Optrævling nøglespillere humorale immunitet: avancerede og optimeret lymfocyt Isolation protokol fra Murine Peyer's Patches

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

I denne undersøgelse præsenterer vi en roman og effektiv protokol til isolering af lymfocytter fra Peyerske plaques (PPs), som senere kan bruges til i vivo og in vitro- funktionelle assays samt flow cytometric undersøgelser af follikulært T hjælperen og germinal center B celler.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Yazicioglu, Y. F., Aksoylar, H. I., Pal, R., Patsoukis, N., Boussiotis, V. A. Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches. J. Vis. Exp. (141), e58490, doi:10.3791/58490 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I tarm mucosa udgør immun celler en unik immunologiske enhed, som fremmer immuntolerance mens samtidigt giver immun forsvar mod patogener. Det er godt etableret, at Peyerske plaques (PPs) har en vigtig rolle i den slimhinde immun netværk af hosting flere effektor T og B-celle subsets. En bestemt brøkdel af disse effektor celler, follikulært T hjælper (TFH) og germinale centrum (GC) B-celler er professionaliseret i reguleringen af humorale immunitet. Dermed, karakterisering af disse celle subsets inden for PPs differentiering program og funktionelle egenskaber kan give vigtige oplysninger om mucosal immunitet. Med henblik herpå, ville en let relevant, effektiv og reproducerbar metode til lymfocyt isolation fra PPs være værdifuldt at forskere. I denne undersøgelse, vi har til formål at skabe en effektiv metode til at isolere lymfocytter fra mus PPs med høj celle udbytte. Vores tilgang viste, at oprindelige væv behandling såsom brugen af fordøjelsessystemet reagenser og væv agitation, samt celle farvning betingelser og udvalg af antistof paneler, har stor indflydelse på kvalitet og identitet af de isolerede lymfocytter og på eksperimentelle resultater.

Her, beskriver vi en protokol, der gør det muligt for forskere at effektivt isolere lymfocyt befolkning fra PPs tillader reproducerbar flow flowcytometri-baserede vurdering af T og B-celle subsets primært fokuserer på TFH og GC B celle subsets.

Introduction

Hele fordøjelseskanalen fra begyndelsen til enden er pyntet med et omfattende lymfoide netværk, der indeholder immunceller mere end nogen andre orgel i mennesker og mus1. Peyer's patches (PPs) udgør en større komponent af den intestinale gren af denne cellulære immunforsvar organisation, såkaldte gut-associerede lymfoide væv (GALT)2,3. I KKS, tusindvis af millioner af antigener stammer fra kosten materialer, commensal mikrobiota og patogener er der udtages kontinuerligt, og når nødvendigt passende immunrespons mod dem er monteret således opretholde intestinal immun homøostase. I denne forstand, PPs kunne blive navngivet som "tonsiller af tyndtarmen". PPs består af store sub rum: subepithelial dome (SED), store B-celle follikel zoner; den overliggende follikel-associerede epitel (FAE) og interfollicular område (IFR) hvor T celler er placeret4. Denne unikke opdelingen af PPs muliggør forskellige effektor celle subsets samarbejde, giver således immunocompetence i tarmen.

PPs mangler afferente lymfevejene, og på grund af denne grund, er antigener transporteres til KKS fra tyndtarmen ikke gennemføres via lymfekar i modsætning til de fleste af de andre lymfoide organer. I stedet, specialiserede epitelceller beliggende i FAE, såkaldte M celler, er ansvarlig for overførsel af luminale antigener til KKS5. Efterfølgende, de transporterede antigener er afhentet af dendritiske celler (DCs) og fagocytter, der er beliggende i regionen subepithelial dome (SED) under FAE6,7. Denne antigen sorterings processen af DCs i PP er afgørende at indlede adaptive immunrespons8 og efterfølgende generationer af IgA hemmelig celler9.

På grund af den tunge antigene byrde fra commensal flora og kosten materiale, PPs vært endogent aktiverede effektor T og B-celle subsets i store mængder som TFH og IgA+ GC B celler10, tyder på, at PPs repræsenterer et websted af aktive immun svar11. Påvisning af op til 20-25% TFH celler inden for samlede CD4+ T celle rum og op til 10-15% GC B celler inden for total B-celler er muligt i PPs indsamlet fra unimmunized unge C57BL/6 mus12. I modsætning til andre T helper celletyper (dvs., Th1, Th2, Th17 celler), TFH celler Vis unikke tropisme i B-celle follikler primært på grund af CXCR5 udtryk, som fremmer TFH celle homing langs CXCL13 gradient13. I B-celle follikel zoner af KKS fremkalde TFH celler IgA klasse switch rekombination og somatiske hypermutation i aktiverede B celler som høj-affinitet IgA producerende celler differentiere14. Senere, disse antistof-secernerende plasmaceller migrere til lamina propria (LP) og regulere immunsystemet homøostase i gut10.

Identifikation og karakterisering af TFH og GC B cellepopulationer i PPs kan give forskerne at undersøge dynamikken i LUN immun svar under steady-state-betingelser uden brug af tidskrævende immunisering modeller traditionelt anvendes i TFH-GC B celle undersøgelser15,16,17,18. Analysere TFH celler i KKS er ikke så ligetil som andre celle subsets. Tekniske udfordringer omfatter identificering ideelle væv forberedelse betingelser, overflade antistof-markør kombination, samt at vælge passende positive og negative kontroller. Både TFH og PP forskningsområder udviser stor variation med hensyn til eksperimentelle procedurer og er langt fra giver en konsensus for at fastlægge standardiserede protokoller på grund af flere årsager. Først, hver celle delmængde i KKS har tendens til at blive påvirket varierende af væv forberedelse betingelser kræver yderligere ændringer i en celle delmængde-specifikke måde. Det andet er der en væsentlig forskel mellem de rapporterede metoder vedrørende detaljer af celle præparat, fra PPs. tredje, antallet af protokol-baseret sammenlignende studier undersøger ideelle væv forberedelse teknikker og forsøgsbetingelser PP og TFH er forskning ret begrænset.

Nuværende protokol-baserede studier foreslog for PP celle forberedelse19,20,21,22 var ikke TFH- eller GC B celle-orienteret. Desuden, nogle væv forberedelse betingelser anbefales til KKS19,20 såsom collagenase-baserede fordøjelsen fandtes for at påvirke resultatet af TFH identifikation ved flowcytometri negativt18. På dette grundlag begrundede vi, at en optimeret, standardiseret og reproducerbare protokol, der kan bruges til at studere TFH og GC B celle dynamikken i PPs ville være værdifuldt at investigatorer om dette emne. Dette behov gav os incitamentet til at generere en forbedret og opdateret protokol til isolering og karakterisering af PP lymfocytter, der er fint optimeret til cellulære opsving, rentabilitet og effektivitet for flow cytometric karakterisering af flere T og B celle subsets. Vi også havde til formål at udelukke flere besværlige forberedelsestrin foreslået i tidligere protokoller, dermed, at reducere den krævede manipulationer og tid for vævs- og forberedelse fra PPs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle undersøgelser og eksperimenter beskrevet i denne protokol blev gennemført under retningslinjerne efter institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Beth Israel Deaconess Medical Center.

1. design af eksperimentelle Set-up og mus grupper

  1. (Valgfrit) Co hus de eksperimentelle mus at lette horisontal overførsel af gut mikrobiota mellem eksperimentelle mus og reducere uspecifikke variation inden for PP lymfocytter. Derudover brug littermate kontrolelementer af samme køn for at minimere variabilitet.

2. kirurgisk Excision og væv forberedelsestrin:

  1. Kirurgisk fjernelse af tyndtarmen (SI)
    1. Aflive mus ved hjælp af CO2 kvælning eller ethvert tilsvarende metode godkendt af den institutionelle Dyreetik.
    2. Overføre musen til et særligt område for kirurgisk excision. Placer bagside ned og desinficere maven med 70% ethanol. Udføre en laparotomi ved at skære abdominal hud og bughinde langs midterlinjen fra pubis til brystkassen således åbning af bughulen.
      Bemærk: Udfør den første indsnit på et relativt lille område af huden for at undgå gennemtrængende bughulen og ødelægger tarmens væv. Fortsætte excision indtil ønskede anatomiske grænsen.
    3. Identificere caecum, som er et ideelt vartegn til påvisning af terminal ileum, som udgør den distale del af tyndtarmen.
      Bemærk: Caecum er normalt placeret på den nederste venstre side af musen maven.
    4. Lokalisere ileocækale junction og gøre et snit på dette niveau så distalt som muligt at adskille tyndtarmen fra caecum. Gennem de næste skridt, undgå overdreven fysisk kontakt med tarmvæggen fordi skrøbelige PPs sammenbrud let ved berøring.
    5. Fjern forsigtigt hele tyndtarmen indtil pylorus lukkemusklen ved at skære mesenterium ved hjælp af saks. Identificere krydset mellem pylorus og duodenum, og snip i duodenum på dette niveau, hvilket vil føre til komplet udstationering af tyndtarmen fra bughulen.
      Bemærk: a undgå hyperekstension som dette kan medføre ruptur af tarmvæggen. (ii) evt LP lymfocyt isolation ud over PP lymfocytter, fuldstændig fjernelse af den mesenteriallymfeknuderne fedt er nødvendige. Men for PP isolation kun, resterende mesenteriallymfeknuderne fedt kunne give nogle fordele under de yderligere isolation skridt; Derfor, det bør bevares.
    6. Sted løsriver sig små tarme i en 6-godt tallerken fyldt med koldt RPMI + 10% føtal bovint serum (FBS) og agitere forsigtigt væv manuelt indtil alle intestinal segmenter er nedsænket i den kolde medier. Vedligeholde væv på is i hele de næste trin.
    7. Efter dissekere det ønskede antal mus små tarme, gå videre til PP excision fra indsamlet små tarme.
  2. Kirurgisk Excision af PPs og forberedelse af enkelt cellesuspension:
    1. Forsigtigt overføre tyndtarmen på et stykke køkkenrulle af gribende mesenteriallymfeknuderne fedt med pincet og placere den mesenteriallymfeknuderne side vender et stykke køkkenrulle. Fugte det hele tarm segment med kolde RPMI + 10% FBS at undgå væv dehydrering og klæbrighed.
      Bemærk: Resterende mesenteriallymfeknuderne fedt kan være nyttige i denne fase, fordi fedtvæv segmenter på webstedet mesenteriallymfeknuderne af SI vil holde sig til et stykke køkkenrulle holder webstedet anti-mesenteriallymfeknuderne opad.
    2. Identificere KKS, der vises som hvidt multi lobulated aggregater i en "blomkål-lignende" form i anti-mesenteriallymfeknuderne side af tarmvæggen.
      Bemærk: Flushing ud den luminale indhold anbefales ikke, indtil alle PPs er skåret ud. Tømme den luminale indhold kan medføre et sammenbrud af PPs og vil forhindre farvekontrast mellem PPs og tarmvæggen, hvilket er meget nyttigt for visuelle identifikation af KKS.
    3. Efter at identificere KKS i anti-mesenteriallymfeknuderne side, placere den kirurgiske buet ende saks på KKS (kurve bør imødegå) fastholdende PP fra den distale og proksimale kant.
      Valgfrit: Skubbe PP forsigtigt mod vinger af scissor ved hjælp af en fingerspids. Denne manøvre vil føre til bedre udelukkelse af omkringliggende ikke-PP væv. Punktafgifter PPs forsigtigt, bortset fra de omkringliggende tarmens væv.
      Bemærk: (i) dette trin er afgørende for at opnå maksimal PP celle udbytte samtidig minimere celle forurening fra nabolandet intestinal rum som LP og intestinale epitel, der er også rig på T-celler. (ii) fra en SI skåret ud fra C57BL/6 mus, kan 5-10 KKS (gennemsnitlige størrelse, multi lobulated) afhentes. Ved sigter endnu mindre KKS (ikke multi lobulated), samling af op til 12-13 KKS pr. mus (C57BL/6) er muligt ved hjælp af denne protokol.
    4. Overførsel skåret PPs til en 12-godt vævskultur tallerken fyldt med iskolde RPMI + 10% FBS og vedligeholdt på isen med pincet eller buede kirurgisk saks.
      Bemærk: (i) umiddelbart efter excision af KKS, slim og tarmindholdet på PP overfladen kan rengøres ved at gnide væv blidt på et stykke køkkenrulle. Dette skridt vil bidrage til at forbedre levedygtighed med PP lymfocytter. (ii) i stedet for at overføre PPs til en plade, kan overførsel til adskilt rør også overvejes afhængig af samlede prøvenummer.
    5. Valgfrit: Når PP excision og efterfølgende placering i godt pladen er afsluttet, antallet og størrelsen af PPs indsamlet fra forskellige eksperimentelle/mus grupper kan dokumenteres ved at tage et billede af vævskultur pladen som indeholder KKS.
    6. Der laves en række 50 mL konisk rør fyldt med 25 mL af RPMI + 10% FBS (pre varmes ved 37 ° C). Ved hjælp af en saks, klippe kanten af en 1.000 µL tip fra den afstand, der gør det muligt aspiration af PPs med 1 mL pipette. Opsug PPs med 1 mL pipette og overføre dem fra 12-godt vævskultur pladen til rede 50 mL konisk rør.
      Bemærk: Brug et nyt tip til hver prøve, musen til at undgå krydskontaminering blandt prøverne.
    7. Sikre låget og lægge rørene vertikalt i en orbitalryster ved 37 ° C, med kontinuerlig agitation på 125-150 rpm i 10 min. I mellemtiden forbereder en ny række 50 mL rør og placere en 40 µm celle si på toppen af hver tube, hvorigennem enkelt cellesuspension vil være forberedt.
      Bemærk: (i) agitation skridt vil fjerne de resterende tarm indhold, slim og celle debris, som nedsætte cellers levedygtighed og inddrivelse af PP lymfocytter hvis ikke fjernes. (ii) enhver form for fordøjelsesenzymer finder ikke anvendelse på PP væv, da fordøjelsesprocessen forårsager en dramatisk tab af CXCR5 udtryk fra cellens overflade.
    8. Efter agitation, overførsel PPs til 40 µm celle sien placeret på toppen af de nypræparerede koniske 50 mL reagensglas. Bruger den afrundede side af en 10 mL sprøjte stemplet, forsigtigt forstyrre PPs gennem celle si til at generere enkelt cellesuspension. Skyl si med 15-20 mL af kolde RPMI + 10% FBS.
      Bemærk: (i) før filtrering, ryste rør indeholdende PPs vandret. Denne korte ryste vil lette overførslen af PPs til celle sier. (ii) ved hjælp af en 70 µm celle si til isolering af ikke-lymfoide immunceller (fx., monocytter, makrofager, DCs) anbefales.
    9. Centrifugeres enkelt celle suspensioner ved 350-400 x g i 10 min. ved 4 ° C.
    10. Omhyggeligt supernatanten og resuspend celler i en koncentration på 10 x 106 celler/mL. Tælle celler ved hjælp af en hemocytometer.
      Bemærk: a forud for celle optælling, nummeret cellen total for hver mus PP gruppe kan ca estimeres ved hjælp af følgende formel: "0,5-1 x 106 celler x (antal KKS) = samlede celletal". Yderligere fortyndinger med trypan blå til celle optælling kan være nødvendigt. (ii) som et alternativ til manuel optælling, kan automatiseret celle tællere bruges.
    11. Overføre 2-2,5 x 106 celler i passende mængde (fx., 200 µL) til en 96-brønd runde-bundplade.
      Bemærk: For enkelt farve og negative kontrolprøver, kan 0,5-1 x 106 celler være tilstrækkelig.
    12. Centrifugeres plade på 350 x g i 5 min. ved 4 ° C. Svip til pladen.
    13. Vaske cellerne i 200 µL af farvning Buffer.

3. overflade antistoffarvning

  1. Levedygtighed farvning:
    1. Efter den sidste vask, resuspend celler i 100 μL af fixable levedygtighed farvestof fortyndes i PBS (1:1, 000). Inkuber i 30 min på is eller ved 4 ° C i mørke.
      Bemærk: a intracellulær farvning for påvisning af centrale transskription faktorer såsom Foxp3 eller Bcl-6 kræver fiksering af celler. I så fald ikke-fixable levedygtighed farvestoffer (fx., 7-ald, DAPI) kan ikke bruges. (ii) for at fortynde fixable levedygtighed farvestof, brug ikke eventuelle farvning buffer, som indeholder protein. De medier, der anvendes i dette trin skal være protein-fri. (iii) udelukkelsen af døde celler ved hjælp af levedygtighed farvning er afgørende, fordi døde celler kan forårsage alvorlige tekniske vanskeligheder i flow flowcytometri analyse af udsender autofluorescence og bindende overfladen antistoffer nonspecifically, som kan føre til falsk positive resultater.
    2. Cellerne vaskes to gange med farvning buffer. Der centrifugeres ved 350 x g i 5 min. ved 4 ° C. Svip til pladen.
  2. FC blok og overflade - lag I:
    1. Forberede Fc-blok løsning ved at fortynde anti-CD16/32 antistof (1:200) i farvning buffer.
    2. Resuspend celler i 20 μL af rede Fc-blok løsning. Inkuber i 15 min på is.
    3. Uden vask, tilsættes 80 μl af overflade antistof cocktail (Se tabel 1 for oversigt-antistof) udarbejdet på passende fortyndinger. Der inkuberes i isbad i mindst 30 min.
    4. Vaskes to gange ved at tilføje overdreven farvning buffer. Der centrifugeres ved 350 x g i 5 min. ved 4 ° C. Svip til pladen.
  3. Overflade - lag II:
    1. Forberede Streptavidin Farvningsopløsningen ved at fortynde fluorokrom-konjugeret Streptavidin i farvning buffer.
    2. Efter den sidste vask, resuspend celler med 100 μL af forud fortyndede Streptavidin (1: 100) farvning løsning. Inkuber i mindst 15 min på is i mørke.
    3. Vaskes to gange med farvning buffer. Der centrifugeres ved 350 x g i 5 min. ved 4° C. Svip til pladen.
      Valgfrit: Hvis intracellulær farvning for follikulært regulerende T-celle påvisning ikke er ønsket, efter den sidste vask, resuspend celler i 200 μl af farvning buffer og overførsel til passende rør til at erhverve data i flow Flowcytometret. Når prøverne ikke er faste, bør erhvervelse af data ved flowcytometri udføres inden for 3-4 h at opnå præcise resultater.

4. celle fiksation

  1. Forberede fiksering/permeabilization (rettelse/Perm) brugsopløsning reagenser fra Foxp3/transskription faktor farvning bufferen indstillet. Bland en del af fiksering/permeabilization koncentrat med tre dele af fiksering/permeabilization fortynder til det ønskede endelige rumfang.
  2. Efter den sidste vask, resuspend celler i 200 μl af Fix/Perm brugsopløsning.
  3. Inkuber plade på is eller ved 4 ° C i 20 min. Ikke overstige 20 min til dette trin. Længere inkubationstiden kan alvorligt formindske celle opsving.
  4. Der centrifugeres ved 350 x g i 5 min. ved 4 ° C. Svip til pladen. (Valgfri) Efter dette trin, faste celler kan gemmes i flere dage ved 4 ° C i farvning buffer indeholdende bovint serumalbumin (BSA) eller FBS indtil efterfølgende intracellulær farvning eller flow flowcytometri erhvervelse.
  5. Resuspend celler i 200 μl af permeabilization Buffer (x1) frisk forud fortyndet i renset deioniseret vand.
  6. Der centrifugeres ved 350 x g i 5 min. ved stuetemperatur (RT).
  7. Vask en gang med 200 μl af permeabilization buffer, og der centrifugeres ved 350 x g i 5 min på RT.

5. intracellulær farvning

  1. Forberede Fc-blok løsning ved at fortynde anti-CD16/32 antistof (1:200) i permeabilization buffer.
    Bemærk: Efter trinnet fiksering cellerne skal holdes i permeabilization buffer indtil udgangen af intracellulær farvning processen.
  2. Efter den sidste vask, resuspend celler i 20 μL af Fc-blok løsning. Der inkuberes i 10 – 15 min på RT i mørke.
  3. Uden vask, tilsættes 80 μl af intracellulære antistof cocktail (100 μL endelige rumfang) forud fortyndet i permeabilization buffer. Inkuber i 30 min. ved RT.
  4. Tilsæt 100 μL af Perm Buffer, og der centrifugeres ved 350 x g i 5 min på RT.
  5. Vask en gang med 200 μl af permeabilization buffer, centrifugeres ved 350 x g i 5 min på RT.
  6. Efter den sidste vask, resuspend celler i 200 μl af farvning buffer og overføre cellerne i passende rør (endelige mængden af 400 μL i farvning buffer) og erhverve data ved flowcytometri. Prøver farves i 96-brønd plade kan også køres uden overførsel i rør, hvis en flow forskellige med plade reader mulighed er tilgængelig. Dette trin minimerer celletab under celle overførsel.
  7. Erhverve et minimum af 5 x 105 samlede celler på flow Flowcytometret at udføre reproducerbare analyse af TFH, TFR samt GC B celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I modsætning til en tidligere protokollen20, vi har observeret at PPs ikke er jævnt fordelt i hele SI men er lokaliseret mere tæt mod de distale og proksimale ender af SI, som vist i figur 1A. Flow cytometric analyse viste, at hvis fulgt korrekt, vores protokol giver en PP lymfocyt befolkning, der viser fremad-side scatter fordeling svarende til splenocytes (figur 2AE, og 2D, H) med > 95% celle rentabilitet (figur 2B og 2F). I modsætning til andre sekundære lymfoide organer (SLOs), i C57BL/6 mus ca 70-80% af samlede PP lymfocytter består af B-celler, hvorimod CD4+ T celler udgør kun 10-15% af samlede PP lymfocytter (figur 2 c og 2 G).

