Genetik ve kimyasal kapsid değişiklikler Adenovirus tabanlı gen transferi vektörlerin koruyucu ve hedefleme için kombine

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Burada açıklanan protokol araştırmacılar özellikle adenovirus capsids seçilen siteler tarafından basit Kimya değiştirmek sağlar. Korumalı adenovirus parçacıklar vektörler ve yeniden hedeflenen gen transferi vektörel çizimler oluşturulacak ve vektör ana etkileşimler okudu.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Jönsson, F., Hagedorn, C., Kreppel, F. Combined Genetic and Chemical Capsid Modifications of Adenovirus-Based Gene Transfer Vectors for Shielding and Targeting. J. Vis. Exp. (140), e58480, doi:10.3791/58480 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Adenovirus vektörel çizimler genetik aşı ve oncolytic virotherapy için güçlü araçlardır. Ancak, onlar özellikle vivo içinde doğumdan sonra birden çok istenmeyen vektör-ana bilgisayar etkileşimlerine yatkındır. Bu istenmeyen vektör-ana etkileşimler tarafından uygulanan sınırlamaları yalnızca olabilir bir fikir birliği vektör yüzey tanımlanmış değişiklikler yapılıyorsa aşılması. Bu değişiklikler istenmeyen etkileşimler gelen parçacıkların koruyucu ve yeni ligandlar giriş tarafından hedefleme içerir. Burada sunulan iletişim kuralı oluşturmak için okuyucu etkinleştirmek için hedeftir korumalı ve, isterseniz, insan adenovirus gen transferi vektörel çizimler veya oncolytic virüs kalktığınız. Protokol araştırmacılar tarafından sentetik polimerler, karbonhidratlar, lipitler veya diğer biyolojik ya da kimyasal moieties belirli kimyasal eki adenovirus vektör capsids yüzeyine değiştirmenizi sağlar. Modern teknoloji, anlayış ve adenovirus vektörel çizimler vivo içinde teslim etmek için engellerin üstesinden kolaylaştırmak için gösterilen genetik ve kimyasal kombine kapsid değişiklikler açıklanır. Biyolojik olarak aktif virüs veya virüs kaynaklı vektörel çizimler ile belirli kimyasal reaksiyonlar gerçekleştirmek için çok önemli adımlar ve yorumladı ve detaylı açıklaması sağlanır. İletişim kuralında tanımlanan teknolojisi (doğal olarak yok) sistein genetik giriş dayanmaktadır artıkları içine solvent maruz döngüler adenovirus kaynaklı vektörel çizimler. Bu sistein kalıntıları sonra üretim vektörlerin yüksek titreleri için son derece özel ve verimli kovalent kimyasal kaplin vektör için çeşitli madde sınıfları moleküllerin için yararlanılabilir belirli bir kimyasal reaktivite sağlamak parçacıklar. Önemlisi, bu iletişim kuralını (thiol tabanlı olmayan) farklı kimyasal değişimleri adenovirus vektör capsids arasında geniş bir çeşitli gerçekleştirmek için kolayca uyarlanabilir. Son olarak, Adenovirus temelini bu protokolü değiştirilebilir dışında büyük olasılıkla o saran virüs dayalı gen transferi vektörel çizimler olduğunu.

Introduction

Adenovirüse bakın (Ad), Aile Adenoviridae, 70'den fazla türlerini tespit (http://hadvwg.gmu.edu) bugüne sigara saran DNA virüsler vardır. Hemaglutination özellikleri, genom yapısı ve sıralama sonuçlar bağlı olarak, 70 reklam türleri yedi tür (insan adenovirüse bakın A g)1,2ayrılabilir. İnsan reklam genom 38 KB içinde büyüklük ve icosahedral nükleokapsid3tarafından saklanmış. Onların bolluk nedeniyle, kapsid protein hexon, penton Bankası ve lif tüm için büyük kapsid protein adlandırılır. En bol ve en büyük kapsid protein hexon her 12 hexon homotrimers4,5/ oluşan 20 kapsid esaslarını oluşturur. Her icosahedral kenarında (vertex), bulunan Penton penton Bankası pentamers oluşur ve glikozile fiber trimers5,6/ inşa vertex spike için temel temsil eder. Yerel Ad hücre giriş temel olarak iki büyük adımlardan oluşur. İlk olarak, fiber topuzu birincil reseptör bağlar. A, C, E ve F türlerden reklam türleri'nde, coxsackie ve adenovirus reseptör (araba) bu. Bu etkileşim böylece hücresel integrinler ve RGD-motif arasındaki etkileşimler penton temel ve sonuç olarak ikna hücresel yanıt-e doğru kolaylaştırmak ve hücre yüzey kayma yakınlık virion getiriyor. İkinci olarak, virion ve taşıma endosome7içselleştirilmesi sitoiskeleti değişimler yol. Endosome yılında kısmi sökme virion yayımlandıktan sonra sitoplazmaya und sonuçta çoğaltma için çekirdek gitmektedir.

Reklam yerel olarak teslim edilebilir iken (Örn., genetik aşılama için), onko-virotherapy için gerekli kan yoluyla sistemik teslim yüzleri çeşitli engelleri. Kan dolaşan süre enjekte virions savunma sistemi ana bilgisayarın bağışıklık sisteminin virüs tabanlı vektörel çizimler hızlı nötralize için önde gelen ve reklam tabanlı vektörel çizimler sistemik uygulamalarda son derece verimsiz işleme, karşılaşma. Ayrıca, reklam doğal hepatotropism sistemik teslimatla engelleyen ve onun yeni hedef hücrelere Ad yönlendirmek çözümlenmesi gerekir.

Doğuştan gelen bağışıklık sisteminin doğal IgM antikor germline kodlanmış hızla tanımak ve son derece tekrarlayan yapıları virion8,9yüzeyinde bağlayın. Bu immün komplekslerin ardından için8virions büyük bir bölümünü hızlı kompleman aracılı nötralize lider Kompleman sistemi, klasik ve klasik olmayan yollar etkinleştirin. İkinci bir yol reklam virions büyük kaldırılması sonucu makrofajlar10 tarafından aracılık ve akut toksik ve haemodynamic yan etkileri11,12ile ilişkili. Reklam durumunda özellikle, karaciğerde bulunan hücreleri bağlamak ve phagocytically Ad virions üzerinden belirli çöpçü reseptörler, böylece almak Kupffer onları kan13,14,15 ortadan kaldırmak . Belirli çöpçü reseptörler Ayrıca karaciğer sinüsoidal endotel hücreleri (LSE)16tarihinde tespit edilmiştir ve LSE hücreleri de vektör eleme17ama ne ölçüde, yine açıklama ihtiyacı için katkıda bulunmak gibi görünüyor. Ayrıca, bazı reklam türleri ve onların türetilmiş vektörler verimli bir şekilde hangi onlar bağlamak yolu ile araba veya kompleman reseptör CR119insan eritrositler18 tarafından münzevi. Notun, iyon bu mekanizma fare modeli sistemi olduğu gibi insan eritrositler kontrast Okulu'nu olamaz, fare eritrositler araba ifade değil.

Reklam reklam ile önceki enfeksiyonlar nedeniyle maruz kaldıktan sonra veya sistemik uygulamalarında ilk doğumdan sonra edinilmiş bağışıklık sistemi tarafından oluşturulan özel anti-reklam antikorlar reklam vektörel çizimler etkin kullanımı için başka bir engel yükseltmek ve onlar içinde yapmamış verimli bir şekilde sistemik teslim.

Son olarak, bazı reklam türleri ciddi (Ad5 dahil) güçlü hepatotropism sistemik tedavi reklam uygulama engeller. Reklam virion yüksek benzeşimi için FX etkileşim reklam hexon protein20,21,22aracılı kan pıhtılaşma faktör X (FX), hepatosit iletim kaynaklanan bu tropism kaynaklanmaktadır. FX virion heparin sülfat glukanlardir (HSPGs) tetkikine20,23,24,25yüzeyi için köprü. Bu etkileşim için önemli bir faktör olan diğer hücre türleri üzerinde HSPGs farklıdır belirli ölçüde, N - ve O-sulfation, karaciğer hücreleri24, HSPGs olacak gibi görünüyor. FX-aracılı bu yolu yanı sıra son yıllarda yapılan çalışmalarda daha da yolları tespit henüz reklam iletim tetkikine26,27,28o sonucu öneririm.

Son zamanlarda, bu FX sadece reklam hepatosit iletim dahil değildir, ama aynı zamanda bağlama tarafından virion virüs parçacık nötralizasyon karşı kalkan Kompleman sistemi26tarafından gösterilmiştir. FX bağlama, önleme tarafından hepatosit iletim azalma bu nedenle, doğuştan gelen bağışıklık sistemi nötralizasyon reklam yoluyla artan istenmeyen yan etkisi yaratacak.

Vektörel çizimler ve ana bilgisayar organizmalar arasındaki karmaşık etkileşimler derin bir bilgi bu nedenle ana bilgisayarın organizma tarafından dayatılan engelleri aşmak sistemik uygulamalar için daha verimli vektörel çizimler geliştirmek gereklidir.

Başlangıçta terapötik proteinler için kullanılan bir strateji için reklam vektörel çizimler en azından kısmen yukarıda açıklanan önündeki engelleri aşmak adapte edilmiştir. Antigenicity ve terapötik protein bileşiklerin immünojenisite Polietilen glikol (PEG)29,30kaplin tarafından azaltılabilir. Bu nedenle, polimerler PEG veya poli [N-(2-HİDROKSİPROPIL) methacrylamid] gibi kovalent kaplin (pHPMA) için kapsid yüzey istenmeyen vektör-ana etkileşimler öğesinden kalkanlar. Genellikle, polimer kaplin kapsid görünüşte rasgele dağıtılır lizin yan artıkları ε-Amin grupları hedefler. Çözüm vektör parçacıklar bağlı polimerler hidrofilik yapısı nedeniyle bağışıklık hücre tanıma veya enzimatik bozulması riskini azaltır bir istikrarlı su kabuk tarafından çevrilidir. Ayrıca, pegile reklam vektörel çizimler anti-hexon antikorlar vitro ve önceden aşılı fareler vivo içinde31nötralizasyon kaçmasına gösterilmiştir. Genetik kapsid değişiklikler aksine, polimerlerin kimyasal kaplin üretim ve arıtma, sadece geleneksel üretici hücreler ve üretim yüksek titresi vektör stoklarının, aynı zamanda kullanımı için değil, aynı anda izin sonra gerçekleştirilir amino asitler kapsid yüzeyinde binlerce modifikasyonu. Ancak, Amin yönelik koruyucu rasgele yüksek heterogeneities kaynaklanan ve belirli capsomers değiştirilmesi için izin vermiyor bütün kapsid yüzeyi boyunca ortaya çıkar. Ayrıca, yararlı etkileri için gerekli büyük polimer moieties virüs bioactivity32zarar.

Bu sınırlamalar, Kreppel ve arküstesinden gelmek için. 33 geneti-kimyasal kavramı vektör re - ve de-hedefleme tanıttı. Katıldı genetik olarak virüs kapsid solvent maruz pozisyonlarda fiber HI-döngü33, protein IX34ve hexon35,36gibi içine tanıtıldı. -E karşın değil doğal olarak meydana gelen, sistein-yatak reklam vektörel çizimler, normal yapımcı hücrelerdeki yüksek titreleri üretilebilir. Önemlisi katıldı belli capsomers ve tek bir capsomer içinde farklı konumları ekleme thiol grup reaktif moieties çok özel değişiklikler için sağlar. Bu geneti-kimyasal yaklaşım reklam vektör tasarımı içinde sayısız engelleri aşmak için gösterilmiştir. Amin tabanlı PEGylation için detargeting ve transferrin HI-döngü başarıyla yeniden Ad vektörel çizimler araba-eksik hücrelerin33değiştiren kanıtlanmıştır fiber düğmesi, thiol tabanlı bağlantı kombinasyonu. Hexon (antikorlar, kan pıhtılaşma faktörü FX nötralize) en istenmeyen etkileşimlerde ilgilenmektedir beri thiol tabanlı değişikliği stratejileri de hexon için uygulandı. Büyük PEG moieties hepatosit iletim14,35artış ise küçük PEG moieties hexon HVR5 için kaplin reklam vektör parçacıklar SKOV-3 hücreleri FX, huzurunda transduce engelledi. Reklam vektör parçacıklar mutasyonlar taşıma araba bağlama inhibe fiber topuzu ve HVR7 inhibe bağlama FX (ve HVR1 pozisyon özel PEGylation için eklenen taşıyan katıldı) antikor ve kompleman aracılı nötralizasyon kaçmasına gösterilmiştir, Çöpçü reseptör aracılı alımını yanı sıra infektivite kaybı olmadan. İlginçtir, doğal FX kalkan olmamasına rağmen PEGylation yeniden, Windows PEG boyutu36bir fonksiyonu olarak hepatosit iletim geliştirilmiş. Ancak, kovalent koruyucu bir etkisi hücre içi ticaret işlemleri olması gösterildi. Prill ve ark. geri dönüşü olmayan pHPMA üzerinde dayalı ve ben de koruyucu ne de kopolimer şarj modu hücreye girişi üzerinde etkili oldu ama parçacık çekirdeğine kaçakçılığı etkilediğini gösterdi bioresponsive kalkanlar karşı karşılaştırıldığında. Pozitif yüklü pHPMA Co polimerler parçacık çekirdeğine reklam yüksek iletim verimliliği korumak, kaçakçılığı için izin ile bir bioresponsive kalkan istihdam vitro ve in vivo37vektörler.

Özet olarak, tüm vektör-konak-etkileşimleri bilinen ve kabul olduğunu bile varsayımı, aşırı kapsid yüzey modifikasyonlar sistemik vektör teslimatla ilişkili engelleri aşmak gerekli olduğunu, bu verileri belirtmek.

Burada siteye özgü kimyasal değişimleri arasında adenovirus vektör capsids koruyucu ve/veya adenovirus vektör parçacıklar ve adenovirus tabanlı oncolytic virüs yeniden hedefleme için gerçekleştirmek için bir protokol sağlar. Bu teknoloji kavramı Şekil 1' de gösterilmiştir. Bu istenmeyen etkileşimler belirli kapsid bölgelerden koruyucu sentetik polimerler kovalent eki tarafından sağlar. Aynı anda, aynı zamanda ligandlar iliştirin ve koruyucu ve hedefleme birleştirmek için bir yol sağlar. Basit kimya kullanarak, Denemecileri kovalent adenovirus vektör yüzey molekülleri dahil peptidler/proteinler, karbonhidratlar, lipitler ve diğer küçük moleküller çok çeşitli ile değiştirmek mümkün olacak. Ayrıca, protokol biyolojik olarak aktif virüs kaynaklı vektörel çizimler onların biyolojik bütünlüğünü ve etkinlik bakım altında kimyasal modifikasyonu için genel bir kavram sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: aşağıda, vektör ayrıntılı olarak anlatılan bir reklamın geneti-kimyasal PEGylation için bir iletişim kuralı. PEG yan belirli kaplin etkinleştirmek için bir Ad5 vektörü önceden genetik olarak yapıldı sistein kalıntı hexon protein hypervariable döngü 5, içine bir önceki yayın36ve maleimide aktive PEG bölümünde açıklandığı gibi tanıtarak değiştirilme tarihi bileşik kaplin bileşik olarak kullanılır.

1. CsCL adım gradyanlar tarafından vektör arıtma için arabellekleri hazırlanması

  1. Adenovirus arabelleği (Ad-tampon) 400 mL 50 mM HEPES (4,76 g/400 mL) ekleyerek hazırlamak ve 150 mM NaCl (3.504 g/400 mL) çift distile su (GKD2O) için. Bu arabelleği 350 mL aşağıdaki üç Ad-tampon değişik hazırlamak için gereklidir.
    1. Varyant A: Ad-tampon 150 mL pH 7,6 NaOH ile için ayarlayın.
    2. Varyant B: 10 mM TCEP [tris(2-carboxyethyl)phosphine), 0.143 g] son bir konsantrasyon 50 mL için eklemek ve pH 7.2 HCl ile için ayarlayın.
    3. Varyant C: 0,5 mM TCEP (0,022 g) son bir konsantrasyon için 150 mL ekleyin ve pH 7.2 HCl ile için ayarlayın.
    4. GKD2O arabellekleri hazırlamak ve analitik sınıf kimyasallar. CsCl arabellekleri hazırlamak için 100 mL her varyant A ve değişken C kullanın (bkz: adımlar her 1.2 ve 1.3; 50 mL) CsCl adım degradeler için gerekli (adımlar 3.2.6 bkz. ve 3.2.18).
  2. CsCl adım degrade tampon hazırlama (ρCsCl = 1,41 g/cm3) içinde reklam-tampon
    Not: Bu arabellek iki farklı varyasyonlar gerekli olacaktır:
    1. İki aliquots CsCl 27.42 g 50 mL tüpler içine tam olarak tartın.
    2. ΡCsCl 1,41/TCEP arabellek =: CsCl Ad-tampon C varyantı 40 mL gidermek.
    3. ΡCsCl 1,41 arabellek =: 40 mL değişken A Ad-arabelleği CsCl çözmek.
    4. Kontrol edin ve gerekirse, pH kadar karşılık gelen Ad-arabellek VARIANT ile tam olarak 50 mL HCl. dolgu ile ayarlayın. En iyi ayrılık sonuçlar elde etmek için tam CsCl konsantrasyonu ve pH önemlidir.
    5. Yoğunluk (CsCl içerik) her degrade tampon 1 mL (1.41 g) ağırlığında tarafından kontrol edin.
  3. CsCl adım degrade tampon hazırlama (ρCsCl = 1.27 g/cm3) içinde reklam-tampon
    Not: Bu arabellek iki farklı varyasyonlar gereklidir:
    1. İki aliquots CsCl 18.46 g 50 mL tüpler tam olarak tartın.
    2. ΡCsCl 1,27/TCEP arabellek =: CsCl Ad-tampon C varyantı 40 mL gidermek.
    3. ΡCsCl = 1.27 arabellek: 40 mL değişken A Ad-arabelleği CsCl çözmek.
    4. Kontrol edin ve gerekirse, pH HCl ile ayarlayın. Son olarak, karşılık gelen Ad-arabellek VARIANT ile tam olarak 50 mL kadar doldurun. En iyi ayrılık sonuçlar elde etmek için tam CsCl konsantrasyonu ve pH önemlidir.
    5. Yoğunluk (CsCl içerik) her degrade tampon 1 mL (1,27 g) ağırlığında tarafından kontrol edin.
  4. Steril şişe içine filtrasyon (0,45 µm kafes gözenek boyutu kullanarak) sayesinde tüm arabellekleri (Ad-arabellekleri ve CsCl adım degrade arabellekleri) sterilize.
  5. Sterilizasyon sonra TCEP oksidasyonunu önlemek için doyurmak ve arabellekleri için yaklaşık 30 argon gazı ile sparging tarafından argon ile TCEP içeren arabellekleri yerleşimi s. Sadece steril cihazların kullanımı için özen (Örn., steril pipet ipuçları) argon gazı ve kullanım şişe argon balina izin vermek için yeterince büyük uygularken.
    Not: Tüm arabellekleri taze ve korunan ışık hazırlanmalı ve 4 ° C'de günlerce saklanabilir (sadece bir kaç günlüğüne tutulmalıdır özellikle CsCl adım degrade arabellekleri).

2. bağlantı Moieties: Depolama ve hazırlama

Not: kaplin katıldı için kullanılan Moeities thiol reaktif grup ayı gerekir. Maleimide aktif bileşikler istikrarlı thioether tahvil ile genetik olarak tanıtılan katıldı oluşturacak. Alternatif olarak, Orto-pyridyldisulfide (OPSS)-aktif bileşikler kullanılabilir, hangi vektör parçacıklar ve kaplin yan arasında bioresponsive disülfür köprü oluştururlar. Liyofilize malPEG-750 yanı sıra çoğu kaplin reaktifler hidroliz için hassas ve kuru-80 ° C'de liyofilize toz şeklinde depolanması gereken

  1. Su şişeleri çözdürme üzerine yoğuşmalı birikmesini önlemek için daha büyük tüplerde şişeleri depolamak (Örn., 50 mL tüpler) silika jel boncuklar bir yastık ile dolu. Bu tüpler de bir silika jel boncuk yastık ile dolu bir yeterli büyük konteyner saklayın.
  2. Sıkı bir şekilde her tüp ve kapsayıcı kapatmadan önce argon gazı ile hava değişimi. Bu açık tüpler ve kapsayıcılar ardından kaldırma ve argon gazı ile hava yerine bir desiccator içine yerleştirerek elde edilebilir. Argon gazı havadan daha ağır olduğu için tüpler ve kapsayıcılar argon gazı ile dolu ve şimdi birbirlerine sıkıca kapalı her kapak ile yerleştirilebilir.
  3. Konteyner-80 ° C'de depolayın
  4. Çözdürme zaman konteyner silis boncuklar üzerine bir desiccator yeri ve yavaş yavaş onları oda sıcaklığına kadar sıcak sonra depoyu açın.
  5. Kaplin reaksiyon gerçekleştirirken, taze uygun çözücü gerekli substrat kaplin miktarını gidermek. Özellikle DMF veya DMSO kaplin substrat için solvent kullanılırsa, çözüm son kaplin tepki kaplin fazla % 10 eklememek için dikkat ediniz.

3. güçlendirme, arıtma ve reklam vektörel çizimler kimyasal modifikasyonu:

  1. Reklam vektörel çizimler amplifikasyon
    Not: Aşağıdaki adımları kullanarak yerel biyolojik güvenlik kurallarına göre bir güvenlik kabini gerçekleştirilmelidir.
    1. Bir çoğaltma eksik ∆E1 reklam vektör Kratzer ve Kreppel38tarafından açıklandığı gibi HEK 293 hücrelere bir (veya birkaç) genetik olarak tanıtılan sistein residue(s) içeren transfect.
    2. İletişim kuralı göre38, 15-20 büyük (15 cm) hücre kültür levhaların (yaklaşık 1-2 x 107 hücreler/plaka) son bir partiye hazırlık enfeksiyon kadar sıralı reinfections tarafından vektör yükseltmek.
      Not: tam cytopathic etkisi (CPE) arıtma ve değişiklik performans sabah hücreleri gösterir böylece en iyi şekilde, son bulaşmalara zaman aşımına uğradı (bkz: Şekil 2).
    3. Son amplifikasyon adımdan sonra resuspended reklam tampon + 10 mM TCEP (varyant B) hücreleri-80 ° C'de donmuş olabilir; Ancak, için en iyi verim vektör parçacıkların hücre lizis ve vektör arıtma ve değişiklik hemen bir takip önerilir.
  2. Reklam vektörel çizimler arıtma ve kimyasal modifikasyonu
    Not: Vektörel çizimler arıtma açıklanan adenovirus arıtma protokolüne göre gerçekleştirilir38Ama sigara oksitleyici koşullar altında. Hücre hasat ve lizis yanı sıra vektör arıtma ve kimyasal değişiklik 1 gün içinde yapılabilir. Hasat ve daha önce açıklanan protokolüne göre enfekte hücreleri parçalayıcı38.
    1. Tabakları kazıma ve süpernatant 200-500 mL aralıklarla tüpler için aktarma tarafından hücreleri toplamak.
    2. Hücre çözümü 10 dk 400 x g az için spin.
    3. Hücre Pelet 4 mL reklam-tampon + 10 mM TCEP (pH 7.2) (varyant B) ve steril 50 mL tüp transferi resuspend. Hücre verim düşükse veya sadece zayıf bir CPE akımıdır, 2 mL resuspend.
    4. Vektör (sıvı azot) dondurma ve çözme (bir 37 ° C su banyosu) 3 kür tarafından kurtarma.
    5. 5000 x g 4 ° C'de 10 dakika için spin
    6. Centrifuging ise, iki eşit CsCl adım degradeler hazırlayın:
      1. Önce daha düşük faz olarak 1,41 g/cm3 ρCsCl 3 mL reklam-tampon + 0,5 mM TCEP (pH 7.2, değişken C) ultracentrifuge tüpler içine ekleyin. Üst aşama yükleme önce alt aşama tüp düzeyini işaretleyin.
      2. Dikkatle 1.27 g/cm3 ρCsCl Ad-tampon + 0,5 mM TCEP (pH 7.2, değişken C) 5 mL üst aşaması çok yavaş 5 mL cilt tüp daha düşük faz üzerine duvarlar boyunca pipetting tarafından yığını.
        Not: Beri bağlantı sırasında TCEP yüksek konsantrasyon malPEG-750 maleimide kalıntı ile tepki ve azaltılmış kaplin verimliliği, arıtma adım degrade zaten düşük bir TCEP konsantrasyon altında yapılması gereken CsCl tarafından yol.
    7. CsCl gradyan üzerine süpernatant yük [ya eşit süpernatant üzerine her iki degradeler veya düşük vektör verim (yukarı bakın) durumunda bölmek, tek bir sütuna süpernatant yük] ve üst eşit her iki gradyanlar doldurun reklam tampon + 10 mM TCEP (pH 7 ile .2, varyant B).
    8. 0.0 g ağırlık farkı için ters tüpler ağırlığını ayarlamak.
    9. Ultracentrifuge 176,000 x g 4 ° C'de 2 h için
    10. Bir kelepçe ile daha düşük Faz düzey işareti çevresini erişilebilir bırakarak bir stand ultrasantrifüj tüp düzeltmek. Boynu lamba tüpü yukarıda yerleştirin. Alt ve üst aşama arasındaki sınırda işareti etrafında farklı bant (vektör virions) görünür (Şekil 3A-3 C) olmalıdır.
    11. Tüp bir iğneyle delme ve vektör grubun bir şırınga aspiring vektörler toplamak. Toplanan vektör virions 15 mL tüp aktarın.
      Not: Yukarıda reklam vektör grubun zayıf bantları eksik vektör parçacıkları içeren ve aspirasyon için kaçınılmalıdır. Hücre artıkları ve floresan protein (EGFP) EGFP ifade Ad-vektörel çizimler-ecek toplamak ultracentrifuge üst kısmındaki yeşil (bkz: Şekil 3A ve 3B) tüp. Vektörler şimdi düşük TCEP konsantrasyonu nedeniyle bağ disülfür için mantıklı olduğu gibi bu ve (adım 3.2.16) kaplin kadar aşağıdaki adımları hızla, yapılmalıdır.
    12. Tüm sistein kalıntıları vektör hazırlık için belgili tanımlık substrate verimli eksiksiz bağlama için gerekli bağlantı substrat miktarı hesaplamak için OD260tedbir:
      1. Kratzer ve Kreppel38, girdap toplanan vektör virions 10 µL karışımı, reklam arabelleği 89 µL ve 1 µL % 10 SDS tarafından açıklanan protokole göre. Bir boş sonda, girdap 99 µL reklam-arabelleği ve 1 µL % 10 SDS.
      2. Virions denatüre için 10 dk 56 ° C de kuluçkaya.
      3. OD260belirlemek.
      4. Fiziksel vektör titresi başına µL aşağıdaki eşitliği kullanarak hesaplar: OD260 reklam ampirik olarak kararlı tükenme katsayısı x seyreltme faktörü x (109 vektör parçacıklar x 1.1 = 1 OD260 birim/µL). Bu nedenle, bir vektör 1.36, ölçülen OD260 1:10 seyreltilmiş, için hesaplamak: 1.36 x 10 x 1.1 x 109 = yaklaşık 1.5 x 1010 vektör parçacıklar/µL.
        Not: Bu titresi sadece kaba bir tahmin olduğunu; Ancak, aşağıda özetlenen stokiometrik hesaplamalar için yeterince doğru.
    13. Bir sistein giriş tarafından değiştirilmiş protein bağlı olarak, aşağıdaki genel denklemi göre bir verimli kaplin tepki için (içinde gram) kaplin substrat miktarını belirlemek: virüs titresi Birim x x katıldı sayısı yan fazlalığı x x Moleküler ağırlık yan / 6,022 x 1023 = substrat kaplin gram.
      Not: Bu denklem içinde: 1) virüs titresi titresi/µL, yukarıda, serbestçe vektör kaplin tepki olarak kullanılan µL hacmindeki hesaplarında 2) birim açıklandığı gibi OD260 tarafından belirlenen, 3) katıldı sayısı olan protein sayısıdır sistein kalıntı vektör parçacık, 4 tanıtıldı) yan fazlalığı olduğunu yan aşırı gerekli bir verimli kaplin reaksiyon (50 x) ve 5 faktör) yan molekül ağırlığı Da (değil kDa) tanıttı.
    14. Taze bileşik miktarı gidermek (veya uygun tutar) uygun solvent gerekli.
      Not: gerekli kaplin substrat miktarı düşük ve tartmak zor ama pahalı olduğu için bileşik mümkün asgari tutarda tartmak ve kaplin tepki için uygulama için uygun bir konsantrasyon geçiyoruz.
    15. Vektör çözüm bir uygun boyutu tüp (Örneğin, 2 mL tüp) aktarmak ve bileşik hisse senedi çözüm için vektör kaplin Hesaplanan tutar ekleyin.
    16. Oda sıcaklığında 1 h için genel gider denemeyi tarafından çözüm karışımı yavaşça.
    17. Reklam-tampon (pH 7,6, değişken A) ile 6 mL toplam birim vektör çözüm kadar doldurun.
      Not: Bu adım adım degradenin hala CsCl ilk adım degrade içerir, vektör çözüm bir yoğunluk 1.27 g/mL altında olduğundan emin olmak için çözüm uygulanmadan önce gerçekleştirilmelidir.
    18. Bir ikinci CsCl bantlama adımda, unreacted kaplin yan vektöründen arındırmak:
      1. Her biri için aşağıdaki adımları uygulayarak iki eşit CsCl adım degradeler hazırlamak: 1) daha düşük Faz: 1,41 g/cm3 ρCsCl Ad-tampon (pH 7,6, değişken A), 3 mL 2) işareti düzey üst aşaması ve 3) üst aşama yükleme önce daha düşük Faz tüp : 1.27 g/cm3 ρCsCl Ad-tampon (pH 7,6, değişken A) 5 mL.
        Not: bağlantı yerini almıştır sonra ücretsiz thiol grup yok şimdi vektör capsids mevcut olması gerektiği gibi arabellekleri TCEP olmadan, kullanılır.
      2. CsCl gradyan üzerine süpernatant yük ve üst eşit her iki gradyanlar reklam önbellekle (pH 7,6, değişken A) doldurun.
      3. 0.0 g ağırlık farkı için ters tüpler ağırlıkları ayarlayın.
    19. Ultracentrifuge 176,000 x g 4 ° C'de 2 h için
    20. Kısa bir süre ultrasantrifüj sonundan önce PD-10 sütun 5 kere ile reklam-tampon (pH 7,6, değişken A) 5 mL equilibrate.
    21. Adım 3.2.10 yapılır gibi daha düşük Faz düzey işareti etrafında alan erişilebilir bırakarak durmak ultrasantrifüj tüp saptamak. Boynu lamba tüpü yukarıda yerleştirin. Yine, alt ve üst aşamalar arasına kenarlık görünür (Şekil 3 c) farklı bant (vektör virions) olmalıdır.
    22. Tüp bir iğneyle delme ve vektör grubun bir şırınga aspiring vektörler toplamak ve 15 mL tüp vektör aktarın. Her iki degrade tüpler 2.5 mL toplam hacim olarak hep birlikte veya daha az virions toplamak için dikkat ediniz. Küçük bir hacim toplanan reklam arabelleği (a değişken) ile 2.5 mL toplam hacim elde etmek isterseniz doldurun.
    23. 2,5 mL dengelenmiş PD-sütuna yerleştirin. Akışı aracılığıyla atın.
    24. 3 mL reklam arabellek (a değişken) sütuna ekleyin ve akış (arıtılmış vektör virions içeren) aracılığıyla toplamak.
    25. % 10 son bir konsantrasyon elde edilir ve uygun aliquots (Örneğin, 400 µL her) bölmek gliserol (333 µL) eklemek ve bir aliquot titresi tayini için 20 µL OD260 ölçüm tarafından dahil.
    26. Vektör çözüm-80 ° C'de depolayın
    27. Vektör titresi 20 µL vektör çözüm, reklam-arabelleği (a değişken) 79 µL ve 3.2.12 adımda anlatıldığı gibi % 10 SDS 1 µL OD260 ölçerek belirlemek. Bir boş, reklam-arabelleği (a değişken) 10 µL % 10 gliserol ve 1 µL % 10 SDS 79 µL kullanın.
    28. Vektör titresi olarak hesaplamak: OD260 x x 1.1 x 109 vektör parçacıklar/µL seyreltme faktörü.
      3.2.27 adımda hazırlanan gibi hesaplama: OD260 x 5 x 1.1 x 109 vektör parçacıklar/µL

4. bağlantı SDS-sayfa tarafından doğrulanması:

Not: bileşikler yeterince yüksek moleküler ağırlıkları ile reklam virions için bağlantı için kullanılıyorsa, kaplin polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) tarafından doğrulanabilir. Başarılı bağlantı sonra değiştirilmemiş reklam virion protein karşılaştırıldığında değiştirilmiş reklam virion protein, karşılık gelen protein grubu bir vardiyada neden (bkz. Şekil 4).

  1. Vektör (adım 3.2.28) hesaplanan titresi göre 1-2 x 1010 vektör parçacıklar tarafından SDS-sayfası (% 8) ayırın.
  2. Jel gümüş-boyama tarafından bile zayıf protein bantları algılamak için jel39 geliştirin:
    1. Arabellekleri (arabellek 100 mL için gerekli tutarlar parantez içinde gösterilir) gümüş boyama için hazırlayın:
      1. Arabellek 1 GKD2O, %50 38 mL karıştırılarak hazırlamak MeOH 100 MeOH (50 mL), % 12'si AcOH (%100 12 mL AcOH) ve %0.0185 HCHO (%37 50 µL HCHO).
      2. Arabellek %2 50 ekleyerek hazırlamak alkol (%100 50 mL alkol) 50 ml GKD2O.
      3. Tampon 3 0,127 g/L Na2S2O3 (12.744 mg) ekleyerek hazırlamak için 100 mL GKD2O.
      4. Arabellek 4 2 g/L AgNO3 (0.2 g) ve %0.0185 ekleyerek hazırlamak HCHO (%37 50 µL HCHO) 100 ml GKD2O.
      5. 60 g/L Na2CO3 (6 g), %0.0185 ekleyerek arabellek 5 hazırlamak HCHO (%37 50 µL HCHO) ve 2,5 mg/L Na2S2O3 (0,256 mg) 100 mL son hacmi elde etmek için GKD2O için.
      6. GKD2O, %50 38 mL karıştırılarak arabellek 6 hazırlamak MeOH (%100 50 mL MeOH) ve % 12'si AcOH (%100 12 mL AcOH).
      7. GKD2O, %30 60 mL karıştırılarak arabellek 7 hazırlamak MeOH (%100 30 mL MeOH) ve % 10 gliserin (10 mL % 100 gliserin).
      8. Arabellek %8 10 gliserin (10 mL % 100 gliserin) karıştırılarak GKD2O. 90 mL ile hazırlamak
  3. Gümüş boyama gerçekleştirme
    1. Jel 30 dk için arabellek 1 fix.
    2. Jel arabellek 2 15 dakika yıkayın.
    3. Jel tampon 3 1 dk içinde pretreat.
    4. Jel GKD2O 20 için 3 kez yıkayın s.
    5. Tampon 4 20 dk için jel hamile.
    6. Jel GKD2O 20 için 2 kez yıkayın s.
    7. Grup görünür hale gelene kadar tampon 5 jel geliştirmek (10 s 10 dk).
    8. Jel GKD2O 2 min için 2 kere yıkayın.
    9. Geliştirme arabelleği 6 5 min için durdurmak.
    10. Jel arabelleği 7 20 dk için korumak.
    11. Jel 8 arabellekte saklar.
      Not: verimlilik kaplin hedeflenen capsomere değiştirilmiş ve unmodified bantları densitometric miktar tarafından belirlenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 2 cytopathic etkisi (CPE) örnekleri başarılı vektör üretim gösterir 293 (HEK 293) hücreleri üzerinde gösterir. Hücre morfolojisi (Şekil 2C) 40-48 saat sonra aşı virüs vektör ile göstermelidir. Hasat için doğru timepoint virüs parçacıkları tarafından hücre lizis kaybetmemek ve genetik olarak tanıtılan thiol gruplarının oksidasyon önlenmesi için önemlidir. Vektör parçacıklar Orta hücre lizis tarafından yayımlanan, genetik olarak tanıtılan thiols hemen okside olur ve arındırmak ve kimyasal olarak onları değiştirmek zor olacak.

Şekil 3 örnek CsCl grupları gösterir. İş öğelerinin sürekli olmayan CsCl bantlama amacı, önce kimyasal değişiklik virüs parçacıkları hücresel enkaz kaldırmaktır. Belgili tanımlık değiştirme sonra CsCl içinde yer alabilir. İkinci kimyasal değiştirilmesinden sonra bant oluşturma (unreacted) kaplin yan aşırı kaldırmak için hizmet vermektedir. Dikkat, virüs başarılı bir değişiklik degradedeki görülemez ve daha fazla SDS-sayfa tarafından ideal olarak moleküler analiz gerektirir.

Şekil 4 başarılı kapsid değişiklikler ile ilgili örnekler gösterir. Çoğu moieties için belirli capsomeres birleştiğinde SDS-sayfa içinde ilgili capsomeres çalışan davranışını değiştirecek. Kaplin başarısı değiştirilmemiş denetimi ile doğrudan karşılaştırma tarafından doğrulanabilir ve densitometric analiz genel olarak belirlemek yardımcı olabilir verimliliği (değiştirilmiş capsomere için değiştirdi ve unshifted grupları yüzde) kaplin.

Figure 1
Şekil 1: adenovirus vektör capsids genetik ve kimyasal kombine kapsid değişiklikler etkinleştirmek polimerler koruyucu ve ligandlar hedefleme kovalent Eki. Sistein kalıntıları adenovirus vektör capsids vektör parçacıklar yeni kimyasal reaktivite ile donatmak için seçilen, solvent maruz kapsid döngüler, genetik olarak tanıtılmaktadır. Vektörler geleneksel üretici hücreler ve iletişim kuralları kullanılarak üretilmektedir. Sonra üretim, genetik olarak tanıtılan sistein kalıntıları özellikle ve kovalent thiol reaktif kaplin moieties (ligandlar, koruyucu polimerler, karbonhidratlar, küçük moleküller, floresan boyalar) ile değiştirildi. Bağlantı için (istikrarlı thioether tahvil vektör parçacık yüzeyli form) maleimide aktif bileşikler veya pyridyldisulfide türevleri (bioresponsive disülfür köprü oluşturan) istihdam edilecek. Kaplin sonra vektörel çizimler unreacted aşırı kaplin moieties kaldırmak için bantlama kesintili CsCl tarafından saf. PEG, Polietilen glikol (koruyucu polimer); L, ligandlar (madde sınıfları geniş bir türetilmiş); -SH, thiol işlevselliği genetik olarak tanıtılan sistein kalıntıları. Bu teknolojiyi kullanarak, bir sayıda molekülleri kovalent vektör capsids birleştiğinde olabilir ve bir hassas kaplin site uygun seçimdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: vektör üretim sırasında Cytopathic etkisi. Geleneksel üretici hücreler (burada, 293-HEK hücreleri) kimyasal değişiklik öncesinde genetiği değiştirilmiş vektörlerin üretimi için kullanılabilir. CPE görünümü hücreleri hasat için en iyi timepoint belirtir. (A) hücreleri iki saat 40 saat sonra hasat öncesinde enfeksiyon enfeksiyon, (B) hücreleri enfeksiyon sonra 24 saat ve (C) hücreleri sonra. Ölçek çubukları 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: örnek sonuçlarını CsCl degradeler. CsCl gradyanlar (A, B) önce ve sonra (C) kimyasal değişikliği. (A) bir adenovirus vektör kesintili CsCl yoğunluk gradient Santrifüjü tarafından bantlı. Üst aşama beri ayılar bir hCMV-organizatörü-driven ifade kaset EGFP için gösterilen vektör yeşil görünür. Vektör virion bir tek, beyaz grupta tüp alt üçüncü bantlı. İki daha küçük şeritler (üstte) kök değil toplanmalıdır eksik parçacıklar. (B) bir sistein taşıyan reklam EGFP ifade vektör kimyasal değişiklik önce. (C) sonra değişikliği aynı vektör. Tüp alt üçüncü grupta toplanan ve desalting bir sütuna göre saf. Kalem işareti, B ve C iki yoğunlukları kenarlığını etiketleri ve toplanacak vektör grup konumunu belirlemek için izin verir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: SiIver lekeli SDS-kaplin etkinliğini değerlendirmek için sayfa. Şeritte 1 MW işaretçisi. Bir vektör katıldı ile temel capsomeres penton tanıtıldı ve hexon değiştirilmemiş (lane 2) sol olduğu veya maleimide aktif PEG (Polietilen glikol) 5 kDa (lane 3) moleküler ağırlığı ile değiştirilmiş. Hem hexon hem de penton temel bir kayma sırasında SDS-sayfa başına kapsid monomerleri % > 90 başarılı değişiklik gösteren, sergi. Hexon bir sistein kalıntıları ile bir vektör kaldı (lane 4) değiştirilmemiş, 5 kDa PEG (lane 5) ya da 20 kDa PEG (lane 6) değiştirilmiş. Bu hexon grup daha büyük kayma 5 kDa PEG (lane 5) göre 20 kDa PEG, daha yüksek molekül ağırlığı nedeniyle olduğunu belirtmek gerekir. Jel özgüllük ve kaplin verimliliğini gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hangi genetik olarak tanıtılan katıldı kimyasal olarak değiştirilebilir verimliliği genellikle 80-%99 olduğunu ve bazı değişkenler bu verimlilik etkiler. İlk olarak, genetik olarak tanıtılan katıldı erken oksidasyon tabi olmayan her şeyden önemlidir. Yapımcı hücrelerinin azaltılması ortamında iyi korunan olurken, vektör parçacıklar yapımcı hücrelerden ve kimyasal değişikliği sırasında bırakmadan sonra oksidatif olmayan bir ortam sağlamak için zorunludur. Bu amaçla, reaktifler azaltarak 0.1-10 mm konsantrasyonlarda kullanılabilir ve kolayca maleimide aktif bileşikler ile tepki vereceğini thiol gruplar içermeyen azalan bakiyeli reaktifler kullanmak gereklidir. İkinci olarak, maleimide aktif bileşikler kullanırken pH kaplin reaksiyon sırasında 7,35, 7,4 tepki özgüllük düşürebilir daha büyük bir pH beri aşmaması gerekir. Üçüncü olarak, ne olursa olsun, Amin-Alerjik arabellekleri (Örneğin, HEPES, PBS) tepki için kullanılır. Not, sistein taşıyan vektör parçacıklar tarafından açıklanan sonra kimyasal değişiklik öncesinde HEPES/10% gliserol içinde saklı olarak bantlama Çift Kişilik CsCl saf. Bu durumda, 0.1-1 mM TCEP-meli var olmak kullanılmış azalan bakiyeli bir reaktif veya tercihen, vektörel çizimler bir argon atmosferde muhafaza edilmelidir. Argon dolu plastik kavanoz kapakları ile bu amaç için kullanılabilir. Ayrıca, değişiklik verimliliği capsids ve sitenin hangi bağlandı birleştiğinde bileşik hidrodinamik çapını etkilenir. Trimers (fiber, hexon) veya pentamers (penton temel) olarak belirli geneti-kimyasal değişiklik için hedefleri olarak hizmet verebilir birçok capsomeres kapsid içinde bulunur. Bu nedenle, genetik olarak tanıtılan sistein konumuna bağlı olarak, bir monomer için birleştiğinde bir yan molekül sterically komşu monomer için başka bir molekül kaplin engel. Bu geneti-kimyasal kapsid değişiklikler için ideal siteleri seçerken dikkate alınmalıdır.

Sorun giderme kolaylaştırmak için birkaç problem ne zaman açıklanan protokol sonrası ortaya çıkabilir. İlk, düşük vektör verimleri (aşağıda yapımcı hücre başına 10.000 vektör parçacıklar) suboptimal üretici hücreler enfeksiyondan neden olabilir. İdeal olarak, 100-300 MOI yapımcı hücreleri enfeksiyon için kullanılmalıdır. Unutmayın ki her iki inoculum çok yüksek ve çok düşük vektör tutarlarının suboptimal verimleri üretmek. Üretici bir gün önce enfeksiyon hücreleri geçiş için idealdir. İkinci, smeary grup CsCl gradyanlar içinde görünür. En sık smeary CsCl degradeler bantlarında görünümünü çok asittir CsCl çözümler pH nedeni. Azalan bakiyeli reaktif TCEP çok asittir ve pH adenovirus vektörel çizimler kolayca bir asidik ortamda parçalanır beri vektör degrade üzerine yüklemeden önce ayarlamak için özen göstermelidir. Üçüncü olarak, düşük kaplin verimliliği (kaplin < %80) en sık sonuç saf olmayan vektör hazırlıkları ve/veya vektör yüzeyinde thiol grupların erken oksidasyon vardır. Yabancı maddelerin SDS-sayfa ve gümüş boyama tarafından tespit edilebilir. Önemli yabancı maddelerin meydana durumunda vektör üretim yeniden başlatılması gerekiyor. Buna ek olarak, düşük kaplin verimliliği ücretsiz vektör sigara thiols tepki neden olabilir. Bu nedenle, β-mercaptoethanol veya dithiothreitol ücretsiz thiol grupları içeren reaktifler, azaltmak olarak kullanmamanız tavsiye edilir. Not Çözücü erişilebilir siteler kolayca değiştirilebilir, sistein kalıntıları tanıtmak için seçmek için kristal yapıları kullanılmalıdır; Aksi takdirde, katıldı kaplin ortağı tarafından erişilebilir olmayabilir. Thiols vektör yüzeyi erken oksidasyonunu argon ve/veya TCEP sıkı kullanılarak önlenebilir.

Son olarak, yanlış stokiometrik hesaplamalar da düşük kaplin verimliliği için yol açabilir. Aşağıdaki örnek yukarıda sunulan genel formülü göstermek ve stokiometrik hesaplamalar kolaylaştırmak içindir. Örneğin, bir sistein hexon capsomere giriliyor. İlk CsCl adım sonra degrade arıtma vektör parçacıklar titresi belirlenir 1.5 x 1010 vektör parçacıklar µL başına ve kaplin yan, malPEG-750 kullanılır. Her vektör kapsid 720 hexon proteinler (240 trimers), içeren katıldı µL başına titresi bu nedenle 720 x 1.5 x 10 için özetliyor bu yüzden10 1,08 x 1013 katıldı/µL =. Vektör parçacıkların 1,62 x 10 toplam 1.5 mL değiştirmek için16 katıldı ile kaplin yan tepki gerekir. Bir 50 x sistein kalıntıları fazla ile bileşik kaplin molar aşırı verimli kaplin ulaşmak için önerilir: 1,62 x 1016 50 = 8.1 x 10 x17 molekülleri malPEG-750 verimli 1.5 x 1016 katıldı çift için gereklidir ilk CsCl adım degrade tarafından arıtılmış vektör çözüm 1.5 mL. MalPEG-750 750 Da bir molekül ağırlığı sergiler; Bu nedenle, 6.022 1023 molekülleri malPEG-750 x 750 gr ağırlığında. Bu nedenle, 1,62 x 1016 sistein kalıntıları vektör çözüm 1.5 ml malPEG-750, 8,1 1017 molekülleri malPEG-750 x 50 x fazlalığı ile verimli kaplin için = (750 x 8.1 x 1017) / (6,022 x 1023) 1 x 10-3 = g = 1 mg malPEG-750 gereklidir.

Sunulan yöntem tamamlar ve vektör PEGylation yöntemi aşıyor. Burada sunulan geneti-kimyasal kaplin teknolojisi tam olarak moieties adenovirus vector öğesine bağlamak için kullanılan, ancak geleneksel, Amin Yönetmen: vektör PEGylation koruyucu veya moieties, hedef siteye özgü ek izin vermez tanımlanmış pozisyonlarda ve tanımlı kopya rakamlarla yüzeyler. Bu nedenle, hem koruyucu hem de adenovirus vektör parçacıkların hedefleme için uygundur.

Not, bu protokolü de geleneksel Amin yönetmen PEGylation yukarıda belirtilen Ad vektörlerin için kullanılabilir. Bu durumda, azalan bakiyeli reaktif TCEP arabelleklerinden atlanabilir. Stokiometrik hesaplamalar için erişilebilir Amin grup başına parçacık sayısı 18.000 olarak kabul ve molar aşırılıkları tipik Amin-reaktif kaplin moieties 20-100 kat vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vector purification and chemical modification
Argon gas Air liquide local gas dealer
Liquid Nitrogen Air liquide local gas dealer
500 mL centrifuge tubes Corning 431123
Stericup Express Plus 0.22 µm Millipore SCGPU02RE
Tris(2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) Sigma-Aldrich C4706-10g
2 mL (3mL) Norm Ject (syringes) Henke Sass Wolf 4020.000V0
Fine-Ject needles for single use (yellow 0.9 x 40 mm) Henke Sass Wolf 4710009040
Caesium chloride 99.999% Ultra Quality Roth 8627.1
Silica gel beads Applichem A4569.2500
Methoxypolyethylene glycol maleimide - 750 (PEG mal-750) Iris Biotech store in silica gel beads at -80 °C
13.2 mL Ultra Clear Ultracentrifuge Tubes Beckman Coulter 344059 only open in hood
PD-10 size exclusion chromatography column GE Healthcare 17-0851-01 store at 4 °C
Hepes AppliChem A1069.1000
SDS Ultrapure AppliChem A1112,0500
Glycerol AppliChem A1123.1000
Name Company Catalog Number Comments
Material for cell-culture
DPBS PAN Biotech P04-36500
DMEM PAN Biotech P04-03590
Trypsin/EDTA PAN Biotech P10-0231SP
FBS Good PAN Biotech P40-37500
Penicillin/Streptomycin PAN Biotech P06-07100
Biosphere Filter Tips (various sizes) Sarstedt
Serological Pipettes (various sizes) Sarstedt
reaction tubes (various sizes) Sarstedt
TC plates 15cm Sarstedt 83.3903
Name Company Catalog Number Comments
Material for silver staining protocol
Methanol J.T.Baker 8045
Ethanol absolute AppliChem 1613,2500PE
Acetic Acid AppliChem A0820,2500PE
Formaldehyde 37% AppliChem A0877,0250
Ethanol absolute AppliChem A1613,2500PE
Sodium thiosulfate AppliChem 1,418,791,210
Silver nitrate AppliChem A3944.0025
Sodium carbonate AppliChem A3900,0500
Name Company Catalog Number Comments
Special Lab Equipment
Desiccator Nalgene 5311-0250
Megafuge 40 Heraeus
Roter for Megafuge TX750 + Adapter andLlids for 500 mL tubes Heraeus
Water bath Conventional
Ultracentrifuge e.g. Optima XPN-80 Beckman Coulter
suitable Ultrazentrifuge Rotor e.g. SW41 Beckman Coulter
pH -Meter Conventional
Stand with clamps Conventional
Goose neck lamp Conventional
Over-head rotor Conventional
Thermal Block Conventional
Photometer (OD 260) Conventional

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Benko, M., Harrach, B. Molecular evolution of adenoviruses. Current Topics in Microbiology and Immunology. 3-35 (2003).
  2. Davison, A. J., Benko, M., Harrach, B. Genetic content and evolution of adenoviruses. Journal of Genetic Virology. 84, 2895-2908 (2003).
  3. Rowe, W. P., Huebner, R. J., Gilmore, L. K., Parrott, R. H., Ward, T. G. Isolation of a cytopathogenic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 84, New York, N.Y. 570-573 (1953).
  4. van Oostrum, J., Burnett, R. M. Molecular composition of the adenovirus type 2 virion. Journal of Virology. 56, 439-448 (1985).
  5. Stewart, P. L., Fuller, S. D., Burnett, R. M. Difference imaging of adenovirus: bridging the resolution gap between X-ray crystallography and electron microscopy. TheEMBO Journal. 12, 2589-2599 (1993).
  6. Stewart, P. L., Burnett, R. M., Cyrklaff, M., Fuller, S. D. Image reconstruction reveals the complex molecular organization of adenovirus. Cell. 67, 145-154 (1991).
  7. Meier, O., et al. Adenovirus triggers macropinocytosis and endosomal leakage together with its clathrin-mediated uptake. Journal of Cellular Biology. 158, 1119-1131 (2002).
  8. Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
  9. Qiu, Q., et al. Impact of natural IgM concentration on gene therapy with adenovirus type 5 vectors. Journal of Virology. 89, 3412-3416 (2015).
  10. Alemany, R., Suzuki, K., Curiel, D. T. Blood clearance rates of adenovirus type 5 in mice. Journal of Genetic Virology. 81, 2605-2609 (2000).
  11. Smith, J. S., Xu, Z., Tian, J., Stevenson, S. C., Byrnes, A. P. Interaction of systemically delivered adenovirus vectors with Kupffer cells in mouse liver. Human Gene Therapy. 19, 547-554 (2008).
  12. Schiedner, G., et al. A hemodynamic response to intravenous adenovirus vector particles is caused by systemic Kupffer cell-mediated activation of endothelial cells. Human Gene Therapy. 14, 1631-1641 (2003).
  13. Xu, Z., Tian, J., Smith, J. S., Byrnes, A. P. Clearance of adenovirus by Kupffer cells is mediated by scavenger receptors, natural antibodies, and complement. Journal of Virology. 82, 11705-11713 (2008).
  14. Khare, R., Reddy, V. S., Nemerow, G. R., Barry, M. A. Identification of adenovirus serotype 5 hexon regions that interact with scavenger receptors. Journal of Virology. 86, 2293-2301 (2012).
  15. Piccolo, P., Annunziata, P., Mithbaokar, P., Brunetti-Pierri, N. SR-A and SREC-I binding peptides increase HDAd-mediated liver transduction. Gene Therapy. 21, 950-957 (2014).
  16. Plüddemann, A., Neyen, C., Gordon, S. Macrophage scavenger receptors and host-derived ligands. Methods (San Diego, Calif). 43, 207-217 (2007).
  17. Ganesan, L. P., et al. Rapid and efficient clearance of blood-borne virus by liver sinusoidal endothelium. PLoS Pathogen. 7, e1002281 (2011).
  18. Cichon, G., et al. Titer determination of Ad5 in blood: a cautionary note. Gene Therapy. 10, 1012-1017 (2003).
  19. Carlisle, R. C., et al. Human erythrocytes bind and inactivate type 5 adenovirus by presenting Coxsackie virus-adenovirus receptor and complement receptor 1. Blood. 113, 1909-1918 (2009).
  20. Waddington, S. N., et al. Adenovirus serotype 5 hexon mediates liver gene transfer. Cell. 132, 397-409 (2008).
  21. Kalyuzhniy, O., et al. Adenovirus serotype 5 hexon is critical for virus infection of hepatocytes in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 105, 5483-5488 (2008).
  22. Vigant, F., et al. Substitution of hexon hypervariable region 5 of adenovirus serotype 5 abrogates blood factor binding and limits gene transfer to liver. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, 1474-1480 (2008).
  23. Jonsson, M. I., et al. Coagulation factors IX and X enhance binding and infection of adenovirus types 5 and 31 in human epithelial cells. Journal of Virology. 83, 3816-3825 (2009).
  24. Bradshaw, A. C., et al. Requirements for receptor engagement during infection by adenovirus complexed with blood coagulation factor X. PLoS Pathogen. 6, e1001142 (2010).
  25. Duffy, M. R., Bradshaw, A. C., Parker, A. L., McVey, J. H., Baker, A. H. A cluster of basic amino acids in the factor X serine protease mediates surface attachment of adenovirus/FX complexes. Journal of Virology. 85, 10914-10919 (2011).
  26. Xu, Z., et al. Coagulation factor X shields adenovirus type 5 from attack by natural antibodies and complement. Nature Medicine. 19, 452-457 (2013).
  27. Prill, J. -M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
  28. Zaiss, A. K., et al. Hepatocyte Heparan Sulfate Is Required for Adeno-Associated Virus 2 but Dispensable for Adenovirus 5 Liver Transduction In Vivo. Journal of Virology. 90, 412-420 (2015).
  29. Delgado, C., Francis, G. E., Fisher, D. The uses and properties of PEG-linked proteins. Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems. 9, 249-304 (1992).
  30. Parveen, S., Sahoo, S. K. Nanomedicine: clinical applications of polyethylene glycol conjugated proteins and drugs. Clin. Pharmacokinet. 45, 965-988 (2006).
  31. O'Riordan, C. R., et al. PEGylation of adenovirus with retention of infectivity and protection from neutralizing antibody in vitro and in vivo. Human Gene Therapy. 10, 1349-1358 (1999).
  32. Subr, V., et al. Coating of adenovirus type 5 with polymers containing quaternary amines prevents binding to blood components. Journal of Controlled Release. 135, 152-158 (2009).
  33. Kreppel, F., Gackowski, J., Schmidt, E., Kochanek, S. Combined genetic and chemical capsid modifications enable flexible and efficient de- and retargeting of adenovirus vectors. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 12, 107-117 (2005).
  34. Corjon, S., et al. Targeting of adenovirus vectors to the LRP receptor family with the high-affinity ligand RAP via combined genetic and chemical modification of the pIX capsomere. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 16, (11), 1813-1824 (2008).
  35. Prill, J. -M., et al. Modifications of adenovirus hexon allow for either hepatocyte detargeting or targeting with potential evasion from Kupffer cells. Molecular Therapy. The Journal of the American Society of Gene Therapy. 19, 83-92 (2011).
  36. Krutzke, L., et al. Substitution of blood coagulation factor X-binding to Ad5 by position-specific PEGylation: Preventing vector clearance and preserving infectivity. Journal of Controlled Release. 235, 379-392 (2016).
  37. Prill, J. -M., et al. Traceless bioresponsive shielding of adenovirus hexon with HPMA copolymers maintains transduction capacity in vitro and in vivo. PloS One. 9, e82716 (2014).
  38. Kratzer, R. F., Kreppel, F. Production, Purification, and Titration of First-Generation Adenovirus Vectors. Methods in Molecular Biology. Clifton, NJ. 377-388 (2017).
  39. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. ELECTROPHORESIS. 8, 93-99 (1987).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics