Préparer le tampon 7 par mélanger 60 mL de ddH2O, 30 % MeOH (30 mL 100 % MeOH) et 10 % de glycérine (10 mL de glycérine 100 %).
      8. Préparer le tampon 8 en mélangeant 10 % de glycérine (10 mL de glycérine 100 %) avec 90 mL de ddH2O.
  3. Effectuer la coloration à l’argent
    1. Fixer le gel dans un tampon 1 pendant 30 min.
    2. Laver le gel dans un tampon 2 pendant 15 min.
    3. Prétraitez le gel dans un tampon 3 pendant 1 min.
    4. Laver le gel 3 fois en FD2O pendant 20 s.
    5. Imprégner le gel dans le tampon 4 pendant 20 min.
    6. Laver le gel 2 fois en FD2O pendant 20 s.
    7. Mettre le gel dans un tampon 5 jusqu'à ce que les bandes sont visibles (10 s à 10 min).
    8. Laver le gel 2 fois en FD2O pendant 2 min.
    9. Arrêter le développement en tampon 6 pendant 5 min.
    10. Conserver le gel dans un tampon 7 pendant 20 min.
    11. Stocker le gel dans la mémoire tampon de 8.
      Remarque : L’efficacité de couplage peut être déterminé en quantification densitométrique des bandes modifiées et non modifiées de la capsomères ciblées.

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Representative Results

Figure 2 montre des exemples de l’effet cytopathogène (ECP) sur les 293 cellules (HEK 293) qui indique la production réussie de vecteur. Cellules devraient montrer la morphologie (Figure 2) 40 à 48 heures après l’inoculation avec le vecteur de virus. La droite validant pour la récolte est crucial pour ne pas perdre des particules virales par lyse cellulaire et empêche l’oxydation des groupes thiol génétiquement introduites. Si le vecteur particules sont libérées dans le milieu de la lyse cellulaire, les thiols génétiquement introduites seront presque immédiatement devenir oxydés, et il deviendra difficile de purifier et de les modifier chimiquement.

La figure 3 montre les bandes de CsCl exemplaires. Le but du discontinu CsCl baguage avant modification chimique consiste à éliminer les débris cellulaires dans les particules de virus. La modification elle-même peut alors avoir lieu en CsCl. Le baguage deuxième après modification chimique sert à supprimer l’excès de portion de couplage (n’ayant pas réagi). À noter une modification réussie du virus n’est pas visible dans le dégradé et nécessite une analyse moléculaire, idéalement par SDS-PAGE complémentaire.

La figure 4 montre des exemples typiques de modifications de la capside réussie. La plupart moitiés couplés à capsomères spécifiques vont modifier le comportement en cours d’exécution des capsomères respectifs en SDS-PAGE. Par comparaison directe avec un contrôle non modifié, le succès de couplage peut être vérifié, et analyse densitométrique peut aider à déterminer dans l’ensemble (le pourcentage de bandes décalés et raies pour les capsomères modifié) l’efficacité de couplage.

Figure 1
Figure 1 : combiné capside génétiques et chimiques modifications des capsides vecteurs adénovirus activez covalente de polymères de blindage et de ciblage des ligands. Résidus de cystéine sont génétiquement introduites à boucles de capside sélectionnés, exposés au solvant des capsides vecteurs adénovirus pour équiper les particules de vecteur avec nouvelle réactivité chimique. Les vecteurs peuvent être produites à l’aide de protocoles et cellules conventionnelles producteur. Après la production, les résidus de cystéine génétiquement introduites sont spécifiquement et de façon covalente modifiés avec couplage thiol réactif moitiés (ligands, blindage des polymères, les glucides, les petites molécules, les colorants fluorescents, etc..). Pour le couplage, composés maléimide activé (qui forment des liaisons thioéther stable avec la surface de particules de vecteur) ou des dérivés de pyridyldisulfide (qui forment des ponts disulfures bioresponsive) peuvent être employées. Après l’accouplement, les vecteurs sont purifiés par CsCl discontinu des bandes pour retirer les moitiés de l’accouplement excès n’ayant pas réagi. PEG, polyéthylène glycol (blindage polymère) ; L, ligands (dérivés d’une grande variété de classes de la substance) ; -SH, fonctionnalité de thiol des résidus cystéine génétiquement introduites. Grâce à cette technologie, un nombre défini de molécules peut être couplé par covalence aux capsides de vecteur, et une sélection précise de l’emplacement de l’accouplement n’est possible. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : effet cytopathique durant la production de vecteur. Les cellules conventionnelles producteur (ici, des cellules HEK-293) peuvent être utilisés pour la production des vecteurs génétiquement modifiés avant modification chimique. L’apparition de CPE indique le meilleur validant pour récolter les cellules. (A) deux heures après l’infection, les cellules (B) 24 heures après l’infection et (C) cellules 40 heures après l’infection avant la récolte des cellules. Barreaux de l’échelle = 20 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : résultats exemplaires du gradient de CsCl. Gradient de CsCl avant (A, B) et après modification (C) chimique. (A) un vecteur de l’adénovirus est groupée par discontinu centrifugation en gradient de densité CsCl. La phase supérieure apparaît en verte depuis le vecteur montré la cassette d’expression ours un hCMV-promoteur-driven pour EGFP. Le virion de vecteur est groupée en une seule bande blanche dans le tiers inférieur du tube. Les deux petites bandes (ci-dessus) proviennent des particules incomplètes, qui ne soit pas perçus. (B) un vecteur exprimant EGFP Ad de cystéine-roulement avant modification chimique. (C) le vecteur même après modification. La bande dans le tiers inférieur du tube est recueillie et purifiée par une colonne de dessalement. La marque de stylo B et C marque la frontière entre les deux densités et permet d’identifier l’emplacement de la bande de vecteur qui est rassemblée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : coloration SiIver SDS-PAGE à évaluer l’efficacité du couplage. Marqueur de MW en voie 1. Un vecteur avec cystéines introduits dans la base de penton capsomères et hexon restait non modifié (piste 2) ou modifiées avec maléimide activé PEG (polyéthylène glycol) avec un poids moléculaire de 5 kDa (piste 3). Hexon tant penton base présentent un changement au cours de la SDS-PAGE, indiquant les modifications de > 90 % des monomères par capside. Un vecteur avec un résidu de cystéine dans hexon restait non modifié (piste 4), modifié avec 5 kDa PEG (piste 5) ou 20 kDa PEG (voie 6). Il est à noter que le plus grand déplacement de la bande hexon est en raison du poids moléculaire plus élevé de la 20 kDa PEG, par rapport à la 5 kDa PEG (piste 5). Le gel montre la spécificité et l’efficacité de l’accouplement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

L’efficacité par lequel les cystéines génétiquement introduits peuvent être chimiquement modifiés est typiquement 80 à 99 %, et certaines variables influent sur ce rendement. Tout d’abord, il est primordial que les cystéines génétiquement introduites ne subissent pas d’oxydation prématurée. Tout en étant bien protégé dans l’environnement réducteur des cellules producteur, il est obligatoire de fournir un environnement sans oxydation après la sortie de vecteur de particules provenant des cellules de producteur et au cours de la modification chimique. À cette fin, réduisant les réactifs peut être utilisé à des concentrations de 0,1 à 10 mM, et il est nécessaire d’utiliser des réactifs réducteurs qui ne contiennent pas de groupements thiol, qui seraient facilement réagir avec les composés maléimide activé. En second lieu, lors de l’utilisation de composés maléimide activé, pH au cours de la réaction de couplage ne doit pas dépasser 7.35, depuis un pH supérieur à 7,4 peut diminuer la spécificité de la réaction. En troisième lieu, dans tous les cas, amines libres tampons (p. ex., HEPES, PBS) devraient être utilisés pour la réaction. À noter, les particules de vecteur de cystéine-roulement peuvent être purifiés par CsCl double cerclage comme décrit, puis stockée dans HEPES/10% glycérol avant modification chimique. Dans ce cas, 0,1-1 mM TCEP devrait être utilisé un réactif réducteur, ou de préférence, les vecteurs doivent être stockés dans une atmosphère d’argon. Récipients en plastique rempli d’argon avec couvercles peuvent être utilisés à cet effet. En outre, efficacité de la modification est influencée par le diamètre hydrodynamique du composé couplé aux capsides et le site auquel il est couplé. Nombreux capsomères pouvant servir de cibles pour la modification de geneti chimiques spécifique sont présents dans la capside trimères (fibre, hexon) ou pentamères (penton base). Par conséquent, selon l’emplacement de la cystéine génétiquement introduite, une molécule de portion couplée à un seul monomère pourrait entraver stériquement le couplage d’une autre molécule de monomère voisine. On devrait considérer lors du choix des sites idéaux pour les modifications chimiques geneti capside.

Pour faciliter le dépannage, quelques problèmes peuvent surgir en suivant le protocole décrit. Vecteur tout d’abord, faibles rendements (moins de particules de 10 000 vecteur par cellule producteur) peuvent résulter de sous-optimale infection des cellules de producteur. Idéalement, 100-300 MOI doit être utilisé pour l’infection de cellules de producteur. Veuillez noter que les deux montants de vecteur trop élevé et trop faible pour l’inoculum génèrent des rendements sous-optimaux. Il est idéal pour le producteur la veille de l’infection des cellules de passage. Deuxièmement, graisseux des bandes dans le gradient de CsCl peuvent apparaître. La raison la plus fréquente d’aspect graisseux des bandes dans le gradient de CsCl est un pH des solutions CsCl qui est trop acide. Le réactif réducteur PTCE est très acide, et il faut pour ajuster le pH avant de charger le vecteur sur la pente, puisque les vecteurs adénovirus se désintègrent facilement en milieu acide. Troisièmement, faible couplage efficacités (< 80 % de couplage) sont le résultat plus fréquent des préparations impur vecteur et/ou oxydation prématurée des groupes thiol sur l’aire de vecteur. Impuretés peuvent être détectées par SDS-PAGE et coloration à l’argent. Dans le cas où surviennent des impuretés significatives, la production de vecteur doit être redémarrée. En outre, couplage faible efficience peut être causée par des thiols non vectoriels gratuits dans la réaction. Par conséquent, il est conseillé de ne pas servir la réduction de réactifs, puisque les deux contiennent des groupements thiol libre de β-mercaptoéthanol ou le dithiothréitol. De la note, pour sélectionner les sites accessibles solvant d’introduire les résidus de cystéine qui peuvent facilement être modifiés, les structures cristallines doivent être utilisés ; dans le cas contraire, les cystéines ne sont pas toujours accessibles pour le partenaire d’accouplement. Oxydation prématurée des thiols sur la surface de vecteur peut être évitée par l’utilisation rigoureuse d’argon et/ou TCEP.

Enfin, des calculs stoechiométriques incorrects peuvent aussi conduire à couplage faible efficacité. L’exemple suivant est destiné à illustrer la formule générique présentée ci-dessus et de faciliter les calculs stoechiométriques. Dans l’exemple, une cystéine est introduit dans l’hexon capsomères. Le titre de particules vecteur après le CsCl première étape de purification dégradée est déterminé 1,5 x 1010 particules de vecteur par µL, ainsi que la portion de l’accouplement, malPEG-750 est utilisé. Chaque capside vecteur contient 720 hexon protéines (240 trimères), donc le titre de cystéines par µL se résume donc à 720 x 1,5 x 1010 = 1,08 x 1013 cystéines/µL. Afin de modifier 1,5 mL de particules de vecteur, un total de 1,62 x 1016 cystéines doivent faire réagir avec la portion de couplage. Pour arriver à couplage efficace, 50 x excès molaire du couplage composé au total de résidus de cystéine est recommandé : 1,62 x 1016 x 50 = 8,1 x 1017 molécules de malPEG-750 est nécessaire de coupler efficacement à la 1.5 x 1016 cystéines de 1,5 mL de solution de vecteur purifiée par le premier gradient de CsCl étape. MalPEG-750 présente un poids moléculaire de 750 Da ; par conséquent, 6.022 x 1023 molécules de malPEG-750 pèse 750 g. Par conséquent, pour un couplage efficace de le 1,62 x 1016 résidus de cystéine dans 1,5 mL de solution de vector avec un excès de 50 x de malPEG-750, 8,1 x 1017 molécules de malPEG-750 = (750 x 8,1 x 1017) / (6 022 x 1023) = 1 x 10-3 g = 1 mg malPEG-750 sont nécessaires.

La méthode présentée complète et dépasse la méthode du vecteur PEGylation. Conventionnelle, amine-directed vecteur PEGylation ne permet pas de fixation spécifique au site de blindage ou ciblant les moitiés, tandis que la technologie de couplage geneti chimiques présentée ici peut être utilisée pour fixer précisément moitiés au vecteur adénovirus faces aux positions définies et dans le nombre de copies défini. Par conséquent, il est convenable pour les blindages et ciblage des particules vecteurs adénovirus.

À noter, ce protocole permet également pour une conventionnelle PEGylation amine dirigée des vecteurs de publicité mentionnées ci-dessus. Dans ce cas, le réactif réducteur PTCE peut figurer dans les tampons. Pour les calculs stoechiométriques, le nombre de groupes amine accessible par particule peut être considérée comme 18 000 et typiques excès molaires des portions de couplage amine-réactives sont 20-100 fois.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vector purification and chemical modification
Argon gas Air liquide local gas dealer
Liquid Nitrogen Air liquide local gas dealer
500 mL centrifuge tubes Corning 431123
Stericup Express Plus 0.22 µm Millipore SCGPU02RE
Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) Sigma-Aldrich C4706-10g
2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) Henke Sass Wolf 4020.000V0
Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) Henke Sass Wolf 4710009040
Caesium chloride 99.999% Ultra Quality Roth 8627.1
Silica gel beads Applichem A4569.2500
Methoxypolyethylene glycol maleimide - 750 (PEG mal-750) Iris Biotech store in silica gel beads at -80 °C
13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 344059 only open in hood
PD-10 size exclusion chromatography column GE Healthcare 17-0851-01 store at 4 °C
Hepes AppliChem A1069.1000
SDS Ultrapure AppliChem A1112,0500
Glycerol AppliChem A1123.1000
Name Company Catalog Number Comments
Material for cell-culture
DPBS PAN Biotech P04-36500
DMEM PAN Biotech P04-03590
Trypsin/EDTA PAN Biotech P10-0231SP
FBS Good PAN Biotech P40-37500
Penicillin/Streptomycin PAN Biotech P06-07100
Biosphere Filter Tips (various sizes) Sarstedt
Serological Pipettes (various sizes) Sarstedt
reaction tubes (various sizes) Sarstedt
TC plates 15cm Sarstedt 83.3903
Name Company Catalog Number Comments
Material for silver staining protocol
Methanol J.T.Baker 8045
Ethanol absolute AppliChem 1613,2500PE
Acetic Acid AppliChem A0820,2500PE
Formaldehyde 37% AppliChem A0877,0250
Ethanol absolute AppliChem A1613,2500PE
Sodium thiosulfate AppliChem 1,418,791,210
Silver nitrate AppliChem A3944.0025
Sodium carbonate AppliChem A3900,0500
Name Company Catalog Number Comments
Special Lab Equipment
Desiccator Nalgene 5311-0250
Megafuge 40 Heraeus
Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes Heraeus
Water bath Conventional
Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 Beckman Coulter
suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 Beckman Coulter
pH -Meter Conventional
Stand with clamps Conventional
Goose neck lamp Conventional
Over-head rotor Conventional
Thermal Block Conventional
Photometer (OD 260) Conventional

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