Bemærk venligst at CD4+ CD19+ dobbelt positive (DP) celler udgør ≈ 1% af samlede PP lymfocytter. Med visse forholdsregler under celle forberedelse som udfører Fc-blok mod Fc receptorer af B-celler og eksklusive dubletter, CD4+ CD19+ DP celle befolkning kunne blive minimeret (figur 3A og B). Men en brøkdel af DPs, der ikke viser forward scatter (FSC) Karakteristik af dubletter er uundgåelig og bør være gated ud fra fælles positive T og B-celle portene (figur 3B). Vores resultater viste at B celler i DP celler meget udtrykkelig CXCR5 på deres overflade (figur 3 c), der kan føre til falsk-positive resultater i TFH porten, som er justeret baseret på CXCR5 udtryk i CD4+ T celler. På den anden side fandt vi, at GL7, en markør for aktiverede B-celler, kommer også til udtryk i CD4+ CD19+ DP celler (figur 3D), som kan forårsage interferens med GC B celle gating.

Eksempler på TFH og GC B celle gating algoritmer er afbildet i figur 4. For GC B celle gating, kan vi bruge GL7 mærkning versus CD38, som identificerer GC B-celler som GL7+ CD38- B-celler (figur 4A-B). PNA mærkning kan anvendes i stedet for GL723 , mens CD38 kan erstattes af en af de følgende mærker: IgD, Bcl-6 og CD95. Alternativ gating strategier for GC B-celler er påvist i figur S1. GC B celle forholdet i PPs viser stor variation i C57BL/6 mus. Men sammenlignet med andre SLOs, PPs har betydeligt højere GC B celle forholdet med et udvalg af 2-10% af total B celler under steady-state-betingelser. Gating strategi for PP TFH celler er beskrevet som CD19- CD4+ PD-1Hej CXCR5+ T-celler (figur 4A, C). "Zebra plot" blev fundet for at være en optimal demonstration metode for TFH gating som det skildrer PD-1Hej befolkningen mere diskret i forhold til andre plot typer (figur 4 c). TFR, en delmængde af TFH celler udtrykker Foxp3, gated som CD19- CD4+ PD-1Hej CXCR5+ Foxp3+ T-celler (figur 4D). Som GC B celler, TFH celle brøkdel varierer også i unimmunized mus individer med en vifte af 10 – 20% af total CD19- CD4+ PP lymfocytter. Oplysninger om alternative gating algoritmer for TFH celler er beskrevet i figur 4E, F og Fig. S1C, D.

For at undgå falsk positivitet baggrund farvning og autofluorescence, bør isotype kontrolelementer eller alternative tilsvarende kontrolelementer som fluorescens Minus én (FMO) medtages i panelet farvning som en negativ kontrol for TFH og GC B celle markører ( Figur 4 g-J).

For at optimere betingelserne for PP væv forberedelse, udviklede vi en roman internt kontrolleret eksperimentel strategi, hvor PPs blev indsamlet fra en enkelt mus og sammenlægges separat afhængigt af deres anatomiske oprindelse (fx., sår på tolvfingertarmen, ileal). For at udføre eksperimenter, poolede PPs blev tildelt til enkelte grupper, således at hver eksperimentelle og kontrolgruppen indgår et tilsvarende antal PPs fra hver anatomiske region (figur 5A). Ved denne tilgang, fandt vi at collagenase-baserede enzymatisk fordøjelsen (testet på 37,5 mg af collagenase II eller IV pr. 25 mL af fordøjelsen mix = 1,5 mg/mL), som er almindeligt anvendt til lymfocyt isolation fra forskellige slimhinden væv, betydeligt reduceret CXCR5 udtryk i PP lymfocytter (figur 5B), især i TFH celler (figur 5F-jeg), mens udtryk for andre overflade molekyler (fx., CD19, CD4) forblev intakt (Figur 5 C-E). Reduktion af CXCR5 opdagelse var fremtrædende, så et udtryk for CXCR5 på collagenase-behandlede TFH celler var næsten umulig at skelne fra isotype kontrol (figur 5F-jeg). Yderligere eksperimenter viste, at niveauet indblanding af Enzymatisk nedbrydning med CXCR5 udtryk var afhængig af CXCR5 antistof klon anvendes (figur 6A-F). Specifikt, ved collagenase II behandling var afsløring kapacitet CXCR5 antistof klon 2 g 8 mere markant forringet, end afsløring kapacitet CXCR5 antistof klon L138D7 (Figur 6A-D).

Enzymatisk fordøjelsen nedsættes ikke kun udtryk for CXCR5, men også andelen af samlede lymfocytter i PP celler som fastsat af FSC-SSC karakteristika, mens en betydelig brøkdel af celler isoleret fra fordøjet PPs udstillet frem og side scatter et højere intensitet end PP lymfocytter (figur 7A-C). Virkningerne af collagenase på celle opsving opstod i en dosisafhængig måde (figur 7A, H-J). Enzymatisk fordøjelse øget cellernes levedygtighed (figur 7 d, E). Dog denne fordel var ikke causatively knyttet til collagenase fordøjelsen fordi cellerne isoleret fra PPs efter agitation uden collagenase blev foretrukket ligeledes (figur 7F). Påvisning af den nukleare transskription faktor Foxp3, som er af særlig interesse her, fordi det vurderes normalt under TFH isolation til at identificere TFR celler, blev forbedret af agitation ved 37 ° C uanset collagenase fordøjelsen (figur 7 g ).

Figure 1
Figur 1: makroskopisk lønstrukturen og anatomiske murine Peyerske. (A). et billede fremstillet af duodenal ende af tyndtarmen med maven. To nært beliggende KKS i duodenum er angivet med sorte pile. (B). PPs indsamlet fra elleve C57BL/6 mus blev opbevaret individuelt i en 12 nå-plade. (C). billede af frisk skåret mus PPs vises på et 40 µm celle sien. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Flow cytometric karakterisering og grundlæggende gating algoritme for PP lymfocytter. (A). Dot parceller viser fordelingen af frisk isolerede ikke optagne PP lymfocytter langs FSC og SSC akser, der udviser stor lighed med splenocytes afbildet i (D). (B). udelukkelse af døde celler ved hjælp af 7AAD udtryk. 7AAD- -cellerne repræsenterer levende celler. (C). CD19 og CD4-baseret Immunofænotypning af T- og B-cellerne blandt pre gated live PP celler. (E-G). Repræsentative flow analyse af faste PP lymfocytter. (H). repræsentative flow karakteristik af faste splenocytes. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: CD4+ CD19+ dobbelt Positive (DP) celler årsag falsk positivitet i TFH og GC B celle gating. (A). CD4+CD19+ DP lymfocytter i live PP celler er påvist. (B). adskillelse af DP celler baseret på FSC karakteristika som dubletter og housecoats. (C,D). CXCR5 og GL7 udtryk for DP celler er afbildet i histogram grunde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: repræsentant TFH og GC B celle gating strategi. PPs blev indsamlet fra en 3 - måneder gamle mus og lymfocytter blev isoleret som beskrevet i afsnittet protokol. (A) CD19 og CD4 mærkning af levende PP lymfocytter er afbildet. (B) CD38lo GL7HejCD19+ B celler var gated som GC B-celler. (C) TFH celler var gated som CXCR5+PD-1Hej CD4+ celler. (D) TFR celler er en brøkdel af TFH celler udtrykker regulerende celle-specifikke transskription faktor Foxp3 sammen med TFH markører og er gated som CXCR5+ PD-1Hej Foxp3+ CD4+ T celler. (E-F) Gating strategi for TFH celleoverflademarkører bekræftet i splenocytes isoleret fra NP-æg-immuniseret mus ved hjælp af BCL-6 udtryk. (G-J) Fluorescens Minus én (FMO) kontrolelementer for nøglen TFH-TFR og GC celle markører er afbildet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Collagenase-baserede enzymatisk fordøjelsen fører til en massiv reduktion af CXCR5 påvisning. (A) PPs fra en 2 måneder gamle mus beliggende i duodenum (≈ 1/3 proksimale), jejunum (≈ 1/3 midterste) og ileum (≈ 1/3 distale) blev indsamlet og sammenlægges separat. Poolede PPs var jævnt fordelt til de eksperimentelle grupper. Enzymatisk nedbrydning med collagenase II eller IV på 1,5 mg/mL koncentration blev udført med agitation i 10 minutter ved 37 ° C. (B-E) Histogram grunde skildrer udtryk af overflade molekyler (CXCR5, CD19, PD-1, CD4) af de celler, der er isoleret fra PPs, der blev udsat for collagenase-baserede fordøjelsen. (F-jeg) TFH gating inden for collagenase-administreret og kontrolgrupper er demonstreret i zebra parceller. Data repræsenterer tre uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: collagenase effekt på CXCR5 udtryk viste stor forskel afhængigt af anti-CXCR5 antistof klon. PP lymfocytter indsamlet fra en 6-måned-forhenværende mus, samles og adskilt i forskellige grupper med hensyn til antistof klon anvendte og enzymatiske fordøjelsen ansøgning. (A-F) Andelen af TFH celler er afbildet i zebra parceller inden for gated pre live, CD19- CD4+ T celler. (A, C og E) PP celler var plettet med Biotin-konjugerede anti-mus CXCR5 antistof (2 g 8 klon), og Streptavidin konjugeret med BV421 fluorokrom. (B, D og F) PP celler blev farves med en primær konjugerede anti-mus CXCR5 antistof (L138D7 klon). (A-B) TFH gating parceller fra ufordøjet PP lymfocytter. (C-D) PPs fordøjes med collagenase II (20 mg/25 mL fordøjelsen mix) og rystes i 10 min ved 37 ° C. Data repræsenterer to uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Collagenase-baserede fordøjelse og agitation ved 37 ° C påvirker cellernes levedygtighed, recovery og intracellulær farvning effektivitet. En 3 måneder gammel C57BL/6 mus blev ofret; PPs blev indsamlet og samles som beskrevet i figur 5A. (A) efter indsamling af KKS, væv blev ophidset i overværelse af collagenase II (37,5 mg/25 mL fordøjelsen mix) i 10 min, FSC og SSC Karakteristik af faste PP celler er afbildet i (A) og levedygtighed farvning plot er afbildet i) D). (B, E) efter indsamling af KKS, væv blev holdt på isen uden ophidselse eller enzymatisk fordøjelsen; FSC og SSC Karakteristik af faste PPs celler er afbildet i (B) og levedygtighed farvning er afbildet i (E). (C, F) Efter samlingen af PPs var væv ophidset på 125-150 rpm i 10 min ved 37° C i mangel af collagenase; FSC og SSC egenskaber og levedygtighed farvning af faste PP celler er afbildet (C, F), henholdsvis. (G) sammenligning af Foxp3 udtryk i regulerende T-celler isoleret fra ophidset og unagitated PPs uden collagenase administration er afbildet i histogrammet plot. (H-J) PPs indsamlet fra en 6 - måneder gamle C57BL/6 mus og blev behandlet med forskellige koncentrationer af collagenase II: 25 mg pr. 25 mL fordøjelsen mix, 15 mg pr. 25 mL fordøjelsen mix eller ingen collagenase. FSC og SSC parceller, der afslører virkningerne af Enzymatisk nedbrydning på PP celle opsving og udbyttet er afbildet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: den molekylære model og den komplette aminosyresekvens af CXCR5. (A) syv-pass transmembrane protein struktur af CXCR5 er modelleret. (B) den komplette aminosyresekvens af CXCR5 er vist. Rækkefølgen af ekstracellulære regioner er angivet med rødt og ekstracellulære aminosyrer med formodede collagenase følsomme kemiske bindinger er vist med gult. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Antigen Klon Fluourochrome Fortynding
CD4 GK1.5, RM4-5 APC, PECy7, PerCpCy5.5, FITC 1: 100
CD19 6D 5 FITC, APC/Cy7 1: 100
PD-1 J43 PE elementærfilen 610 (Texas rød) 1: 100
ICOS 15 F9, 7E.17G9 PE 1: 100
BLR BLR PerCp/Cy5.5 1:75
CXCR5 2 g 8,L138D7 * Biotin 1:50
BCL-6 7 D 1 PE/Cy7 1:50
FOXP3 FJK-16 APC, PE 1: 100
Streptavidin - BV421, PE 1: 100
FixableViability farve - BV 510(AQUA) 1:1,000
7AAD - PerCp/Cy5.5 1: 500
FcBlock (CD16/32) 2.4G2 - 1:200

Tabel 1: antistof Resumé. Fortyndinger, kloner og fluorokrom bøjninger for relevante antistoffer og levedygtighed farvestoffer er angivet. Den optimale fortynding kan variere afhængigt af eksperimentelle betingelser og mange kvaliteten af produktet. Primære BV421-konjugeret L138D7 klon på 1:20 fortynding viste sammenlignelige CXCR5 afsløring kapacitet med biotin-konjugeret 2 g 8 klon på 1:50 fortynding. Derfor, primær-konjugeret L138D7 kan bruges som alternativ til biotin-konjugeret 2 g 8 klon.

Figur supplerende 1 (S1): Alternative strategier for TFH og GC B celler-gating. (A) leve PP lymfocytter fra en 3 måneder gammel mus på C57BL/6 baggrunden er afbildet. (B-C) GC B-celler er gated som CD38- GL7+ (B) og BCL-6+ GL7+ B celler (C). (D-E) TFH celler er afbildet som PD-1Hej CXCR5+ (D) og som ICOS+CXCR5+ CD4 + T celler (E). Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her, beskriver vi en protokol optimeret til flow cytometric karakterisering af TFH og GC B-cellerne. En af de store fordele ved vores protokol er, at det giver mulighed for dyrkning af op til 107 (gennemsnit 4-5 x 106 celler) samlede PP celler fra en enkelt mus (C57BL/6 stamme) uden nogen fordøjelsesprocessen. Vi bemærkede, at cellen total udbyttet var positivt korreleret med antallet af PPs og kunne estimeres ud fra følgende enkle ligning, som er nyttige for eksperimenterende planlægning: "samlede PP celle count per mus = 0,5 – 1 x (antal skåret PP per mus) x 106". Denne høje celle udbytte blev suppleret med forbedret cellernes levedygtighed (> 95%). Forbedret celle opsving og levedygtighed tilladt udfører flow cytometric analyse af forskellige lymfocyt delmængder i købekraftsstandarder ved hjælp af forskellige antistof farvning paneler i parallel.

I forhold til en nylig PP isolation protokol udgivet af De Jesus mfl. 20 og tidligere rapporter19,21, gav vores protokol betydeligt højere cellen total udbytte og levedygtighed, på trods af manglen fordøjelse med collagenase. Selv om identifikation af PPs kan være "tricky" for første gang efterforskere, indlæringskurven for denne protokol er temmelig stejl, og hvis mestret, vores teknik giver identifikation og kirurgisk excision af PPs fra tyndtarmen i en kort tid. Hvis det ønskede PP nummer ikke er nået efter første forsøg, foreslår vi, at gentage trinnet PP identifikation med fokus på den distale og proksimale ende af SI. I vores praksis, næsten i alle de mus, var to tæt placeret KKS i duodenal udgangen (figur 1A) og mindst 2-3 PPs inden for de sidste 5 cm af ileum påviselig.

TFH farvning kan være mere krævende end andre celle subsets i KKS, hvilket kræver ekstra opmærksomhed18. Hvis visse skridt er savnet under væv forarbejdning og celle isolation, kan resultaterne være helt misvisende. Derfor foreslår vi, at forskere for at være opmærksom på de følgende eksperimentelle "tips". Siden centrale TFH og GC B celle markører som CXCR5 og GL7 kan udtrykkes i både B og T celler, det er afgørende at medtage en B-celle markør i antistof paneler til at undgå falske positive resultater for kontaminerende CD19+CD4+ DP celler24 ( Figur 2). Bemærk venligst at gating strategier baseret på T-celle markører kun25 ikke vil give tilstrækkelig udelukkelse af DP celler, da disse celler også meget express T-celle markører herunder CD3 (data ikke vist) og CD4. Ud over udelukkelsen af DP celler flow flowcytometri resultaterne valideres og bekræftet ved at anvende passende negative kontroller (fx., isotype kontrolelementer, FMO'er). Ikke blot falsk positivitet, men også malplaceret TFH gate kan føre til falsk resultater og konklusioner. Justering af TFH gate kunne undertiden udfordring, især hvis TFH celle befolkning ikke er rigelige, dermed ikke optræder som en diskret befolkning i flowcytometri. At omgå denne begrænsning, tilføjelse af flere TFH markører (fx., BCL-6, PD-1, ICOS) til antistof panel kan give alternative gating muligheder og øge nøjagtigheden26. Af praktiske grunde blev BCL-6 fundet for at være en ideel Co farvning markør for alternative TFH gating som det kan bruges til gating GC B celler samtidigt16 (Figur S1C).

Derudover kunne har en positive kontrolprøve, der indeholder en høj TFH andel give forskerne god navigation for at placere TFH gate korrekt. I vores forsøg og, vi brugte PP prøver fra alderen mus (ældre end 6 måneder) som en positiv kontrol, da vi har konstateret, at aldring forårsager styrkelse af TFH celler i PPs op til 40% af samlede CD4+ T celler i steady state (data ikke vist). Vi opfordrer også de forskere, der har yderligere interesse i tekniske detaljer af TFH farvning for at undersøge metoder i bogens offentliggjort protokol for TFH celle farvning18.

Test eksperimentelle hypoteser i PP kan være relativt udfordrende og måske kræver et meget højt antal mus pr. gruppe for at opnå Statistisk signifikans21. Ved at udnytte det høje celle udbytte af vores protokol, omgås vi denne hindring med følgende eksperimentelle strategier. Først, vi skåret ud PPs og sorterede dem separat afhængigt af deres anatomiske oprindelse (fx., sår på tolvfingertarmen, jejunal og ileal). Derefter, vi jævnt fordelt disse poolede KKS i forskellige eksperimentelle og kontrolgrupper. Dette internt kontrolleret eksperimentel strategien gjort det muligt at minimere den indbyrdes individuelle forskel i mus, mens alle celler blev indhentet fra et enkelt museklik.

Desuden variation mellem forskellige intestinal rum (fx., duodenum vs. ileum)-tidligere rapporteret at være betydelig2 — blev forhindret som eksperimenterende og kontrolgruppen bestod af et lige antal KKS pr. anatomiske region (figur 5A). Ved at udføre replikater af uafhængige eksperimenter ved hjælp af den samme tilgang, vi har forbedret pålidelighed og betydningen af vores resultater. Udover at fjerne uspecifik variationer, hjælper denne metode også ekstra mus, reagenser og tid.

I løbet af udvikling og optimering af vores protokol viste vores resultater, at collagenase II og IV-baserede fordøjelsen markant reduceret CXCR5 udtryk (figur 5B) mens andre overflade molekyler til påvisning TFH og GC B celler forblev intakt ( Figur 5 c -E) . I en nylig rapporteret JoVE protokol19, collagenase II blev vist sig at være meget effektiv til lymfocyt isolation fra PPs og lp'er. Dog er collagenase II tidligere blevet rapporteret at have en høj tryptic aktivitet, hvilket resulterer i kløvningen af flere overflade molekyler. Givet sin overflade-molekyle venlige natur27 på grund af den lavere tryptic aktivitet og mere almindelige skik i litteratur28,29,30, Collagenase IV havde også medtaget ud over collagenase II i vores undersøgelse og bruges i koncentrationerne, som anbefalet i de tidligere betænkninger. Brugen af collagenase og tilsvarende enzymer har været en modstridende spørgsmål i Slimhindeimmunologi på grund af de uønskede virkninger af fordøjelsen på immunceller som ændret overflade molekyle udtryk31,27.

Tidligere forlød det, at brugen af forskellige typer af collagenase kunne forstyrre flow cytometric CXCR5 opdagelse inden for menneskelige gut32 og tonsil prøver18. Omvendt, andre undersøgelser vist isolering af TFH og GC B celler fra PPs uden brug af collagenases24,33. Men indtil nu ingen komparativ tilgang havde været forpligtet sig til at vurdere, om medtagelse eller udelukkelse af collagenase fordøjelse vil repræsentere den optimale tilstand til isolation af CXCR5-udtrykker TFH celler fra murine PPs. mus CXCR5 er en 374 aminosyre længe syv-pass membran proteiner med relativt korte ekstracellulære regioner sammenlignet med andre transmembrane proteiner som CD4, CD19, der er overflod udtrykt i lymfoide celler i KKS (data fra UniProt). I figur 8A-B, en molekylær model og samlede aminosyresekvens af mus CXCR5 er afbildet med den formodede target sekvenser af collagenase-baserede fordøjelse, som har tendens til at adskille kemiske bindinger mellem glycin (Gly) og neutral amino syrer34. De syv-pass transmembrane molekylære struktur resulterende kort ekstracellulære domæner kan være ansvarlige for at gøre CXCR5 molekyle sårbare over for enzymatisk fordøjelsen (figur 8A). Intriguingly, fandt vi at påvisning af CXCR5 udtryk efter collagenase behandling er afhængig af antistof klon anvendes. Selv om 2 g 8 og L138D7 kloner viste lignende resultater i ufordøjet PP-gruppen, som bestemt af påvisning af sammenlignelige TFH brøker, i gruppen fordøjet PP L138D7 klon afslørede ca 3 x (≈ 9%) højere brøkdel af TFH celler i CD4+ T-celler end 2 g 8 klon (≈ 3%) (Figur 6). Dette resultat tyder på, at reduceret CXCR5 farvning kan være sekundært til modificerede tredimensionale epitop konfiguration af enzymatisk aktivitet af collagenase. Vores resultater viser, at collagenase-baserede fordøjelsen skal undgås under PP forberedelse.

Indblanding af collagenase dissociation med CXCR5 molekyle opdagelse blev omgået ved at udelukke trinnet fordøjelsen. Dog skal det bemærkes, at for nogle væv som LP, mekanisk forstyrrelser er ikke tilstrækkeligt at isolere cellerne og for sådanne væv, enzymatisk fordøjelsen ville være påkrævet19. Fremover, vil det være vigtigt at teste alternative fordøjelse betingelser samt fordøjelsen-kompatible antistof kloner til at omgå denne tekniske begrænsninger for væv der kræver enzymatisk fordøjelse. Indtil da, vil Billeddannende teknikker såsom immun Fluorescens mikroskopi forblive som den foretrukne metode til påvisning af TFH i disse væv. Ud over isolere LP celler, isolation af nogle hæmatopoietisk celle subsets som DCs og plasma celler fra PPs kræver enzymatisk fordøjelsen35. Når ansætte vores protokol, bør forskere, der ønsker at isolere disse celle subsets fra PPs omfatte passende enzymatisk fordøjelsen trin20. Mulige indblanding af Enzymatisk nedbrydning med udtryk for DC markører bør tages i betragtning og fordøjelse betingelser bør optimeres efter behov. Hvornår isolation af TFH og GC B celler der ønskes ud over en celle delmængde, der kræver collagenase fordøjelsen36, PPs indsamlet fra hver mus kunne adskilles i to grupper for behandling med og uden collagenase behandling i parallelle paneler.

Virkningerne af collagenase på PP lymfocytter var ikke begrænset til overflade molekyle udtryk. Vores resultater viste, at Enzymatisk nedbrydning forårsaget en relativ nedgang i lymfocyt andelen inden for PP celler i en dosisafhængig måde (figur 7). Faldet i lymfocyt fraktion kan blive en konsekvens af collagenase-medieret frigivelse af andre typer af hæmatopoietisk celle subsets som fagocytter og DCs fra PPs, der er større og mere granulat end lymfoide celler. Det er også muligt at collagenase fordøjelsen medieret celle frigivelse fra nabolandet LP og intraepithelial rum kunne bidrage til ændring af FSC-SSC profil. Denne celle forurening fra andre gut rum kan også forårsage interferens i flow analyse af PP lymfocytter. På dette grundlag, for at maksimere celle renhed, undgå vi også tilsætning af reagenser som EDTA eller DTT, der er almindeligt anvendt til at udtrække epitelceller og slim20, holde væv forberedelse betingelser som fysiologisk og unmanipulated som muligt. Trods disse negative virkninger af enzymatisk fordøjelse, blev gavnlige virkninger på PP lymfocytter også opdaget såsom forbedring af intracellulær farvning og cellernes levedygtighed (figur 7 d-F, G). Imidlertid yderligere viste analyser, at disse virkninger blev tilskrevet agitation processen ved 37 ° C uafhængigt af Enzymatisk nedbrydning, fordi cellernes levedygtighed og intracellulære Foxp3 farvning blev foretrukket til en sammenlignelig grad når celler blev ophidset i manglen collagenase. Mekanisk, kan den gavnlige effekt af agitation være på grund af den forbedrede fjernelse af tarmindholdet og slim fra KKS.

I sammendrag, har vi beskrevet en strømlinet protokol til isolering af lymfocytter fra PPs. isoleret celler kan farves til flow cytometric karakterisering af adskillige celle subsets eller kan blive udsat for celle sortering og efterfølgende ansat i forskellige in vitro- og i vivo funktionelle assays.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke Laura Strauss og Peter Sage til nyttige diskussioner og støtte med flow flowcytometri analyser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-mouse CD4 antibody eBioscience, Biolegend* 17-0041-81 ,10054* For detailed information see Table 1
anti-mouse CD19 antibody eBioscience MA5-16536 For detailed information see Table 1
anti-mouse PD-1 antibody eBioscience 61-9985-82 For detailed information see Table 1
anti-mouse ICOS antibody eBioscience 12-9942-82 For detailed information see Table 1
anti-mouse GL7 antibody Biolegend 144610 For detailed information see Table 1
anti-mouse CXCR5 antibody Biolegend*, BD Bioscience 145512*, 551960 For detailed information see Table 1
anti-mouse BCL-6 antibody Biolegend 358512 For detailed information see Table 1
anti-mouse Foxp3 antibody eBioscience 17-5773-82 For detailed information see Table 1
Streptavidin-BV421 BD Bioscience 563259 For detailed information see Table 1
FixableViability Dye eBioscience L34957 For detailed information see Table 1
7AAD Biolegend 420404 For detailed information see Table 1
FcBlock (CD16/32) BD Bioscience 553141 For detailed information see Table 1
Collagenase II Worthington LS004176
Collagenase IV Worthington LS004188
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set eBioscience 00-5523-00
6-well,12-well & 96-well plates Falcon/Corning 353046,353043/3596
50 mL conical tubes Falcon 3520
40 µm cell strainer Falcon 352340
10 mL syringe-plunger Exel INT 26265
RPMI Corning 15-040-CV
PBS Corning 21-040-CM
FBS Atlanta Biologicals S11150
Orbital shaker VWR Model 200
Curved-end scissor
Fine Serrated Forceps
Small curved scissor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van den Berg, T. K., van der Schoot, C. E. Innate immune ‘self’ recognition: a role for CD47-SIRPα interactions in hematopoietic stem cell transplantation. Trends in Immunology. 29, (5), 203-206 (2008).
  2. Mowat, A. M., Agace, W. W. Regional specialization within the intestinal immune system. Nature Reviews Immunology. 14, (10), 667-685 (2014).
  3. Reboldi, A., Cyster, J. G. Peyer’s patches: Organizing B-cell responses at the intestinal frontier. Immunological Reviews. 271, (1), 230-245 (2016).
  4. Heel, K. A., McCauley, R. D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. Review: Peyer’s patches. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 12, (2), 122-136 (1997).
  5. Fagarasan, S., Kinoshita, K., Muramatsu, M., Ikuta, K., Honjo, T. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413, (6856), 639-643 (2001).
  6. Hopkins, S. A., Niedergang, F., Corthesy-Theulaz, I. E., Kraehenbuhl, J. P. A recombinant Salmonella typhimurium vaccine strain is taken up and survives within murine Peyer’s patch dendritic cells. Cellular Microbiology. 2, (1), 59-68 (2000).
  7. Shreedhar, V. K., Kelsall, B. L., Neutra, M. R. Cholera toxin induces migration of dendritic cells from the subepithelial dome region to T- and B-cell areas of Peyer's patches. Infection and Immunity. 71, (1), 504-509 (2003).
  8. Sato, A., Iwasaki, A. Peyer’s patch dendritic cells as regulators of mucosal adaptive immunity. Cellular and Molecular Life Sciences. 62, (12), 1333-1338 (2005).
  9. Bemark, M., Boysen, P., Lycke, N. Y. Induction of gut IgA production through T cell-dependent and T cell-independent pathways. Annals of the New York Academy of Sciences. 1247, (1), 97-116 (2012).
  10. Fagarasan, S., Kawamoto, S., Kanagawa, O., Suzuki, K. Adaptive Immune Regulation in the Gut: T Cell-Dependent and T Cell-Independent IgA Synthesis. Annual Review of Immunology. 28, 243-273 (2010).
  11. Hase, K., et al. Uptake through glycoprotein 2 of FimH + bacteria by M cells initiates mucosal immune response. Nature. 462, (7270), 226-230 (2009).
  12. Wu, H., et al. An Inhibitory Role for the Transcription Factor Stat3 in Controlling IL-4 and Bcl6 Expression in Follicular Helper T Cells. Journal of Immunology. 195, (5), 2080-2089 (2015).
  13. Vinuesa, C. G., Tangye, S. G., Moser, B., Mackay, C. R. Follicular B helper T cells in antibody responses and autoimmunity. Nature Reviews Immunology. 5, (11), 853-865 (2005).
  14. Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal Centers. Annual Review of Immunology. 30, 429-457 (2012).
  15. Vaeth, M., et al. Store-Operated Ca2+Entry in Follicular T Cells Controls Humoral Immune Responses and Autoimmunity. Immunity. 44, (6), 1350-1364 (2016).
  16. Meli, A. P., et al. The Integrin LFA-1 Controls T Follicular Helper Cell Generation and Maintenance. Immunity. 45, (4), 831-846 (2016).
  17. Fu, W., et al. Deficiency in T follicular regulatory cells promotes autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 215, (3), 815-825 (2018).
  18. Espéli, M., Walker, J. M. T follicular helper cells - Methods and Protocols. (2015).
  19. Couter, C. J., Surana, N. K. Isolation and Flow Cytometric Characterization of Murine Small Intestinal Lymphocytes. Journal of Visual Experiments. (111), e54114 (2016).
  20. De Jesus, M., Ahlawat, S., Mantis, N. J. Isolating And Immunostaining Lymphocytes and Dendritic Cells from Murine Peyer’s Patches. Journal of Visual Experiments. (73), e50167 (2013).
  21. Pastori, C., Lopalco, L. Isolation and in vitro Activation of Mouse Peyer’s Patch Cells from Small Intestine Tissue. Bio-protocol. 4, (21), e1282 (2014).
  22. Fukuda, S., Hase, K., Ohno, H. Application of a Mouse Ligated Peyer’s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells. Journal of Visual Experiments. (58), 3225 (2011).
  23. Naito, Y., et al. Germinal Center Marker GL7 Probes Activation-Dependent Repression of N-Glycolylneuraminic Acid, a Sialic Acid Species Involved in the Negative Modulation of B-Cell Activation. Molecular and Cellular Biology. 27, (8), 3008-3022 (2007).
  24. Bollig, N., et al. Transcription factor {IRF4} determines germinal center formation through follicular T-helper cell differentiation. Proceedings of the National Academy of Science of U. S. A. 109, (22), 8664-8669 (2012).
  25. Pérez-Mazliah, D., et al. Follicular Helper T Cells are Essential for the Elimination of Plasmodium Infection. EBioMedicine. 24, 216-230 (2017).
  26. Sage, P. T., Sharpe, A. H. T follicular regulatory cells in the regulation of B cell responses. Trends Immunology. 36, (7), 410-418 (2015).
  27. Van Damme, N., et al. Chemical agents and enzymes used for the extraction of gut lymphocytes influence flow cytometric detection of T cell surface markers. Journal of Immunological Methods. 236, (1-2), 27-35 (2000).
  28. Meenan, J., et al. Altered expression of alpha 4 beta 7, a gut homing integrin, by circulating and mucosal T cells in colonic mucosal inflammation. Gut. 40, (2), 241-246 (1997).
  29. Cao, A. T., et al. Interleukin (IL) -21 promotes intestinal IgA response to microbiota. Mucosal Immunology. 8, (5), 1072-1082 (2015).
  30. Wei, J., et al. Autophagy enforces functional integrity of regulatory T cells by coupling environmental cues and metabolic homeostasis. Nature Immunology. 17, (3), 277-285 (2016).
  31. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. European Journal of Microbiology & Immunology. 2, (2), 112-120 (2012).
  32. Trapecar, M., et al. An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies. AIDS Research and Human Retroviruses. 33, (S1), (2017).
  33. Bergqvist, P., Gardby, E., Stensson, A., Bemark, M., Lycke, N. Y. Gut IgA Class Switch Recombination in the Absence of CD40 Does Not Occur in the Lamina Propria and Is Independent of Germinal Centers. Journal of Immunology. 177, (11), 7772-7783 (2006).
  34. Keil, B., Gilles, A. M., Lecroisey, A., Hurion, N., Tong, N. T. Specificity of collagenase from Achromobacter iophagus. FEBS Letters. 56, (2), 292-296 (1975).
  35. Mora, J. R., et al. Selective imprinting of gut-homing T cells by Peyer’s patch dendritic cells. Nature. 424, (6944), 88-93 (2003).
  36. Reboldi, A., et al. Mucosal immunology: IgA production requires B cell interaction with subepithelial dendritic cells in Peyer’s patches. Science. 352, (6287), (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics