En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokollen beskriver en fluorescens svingninger spektroskopi tilnærming for å undersøke interaksjon mellom proteiner formidling celle-celle interaksjoner, dvs proteiner lokalisert i cellen veikryss, direkte i levende celler. Vi gir detaljerte veiledninger på instrumentet kalibrering, datainnsamling og analyse, inkludert rettelser til mulig gjenstanden kilder.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dunsing, V., Chiantia, S. A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts. J. Vis. Exp. (142), e58582, doi:10.3791/58582 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En rekke biologiske prosesser innebærer celle-celle interaksjoner, vanligvis formidlet av proteiner som samhandler på grensesnittet mellom nabokommunene cellene. Rundt er bare få analyser dugelig av spesielt sondering slik interaksjon direkte i levende celler. Her presenterer vi en analyse for å måle binding av proteiner uttrykt på overflater av nabokommunene cellene på celle-celle kontakter. Denne analysen består av to trinn: blanding av celler som uttrykker proteiner rundt smeltet forskjellige fluorescerende proteiner, etterfulgt av fluorescens svingninger spektroskopi målinger på celle-celle kontakter ved hjelp av en AC confocal laserskanning mikroskop. Vi viser muligheten for denne analysen i en biologisk relevante kontekst ved å måle samspillet av amyloid forløper som protein 1 (APLP1) over celle-celle veikryss. Vi gir detaljert protokoller på datainnsamling bruker fluorescens-baserte teknikker (skanning fluorescens kryss-korrelasjon spektroskopi, cross-korrelasjon tall og lysstyrke analyse) og nødvendige instrument kalibreringer. Videre, vi diskutere avgjørende skritt i dataanalyse og hvordan å identifisere og korrigere eksterne, falske signal variasjoner, for eksempel på grunn av photobleaching eller celle bevegelse.

Vanligvis presentert analysen gjelder homo - eller heterotypic protein-protein interaksjon på celle-celle kontakter mellom celler av samme eller forskjellige typer og kan implementeres på en kommersiell AC confocal laserskanning mikroskop. En viktig forutsetning er stabiliteten i systemet, som må være tilstrekkelig å undersøke diffusive dynamikken i proteiner rundt over flere minutter.

Introduction

Mange biologiske prosesser oppstå ved celle-celle interaksjoner, f.eks celle-celle adhesjon1,2,3, celle-celle fusion4 og mobilnettet anerkjennelse5. Slike hendelser er spesielt viktig i utviklingen av multicellular organismer og for celle-celle kommunikasjon, f.eks under immunreaksjoner. Disse prosessene er vanligvis formidlet av proteiner som er lokalisert på overflaten, dvs. i plasma membranen (PM) til nabokommunene cellene og gjennomgå spesifikke interaksjoner ved celle-celle kontakt som er nøyaktig regulert i rom og tid. I mange tilfeller kan disse interaksjoner er direkte homo- eller heterotypic protein-protein trans interaksjoner, men kan også innebære ioner eller ligander som ekstracellulære linkers1. Selv om du er av grunnleggende betydning, er det mangel på analyser sondering disse bestemt protein-protein interaksjoner direkte i sine opprinnelige omgivelser av levende celler. Mange metoder krever enten celle avbrudd (f.eks biokjemiske analyser som co-immunoprecipitation6), fiksering (f.eks noen super-oppløsning mikroskopi optisk teknikker og elektronmikroskop av celle-celle kontakter7), eller er ikke-spesifikk, f.eks aggregering / vedheft søk8,9. For å overvinne problemet, er fluorescens teknikker gjennomført basert på fluorescens resonans energi overføring (bånd)10 eller fluorescens complementation11. Men for å oppnå tilstrekkelig små avstander mellom fluorophores, krever disse metodene fluorescerende etiketter på ekstracellulære side av proteiner10, potensielt forstyrre trans interaksjoner.

Her presenterer vi en alternativ fluorescens-baserte analysen for protein-protein interaksjoner i celle-celle kontakter. Denne tilnærmingen kombinerer fluorescens kryss-korrelasjon tilnærminger (skanning fluorescens kryss-korrelasjon spektroskopi (sFCCS), cross-korrelasjon nummer og lysstyrke (ccN og B)) og blanding av celler som uttrykker en fusion konstruksjon av protein av interesse, f.eks en vedheft reseptor. Undersøkte receptors i de to samspill cellene er merket med to spectrally atskilt fluorescerende proteiner (FPs), fra den intracellulær side (se figur 1A).

De næringsdrivende metodene er basert på den statistiske analysen fluorescens svingninger forårsaket av diffusive bevegelse fluorescerende fusion proteiner gjennom fokal volumet av en AC confocal laserskanning mikroskop. Mer i detalj sonder analysen co spredningen av proteiner interesse både nabolandet PMs på celle-celle kontakter. Hvis proteiner gjennomgå trans interaksjoner, vil disse trans komplekser bære fluorescerende proteiner emitting i begge spectral kanalene, forårsaker korrelert fluorescens svingninger av både emittere. Derimot, hvis ingen binding, vil antall svingninger proteiner i overfor PMs være uavhengig, forårsaker ingen samsvarende svingninger. Oppkjøpet kan utføres på to måter: 1) sFCCS er basert på en linje-formet skanning over celle-celle kontakten og effektivt sonder samhandlinger i et sted i regionen kontakt. Gjennom en timelig analyse av fluorescens svingninger gir sFCCS også dynamics informasjon, dvs. diffusjon koeffisientene av protein komplekser; 2) ccN & B er basert på en pixel-wise analyse av en sekvens av bilder kjøpt til celle-celle kontakt regionene. Den har evnen å undersøke og kart interaksjoner langs hele kontakt regionen (i en fokalplanet), men gir ikke informasjon på dynamics. Begge metodene kan kombineres med en analyse av molekylære lysstyrken, dvs. gjennomsnittlig fluorescens signalet slippes ut i tidsenheten av enkelt spre protein komplekser, og dermed gir anslag over støkiometri av protein komplekser på celle-celle kontakter.

I denne artikkelen gir vi detaljert protokoller for eksempel forberedelse, instrument kalibrering, datainnsamling og analyse å utføre presentert analysen på en kommersiell AC confocal laserskanning mikroskop. Eksperimenter kan utføres på instrument Foton teller eller analoge detektorer og et mål med høy numeriske blenderåpning. Vi videre diskutere avgjørende skritt av protokollen og gi korreksjon ordninger for flere prosesser forårsaker artefactual signal svingninger, f.eks detektor støy, photobleaching eller celle bevegelse. Opprinnelig utviklet for å undersøke interaksjoner mellom tilhenger celler, analysen kan endres for suspensjon celler eller tilpasset modell membran systemer, f.eks gigantiske unilamellar blemmer (GUVs) eller gigantiske plasma membran blemmer (GPMVs), slik at den kvantifisering av interaksjoner i forskjellige lipid miljøer eller i fravær av en organisert cytoskjelett12,13.

Skanning fluorescens kryss-korrelasjon spektroskopi er en modifisert versjon av fluorescens kryss-korrelasjon spektroskopi14 og var spesielt beregnet på sonde langsom diffusive dynamikk i lipid membraner15. Den er basert på en linje skanning oppkjøpet vinkelrett til PM med fluorescerende proteiner av interesse. For å undersøke interaksjoner av to annerledes merket protein arter, utføres oppkjøpet i to spectral kanaler med to laser linjer og to oppdagelsen Vinduer for spectrally atskilt fluorophores. På grunn av treg diffusjon dynamikken i proteiner i PM (D≤ ~ 1 µm2/s), en cross-talk-fri måling kan utføres av vekslende eksitasjon ordningen fra linje til linje15. Analysen starter med: 1) en justering algoritme korrigere for sideveis celle bevegelse basert på block-wise gjennomsnitt ~ 1000 linjer, 2) fastsettelse av posisjon med maksimal fluorescens signaldvs. PM posisjon, i hver blokk og 3) skiftende Alle blokkene til en felles opprinnelse12,15, separat i hver enkelt kanal. Deretter utføres en automatisk valg av bildepunkter som tilsvarer PM ved å velge den sentrale regionen et Gaussian anfall av summen av alle justerte linjer (dvs. center ± 2.5σ). Integrering av signalet i hver linje gir membran fluorescens tiden serien f (t) i hver enkelt kanal (g = grønn kanal, r = rød sone). Merk at pikselstørrelsen må være små nok, f.eks < 200 nm, å rekonstruere form av punkt spredning funksjon og finne midten, tilsvarer plasseringen av PM. I nærvær av betydelig photobleaching, fluorescens tiden serien i hver kanal kan være modellert med en dobbel-eksponentiell funksjon og deretter korrigert med følgende formel:16

Equation 1.    (1)

Det er viktig å merke seg at denne formelen effektivt korrigerer både amplitudes og diffusion times fra korrelasjon analyse av f (t)c, sammenlignet med parameteren anslår at skulle hentes fra det ukorrigert f (t). Deretter auto - og kryss-korrelasjon funksjonene (ACFs / CCFs) av fluorescensen signaler beregnes:

Equation 2, (2).

Equation 3, (3).

hvor sesFjeg = Fjeg(t) - Image 1 Fjeg(t)Image 2 og jeg = g, r.

En todimensjonal diffusjon modell er da utstyrt til alle korrelasjon funksjoner (CFs):

Equation 4.   (4)

Her, angir N antall fluorescerende proteiner i observasjon volumet og τd diffusjon tiden for hver kanal. Denne modellen tar hensyn at beskrevet eksperimentelle innstillingen, spredning av proteiner i PM oppstår i x-z flyet, i motsetning til vanlige konfigurasjonen fluorescens korrelasjon spektroskopi (FCS) eksperimenter på membraner undersøkelser diffusjon i x-y flyet AC confocal volum17. Livet w0 og struktur faktoren S, som beskriver forlengelse wz fokal volumroten i z, S = wz/w0, hentes fra et punkt FCS kalibrering mål med spectrally lignende fargestoffer og optisk innstillingene bruke allerede tilgjengelig for diffusion rthe Dfargestoff:

Equation 5, (5).

hvor τd, fargestoff er målt gjennomsnittlig diffusjon tiden av fargestoff molekyler, fra montering en modell for tredimensjonale diffusjon til dataene, tar konto overganger av en brøkdel T alle N molekyler til en trilling stat med en gang konstant ττ:

Equation 6.   (6)

Til slutt, diffusjon koeffisientene (D), molekylær lysstyrkeverdier (ε) og relativ kryss-korrelasjonen sFCCS data (rel.cc.) er beregnet som følger:

Equation 7, (7).

Equation 8, (8).

Equation 9, (9).

hvor Gcross(0) er amplituden til funksjonen kryss-korrelasjon og Equation 14 er amplituden til funksjonen autokorrelasjon i jeg-th kanalen.

Denne definisjonen av relativ kryss-korrelasjon, dvs med max i stedet for betyr i ligningen 9, tar hensyn til at maksimalt antall komplekser av to protein arter til stede i ulike konsentrasjoner er begrenset av den arter til stede i et lavere tall.

Cross-korrelasjon tall og lysstyrke er basert på litt analyse av fluorescens intensiteten for hvert bildepunkt i en bildestakk kjøpt over tid til en fast stilling i utvalget, vanligvis bestående av ~ 100-200 rammene, med to spectral kanaler () g = grønn kanal, r = rød sone). Fra timelige middelverdien Image 1 jegImage 2jeg og varians Equation 16 , den molekylære lysstyrke εjeg og nummer njeg beregnes i hver piksel og spectral kanal (jeg = g, r)18:

Equation 10, (10).

Equation 11. (11)

Det er viktig å merke seg at gitt ligningene gjelder det ideelle tilfellet av en sann Foton-telling detektor. For analoge oppdagingssystemer gjelder følgende ligningene19,20:

Equation 12, (12).

Equation 13.   (13)

Her, S er omregningsfaktoren mellom oppdaget fotoner og innspilte digitalt teller, Equation 24 er avlesning støy og forskyvning refererer til detektor intensitet forskyvningen. Vanligvis bør disse antallene kalibreres, for alle merker, basert på måling detektor avviket som en funksjon av intensitet for jevn belysning19, f.eks en reflekterende metalloverflate eller tørket fargestoff løsning. Forskyvning kan bestemmes ved å måle antall prisen for et utvalg uten eksitasjon lys. Ved å utføre en lineær regresjon av detektor-assosiert variansen Equation 25 versus intensitet (jeg) plot, S og Equation 24 kan være bestemt19:

Equation 14.   (14)

Til slutt, cross-korrelasjon lysstyrken beregnes i hver piksel og defineres generelt som21

Equation 15, (15).

hvor Equation 29 er kryss-variansen Equation 30 .

For å filtrere varige svingninger, utføres alle ccN & B beregninger etter en boxcar filtrering, uavhengig for hver piksel22. Kort, njeg, εjeg (jeg = g, r) og Bcc beregnes i skyve segmenter av f.eks 8-15 rammer. Verdiene anskaffes kan være så gjennomsnitt for å få den endelige pixel tall og lysstyrke.

Støkiometri analyse
For å beregne støkiometri av protein komplekser på celle-celle kontakter, kan molekylær lysstyrken bli separat analysert i hver spectral kanal for sFCCS eller ccN & B data. I sFCCS hentes en lysstyrkeverdi per måling i hver enkelt kanal. I ccN & B, et lysstyrke histogram for alle bildepunkter ved celle-celle kontakten er innhentet og gjennomsnittlig (eller median) verdien kan brukes som representant lysstyrke for målingen. Ved å utføre den samme analysen på en monomerisk referanse, kan alle lysstyrkeverdier normaliseres for å få direkte gjennomsnittlig oligomeric staten oppdaget protein komplekser. På dette punktet, er det viktig å korrigere for tilstedeværelsen av ikke-fluorescerende FPs som kan resultere i en undervurdering av oligomeric. Dette er vanligvis utføres av måle lysstyrken på en homo-dimeric referanse protein23,24 med én farge sFCS eller tall og lysstyrke (N & B).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. sample forberedelse: Celle-celle blanding analysen

Merk: Følgende protokollen beskriver blande fremgangsmåten for tilhenger celler. Det kan endres for cellene kultivert i suspensjon.

  1. Frø et passende antall celler i en 6-vel plate, f.eks 800.000 HEK 293T celler (telt med en Neubauer telling kammer), en dag før transfection. Nummeret kan endres avhengig av tiden mellom såing og transfection og justert for andre celletyper. For å utføre et grunnleggende eksperiment (dvs. proteiner av interesse og negativ kontroll), forberede minst 4 brønner. Kultur celler ved 37 ° C, 5% CO2 i Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) medium, supplert med fosterets bovin serum (10%) og L-glutamin (1%).
  2. Transfect celler i henhold til instruksjonene fra produsenten (se Tabell for materiale).
    1. Du utfører en grunnleggende eksperiment ved transfect, i separate brønner, plasmider for protein rundt smeltet sammen til en 'grønne' (f.eks monomerisk forbedret grønne fluorescerende protein (mEGFP) eller gul fluorescerende protein (mEYFP)) eller 'rød' (f.eks mCherry, eller mCardinal) fluorescerende protein.
      Merk: I denne protokollen fokuserer vi på APLP1-mEYFP og APLP1-mCardinal12, og tilsvarende negativ kontroll, f.eks myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-palm-mEYFP) og -mCardinal (myr-palm-mCardinal)12. Vanligvis 200 ng - 1 µg av plasmider DNA er tilstrekkelig. Høy transfection effektivitet øker sjansen til å finne 'rød' og 'grønne' celler i kontakt. Endre mengden plasmider og transfection reagens å optimalisere transfection effektivitet. Kritisk: Celle confluency bør være rundt 70% når transfecting cellene. Hvis celler over confluent, minker transfection effektiviteten. Hvis celler ikke confluent nok, kan hva og miksing indusere stress og forhindre mange celler fra riktig vedlegg etter blanding.
  3. Utføre celle blande ~4 ± 2t etter hva.
    1. Fjerne oppblomstringen medium og vask godt forsiktig med 1 mL PBS med Mg2 + og Ca2 +. Deretter Fjern PBS. (Kritisk) Slipp PBS på godt for å hindre avdeling av celler under vask.
    2. Legge til ~ 50 µL trypsin ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) løsning drop-wise i hver brønn å lette avdeling av celler. Inkuber ved 37 ° C i 2 min. etterpå, sakte riste 6-vel platen sidelengs for å koble cellene.
      Merk: Utvidet inkubasjon ganger kan være nødvendig for noen celletyper.
    3. Legg 950 µL av vekstmediet i hver brønn og resuspend celler av pipettering et par ganger og dermed løsne alle celler fra godt bunnen. (Kritisk) Kontroller at cellene er resuspended riktig og løsrevet fra hverandre av visuelt kontroll for fravær av store celle aggregater etter rørets. Ellers oppnås mange 'rød'-'rød' eller 'grønne'-'grønne' kontakter etter blanding.
    4. Overføre celle løsning av en brønn (protein severdigheter eller negativ kontroll) til tilsvarende Vel, dvs 'rød' (f.eks APLP1-mCardinal transfekterte) til 'grønne' (f.eks APLP1-mEYFP transfekterte) celler. Bland ved forsiktig pipettering noen ganger opp og ned. Deretter seeded frø blandet cellene på 35 mm glass bunn retter (1 mL av mikset-celle løsning per fat), pluss 1 mL av oppblomstringen medium og kultur celler for en annen dag på 37 ° C, 5% CO2.

Figure 1
Figur 1 . Eksperimentell arbeidsflyt og skjematisk fremstilling av skanning fluorescens kryss-korrelasjon spektroskopi og kryss-korrelasjon tall og lysstyrke analyse i celle-celle kontakter. (A) ordningen eksempel forberedelser: to celle populasjoner transfekterte med protein av interesse (f.eks APLP1) smeltet to spectrally distinkte fluorescerende proteiner (f.eks mEYFP og mCardinal) er blandet etter hva. Kontakter med forskjellig transfekterte celler er merket i mikroskopi eksperimenter. For å unngå interferens med ekstracellulære bindende domener, skal fluorescerende proteinet være smeltet til intracellulær endestasjonen til protein rundt. (B) skanning FCCS (sFCCS) målingene er utført vinkelrett celle-celle kontakten i to spectral kanaler (kanal 1, grønn og kanal 2, rød). Linjer (representert som kymographs) er justert og membran piksler summert. Så, ACFs og CCFs beregnes fra intensitet spor Fjeg(t). ACFs er representert i rødt og grønt. CCF representeres i blått. (C) Cross-korrelasjon N & B (ccN & B) oppkjøpet resulterer i en tredimensjonal (x-y-tid) bildestakk. En avkastning er valgt rundt celle-celle kontakten. Så kanalen og kryss-korrelasjon lysstyrke (ε1, ε2og Bcc) beregnes verdier i hver celle-celle kontakt piksel. Resultatene er deretter visualisere som histogrammer, samle alle merkede bildepunkter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

2. prøven forberedelse: Positiv kontroll for kryss-korrelasjon eksperimenter og Homo-Dimer konstruere for lysstyrke analyse

  1. Frø 600.000 HEK 293T celler, telles med en celle teller kammer, 35 mm glass bunn retter dagen før transfection. Kultur cellene på 37 ° C, 5% CO2 i fullstendig DMEM medium (se trinn 1.1) for en annen dag.
  2. Transfect celler med ~ 250 ng av plasmider DNA i henhold til instruksjonene fra produsenten. Bruke en plasmider koding en membran-forankret fluorescerende protein hetero-dimer, f.eks myr-palm-mCherry-mEGFP eller myr-palm-mCardinal-mEYFP12 svarer til FPs av proteinet rundt kontrollen positive kryss-sammenheng. For lysstyrke kalibrering, bruke plasmider koding både membran-forankret FP monomer og homo-dimer tilsvarer FPs smeltet protein av interesse, f.eks myr-palm-mEYFP og myr-palm-mEYFP-mEYFP for å kalibrere lysstyrke analyse av APLP1-mEYFP12.
  3. Kultur celler ved 37 ° C, 5% CO2 i fullstendig DMEM medium (se trinn 1.1) for en annen dag.

3. AC confocal Laser skanning mikroskopi: Oppsett og fokal volumkalibrering

Merk: Følgende protokollen er skrevet for eksperimenter utført med mEGFP/mEYFP og mCherry/mCardinal på laser skanning AC confocal mikroskop brukt i denne studien. Optisk oppsettet, programvareinnstillinger (laser linjer, dichroic speil, filtre) og valg av kalibrering fargestoffer kan endres for andre FPs og mikroskopet oppsett.

  1. Slå på mikroskopet og lasere minst en time før forsøket å sikre laser stabilitet og balanse av temperatur.
  2. Forberede 100-200 µL av aktuelle vannløselige fluorescerende fargestoff løsninger (se Tabell for materiale eksempler) i vann eller PBS kalibrere fokal volumet, med konsentrasjoner i 10-50 nM området.
  3. Plasser fargestoff løsninger på et rent 35 mm glass bunnen rett #1.5, dvs. har en tykkelse på 0,16-0,19 mm.
    Merk: Bruk ideelt retter med høy ytelse cover glass har en lav tykkelse toleranse, f.eks 0.170 ± 0.005 mm, slik at en optimal krage ring korreksjon (trinn 3.6). Det er viktig å bruke samme type parabolen som brukes senere til følgende eksperimenter.
  4. Plass rett som inneholder fargestoff løsningen direkte på målet (helst vann nedsenkning, med NA 1.2) for å sikre fokus i løsningen. Alternativt plass rett ved eksempel holderen og fokus i prøven (f.eks 10-20 µm over bunnen av parabolen).
    Merk: Vi anbefaler ikke bruke olje mål på grunn av dårlig signalet ved å fokusere dypt i vandig prøvene.
  5. Definere eksitasjon og utslipp banen, f.eks velge 488 nm laser, et 488/561 nm dichroic speil, oppdagelsen vinduet 499-552 nm og en pinhole størrelse 1 luftige enhet (AU). Kontroller at pinhole størrelsen er den samme som den som brukes i kryss-korrelasjon målinger.
  6. Justere pinhole posisjon (pinhole justering) og objektive krage ring å maksimere antall rate. Til dette målet, slå krage ring før maksimalt antall rate oppdages.
    Merk: Krage ring korreksjon står for bestemte tykkelsen på dekket glasset. Maksimere antall ofte, dvs., samle så mange fotoner per molekyl som mulig, er avgjørende for å maksimere signal-til-støy-forhold (SNR) av målinger.
  7. Utføre en rekke punkt FCS målinger (f.eks 6 målinger på forskjellige steder, hver bestående av 15 repetisjoner av 10 s, dvs. 2,5 min totale tiden, samplet med 1 µs holdetiden eller mindre) på samme laser makt som brukes i kryss-korrelasjon målinger (vanligvis ~ 1%, dvs. ~ 1-2 µW).
  8. Passe en tredimensjonal diffusjon modell inkludert trilling bidrag (ligningen 6) til dataene.
    Merk: Vanligvis innhentet diffusjon tidene er rundt 30 µs og struktur faktoren er rundt 4-8.
  9. Beregne midjen w0 fra målt gjennomsnittlig diffusjon tid og publiserte verdier for diffusion koeffisient brukte fargestoff ved romtemperatur25 etter formelen 5. Vanlige verdier er 200-250 nm.
  10. Gjenta kalibrering rutine (trinn 3.4-3.9) med en annen fluorescerende farge for en andre oppdagelsen kanalen hvis nødvendig (f.eks 561 nm eksitasjon og oppdagelsen mellom 570 nm og 695 nm). Beholde pinhole posisjonen og størrelsen som det var satt for den første oppdagelse kanalen.
  11. Beregne molekylær lysstyrken (ligningen 8) fra kalibrering målinger, og lagre fått verdier.
    Merk: Vanlige verdier for brukte oppsettet er ~8-10 kHz/molekyl (MOL) for 1,8 µW 488 nm eksitasjon makt. Lavere enn vanlige verdier kan tyde smuss på målet, forskyvning av oppsettet eller en redusert laser utgang. Kontroller og lagre laser virkningsgrad på målet jevnlig bruker en strømmåleren. For sammenligning av ulike oppsett er molekylær lysstyrke normalisert eksitasjon laser kraft meningsfulle parameteren å vurdere mikroskop ytelse.

4. skanning fluorescens Cross-korrelasjon spektroskopi: oppkjøp

Merk: Følgende protokollen er skrevet for eksperimenter med mEGFP/mEYFP ('grønne') og mCherry/mCardinal ('rød') på laser skanning AC confocal mikroskopet brukt i denne studien. Optisk oppsettet og software settings (laser linjer, dichroic speil, filtre) kan være forskjellig for andre FPs eller mikroskop oppsett.

  1. Definere den optiske banen, f.eks 488 nm og 561 nm eksitasjon og 488/561 nm dichroic speil, pinhole 1 AU for 488 nm eksitasjon. For å unngå spectral cross-talk, Velg to separate spor å opphisse og oppdage mEGFP/mEYFP (488 nm eksitasjon, grønne kanalen) og mCherry / mCardinal (561 nm eksitasjon, røde kanalen) sekvensielt og merker bytte spor hver linje. For deteksjon, bruke aktuelle filtre for både kanaler, f.eks 499-552 nm i den grønne kanalen og 570-695 nm i den røde kanalen.
  2. Hvis vekslet eksitasjon ikke er mulig, bruke aktuelle filterinnstillinger for den røde kanalen for å minske spectral cross-talk (dvs. finne mCherry/mCardinal fluorescens ikke under 600 nm). Dette kan redusere mengden av fotoner i den røde kanalen og dermed redusere SNR.
  3. Plass rett som inneholder blandede celler eksempel holderen for. Vent minst 10 min å sikre temperaturen balanse og redusere fokus drift.
  4. Fokus på cellene med girkasse lys i Finn -menyen.
  5. Etter et par en 'rød' og en 'grønne' celle i kontakt med hverandre. For positive kryss-sammenheng eller homo-dimer lysstyrkekontroll (se avsnitt 2), etter en isolert celle emitting fluorescens i begge kanaler eller respektive homo-dimer signalet på PM.
    Merk: (Kritisk) Minimer eksempel eksponering etter celler å unngå pre bleking, noe som kan redusere kryss-korrelasjon26. Derfor skanne raskeste skannehastighet og lave laser krefter. For å unngå detektor metning mens imaging sterkt uttrykke celler, kan du søke i integrasjon modus. For å minimere eksponering, er det imidlertid mulig i Foton teller modus skanning med lavere laser krefter.
  6. Velg en skanning banen vinkelrett til celle-celle kontakt (eller PM av en enkelt celle for positive kryss-sammenheng eller homo-dimer lysstyrkekontrollen) med Beskjær -knappen som vist tall 1B og 2A.
    Merk: Noen eldre mikroskop tillater ikke vilkårlige skanning retninger. I dette tilfellet måtte celle-celle kontakter med en retning vinkelrett på skanning retningen ligge.
  7. Zoom for å oppnå en pikselstørrelse 50-200 nm og velg linje i Skannemodus. Sette bildestørrelsen til 128 × 1 piksler.
    Merk: Typisk pikselstørrelsen er 160 nm, tilsvarer en skanning lengde på rundt 20 µm.
  8. Sett skanning fart til den maksimale tillatte verdien, eksempelvis 472.73 µs per linje.
    Merk: For en alternativ eksitasjon ordningen, dette tilsvarer 954.45 µs skanningen tid, dvs ~ 1000 skanner/s på oppsettet brukes. Skannehastighet kan justeres avhengig av diffusjon koeffisient av protein av interesse. Membranen-forankret proteiner, typisk diffusjon ganger er rundt 10-20 ms. skanningen tid bør være minst ti ganger mindre enn diffusjon tider. Lavere søkehastighet kan indusere sterkere photobleaching og krever lavere belysning krefter. Alternativt kan en pålegge en pause, f.eks 5 ms, mellom hver skanning for veldig langsomt spre komplekser bruker intervall i undermenyen Tidsserier .
  9. Velge riktig laser krefter, f.eks ~ 1-2 µW for 488 nm og ~ 5-10 µW for 561 nm eksitasjon.
    Merk: Høyere laser makter forbedre SNR, men øke photobleaching. Laser makt bør derfor velges slik at photobleaching er mindre enn 50% av den opprinnelige teller.
  10. Angi sykluser til 100.000-500, 000.
    Merk: Antall skanninger, dvs. varigheten av måling, kan variere: lengre måling ganger vil forbedre SNR og kan være mer passende for langsomt spre molekyler, men bevegelse av celler og photobleaching begrense maksimal måling tid. Dataene som presenteres her anskaffet rutinemessig i ~ 3-6 min, dvs. 200.000-400.000 line skanner.
  11. Angi detektorer Foton teller modus. Trykk Start eksperimentet å starte oppkjøpet. Gjenta 4.5-4.11 å måle en annen celle.
    Merk: Det anbefales å måle 10-15 celler per eksempel på ulike uttrykk nivåer. (Kritisk) Unngå detektor metning på høy uttrykk nivåer. Det maksimale antall rate bør ikke overstige ~ 1 MHz.
  12. Hvis lysstyrke analyse er gjennomført for å fastslå oligomeric stater, utføre homo-dimer lysstyrke kalibrering målinger i henhold til endrede trinnene 4.1-4.11: måle hver fluorescerende protein homo-dimer separat (i isolerte celler, tilberedt med protokollen inndeling 2) og utføre målinger i spektral kanal.

5. skanning fluorescens Cross-korrelasjon spektroskopi: Dataanalyse

Merk: Følgende protokollen følger en implementering analyse prosedyren beskrevet i detalj i tidligere artikler12,15. De er tilgjengelig ved forespørsel til forfatterne.

  1. Eksport rådata (f.eks CZI)-filer til et RGB TIFF-bilde i raw-format. Denne filen inneholder et kymograph med grønne og røde kanaldata, i kanalen kalt G og R av bildet, henholdsvis.
  2. Importere TIFF-fil med riktig analyseprogramvare og fortsetter å utføre analysen.
    Merk: Følgende (trinn 5.3-5.7) brukes separat på hver kanal:
  3. Juster linjene ved å utføre en segment-wise eller glidende gjennomsnitt med blokker 500-1000 linjer. Bestemme membran plasseringen, dvs. pixel plasseringen med det maksimale antall rate, i hver blokk. Skifte alle blokkene til samme lateral posisjon. Denne prosedyren korrigerer for sideveis for celle-celle kontakten, eksempelvis på grunn av cellen bevegelse.
  4. Oppsummere alle justerte linjer langs Tidsaksen og passer gjennomsnittlig intensitet profilen en Gaussian funksjonen. I nærvær av betydelig intracellulær bakgrunn, bruk en Gaussian pluss en sigmoid funksjon. Definere bildepunkter som tilsvarer membranen som alle pikslene i ±2.5σ av membran plasseringen og oppsummere intensiteten av disse bildepunktene i hver linje, skaffe en enkelt fluorescens signal verdien for hvert punkt (dvs. for hver linje skanning).
  5. Hvis nødvendig (f.eks bakgrunn > 10% av membran), bruke en bakgrunn korrigering ved å trekke gjennomsnittlig pixel intensiteten i cytoplasma multiplisert med 2.5σ (i pixel-enheter) fra membranen fluorescens, i blokker 1000 linjer. Unngå lyse intracellulær blemmer når pikslene.
  6. Hvis photobleaching er observert, bruke en bleking korreksjon. Derfor passer membran fluorescens tiden serien med en dobbel-eksponentiell funksjon og bruk de rette formelen, Formel 1-16.
    Merk: Alternativt Fourier spektrum basert korreksjon ordninger kan være anvendt27. (Kritisk) Hvis photobleaching men ikke korrigert for, CFs kan bli sterkt fordreid og parameteren anslag kan være sterkt partisk (f.eksse figur 5E).
  7. Beregn ACFs og CCFs ligninger 2 og 3 bruker, f.eks en flere-tau algoritmen28. For å forbedre påliteligheten til analysen og unngå gjenstander, utføre beregningene for 10-20 lik segmenter i den totale målingen. Kontroller fluorescens tidsserier og CFs i hvert segment og fjern tydelig forvrengt segmenter (se eksemplene i figur 4A- 4 D). Gjennomsnittlig alle forvrengningsfri segmenter.
    Merk: Denne fremgangsmåten kan automatiseres for å unngå en subjektiv skjevhet data29. For svært ustabil målinger kan har mange korte segmenter være nyttig. Lengden på et segment bør imidlertid fortsatt være minst tre størrelsesordener over diffusjon tiden å unngå statistiske undersampling feil29,30,17.
  8. Passe en todimensjonal diffusjon modell, ligningen 4, til den fått CFs. Derfor fastsette struktur faktoren verdien hentes kalibrering måling (Protocol avsnitt 3). Nøyaktigheten av passer kan forbedres ved å utføre en vektet passform hjelp av statistiske vektlegging av hvert datapunkt fra flere tau algoritmen.
  9. Beregne diffusjon koeffisient bruker kalibrert livet ifølge ligningen 7.
  10. Beregne molekylær lysstyrken ved gjennomsnittlig fluorescens intensiteten i hver kanal med et tilsvarende antall partikler, formel 8. Normalisere bestemt lysstyrkeverdien i hver kanal av gjennomsnittlig lysstyrken i tilsvarende monomerisk referansen til få oligomeric staten, ta konto ikke-fluorescerende FPs23. Til dette målet, bestemme gjennomsnittlig homo-dimer lysstyrkeverdier fra én farge analyse til å beregne hvor stor del av ikke-fluorescerende FPs23.
  11. Beregne relative kryss-korrelasjonen ifølge ligningen 9.

6. Cross-korrelasjon tall og lysstyrke: detektor kalibrering

Merk: Følgende protokollen gir en generell retningslinje om hvordan å kalibrere oppdagelsen system. Denne prosedyren er obligatorisk for analoge oppdagingssystemer, men er ikke strengt nødvendig når sant Foton telling detektorer brukes.

  1. Tørr riktig vannløselige fargestoff løsninger (se Tabell for materiale for eksempler) på et 35 mm glass bunnen rett. Angi den optiske banen følgelig dvs 488 eller 561 nm eksitasjon og gjenkjenning på 499-552 nm eller 570-695 nm, henholdsvis.
    Merk: Alternativt en reflekterende metalloverflate kan brukes i stedet for tørket fargestoff løsninger ved å plassere metallet brikken direkte på målet.
  2. Utføre én farge N & B målinger i områder med ulike fargestoff konsentrasjoner eller annen laser krefter. Derfor bruke Zoom for å oppnå en pikselstørrelse 300 nm, skanne hastighet angir passende pixel holdetiden, f.eks 25 µs og angi sykluser til 100-200 rammer.
  3. Still detektorer Foton teller (eller analog modus hvis mål utføres med analoge oppdagelsen) og trykk Start eksperimentet å starte oppkjøpet. Foreta en måling på null eksitasjon makt til å avgjøre intensitet forskyvningen.
  4. Plot pixel avvik som en funksjon av pixel intensitet for alle målt bildepunkter og utføre en lineær tilpasning av disse dataene. Bestemme S som stigningstallet for den lineære passformen. Beregne avlesning støy fra y-skjæringspunktet, S og bestemt intensitet forskyvningen ifølge ligningen 14.

7. Cross-korrelasjon tall og lysstyrke: oppkjøp

  1. Følg trinnene 4.1-4,4 sFCCS oppkjøpet protokollen.
  2. Bruk Beskjær for å velge en ramme på 512 × 128 piksler rundt en celle-celle-kontakt (eller isolert PM for homo-dimer lysstyrkekontroll) og Zoom for å oppnå en pikselstørrelse på 50-100 nm.
  3. Bruk skanning fart å angi aktuelle pixel holdetiden, f.eks 6,3 µs.
    Merk: I N & B, pixel holdetiden bør være mye mindre enn spredning av protein av interesse. Hvis en alternativ eksitasjon ordning velges, f.eks bytte spor hver linje, tiden mellom to spor skal være mindre enn spredning av protein av interesse. Ellers er synlig kryss-korrelasjonen redusert.
  4. Angi sykluser til 100-200 rammer.
    Merk: Mange rammen vil forbedre SNR, men cellen bevegelse kan begrense den totale måling tid. Skanningen tid per bilde bør være mye høyere enn spredning av protein av interesse. Ellers tilsynelatende lysstyrke er redusert, dvs. partikler synes å være immobile. For veldig langsomt spre komplekser, pålegge en pause, f.eks 2 s, mellom rammer bruker intervall i undermenyen Tidsserier .
  5. Angi laser krefter til riktige verdier (vanlige verdier er ~ 1-2 µW for 488 nm og ~ 5-10 µW for 561 nm eksitasjon).
    Merk: Høyere laser makt fører til bedre skarphet og forbedret SNR, men også forbedret photobleaching. Laser makt bør være høy nok til å oppnå en oppdaget lysstyrke på minst ~ 1 kHz/MOL men holdt lav nok til å unngå mer enn 10-20% photobleaching. For mEGFP/mEYFP eller mCherry/mCardinal, mindre enn 10% photobleaching oppnås vanligvis.
  6. Angi detektorer Foton teller (eller analog modus hvis mål utføres med analoge oppdagelsen). Trykk Start eksperimentet å starte oppkjøpet.
  7. Evaluere Foton teller prisen. Hvis antall priser i celle-celle kontakt piksler overstiger 1 MHz, redusere laser makt eller Merk celler med lavere uttrykk nivåer. Gjenta trinnene 7.2-7.7. å måle det neste paret av celler. Det anbefales å måle 10-15 celler per forsøk på ulike uttrykk nivåer.
  8. Hvis lysstyrke analyse er utført for å kvantifisere oligomerization, utføre homo-dimer lysstyrke kalibrering målinger i henhold til endrede trinnene 7.1-7.7: måle hver fluorescerende protein homo-dimer separat (i isolerte celler, tilberedt med protokollen inndeling 2) og utføre målinger i spektral kanal.

8. Cross-korrelasjon tall og lysstyrke: dataanalyse

Merk: Følgende protokollen følger en tidligere beskrevet analyse prosedyren12,31. De er tilgjengelig fra forfatterne på forespørsel.

  1. Importere rådataene (foreksempel CZI filer kan importeres ved hjelp av Bioformats32 pakken). Gjennomsnittlig alle rammer og velge et område av interesse (ROI) rundt celle-celle kontakten.
  2. Utføre en bilde justering algoritme33, f.eks maksimere romlige sammenhengen mellom ROIs i etterfølgende bilder for vilkårlig lateral oversettelser, gjennomsnitt over begge kanaler. Denne fremgangsmåten vil rette vridning av cellene.
  3. Bruke en boxcar filter22 for å redusere overflødig varige svingninger, Hentet fra f.eks gjenværende celle bevegelse eller bakgrunn bleking. En detrending metode kan også brukes til å korrigere photobleaching34.
    Merk: Hvis ingen segment-wise analyse eller detrending brukes, tilsynelatende lysstyrken kan i stor grad overvurderes.
    1. Definere skyve segmenter av, f.eks 8-15 rammer (f.eks rammer 1 til 8, 2 til 9 og så videre) og beregne kanal og kryss-korrelasjon lysstyrkeverdiene ifølge ligninger 10, 11 og 15 pixel-wise i hvert segment. Hvis detektorer ikke sant Foton teller detektorer, ta parameterne kalibrert detektor hensyn ved beregning av lysstyrken, dvs. bruke formler 12 og 13 i stedet.
      Merk: Beregne lysstyrkeverdiene i segmenter av 8 til 15 rammens fører til et 10-20% undervurdering av absolutt lysstyrken og en 10-20% overvurdering av partikkel tall. Likevel påvirkes lysstyrke prosenter (f.eks dimer til monomer lysstyrke) ikke, så lenge lengden holdes konstant gjennom analyse (data ikke vist). Statistisk feil for en gitt lengde kan bestemmes via simuleringer og dermed korrigert for.
    2. Gjennomsnittlig innhentet lysstyrkeverdiene pixel-wise over alle segmenter. I dette trinnet kan en fjerne de høyeste og laveste 5% av segmentet lysstyrkeverdier fra gjennomsnittet eller utelukke segmenter som viser en klar forvrengning i intensitet, på grunn av f.eks en intracellulær vesicle eller samlet transiently stede i disse piksler.
  4. Plot lysstyrke bildepunktverdiene som en funksjon av pixel intensiteten og velg befolkningen piksler som tilsvarer celle-celle kontakten. Pikslene vil ha svært lav intensitet verdier. På dette punktet, revurdere det maksimale antallet hastigheten. Ekskludere piksler med antall prisene over 1 MHz å hindre endte effekter.
  5. Opprette kanal og kryss-korrelasjon lysstyrke histogrammer for valgt celle-celle kontakt piksler og få avkastning-gjennomsnitt lysstyrkeverdiene. Normalisere den gjennomsnittlige kanalverdien for lysstyrke av gjennomsnittlig lysstyrken i tilsvarende monomerisk referansen til få oligomeric staten, ta konto ikke-fluorescerende FPs23. Derfor bestemme gjennomsnittlig homo-dimer lysstyrkeverdier fra én farge analyse til å beregne hvor stor del av ikke-fluorescerende FPs23.
  6. For illustrasjon, tegne kanal og kryss-korrelasjon lysstyrken kart.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En første test for protein-protein samhandling analysen, dvs. blanding av celler som uttrykker spectrally distinkte fluorescerende proteiner etterfulgt av sFCCS/ccN & B målinger (figur 1), skal utføres på proteiner som ikke forventes å samhandle på celle-celle kontakten (dvs. en negativ kontroll). Derfor HEK 293T celler uttrykke myristoylated-palmitoylated-mEYFP (myr-palm-mEYFP) eller -mCardinal ble blandet og sFCCS ble utført over celle-celle kontakten (figur 2A). I en ideell tilfellet fluorescens signalet i hver kanal skal svinge rundt en stabil mener, at diffusive bevegelse proteinene i PM og statistiske variasjoner av antall proteiner i fokal volumet. For proteiner som ikke arbeider interaktivt, svingningene i begge kanaler er uavhengige av hverandre og dermed spectral kryss-korrelasjonen forventes å svinge rundt null. Faktisk ble en relativ kryss-korrelasjon nær null observert i typisk målinger (figur 2C). ACFs viser karakteristiske forfall ganger ~ 10-20 ms (tilsvarende til, gjennomsnittlig Dmyr-palm = 1.3 ± 0,3 µm2/s (mener ± SD, n = 20 celler)), som forventet for spredningen av myr-palm-mEYFP og -mCardinal i PM, f.eks Dmyr-palm = 0,88 ± 0,11 µm2/s (gjennomsnittlig ± SEM) basert på fluorescens gjenoppretting etter photobleaching (FRAP) eksperimenter35. Spesielt tillater disse ganske langsom dynamics bruk av en vekslende eksitasjon ordningen, dvs. bytte mellom bare grønn og bare røde eksitasjon og oppdagelsen hver linje, forårsaker en ~0.5 ms forsinkelse mellom signaler i begge kanaler men undertrykke Spectral cross-talk. I gjennomsnitt, en svært lav gjennomsnittlig kryss-sammenheng 0,08 + 0,10 (mener ± SD, n = 17 celler) ble innhentet for negativ kontroll (Figur 3E), som forventet.

Deretter ble en positivt kryss-korrelasjon kontroll brukt til maksimal mulig kryss-sammenheng i optisk oppsettet. Derfor den membran-forankret hetero-dimer myr-palm-mCardinal-mEYFP ble uttrykt i HEK 293T celler og sFCCS mål ble utført på enkeltceller (figur 2B). Innhentet CCFs hadde positiv amplitudes og viste lignende forfall ganger som ACFs, igjen ~ 10-20 ms (figur 2D). I gjennomsnitt, en relativ kryss-sammenheng 0.96 + 0,18 (mener ± SD, n = 14 celler) ble målt for positiv kontroll (Figur 3E).

Figure 2
Figur 2 . Skanning fluorescens kryss-korrelasjon spektroskopi kontroll målinger. (A) representant bilder av blandet HEK 293T celler uttrykke myr-palm-mEYFP /-mCardinal som negativ kontroll for trans interaksjoner. Gule pilen viser sFCCS skanne banen. Skala barer er 5 µm. (B) representant bilder av HEK 293T celler uttrykke myr-palm-mCardinal-mEYFP hetero-dimer (venstre: grønn kanaler, venstre: røde kanalen) som positive kryss-sammenheng. Gule pilen viser sFCCS skanne banen. Skala barer er 5 µm. (C) representant CFs (grønn: ACF i grønne kanalen (mEYFP), røde: ACF i rød sone (mCardinal), blå: CCF) innhentet i sFCCS mål for negativ kontroll. Solid linjene viser anfall av en todimensjonal diffusjon modell med CFs. (D) representant CFs (grønn: ACF i grønne kanalen (mEYFP), røde: ACF i rød sone (mCardinal), blå: CCF) innhentet i sFCCS måling av positiv kontrollen. Solid linjene viser anfall av en todimensjonal diffusjon modell med CFs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Egnetheten av denne analysen ble deretter undersøkt i en biologisk relevante sammenheng av sondering trans samhandling amyloid forløper som protein 1 (APLP1), en type jeg transmembrane protein som har blitt foreslått som en neuronal vedheft reseptor. Til dette målet, APLP1 del mEYFP, eller mCardinal ble uttrykt i HEK 293T celler. For å utelukke forstyrrelser med ekstracellulære bindende domener, FPs var smeltet til C-terminus av APLP1, dvs. på intracellulær domenet (se figur 1A). Deretter ble sFCCS målinger utført på celle-celle kontakter mellom APLP1-mEYFP og APLP1-mCardinal uttrykke celler (Figur 3A), ACFs og CCFs (Figur 3C) som gir informasjon om APLP1 diffusjon og interaksjoner. En positiv relative kryss-korrelasjon 0,45 + 0,21 (mener ± SD, n = 17 celler) ble observert, dvs. en verdi betydelig større enn kontrollen negative (Figur 3E). Interessant, var gjennomsnittlig relative kryss-sammenhengen lavere enn positive kontrollen (Figur 3E), som angir bare delvis trans bindende.

Til slutt, analysen ble brukt til å vise at sink ioner lette forbedret APLP1 trans bindende12,31. SFCCS CFs innhentet fra målinger over APLP1 klynger på celle-celle kontakter (preget av en sterk co lokalisering av APLP1-mEYFP og APLP1-mCardinal og danner raskt i nærvær av sink ioner, Figur 3B) viste sterkt reduserte dynamics, som tydelig fra store forfall ganger og svingninger på stort etterslep ganger (Figur 3D). Likevel analyse av amplituder på kort forsinkelser avdekket en betydelig økning av relativ kryss-sammenheng med 0,8 ± 0,3 (mener ± SD, n = 17 celler), dvs. ~ 80% kalibrert maksimalt (Figur 3E). Er det forventes at slike langsom dynamikk induserer alvorlig forvrengninger av korrelasjon kurver (se Figur 3D) skyldes begrenset antall diffusive hendelser som kan oppdages Imens endelig mål, indusere såkalte partikkel støy30. For en nøyaktig kvantifisering, bør maksimal forsinkelse være minst 3 størrelsesordener ovenfor diffusjon tiden (se forrige Kritikken30,17 for mer informasjon).

Molekylær lysstyrken fra sFCCS APLP1 data ble ytterligere analysert, bruke myr-palm negative kontrollen som en monomerisk referanse i hver kanal og korrigere for ikke-fluorescerende proteiner23. På sink ion tillegg molekylær lysstyrken betydelig økt fra små oligomers (~ dimers) til større multimers bestående av ~ 10-50 monomerer på hver celle (Figur 3F). Dermed gjennomsnittlig finnes til ~ 100 APLP1 monomerer i en hel protein klynge over celle-celle krysset.

Figure 3
Figur 3 . Skanning fluorescens kryss-korrelasjon spektroskopi målinger av APLP1 vekselsvirkningene på celle-celle kontakter. (A, B) Representant bilder av HEK 293T celler uttrykke APLP1-mEYFP (grønn) / APLP1-mCardinal (rød) før (A) og 30 min etter sink ion behandling (B, forskjellige celler). De gule pilene indikerer sFCCS skanne baner. Skala barer er 5 µm. (C, D) representant CFs (grønn: ACFs i grønne kanalen (mEYFP), røde: ACFs i rød sone (mCardinal), blå: CCFs) fikk i sFCCS mål for (C) APLP1 før sink ion behandling og (D) etter sink ion behandling. Solid linjene viser anfall av en todimensjonal diffusjon modell til CFs. (E) boksen plott av relativ kryss-korrelasjon innhentet fra sFCCS analyse av negativ kontroll ("negative"), APLP1 i fravær og sink ioner, og positiv Cross-korrelasjon kontroll ("positiv"). Tomter viser median verdier og værhår mellom minimum maksimumsverdier. (F) boksen plott normalisert molekylær lysstyrken i grønne kanalen (mEYFP) innhentet fra sFCCS analyse av APLP1 i celle-celle kontakter i fravær og tilstedeværelsen av sink ioner. Lysstyrkeverdiene er rettet for ikke-fluorescerende mEYFP basert på sFCS målinger av myr-palm-mEYFP-mEYFP homo-dimers uttrykt i HEK 293T celler, målt under de samme betingelser23. Tomter viser median verdier og værhår mellom minimum maksimumsverdier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Alle målene vises så langt er rettet for ekstra, falske svingningene forekommer i cellene som, hvis ikke tatt hensyn til, ville gjøre sFCCS analysen utfordrende. For negativ kontroll, for eksempel kan disse forårsake en falske positive kryss-sammenheng, hvis ingen korreksjon ordninger brukes. To store prosesser som kan alvorlig forvrenge CFs er: 1) ustabilitet i den innspilte fluorescensen signal på grunn av intracellulær blemmer som transiently angi fokal volumet eller treg membran dynamics, f.eks drift i z-retningen og 2) photobleaching. For å identifisere forbigående ustabilitet, anbefales det å dele hele målene på 10-20 like store deler og visuelt inspisere intensitet tidsserier og CFs i hvert segment. Denne fremgangsmåten er illustrert i Figur 4, som gir et eksempel på klart forvrengt segmenter innhentet i analysen av en negativ kontroll måling. Forbigående ustabilitet (Figur 4A, intensitet spor av segmenter 1 og 2) kan resultere i en CCF har negative verdier (Figur 4B, segment 1) eller en høy falske positive kryss-korrelasjon (Figur 4B, avsnitt 2). Vanligvis er slike ustabilitet synlige i intensitet serien som langsom signal variasjoner (Figur 4A). Den tilsvarende CFs vanligvis fravike sterkt CFs flertallet av segmenter, vise, f.eks høyere amplitude og mye tregere forfall ganger på den ~ andre skala (se figur 4B-4 D). Det anbefales å fjerne slike segmenter fra analyse og for å beregne den siste CFs ved å beregne alle forvrengningsfri segmenter, dvs. segmenter preget av CFs ikke avvikende fra fleste av CFs. vanligvis dette gjøres i et grafisk grensesnitt ved 1) iterativt undersøke segmentene, 2) fjerne tydelig forvrengt segmenter fra gjennomsnittet og 3) inspisere CFs gjenværende segmenter med hensyn til den oppdaterte gjennomsnittlig CFs segmenter som ikke ble fjernet. Ved å bruke denne fremgangsmåten, delvis forvrengt lang målinger (figur 5A), viser langsomt avtagende (korrupt) CFs (figur 5B) var er korrigert og meningsfull sammenheng kurver var gjenopprettet (figur 5C). Vanligvis kan denne korreksjonen prosedyren automatiske29, unngå en visuell inspeksjon av brukeren, som kan være utsatt for subjektive bias. I forhold til intensitet basert filtrering metoder36, der små hyller av målingen evalueres basert på intensitet sammenlignet med gjennomsnittlig intensiteten av full måling og fjernet hvis overskrider en terskel parameter, beskrevet prosedyren stole ikke på eksterne parametere og følsom også for mindre ustabilitet.

For å kompensere for photobleaching, ble beskrevet matematiske korreksjon, Formel 1, brukt. Vanligvis photobleaching kan identifiseres av en eksponensiell decay fluorescens signaler (figur 5D), dominerende CFs, som så viser false-positiv kryss-sammenheng og forfalle ganger på den ~ min skala (se figuren typisk kurve i figur 5E). Korreksjon prosedyren gjenopprettet forvrengningsfri CFs (figur 5F). Som allerede nevnt, lignende intensitet kan variasjoner i enkle målinger også skyldes PM bevegelse, f.eks z-drift eller store sakte beveger strukturer. Men hvis lignende eksponentiell henfall vises i alle mål, vil photobleaching være den mest sannsynlige kilden. Vanligvis korreksjon ordninger kan kombineres, f.eks intensitet filtrering, CF basert filtrering og ytterligere metoder som Fourier transform basert filtrering av langsom signal variasjoner i frekvens plass27.

Figure 4
Figur 4 . Segment-Wise analyse av skanning fluorescens kryss-korrelasjon spektroskopi målinger av negativ kryss-korrelasjon kontroll. (A) fluorescens intensiteten i grønt (F-1) og røde kanalen (F2) av to ulike tidspunkt segmenter (hver måling ble analysert i 20 segmenter av ~ 20 s hver), fra sFCCS måling av negativ kontroll. (B) CCFs av hver av de 20 segmentene. CCFs for segmenter 1 og 2 er uthevet i rødt og oransje, henholdsvis. (C, D) ACFs på hvert segment i grønt (C) og rød (D) kanal. ACFs for segmenter 1 og 2 er uthevet i rødt og oransje, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Forstyrrelser skanning fluorescens kryss-korrelasjon spektroskopi målinger på celle-celle kontakter, eksemplifisert for negative kryss-korrelasjon kontroll. (A) Full fluorescens tidsserier for en exemplar måling i grønt (F-1) og røde kanalen (F2). Solid røde linjene representerer en dobbel-eksponentiell tilpasning av tiden serien i hver enkelt kanal. (B, C) CFs (grønn: ACFs i grønne kanalen, røde: ACFs i røde kanalen, blå: CCFs) i fluorescens tidsserien vist i A, beregnet ved (B) samkjøre hele måling eller (C) samkjøre 20 segmenter separat og gjennomsnittlig den minste forvrengt CFs ~ 80% (grønn kanal) og ~ 50% (rød kanal) av segmentene. Solid linjene representerer tilpasning av en todimensjonal diffusjon modell til dataene. (D) Full fluorescens tidsserier og dobbel-eksponentiell tilpasning (solid røde linjer) av måling preget av betydelig bleking i grønt (F-1) og røde kanalen (F2). (E, F) CFs (grønn: ACFs i grønne kanalen, røde: ACFs i røde kanalen, blå: CCFs) av fluorescens tidsserien vist i D, beregnet ved (E) samkjøre hele måling eller (F) søker bleking korreksjon, Formel 1, samkjøre 20 segmenter separat og gjennomsnittlig den minste forvrengt CFs ~ 90% (begge kanaler) av segmentene. Solid linjene representerer tilpasning av en todimensjonal diffusjon modell til dataene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Som en komplementær tilnærming til sFCCS, kan ccN & B (figur 1C) brukes til å oppdage protein-protein interaksjoner etter celle blanding. I motsetning til sFCCS, ccN & B gir ikke informasjon om protein dynamics, men kan måle trans interaksjoner langs hele celle-celle kontakten i en fokalplanet. Mål på APLP1 prøver ble utført før og etter behandling med 50 µM ZnCl2samt kontrollen negative myr-palm. Disse målingene er følsomme for cellen bevegelser, spesielt for sink ion behandlet prøver, krever lengre oppkjøpet ganger rede for langsom dynamikken i APLP1 klynger. Derfor ble en bilde justering algoritme implementert for å rette vridning celler33. Også en boxcar filtrere22 (8 bilder boksen størrelse, ~ 5 s) ble brukt til å fjerne lavfrekvente svingninger målt signaler. Denne fremgangsmåten er svært lik andre filtre brukes i N & B analyse som omfatter lokale gjennomsnitt37 eller detrending18,34, men beholder de opprinnelige dataene uendret, dvs. piksler behandles uavhengig og ingen snitt eller subtraksjon av signaler utføres. Denne fremgangsmåten skjuler effektivt varige svingninger på tidsskalaer lengre enn boksen størrelse22. Etter så dataanalyse, cross-korrelasjon lysstyrkeverdiene for alle prøver ble sammenlignet ved pooling alle celle-celle kontakt bildepunkter i et kryss-korrelasjon lysstyrke histogram. For APLP1 i fravær av sink ioner (figur 6A og 6 D), en positiv gjennomsnitt Bcc fra 0.068 + 0.004 (mener ± SEM, n = 18 celler) ble observert. Etter sink ion tillegg (figur 6B og 6E), Bcc -verdien økt til 0.266 ± 0.006 (mener ± SEM, n = 19 celler). For negativ kontroll (figur 6C og 6F), fant en lavere gjennomsnittlig kryss-korrelasjon lysstyrke (Bcc = 0.022 ± 0,002, mener ± SEM, n = 26 celler). For å beregne støkiometri av APLP1 komplekser på celle-celle kontakter, lysstyrken på APLP1-mEYFP ble normalisert med den gjennomsnittlige verdien for myr-palm-mEYFP (dvs., kontrollen negative) og korrigert for ikke-lysstoffrør proteiner23. Med sFCCS data, var lysstyrke fordelingen sentrert rundt en verdi som tilsvarer dimers (figur 6G), i fravær av sink ioner, antyder en gjennomsnittlig 2:2 støkiometri. Etter sink ion behandling, normalisert lysstyrken sterkt flyttet til større verdier, alt ~ 10 til ~ 60 (figur 6H), dvs., stoichiometries av på minst 10:10 eller større, i god avtale med sFCCS data.

Figure 6
Figur 6 . Cross-korrelasjon tall og lysstyrke målinger av APLP1 vekselsvirkningene på celle-celle kontakter. (A-C) Representant ccN & B bilde rammens av celle-celle kontakter mellom APLP1-mEYFP og APLP1-mCardinal uttrykke HEK 293T celler uten (A) og med sink ioner (B) eller myr-palm-mEYFP og myr-palm-mCardinal uttrykke cellene negativ Cross-korrelasjon kontroll (C). Skala barer er 5 µm. (D-F) Cross-korrelasjon lysstyrke (Bcc) histogrammer for alle undersøkt piksler og celler Hentet fra ccN & B analyse for celle-celle kontakter i APLP1 prøver (D), sink-behandlet APLP1 prøver () E) og eksempler som inneholder myr-palm-mEYFP og myr-palm-mCardinal (F). (G, H) Normalisert lysstyrke histogrammer av APLP1 prøver (G: uten sink ioner, H: med sink ioner) for den grønne kanalen (mEYFP) fra lysstyrke analyse av samme celler og ROIs brukes til beregning av Bcc. Innfelt i G viser en forstørrelse i normalisert lysstyrkeområdet -2 til 10. Lysstyrkeverdiene er rettet for ikke-fluorescerende mEYFP basert på N & B målinger av myr-palm-mEYFP-mEYFP homo-dimers uttrykt i HEK 293T celler, målt under de samme betingelser23. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For å utføre den ccN & B analyse, bør en forsiktig kalibrering av detektorer utføres. For eksperimentelle oppsett brukt i denne studien, ble behovet for slike en kalibrering klart når molekylær lysstyrken ble analysert i fast prøver (dvs. i fravær av antall svingninger). I dette tilfellet forventes molekylær lysstyrken å være null etter ligningen 10, siden variansen må bare starte fra detektor støy. Når en avkastning som inneholder bare (immobile) bakgrunn piksler var analysert (figur 7et og 7B) identifiserte imidlertid en positiv lysstyrke på ~0.1 cts./(MOL x dwell time). En lignende verdi ble innhentet resultater N & B målinger av HEK 293T celler uttrykke glycosylphosphatidylinositol-mCherry (GPI-mCherry, figur 7C) med varierende laser krefter og ekstrapolere målt molekylær lysstyrken til null laser makt. For å korrigere for denne effekten, utført vi en systematisk kalibrering av detektoren, som tidligere rapportert (se ligningen 12)19,20. Vi derfor målt avviket som en funksjon av detektor teller rate på et utvalg bestående av en tørket fluorescerende fargestoff løsning og bestemt parameterne S, Equation 24 og mørke teller rate offset. Sistnevnte ble Hentet fra måle intensiteten på null laser makt og var, i vårt tilfelle, ubetydelig. Fra et lineær anfall varianse versus intensitet tomten, vi bestemt, ifølge ligningen 14, en skråning s = 1.1 og en ubetydelig avlesning støy. Bestemt verdiene (S = 1.1, Equation 24 = 0, offset = 0) ble da brukt å beregne riktig molekylær lysstyrke og tall i henhold til ligninger 12 og 1319. Alternativt kan en mer empirisk korreksjon ordningen brukes basert på det faktum at en superpoissonian detektor støy, dvs. ~ 10% større enn Poissonian skutt støy, ville også forklare observasjon av en positiv molekylær lysstyrke i piksler uten nummer svingninger. Bruker denne antakelsen, kan bestemmes lysstyrke på ~0.1 cts./(MOL x dwell time) i slike piksler betraktes som en konstant lysstyrke forskyvning og bør dermed trekkes fra alle lysstyrkeverdier beregnet med ligningen 10. Viktigst, både beskrevet tilnærminger føre til samme resultat ved beregning av lysstyrke prosenter, så lenge Equation 24 og forskyvning er ubetydelig. Det er verdt å nevne at blant annet mikroskop av samme type (samme leverandør, samme modell, Amstel detektorer i Foton telling modus) forskjellige S verdier ble observert, fremhever behovet for en forsiktig detektor kalibrering på hvert individ setup.

En ytterligere viktig parameter påvirke detektoren ytelsen i lysstyrke målinger er detektor døde tiden. Som det har vært tidligere vist, detektor døde tiden kan vesentlig redusere oppdaget molekylær lysstyrken, selv til middels antall priser (over 102-103 kHz)38. For å unngå denne gjenstand, målinger skal enten utføres på lavere antall priser, eller død tid bør kalibreres basert på utfører N & B eller FCS i en fortynning serie, f.eks EGFP i buffer løsning. Deretter kan målte teller priser korrigeres med en kalibrert dødtid38. For oppsettet brukt i denne studien, slik en kalibrering ved hjelp av N & B på utvannet fargestoff løsninger avslørt stabil molekylær lysstyrkeverdier teller antallet ~0.5 MHz og en tilsvarende dødtid ~ 6 ns (figur 7E). Nedgangen på høyere antall priser dermed kan korrigeres ved hjelp av en tidligere publiserte korreksjon formel38, noe som resulterer i en konstant lysstyrkeverdi ~ 8 kHz/MOL.

Figure 7
Figur 7 . Detektor kalibrering for tall og lysstyrken. (A) representativt bilde fra N & B målinger av HEK 293T celler uttrykke GPI-mCherry. En avkastning (blå stiplet rektangel) ble valgt i bakgrunnen. (B) Pixel lysstyrke histogram for alle bildepunkter som tilsvarer Avkastningen vises i. Gjennomsnittlig pixel lysstyrken, fra montering pixel lysstyrke histogrammet med en Gaussisk funksjon, er ~0.1 cts./(MOL x dwell time). Data ble kjøpt på 25 µs pixel holdetiden. (C) molekylær lysstyrke fra N & B analyse av GPI-mCherry i HEK 293T celler, målt på tre forskjellige laser powers (6 celler, 561 nm eksitasjon, 25 µs pixel holdetiden). Data vises som betyr ± SD. En lineær regresjon (rød linje) gir en verdi av 0,11 ± 0.02 cts./(MOL x dwell time). (D) Plot pixel avvik som en funksjon av pixel fra N & B målinger i en tørket løsning av en fluorescerende farge (spent på 561 nm), gruppert fra alle pikslene med flere mål i ulike regioner av utvalget. Den solide røde linjen viser en lineær tilpasning av dataene, som resulterer i en skråning på 1.1, gir S faktor på detektoren kalibreringen. (E) molekylær lysstyrke som en funksjon av detektor antall, hentes fra N & B målinger av fortynnet fluorophore løsninger (spent på 488 nm). En tidligere publiserte korreksjon ordningen38 ble brukt detektor døde gangs bruk forskjellige mulige verdier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den eksperimentelle prosedyren beskrevet her kan etterforskningen av protein-protein trans samhandlinger på celle-celle kontakter, ansette fluorescens svingninger spektroskopi teknikker, nemlig sFCCS og ccN & B. Disse metodene omfatter en statistisk analyse av fluorescens svingninger slippes ut av to spectrally atskilt FPs smeltet sammen til protein(s) rundt på en kontakt med to nabokommunene cellene hver uttrykke en eller andre fusion protein. Tilstedeværelsen av trans komplekser er kvantifisert ved sondering graden av co spredningen av proteiner i nabolandet PMs. I tillegg til detaljert protokoller på prøven forberedelse, datainnsamling og analyse gir denne artikkelen eksperimentell bevis på bruk av analysen på neuronal vedheft protein APLP1. Vi viser at APLP1 gjennomgår spesifikke, homotypic trans interaksjoner i celle-celle kontakter. Videre fremme sink ioner dannelsen av APLP1 klynger på celle-celle kontakter som gir en multivalent plattform for trans interaksjoner, og dermed indusere forbedret trans bindende.

I motsetning til tidligere analyser å oppdage slike samhandlinger basert på forstyrrende biokjemiske metoder6, kan presentert tilnærming utføres direkte på levende celler, uten behov for fiksering eller isolasjon av protein komplekser. Videre gir den molekylære spesifisitet og informasjon av gjenkjenning av fluorescerende proteiner genetisk smeltet protein av interesse, i motsetning til tidligere kvalitative analyser8,9. Forskjellig fra andre fluorescens basert tilnærminger som bånd10 og fluorescens complementation11er det ingen krav for fluorescerende etikettene til være lokalisert på ekstracellulære side (potensielt forstyrre Protein-protein interaksjoner). Likevel, det må bemerkes at C-terminalen FPs kan fortsatt endre bindingen til intracellular komponenter, f.eks adapter proteiner som megle interaksjon med cytoskeleton. Spesielt er analysen både homo - og heterotypic vekselsvirkningene.

Noen krav for en vellykket program til presentert analysen er verdt å nevne. Utført fluorescens svingninger metodene er basert på timelige målinger som krever lyse og photostable monomerisk FPs, som er et stort hinder for mange røde FPs23. Selv om presentert skanning ordningen er spesielt godt egnet for etterforskningen av langsom dynamikken i transmembrane proteiner, som vanligvis er involvert i celle-celle interaksjoner, oppstå fortsatt gjenværende photobleaching. Derfor presenterer vi en detaljert beskrivelse av korreksjon ordninger, dvs. en bleking korreksjon for sFCCS og boxcar filter ccN & B, som minimerer slike forstyrrelser. Videre vi diskutere numeriske justering algoritmer som effektivt korrigerer andre systematisk forstyrrelser, for eksempel sideveis bevegelse av celler, og gir retningslinjer for å fjerne forbigående ustabilitet. En viktig kilde til slike ustabilitet er vesicula transport, dvs. intracellulær blemmer bærer protein rundt transiently angir fokal volumet. Selv om varierer fra sak til sak, kan dette fenomenet generelt sterkt forstyrre datainnsamling og analyse. Men forbedrer anvendelsen av korreksjon algoritmer stabiliteten til oppkjøpet, tillater utvidede måling ganger som nødvendig å undersøke spesielt treg diffusive dynamikken. I denne forbindelse, må det understrekes at diffusive dynamics er en viktig betingelse for den å arbeide. Eksempel på sink ion mediert APLP1 klynger viser en drastisk eksempel på store, veldig treg protein komplekser (D ≈ 0,001 µm2/s) som presse teknikken til sine grenser og hindre en nøyaktig kvantifisering av underliggende dynamikken, på grunn av stor støy indusert av begrenset ervervelse tid30,17.

I denne sammenheng nylige fremskritt på gre sFCS og super-oppløsning tilnærminger, f.eks skanning tilsvarende uttømming FCS (STED-FCS), kan være gunstig ved å gi en mindre fokal volum og dermed mindre effektiv diffusion ganger39 ,40. Dette kan også bidra til å løse protein klynger ved et ikke-homogen lokalisering av protein av interesse på celle-celle kontaktene, som observert i APLP1 i nærvær av sink. Dessverre, en cross-korrelasjon gjennomføring av skanning STED-FCS, dvs. STED-FCCS, som kan brukes direkte her, ikke ble vist ennå på grunn av vanskelighetene med å finne kompatible fargestoffer for to farger STED-FCS. Ved tilstrekkelig rask dynamics (D ≥ ~0.05 µm2/s) kan sFCCS analyse kvantifisere spredningen av proteiner i celle-celle kontakter eller i andre områder av PM12.

Videre en lysstyrke analyse kan utføres for alle data (sFCCS og ccN & B), gir et anslag over støkiometri av trans protein komplekser. Det bør nevnes at nøyaktigheten av støkiometri kvantifiseringen øker med mengden av proteiner som binder i trans (dvs. finnes det bare par cis komplekser som kan påvirke lysstyrke bestemmelse). Lysstyrke analyse tillater ikke løse blandinger av forskjellige oligomeric stater, e.g.,cis monomerer og trans -tetramers. Mer generelt, bør det bemerkes at N & B ikke kan løse blandinger av ulike oligomeric arter homogent distribuert i et utvalg. Hvis flere arter finnes innenfor en piksel, blir én verdi lysstyrken målt (dvs. et veid gjennomsnitt av lysstyrken i hver oligomeric Art). Statistisk distribusjon av observerte lysstyrkeverdiene (f.eks i forskjellige piksler) er ikke direkte knyttet til de relative mengdene av oligomeric. Du kan løse slike blandinger, andre metoder skal brukes (f.eks romlige intensitet distribusjon analyse (SpIDA)41, Foton teller histogrammet (PCH)42). Tilsvarende gir kvantifisering av spectral kryss-sammenhengen i sFCCS en nøyaktig kvantifisering av brøkdelen av bundne og ubundne proteiner bare for enkel, kalt stoichiometries, f.eks 1:1. For en mer kompleks støkiometri, ytterligere må forutsetninger gjøres43. Samlet er lysstyrke analyse et kraftig verktøy for eksperimentell, hvis de merker systemet og brøkdel av ikke-fluorescerende FPs er kalibrert23 som beskrevet i protokoller.

Selv om programmet presenteres her er fokusert på protein-protein interaksjoner i tilhenger celler, kan analysen brukes på et bredere spekter av prøver, f.eks suspensjon celler. For slike systemer, kan korreksjon for sideveis celle bevegelse være spesielt viktig. I tillegg kan det lett brukes til å modellere membran systemer som GUVs eller GPMVs, slik at kvantifisering av molekylære interaksjoner under godt kontrollerte forhold, f.eks forskjellige lipid komposisjoner eller membraner mangler en organisert cytoskeleton. Når du utfører sFCCS på slike blemmer, vertikale bevegelser kan forårsake ekstra signal svingninger, men kan minimeres når fokuserer på store blemmer. I denne sammenheng, flere kombinasjoner er lovende, f.eks GUV- / GPMV-celle blande12. Som vist i en fersk publikasjon, kan dannelsen av immun synapser modelleres vellykket av slike systemer44. Dermed vil presentert analysen sikkert være nyttig for etterforskningen av en rekke celle-celle interaksjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble delvis støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) gi 254850309. Forfatterne takker Madlen Luckner for kritisk lesning av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM growth medium PAN-Biotech P04-01548
DPBS w/o: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-36500
DPBS w: Ca2+ and Mg2+ PAN-Biotech P04-35500
Trypsin EDTA PAN-Biotech P10-023100
TurboFect Transfection Reagent Thermo Fisher Scientific R0531
HEK 293T cells DSMZ ACC 635
Alexa Fluor 488 NHS Ester Thermo Fisher Scientific A20000
Rhodamine B Sigma-Alderich 83689-1G
Plasmid DNA Addgene NA See reference 12 (Dunsing et. al., MBoC 2017),for a detailed description of all plasmids
6-well plate Starlab CC7672-7506
35-mm glass bottom dishes CellVis D35-14-1.5-N
Zeiss LSM780 confocal Carl Zeiss NA
MATLAB software package MathWorks  2015b 
Neubauer cell counting chamber Marienfeld 640110

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Molecular biology of the cell. Garland Science. (2002).
  2. Tepass, U., Truong, K., Godt, D., Ikura, M., Peifer, M. Cadherins in embryonic and neural morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1, (2), 91-100 (2000).
  3. Harris, T. J. C., Tepass, U. Adherens junctions: from molecules to morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, (7), 502-514 (2010).
  4. Hernández, J. M., Podbilewicz, B. The hallmarks of cell-cell fusion. Development. 144, (24), Cambridge, England. 4481-4495 (2017).
  5. Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews Immunology. 3, (12), 973-983 (2003).
  6. Kaden, D., Voigt, P., Munter, L. -M., Bobowski, K. D., Schaefer, M., Multhaup, G. Subcellular localization and dimerization of APLP1 are strikingly different from APP and APLP2. Journal of cell science. 122, Pt 3 368-377 (2009).
  7. Yap, A. S., Michael, M., Parton, R. G. Seeing and believing: recent advances in imaging cell-cell interactions. F1000Research. 4, F1000 Faculty Rev 273 (2015).
  8. Kashef, J., Franz, C. M. Quantitative methods for analyzing cell-cell adhesion in development. Developmental Biology. 401, (1), 165-174 (2015).
  9. Soba, P., et al. Homo- and heterodimerization of APP family members promotes intercellular adhesion. The EMBO Journal. 24, (20), 3624-3634 (2005).
  10. Kim, S. A., Tai, C. -Y., Mok, L. -P., Mosser, E. A., Schuman, E. M. Calcium-dependent dynamics of cadherin interactions at cell-cell junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (24), 9857-9862 (2011).
  11. Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems. Neuron. 57, (3), 353-363 (2008).
  12. Dunsing, V., Mayer, M., Liebsch, F., Multhaup, G., Chiantia, S. Direct evidence of amyloid precursor-like protein 1 trans interactions in cell-cell adhesion platforms investigated via fluorescence fluctuation spectroscopy. Molecular biology of the cell. 28, (25), 3609-3620 (2017).
  13. Schneider, F., et al. Diffusion of lipids and GPI-anchored proteins in actin-free plasma membrane vesicles measured by STED-FCS. Molecular Biology of the Cell. 28, (11), 1507-1518 (2017).
  14. Bacia, K., Kim, S. A., Schwille, P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells. Nature methods. 3, (2), 83-89 (2006).
  15. Ries, J., Schwille, P. Studying Slow Membrane Dynamics with Continuous Wave Scanning Fluorescence Correlation Spectroscopy. Biophysical Journal. 91, (5), 1915-1924 (2006).
  16. Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. Accurate Determination of Membrane Dynamics with Line-Scan FCS. Biophysical Journal. 96, (5), 1999-2008 (2009).
  17. Chiantia, S., Ries, J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in membrane structure elucidation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1788, (1), 225-233 (2009).
  18. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical journal. 94, (6), 2320-2332 (2008).
  19. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy research and technique. 71, (1), 69-81 (2008).
  20. Unruh, J. R., Gratton, E. Analysis of Molecular Concentration and Brightness from Fluorescence Fluctuation Data with an Electron Multiplied CCD Camera. Biophysical Journal. 95, (11), 5385-5398 (2008).
  21. Digman, M. A., Wiseman, P. W., Choi, C., Horwitz, A. R., Gratton, E. Stoichiometry of molecular complexes at adhesions in living cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, (7), 2170-2175 (2009).
  22. Hellriegel, C., Caiolfa, V. R., Corti, V., Sidenius, N., Zamai, M. Number and brightness image analysis reveals ATF-induced dimerization kinetics of uPAR in the cell membrane. The FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 25, (9), 2883-2897 (2011).
  23. Dunsing, V., Luckner, M., Zühlke, B., Petazzi, R. A., Herrmann, A., Chiantia, S. Optimal fluorescent protein tags for quantifying protein oligomerization in living cells. Scientific Reports. 8, (1), 10634 (2018).
  24. Chen, Y., Johnson, J., Macdonald, P., Wu, B., Mueller, J. D. Observing Protein Interactions and Their Stoichiometry in Living Cells by Brightness Analysis of Fluorescence Fluctuation Experiments. Methods in enzymology. 472, 345-363 (2010).
  25. Kapusta, P. Absolute Diffusion Coefficients: Compilation of Reference Data for FCS Calibration. Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/7353/appnote_diffusioncoeffients.pdf (2010).
  26. Foo, Y. H., Naredi-Rainer, N., Lamb, D. C., Ahmed, S., Wohland, T. Factors affecting the quantification of biomolecular interactions by fluorescence cross-correlation spectroscopy. Biophysical journal. 102, (5), 1174-1183 (2012).
  27. Baum, M., Erdel, F., Wachsmuth, M., Rippe, K. Retrieving the intracellular topology from multi-scale protein mobility mapping in living cells. Nature Communications. 5, 4494 (2014).
  28. Wohland, T., Rigler, R., Vogel, H. The standard deviation in fluorescence correlation spectroscopy. Biophysical journal. 80, (6), 2987-2999 (2001).
  29. Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Optics Express. 18, (11), 11073 (2010).
  30. Ries, J., Schwille, P. New concepts for fluorescence correlation spectroscopy on membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 10, (24), 3487 (2008).
  31. Mayer, M. C., et al. Amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) exhibits stronger zinc-dependent neuronal adhesion than amyloid precursor protein and APLP2. Journal of Neurochemistry. 137, (2), 266-276 (2016).
  32. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189, (5), 777-782 (2010).
  33. Trullo, A., Corti, V., Arza, E., Caiolfa, V. R., Zamai, M. Application limits and data correction in number of molecules and brightness analysis. Microscopy Research and Technique. 76, (11), 1135-1146 (2013).
  34. Nolan, R., et al. nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm. Bioinformatics. 33, (21), Oxford, England. 3508-3510 (2017).
  35. Hammond, G. R. V., Sim, Y., Lagnado, L., Irvine, R. F. Reversible binding and rapid diffusion of proteins in complex with inositol lipids serves to coordinate free movement with spatial information. The Journal of cell biology. 184, (2), 297-308 (2009).
  36. Hendrix, J., Dekens, T., Schrimpf, W., Lamb, D. C. Arbitrary-Region Raster Image Correlation Spectroscopy. Biophysical journal. 111, (8), 1785-1796 (2016).
  37. Hendrix, J., et al. Live-cell observation of cytosolic HIV-1 assembly onset reveals RNA-interacting Gag oligomers. The Journal of cell biology. 210, (4), 629-646 (2015).
  38. Hendrix, J., Schrimpf, W., Höller, M., Lamb, D. C. Pulsed Interleaved Excitation Fluctuation Imaging. Biophysical Journal. 105, (4), 848-861 (2013).
  39. Honigmann, A., et al. Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells. Nature Communications. 5, (1), 5412 (2014).
  40. Chojnacki, J., et al. Envelope glycoprotein mobility on HIV-1 particles depends on the virus maturation state. Nature Communications. 8, (1), 545 (2017).
  41. Godin, A. G., et al. Revealing protein oligomerization and densities in situ using spatial intensity distribution analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (17), 7010-7015 (2011).
  42. Müller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Resolving Heterogeneity on the Single Molecular Level with the Photon-Counting Histogram. Biophysical Journal. 78, (1), 474-486 (2000).
  43. Kim, S. A., Heinze, K. G., Bacia, K., Waxham, M. N., Schwille, P. Two-Photon Cross-Correlation Analysis of Intracellular Reactions with Variable Stoichiometry. Biophysical Journal. 88, (6), 4319-4336 (2005).
  44. Jenkins, E., et al. Reconstitution of immune cell interactions in free-standing membranes. Journal of cell science. 132, (4), (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics