Kültür Drosophila Egg Chambers Time-Lapse filmler kullanarak yerel hücresel ve doku ölçeklerde Actomyosin dinamikleri Analizi

* These authors contributed equally
Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu protokol, tek hücrelerde ve kavisli epitelyal dokularda akomyosin davranışlarını nasıl güvenilir bir şekilde analiz ettiğini açıklayan basit yönergelerle birlikte Fiji tabanlı, Kullanıcı dostu bir metodoloji sunar. Öğretici izlemek için hiçbir programlama becerileri gereklidir; tüm adımlar Fiji grafik kullanıcı arayüzü ve ilişkili eklentileri kullanarak yarı interaktif bir şekilde gerçekleştirilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Viktorinová, I., Haase, R., Pietzsch, T., Henry, I., Tomancak, P. Analysis of Actomyosin Dynamics at Local Cellular and Tissue Scales Using Time-lapse Movies of Cultured Drosophila Egg Chambers. J. Vis. Exp. (148), e58587, doi:10.3791/58587 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Drosophila olgunlaşmamış Yumurtalar yumurta odaları denir ve onların yapısı geliştirme sırasında bir elipsoid şekle bir turda morfolojik değişiklikler geçmesi ilkel organlar benzer. Bu gelişimsel süreç oogenesis denir ve bir sonraki sinek nesil güvenli fonksiyonel Olgun yumurta üretmek için çok önemlidir. Bu nedenlerden dolayı, yumurta odaları hayvan organı gelişimini anlamak için ideal ve ilgili bir model olarak hizmet vermiştir.

Çeşitli in vitro kültür protokolleri geliştirilmiştir, ancak bu protokoller için çeşitli dezavantajları vardır. Biri, onları hareketsiz ve analiz yumurta odalarının çevresel yüzeyinin görüntülenmiş edinme düzlemini artırmak için görüntülenmiş yumurta odalarında yapay bir basınç sağlayan çeşitli kapakları uygulama içerir. Böyle bir yaklaşım, uzun eksenleri etrafında yumurta odaları döndürmek için güç üreten ince akomyosin makinenin davranışını olumsuz etkileyebilir.

Böylece, bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, yumurta odalarının çevresi boyunca akomyosin makinelerini güvenilir bir şekilde analiz etmek amacıyla medyada serbestçe Drosophila Egg Chambers kültürü sunuyoruz. Protokolün ilk bölümünde, yerel hücresel ölçekte (15 hücreye kadar) sınırlı bir satın alma düzleminde aktomiozin makinelerini nasıl analiz edebileceğiz hakkında ayrıntılı bir kılavuz sağlıyoruz. Protokol ikinci bölümünde, biz yumurta odaları ' çevresel yüzey tanımlanmış bir ince tabaka basit ekstraksiyon sağlayan yeni bir Fiji tabanlı eklentisi ile kullanıcılara sağlar. Aşağıdaki protokol daha sonra doku ölçeğinde (> 50 hücre) akomyosin sinyallerinin nasıl çözümleneceğini açıklar. Son olarak, bu yaklaşımların kısıtlamalarını hem yerel hücresel hem de doku ölçeklerde tespit ediyoruz ve potansiyel gelecekteki gelişimini ve olası uygulamalarını tartışıyoruz.

Introduction

Yeni görüntüleme ve yazılım teknolojilerinin yaşam bilimleri uygulamalarında sürekli gelişimi, yaşamın temel ilkelerini anlamakta büyük bir etki sağladı. Ana zorluklardan biri, çeşitli dokularda canlı görüntüleme ile birlikte gelişimsel süreçlerin güvenilir bir şekilde görselleştirilmesi. Dokular organlar ve organları ve bu nedenle, çoğunluğu kolayca görüntüleme için erişilebilir değildir. Bu nedenle, kendi diseksiyon ve in vitro kültür izin protokolleri yeterince canlı bir vücut içinde in vivo durumu yansıtmak biyolojik olayları görselleştirmek için geliştirilmiştir.

Geçtiğimiz yıllarda, Drosophila yumurta odalarının kültür ve canlı görüntülemesinde, ilkel organlara benzeyen acinar benzeri yapıların, ilkel organ gelişimi temel prensiplerinin anlayışına son derece katkı sağladı1 , 2 , 3. Şu anda, mevcut çeşitli kültür protokolleri vardır, ve kullanımı edinme süresi bağlıdır, hücre türü görüntülenmiş olması, ve onların Erişilebilirlik (örn., iç germline vs dış somatik hattı)4.

Tüm bu kültür protokollerinde ortak bir özellik sıvı medyada yüksek kontril aktivite gösteren analiz yumurta odaları immobilizasyon için ihtiyaç vardır. Yumurta odaları kontril aktivite bağlı yumurta odaları uzun bir dize kapsayan kas levha ağırlıklı olarak neden olur5,6,7. Bu nedenle, Genç yumurta odalarının düzgün immobilizasyonu elde etmek için, çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir, Cover,6,8,9 veya esnek battaniye 4 ile yumurta odaları kapsayan içeren, 10 veya düşük erime noktası agaroz3,11içine katıştırma. Aynı zamanda yumurta odalarının çevresel yüzeyinin ince düzleştirme nedeniyle daha büyük bir görsel düzlem görüntüleme izin olarak bu yaklaşımlar popülerdir.

Ancak, son zamanlarda, bu genç yumurta odaları (Aşama 1-8) onların anterior-posterior eksen etrafında döndürmek gösterilmiştir6 ve bu doku hareketi bu genç yumurta odalarının çevresel yüzeyine yakın ince bir aktomiozin ağ tarafından desteklenmektedir olduğunu 12. bu nedenle, bu doku ince bir düzleştirme neden hücresel yüzey yapay değişiklik kuvvet üreten aktomiozin makine davranışı üzerinde olumsuz bir etkisi olabilir. Kontrpuan, yumurta odası dokusu düzleştirilmiş değilse, yumurta odalarının çevresel yüzeyinde proteinlerin mikroskobik görüntüleme daha da satın uçak azalan boyutu ile sınırlı hale gelir.

Bu nedenle, Prasad ve al.9 ve Celeste Berg4,10 laboratuvarından birleştirilmiş protokollere sahibiz ve gelişmiş yöntemde hiçbir coverslip/esnek battaniye/agarose kullanılabilmesi için onları daha fazla değiştirdik. Drosophila yumurta odaları serbestçe medyada kültürlü ve burada sunulan protokol sadece ters mikroskopiye uygulanır. Protokole iki parça vardır. İlk bölüm, yumurta odaları içinde yerel hücresel ölçekte (15 hücreye kadar) akomyosin sinyallerinin analizine odaklanmıştır. İkinci bölümde, yumurta odalarının ücretsiz kültürü nedeniyle küçük bir satın alma uçağı ile ilişkili sınırlamaları üstesinden odaklanıyoruz. Bu bağlamda, biz seçici özler ve bir çevresel doku yüzeyi tanımlanan katmanları ortaya çıkaran bir yarı interaktif grafik kullanıcı arayüzü ile bir roman Fiji tabanlı hesaplama yöntemi geliştirdik. Bunun ardından doku ölçeğinde akomyosin nasıl çözümleneceğini açıklayan bir protokol izlenir (yani, > 50 hücre). Eğri epitelyal dokularda tanımlanmış bir ince tabakanın seçici olarak çıkarılması, klasik z-Stack projeksiyon kullanarak kolayca mümkün olmamıştır (Şekil 1), bu kolay kullanımlı Yöntem, önemli bir ön koşul olarak anlaşılır Drosophila yumurta odalarında doku ölçeğinde ince (< 1 μm) aktomiozin ağının davranışı.

Buna ek olarak, protokol kolaylaştırmak için, biz örnek zaman atlamalı Filmler (tlms) ve floresan etiketli kasa invaze olmayan konvansiyonel myosin II davranış örnek dosyaları ( ek dosya 3bakın) sağlar. Myosin II bir motor proteindir ve akomyosin makinenin aktif kontroton parçasını temsil eder. Myosin II görüntü için, biz myosin II adlandırılan mrlc değiştirilmiş bir düzenleyici ışık zinciri içeren Drosophila transjenik hatları kullanın:: GFP (Ayrıntılar için malzeme tablosuna bakın)12,13. Hücre zarlarını görselleştirmek için protokol ticari boyalara dayanır (bkz. malzeme tablosu). Bu protokol sadece küçük hücre altı mrlc analizi için uygundur:: Gfp sinyalleri12 ama aynı zamanda ± 300 μM civarında herhangi bir benzer boyutlu hücre altı parçacıklar için, böyle yaşam-ACT ile gözlenen gibi:: Gfp12,14.

Her ikisi de bu protokoller içinde vitro kültürlü Drosophila yumurta odaları kullanılarak sunulmasına rağmen, akomyosin sinyalleri satın alma da kültür medyanın optimizasyonu üzerine diğer dokularda kullanılarak yapılabilir ve kullanılabilirliği bağlı ilgili ticari boyalar veya örneğin, mRNA mikroenjeksiyonları geçici gen ifade profilleri elde etmek için floresan etiketli proteinlerin. Benzer şekilde, bir çevresel yüzeyden ince bir tabakanın çıkarılması için Fiji tabanlı protokol, elipsoid ve organ benzeri dokulara daha genel olarak uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Aşağıdaki protokol, yerel hücresel ve Drosophila yumurta odalarında doku ölçeği aktomiozin analiz talimatları sağlar. Yerel ölçekli yaklaşım, kullanıcıların yumurta odasına göre 15 hücreye kadar ayrıntılı akomyosin davranışını analiz etmelerini sağlar ve yüksek hızlı görüntüleme ve ters bir Konfokal mikroskop kullanarak kısa bir süre için (5 – 10 dakika) TLMs satın almayı gerektirir. Buna karşılık, doku ölçeği 50 – 100 hücrelerde aktomiozin bilgi sağlar ve düşük hızlı görüntüleme ve ters dönen disk mikroskop kullanarak uzun bir süre (≥ 30 dk) için tlms edinme gerektirir (bkz. Şekil 2 ve Tablo 1' de her ölçekte önerilen parametreler). Akomyosin sinyallerini analiz etme ölçeğinin tamamen kullanıcının bilimsel sorusuna bağlı olduğu karar. Eşlik eden test TLMs bu kararı vermek için yardımcı olmalıdır.

1. yerel hücresel ölçek (LCS)

Not: İncelemek ve görüntü in vitro kültürlü Drosophila yumurta odaları, ek dosya 1açıklanan protokol izleyin. Elde edilen TLD 'Leri çözümlemek için aşağıdaki protokole devam edin. TLMs 'in eşlik eden test dosyalarına bağlantılar ek dosya 3' te sağlanır.

  1. Yerel hücresel ölçekte (LCS) TLMs veri işleme
    1. Floresan etiketleri yoğunluğu çürümesini telafi etmek için TLMs Bleach düzeltmesi
      1. Şu yönergeleri izleyerek kullanılan bilgisayarda güncel bir Fiji uygulamasının yüklü olduğundan emin olun: fiji > bir TLM açın (örn., ek dosya 3' ten TestMovie1. tif).
      2. Görüntü > renk > bölünmüş kanallar'ı tıklatarak renk kanallarını bölün.
      3. Görüntü > Adjust bleach düzeltme basit oran > arka plan yoğunluğu 0,0kullanarak her iki kanalda bir çamaşır suyu düzeltmesi gerçekleştirin.
        Not: Tatmin edici olmayan sonuçlar elde ediliyorsanız, bu eklentinin hangi düzeltme yöntemlerinin en iyi şekilde uyduğunu keşfedin (örn. basit oranyerine histogram eşleştirme kullanın).
    2. TLMs için bir hücre maskesi oluşturmak için hücre segmentasyon
      1. Fiji zaten açık değilse, yeniden açın (ve güncel olduğundan emin olun) aşağıdaki yardım > güncelleştirme Değişiklikleri Uygula > Tamam.
      2. Bu zaten yapılmadı, makro Tıssuecellsegmentmovie. ijm (http://adm.irbbarcelona.org/MATLAB/TissueCellSegmentMovie.ijm) indirin. Sürükle ve Fiji içine bu script bırakın.
      3. Çamaşır suyu ile düzeltilmiş TLM. tiff dosyasını açın (bkz. Bölüm 1.1.1). Resim > renk > bölünmüş kanallarkullanarak çamaşır suyu tarafından düzeltilmiş dosya kanallarını Böl.
      4. Yüklenen komut dosyasını, açık komut dosyasında Çalıştır simgesine basarak seçilen TLM 'nin etkin hücre membran kanalına çalıştırın. 2,500 Için Gauss bulanıklığını ve hücre algılama hassasiyetini -1 olarak ayarlayın ve Tamam'ı tıklatın. Güzel bir hücre maskesi almak için, yukarıdaki bu parametreleri değiştirmeyin. 63x hedefiyle elde edilen TLD 'Ler için 10 – 20 arasındaki tahmini gürültü Toleransını ayarlayın ve Tamam'ı tıklatın.
        Not: Diğer hedefler için farklı parametreler gerekebilir. Bir TLM arka plan temizleyici, düşük tahmini gürültü toleransı gereklidir.
      5. Oluşturulan bir hücre maskesi, analiz edilen TLM 'de ve Particlestack (G)adlı yeni bir pencerede görünür ve buna ek olarak, eylem gerekli adlı küçük bir pencere görüntülenir. TLM 'deki hücre maskesinden, yalnızca TLM 'nin merkezindeki hücrelere odaklanın ve TLM boyunca tam ve iyi tanımlanmış anahatlar sağlayabilirler.
      6. Seçili hücreler yapay/ekstra hücre anahatları içeriyorsa, TLM 'de gerekli eylem adlı birleştirme aracı penceresini kullanın. İkincisi için, penceredeki yönergeleri izleyin.
        Not: Hücre anahatlarının iyi tanımlandığından emin olun ve bir TLM 'de gerçek hücre membranlarına karşılık gelen herhangi bir kesinlik sonraki analizleri etkileyebilir. İstenmeyen hücrelerin kaldırılması gibi ek tweaks ve değişiklikler, daha sonra Surface Manager aracını kullanarak yapılabilir (Bölüm 1.1.3 ' de açıklanmıştır).
      7. Merkezinde Seçilen hücreler güzel gerçek hücre membranlarına karşılık geldiğinde, ParticleStack bir. tiff dosyası olarak kaydedin > > Tiff olarak kaydedin .
    3. Oluşturulan hücre maskesinin Surface Manager 'a yüklenmesi
      1. Surface Manager Plugin15 kullanılan Fiji kurulum içine yükleyin. Viktorinova ve al.16' nın talimatlarını takip edin.
      2. Eklentiler segmentasyon Surface Manager (3D) kullanarak Surface Manager 'ı açın.
        Not: Surface Manager penceresi sağdaki birkaç eylem düğmelerini ve soldaki boş bir pencereyi görüntüler. Tüm eylem düğmelerini görmek için, pencerenin yüksekliğini/genişliğine uzatmak için gerekli olabilir. Zaman dilimlerinin z-dilimleri olarak görüneceğini unutmayın.
      3. İlgili ParticleStack. tiff dosyasını Surface Manager 'a tıklayarak dosya > 'ı tıklatıp açmak için resmi seçin (örn., ParticlesStack1. tif).
      4. Surface Manager 'da, anahat görüntüsünü oku düğmesini tıklatın ve jakarlı dizinini% 60 olarak ayarlayın.
        Not: ParticlesStack1. tif dosyasının yüklenmesi, bilgisayarın işlem gücüne bağlı olarak birkaç dakikaya kadar sürebilir.
      5. Yüklendikten sonra her hücre bir S numarası ile atanır ve yüzey Yöneticisi penceresinin sol kısmında görünür.
        Not: Tüm hücrelerin anahatları ve hücre adlarını göstermek için, yüzey Yöneticisi penceresinin alt kısmındaki Tümünü göster ve etiketleri göster onay kutularını işaretleyin. Hücre numaraları kendi doğruluğu için kontrol edildikten sonra bu işlevi kullanmak için önerilir.
      6. İlk S numarasını tıklayın; ParticlesStack1. tif öğesinden alınan hücre anahattı TLM 'de görünür. TLM genelinde hücre anahat kalitesi için alınan her S numarasını kontrol edin ve yanlış hücre anahatları görüntüleyen istenmeyen hücreleri kaldırın. Bunu yapmak için, hücre anahattı vurgulayın ve düğmeyi tıklatın Delete.
        Not: Aynı zamanda hassas hücre anahatları için düzeltmek ve yeni hücre anahatları eklemek mümkündür. Bu, tartışma bölümünde açıklanmıştır.
      7. Tüm düzeltilmiş hücreleri, diske kaydet düğmesine basarak RoiSet. zip dosyası olarak kaydedin.
        Not: Oturumun kesintiye uğramması gerekiyorsa, RoiSet dosyasını daha sonra Surface Manager 'a yüklemek mümkündür: Fiji 'de (dosya > Open) bir TLM açın ve bir TLM seçin. Eklentileri segmentasyonSurface Manager (3D)üzerinden yüzey Yöneticisi açın. Diske yükle düğmesini tıklatarak ve uygun roiset. zip dosyasını seçerek Ilgili roiset. zip dosyasını yükleyin. Yüklenen hücre maskelerinin yüklenmiş TLM 'ye karşılık geldiğini iki kez kontrol edin.
    4. TLMs 'de doku sürüklenme için düzeltme
      Not: TLMs 'in edinme süresi boyunca, epitelyal rotasyon veya istenmeyen bir hareket nedeniyle drift efektleri görülebilir. Her iki durumda da, daha sonra manuel akomyosin analizini kolaylaştırmak için herhangi bir drift için düzeltme yapmanızı öneririz. Drift düzeltmesi sadece manuel aktomiozin analizi için gereklidir. Bu yazının yüklü MultiStackReg Plugin (https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#multistackreg) ile güncel Fiji yazılımı gerektirir.
      1. Dosya > Açık ve seçin Bleach-düzeltilmiş dosya aracılığıyla Fiji 'de çamaşır suyu düzeltilmiş TLM açın yukarıda belirtilen öğretici kullanılarak oluşturulan.
      2. Kanalları Böl ve görüntü > renk > bölünmüş kanallararacılığıyla hücre membranlarını tanımlayan birini seçin.
      3. Hücre anahatları görünür şekilde pürüzsüz olmadığında aşağıdaki protokolü kullanın: işlem > Filtreler Gauss bulanıklaştırma. Bir 63x amacı için ~ 1 – 2 olarak ayarlayın ve Tamam 'ı tıklatın ve sonra Evet. Tıklatın işlem > ikili ≫ varsayılan ayarları kullanarak maske Dönüştür ; sonra Tamam' ı tıklatın.
      4. Yük MultiStackReg Plugin aşağıdaki eklentileri > kayıt > multistackreg.
      5. Yığın 1 ' in hücre membran kanalına ayarlandığından emin olun, eylem 1 Hizala olarak ayarlanır ve dönüştürme çeviri olarak ayarlanır. Dönüşüm dosyasını Kaydet onay kutusunu Işaretleyin ve Tamam'ı tıklatın.
      6. Seçili TLM, MultiStackReg eklentisi ve dosya > Open 'ı kullanarak kaydedilmiş dönüştürme dosyasını yeniden açın ve bir TLM seçin. Görüntü > renk > bölünmüş kanallarıkullanarak renk kanallarını Böl.
      7. Eklentileri > kayıt > Multistackregtıklayarak multistackreg Plugin yükleyin. Dönüşüm dosyasını eylem 1 olarak yükle 'yi seçin.
      8. Dönüşümü sert gövde olarak bırakın ve Tamam'ı tıklatın. Önceden kaydedilmiş dönüşüm dosyasını seçin ve Tamam 'ı yeniden tıklatın.
      9. Görüntü > renk > birleştirme kanallarıaşağıdaki görüntü Kanalları Birleştir ve kayıtlı TLM. tiff dosyası olarak kaydedin. Dosya > > Tiff olarak kaydet 'i tıklatarak dosyayı kaydedin.
        Not: Orada alternatif yollar Fiji 'de bir doku drift için düzeltmek için, yani eklentileri > kayıt stackreg/doğru 3D driftile.
  2. LCS 'de Surface Manager 'da akomyosin darbeleri Analizi
    Not: Bu protokol adımı, bilim adamlarının, analiz edilen dokuda akomyosin darbeleri olup olmadığını belirlemesini ve ayrıntılı davranışları ve akomyosin sinyallerinin yönünü anlamanızı sağlar.
    1. Fiji açın ve bir TLM ve karşılık gelen hücre maskesi Surface Manager 'da açık olduğundan emin olun.
      Not: Fiji yüklü ve güncel ve Surface Manager eklentisi yüklü olduğundan emin olun (adım 1.1.3.1).
    2. Dosya > Open ile bir TLM açın ve açmak için bir TLM seçin (örn., TestMovie1_bleach. tif). EklentilersegmentasyonSurface Manager (3D)aracılığıyla yüzey Yöneticisi eklentisi yükleyin. Burada öğretici oluşturulan kaydedilmiş hücre maskesini yükleyin (örn., ParticlesStack1. tif) dosya > ve seçin bir hücre maskesi (örn., ParticlesStack1. tif). İlgili bölge (YG, örneğin, TestMovie1_RoiSet. zip) yükleyin. Bkz. Şekil 3A.
    3. Seçilen TLM 'de ilgilendiğiniz kanala geçin.
      Not: Kanalları ayırt etmek için TLM 'nin etrafında belirtilen renk kodunu izleyin.
    4. Yüzey Yöneticisi 'nde, Ortalama gri değer Slice tarafından Slice (Şekil 3B) adlı pencereyi elde etmek için İstatistikler düğmesini tıklatın. Belirtilen hücre içindeki belirli bir analiz kanalındaki aktomiozin sinyallerinin ortalama/medyan yoğunluğu değerlerinin zaman içinde özetlendiğini, aynı zamanda hücre alanı ve hücre şekline ilişkin diğer parametrelerin de görüntüleneceğini unutmayın.
      Not: Yoğunluk değerleri arbitraty ünitelerinde (A.U.); hücre alanı pikseldir ve kare mikrometre içine dönüştürülmesi gerekir.
    5. Elde edilen değerleri bir elektronik tablo dosyası olarak kaydedin. Istatistik penceresine tıklayın, dosya ≫ farklı Kaydet.
      Not: Elde edilen istatistiksel değerleri daha sonra aşağıdaki şekilde doğrulamak mümkündür: Fiji 'de çamaşır suyu ile düzeltilmiş TLM ve Surface Manager 'ı açın. Diskten yük düğmesine basarak ve dosyayı açmak için karşılık gelen RoiSet. ZIP TLM yükleyin. Hücre anahatları olan kaydedilmiş maske yüklenir ve hücrelerin adları sol yüzey Yöneticisi penceresinde görünecektir. İstatistik değerleri için istatistik düğmesini tıklatın.
  3. LCS 'de bireysel hücre altı aktomiozin sinyallerinin manuel Analizi
    Not: Bu protokol en çok konsantrasyon gerektirir ve zaman alıcı. Genel olarak, elde edilen bir TLM 1 gün içinde rahatça analiz edilebilir. Bu onların diseksiyon önce sinek hazırlama için zaman içermez, diseksiyon, ve görüntü edinme.
    1. Seçilen, çamaşır suyu ile düzeltilmiş ve kayıtlı (drift-düzeltilmiş) TLM 'i güncel bir Fiji uygulamasında açın. Bir test örneği olarak bir çamaşır suyu düzeltilmiş ve drift-düzeltilmiş TLM (örneğin, TestMovie1_bleach_reg. tif) kullanın.
    2. Görüntü > Adjust > Parlaklık/kontrastkullanarak bireysel akomyosin sinyallerini görmek için parlaklığı ve karşıtlığı ayarlayın.
    3. TLMs 'Leri doku/gövde eksenine göre aynı yönde hizalayın. Yumurta odaları durumunda, yumurta odalarının ön tarafını her zaman görüntü/submovie/TLM soluna analiz etmeden önce hizalayın.
    4. Seçilen filmi kısa 30 s alt filmlere ve her biri zaman projesine bölün. Zaman yansıtılan ve zaman yansıtılan alt filmleri ilgili adlarla kaydedin. Orijinal kaynağı saklayın.
      Not: Submovies orijinal TLMs ilk görüntü > yığınları > Slice Removeraracılığıyla istenmeyen çerçeveleri silerek oluşturulabilir. Kaldırılacak dilimleri tanımlayın ve artırma ayarlayın. Dilim çıkarıcı kullanmadan önce RGB 'ye Dönüştür zaman artırma = 1. 30 s alt filmi zaman projesi için, tanımlanan çerçeveler (dilim) için ımage > Stacks > Z-Project > Max yoğunluk 'ı tıklatın ve sonra Tamam'ı tıklatın. İki sonraki 30 s alt filmlerde 2 adet aktomiozin sinyallerini saymamak için her saniyede 30 s alt filmi atlayın.
    5. İlgili 30 s alt filminin (Şekil 4A, B) yanında zaman yansıtılan bir görüntü yerleştirin. Zaman yansıtılan alt filmde sinyal hattını tanımlayın. Submovie el ile oynatarak orijinal alt filmde bu çizgi boyunca aktomiozin sinyal hareketinin yönünü (0 ° – 360 °) belirleyin. Sinyal hareketinin yönünü tanımlanan doku eksenine veya benzer bir araca göre el ile ölçmek için açı aracını (Fiji çubuğunda) kullanın.
      Not: Fiji sadece 0 ° – 180 ° ölçekli (Şekil 4c) çalışır ve elde edilen değerlerin 0 ° – 360 ° ölçekte yeniden hesaplanması gereklidir. Bir sinyal hattı zaman içinde bir akomyosin sinyal hareketinin yörüngesine karşılık gelir.
    6. Akomyosin sinyallerinin analizinde çoğaltılmasını önlemek için, zaman yansıtılan alt filmde (Şekil 4b, D) hücrelerdeki analiz sinyal çizgilerini işaretleyin.
    7. 30 s alt filminde seçilen tüm hücreleri analiz edin ve elde edilen açıları kaydedin.
      Not: TLM boyunca iyi tanımlanmış hücre anahatları olan hücrelerde yalnızca hücre altı sitoplazmik akomyosin sinyallerini analiz edin. Tüm TLM 'deki 15 – 20 ' den az algılanan sinyallerle bireysel hücreleri hariç tutun. Bilinmeyen kökenleri nedeniyle hücreler arasında hareket eden akomyosin sinyallerini yoksay. 30 s alt filmdeki bir analiz hücresi için sinyal sayılarının bir örneği Şekil 4d'de gösterilir.
    8. Bir TLM 'nin tüm 30 s uzunluğunda alt filmleri analiz edilinceye kadar devam edin ve bir e-tablo dosyasında bir TLM 'nin akomyosin sinyallerinin tüm ölçülen açısını kaydedin.
    9. Tüm ölçülen açıları ilgili TLMs sayısı (denemeye bağlı) üzerinde özetlemek. Analiz edilen akomyosin sinyallerinin yönü yüzdesini, örneğin, tercih edilen bir yazılım ile 0 ° ile 360 ° arasında bir Aralık ile bir gül diyagramı olarak arsa.
      Not: İstatistiksel olarak önemli sonuçlar elde etmek için, herhangi bir yumurta odası aşamasının beş ila on bağımsız yumurta odaları analiz edilmesi tavsiye edilir.

2. doku ölçeği

Not: İncelemek ve görüntü in vitro kültürlü Drosophila yumurta odaları için, ek dosya 2protokol izleyin. Elde edilen TLD 'Leri çözümlemek için aşağıdaki protokole devam edin. TLMs eşlik eden test dosyaları ek dosya 3yerleştirilir.

  1. Eğri epitelyal dokularda seçici yüzey ekstraksiyon
    Not:Bu protokol, kullanıcıların zaman içinde eğri epitelyal dokuda ince bir akomyosin katmanını seçici olarak çıkarmasına olanak tanır. Bu protokol adım kullanıcı dostu ve sezgisel bir grafik arayüzüne dayanmaktadır. Kolayca analiz etmek mümkündür (yüzey ayıklamak) birkaç TLMs. kullanım TestMovie2. czi (Ek dosya 3) bir test TLM örneği olarak.
    1. Güncel bir Fiji uygulaması açın (fiji > yardım güncelleme > Değişiklikleri Uygula > Tamam).
    2. Ellipsoid yüzey projeksiyon eklentisi15 yüklü olduğundan emin olun. Viktorinova et al. takip edin. 16 yaşında.
    3. Bir TLM açın ve eklentiler bigdataviewer > geçerli görüntüyü XML/HDF5 dosyası olarak dışa aktar'ı tıklatarak XML/HDF5 dosyası olarak dışa aktarın.
      Not: Bir verme yolu tanımlamak için gereklidir. Kaydetme birkaç dakika sürebilir ve TLM uzunluğuna bağlıdır.
    4. Dışa aktarılan dosyayı ellipsoid yüzey projeksiyon içinde eklentiler bigdataviewer ellipsoid yüzey projeksiyon > Select XML dosyasınıtıklatarak açın.
      Not: Yumurta odasının sagittal görünümleri ve işleme yoluyla Kullanıcı rehberlik etmek için bir diyalog ile yeni bir pencere görünecektir. Dilim görünümünde gezinme hakkında ayrıntılar https://imagej.net/BigDataViewer adresinde bulunabilir.
    5. Ofarklılık projeksiyon adlı iletişim penceresinde birkaç sekme vardır. Sınırlayıcı kutusu olarak adlandırılan ilk iletişim sekmesinde, TLM 'de bir yumurta odasının x ve y kenarlıklarını sınırlayıcı kutunun z genişliğiyle birlikte (örn. z yığını/yumurta odasının derinliği) ve set tuşuna (Şekil 5A) belirleyin.
    6. Kenarlıkları tanımlamak için x, y ve z 'nin yanındaki düğmeleri sürükleyin veya x, y ve z kutularındaki sayı koordinatlarını tanımlayın. Kenarları yüzey ekstraksiyon içine ilgi yumurta odasının parçası almak için yeterince cömert olduğundan emin olun. Yumurta odasının seçilmiş parçaları pembe vurgulanır.
    7. Penceredeki bul Blobları adlı sekmeye geçiş yapın. Sigma ve minimal en yüksek değeri tanımlayın; daha sonra, yeşil Bloblar olarak görünecek olan akomyosin sinyallerini (Şekil 5B) tanımlamak için COMPUTE tuşuna basın. Yeterli noktalar (100 civarında) bulunduğunda kadar farklı parametrelerle bu adımı yeniden deneyin.
      Not: Minimum pik değeri 20 \ u2012100 değerleri taşır ile Sigma 1 \ u20123 Stage-6-8 yumurta odaları aktomiozin sinyalleri belirlemek için en iyi çalışır. Akomyosin sinyallerinin belirlenmesi önemli bir adımdır ve sinyal kalitesine ve boyutuna bağlıdır. Varolan Bloblar doğru boyutunu onaylamak önemlidir. Görüntüde görünür yeşil lekeler/Bloblar bir sonraki adımın işe yaramazsa anlamına gelir. Blob 'ları görmek için seçilen z düzlemlerini inceleyin.
    8. Elipsoid tasarlamak için, fit elipsoidadlı sekmeyle devam edin. Rasgele örnekleri 10.000, dış/iç kesme mesafesi 1 \ u201210 Için ayarlayın ve sonra COMPUTE (Şekil 5c) tıklatın.
      Not: Düşük kesme mesafesi, daha hassas istenen elipsoid olacaktır. Bunun ardından, projeksiyon denilen sekme otomatik olarak açılacaktır ve yüzey ekstraksiyon tanımına izin verir. Ayarların optimize edilmesi gerekir.
    9. Projection (Şekil 5D) adlı sekmeyle daha fazla devam edin. Minimum ve maksimum projeksiyon mesafesi (örn. istenilen elipsoid genişliği) ayarlayın. Pembe tanımlanan elipsoid bölgenin yumurta odasının tüm dış tabakasını içeren, böylece minimal ve maksimal projeksiyon uzaklığı ayarlamak için gereklidir. Dilim mesafesini tanımlayın (1 önerilir).
      Not: Şekil 6a, C'de yanlış ve optimum projeksiyon parametrelerine neden olan bir hatalı ve optimum elipsoid Sığdır örnekleri gösterilir. Faiz ince çevresel tabaka daha sonra tanımlanabilir. Hesaplama basmadan önce yumurta odasında tanımlanan genişlikte elipsoid pembe bölgenin görünür olduğundan emin olun. İstenilen elipsoid (pembe tek çizgi) iyi sonuçlar elde etmek için bir yumurta odasının elipsoid yüzeyine güzel uyum önemlidir. Elipsoid Sığdır iyi değilse, istenilen yüzey ekstraksiyon elde edilinceye kadar farklı ayarlar düzenleyin.
      1. Elipsoid bir çıkış genişliği (≥ 800) ve yüksekliği (≥ 400) ayarlayın. Yüzey çıkarma işlemi için hangi zaman noktasının oluşturulacağını ayarlayın (örneğin, TLM ekstraksiyonu uzunluğunu tanımlayın). Küresel veya silindirik bir projeksiyon seçin. Z 'ye çevirin ve gerekirse Y 'ye hizalayın.
      2. Görüntüolarak adlandırılan yeni pencerelerin her iki kanalı için bir yüzey ekstraksiyonu elde etmek için COMPUTE tuşuna basın. Görüntü > Ayarla > Parlaklık/kontrast seçeneğini tıklatarak, elde edilen görüntü pencerelerin parlaklığını ve karşıtlığını, yansıtılan akomyosin sinyallerini görebilecek şekilde ayarlayın.
        Not: Şekil 6B, D'de yanlış ve en iyi elipsoid Sığdır kaynaklanan bir projeksiyon örnek bir karşılaştırma gösterilir.
    10. Yüzey ekstraksiyon iyi görünüyorsa, görüntüleri (her iki kanal ayrı olarak). tiff olarak kaydedin. Ayrıca, bu belirli yumurta odasının yüzeyinin nasıl ayıklandığı gibi gelecekteki başvuru için günlük penceresi dosyasını kaydedin.
      Not: Bu, ayıklanan ince katmanın orijinal açılmamış şekline (yalnızca geliştiriciler için) döndürülmesi durumunda özellikle önemli bilgilerdir.
    11. Fiji 'de tercih edilen renk koduyla kanalları birleştirin.
      Not: Gerekirse, proje seçilen z-yığın katmanları ile aktomiozin sinyalleri. Satın alma odağı bir TLM 'de zaman içinde biraz değiştiğinde, seçilen z yığını katmanlarının projeksiyon gereklidir. En iyi sonuçlar için, en çok bir-iki z yığını katmanları proje.
    12. Sonuçları. tiff dosyaları olarak kaydedin.
      Not: Myosin II (mrlc:: Gfp) kontrol ve fat2 mutant yumurta odaları folikül Epitelyumu temsil eden ince Katmanlar (seçici bazal ve apikal yüzey) temsili örnekler Şekil 8' de bulunabilir.
  2. Seçici olarak çıkarılan doku yüzeyinin veri işleme
    1. Bleach-floresan etiketlerinin yoğunluğu çürümesini telafi etmek için TLD 'Leri düzeltin.
      1. Fiji açın. Bir TLM açın (örn., TestMovie2_extraction. tif ek dosya 3) Dosya > Openkullanarak. Görüntüyü açmak için seçin.
      2. Renk kanallarını Böl ve gerekirse resim > renk > bölünmüş kanallar'ı tıklatarak 16 bitlik resimlere dönüştürün. Görüntü > türü > 16-bitkullanarak kanalları 16 bit görüntülere (32 bit görüntülerden) dönüştürün.
      3. Görüntü > Adjust bleach düzeltme basit oran > arka plan yoğunluğu 0,0kullanarak her iki kanalda bir çamaşır suyu düzeltmesi gerçekleştirin.
        Not: Eğer gereksiz sonuçlar elde edilir, bu eklentinin hangi düzeltme yöntemlerinin en iyi sığacağı keşfetmek için gereklidir (örn., basit oran yerine histogram eşleştirme kullanın).
      4. Görüntü > renk > Kanalları Birleştir'i tıklatarak, çamaşır suyu ile düzeltilmiş iki görüntüden kanalları birleştirin. Birleştirilmiş görüntüyü, dosya ≫ ≫ Tiff olarak kaydet 'i tıklatarak. tiff dosyası olarak kaydedin.
        Not: Gerekirse kanallar için kontrast ve parlaklığı ayarlayın.
    2. TLMs için bir hücre maskesi oluşturmak için hücre segmentasyon
      1. Fiji zaten açık değilse, yeniden açın (ve Yardım 'ı tıklatarak güncel olduğundan emin olun > güncelleştirme Değişiklikleri Uygula > Tamam).
      2. Bu zaten yapılmadı ise, makro TissueCellSegmentMovie. IJM (http://adm.irbbarcelona.org/matlab/TissueCellSegmentMovie.ijm) indirin.
      3. Sürükle ve Fiji içine bu script bırakın. Bleach tarafından düzeltilmiş dosyayı açın (örn., ek dosya 3' ten TestMovie2_bleach. tif, Ayrıca bkz: 2.2.1).
      4. Resim > renk > bölünmüş kanallar'ı tıklatarak çamaşır suyu tarafından düzeltilmiş dosyanın kanallarını bölün. Görüntü > Ayarla > Parlaklık/kontrastseçeneğini tıklatarak açık hücre anahatlarını sağlamak için membran kanalını ayarlayın.
      5. Yüklenen komut dosyasını, açık komut dosyasında Çalıştır simgesine basarak seçilen TLM 'nin etkin hücre membran kanalına çalıştırın. Gauss bulanıklığını 1,500olarak ayarlayın. Hücre algılama duyarlılığı-1 ' e ayarlayın ve Tamam' ı tıklatın. 40X hedefiyle elde edilen TLMs için tahmini gürültü toleransı 'nı ~ 8 olarak ayarlayın ve Tamam'ı tıklatın.
        Not: Güzel bir hücre maskesi almak için, yukarıdaki bu parametreleri değiştirmeyin. Diğer hedefler için farklı parametreler gerekebilir. TLM 'de arka plan temizleyici, düşük tahmini gürültü toleransı gereklidir.
      6. Oluşturulan bir hücre maskesi, analiz edilen TLM 'de ve Particlestack (G)adlı yeni bir pencerede görünür. Ayrıca, eylem gerekli adlı küçük bir pencere görüntülenir. TLM 'deki hücre maskesinden, yalnızca TLM 'nin merkezindeki hücrelere odaklanın ve TLM boyunca tam ve iyi tanımlanmış anahatlar sağlayabilirler.
      7. Seçili hücreler yapay/ekstra hücre anahatları içeriyorsa, TLM 'de gerekli eylem adlı birleştirme aracı penceresini kullanın. İkincisi için, penceredeki yönergeleri izleyin.
        Not: Hücre anahatlarının iyi tanımlandığından emin olun ve bir TLM 'de gerçek hücre membranlarına karşılık gelen herhangi bir kesinlik sonraki analizleri etkileyebilir. İstenmeyen hücrelerin kaldırılması gibi ek tweaks ve değişiklikler, daha sonra Surface Manager aracını kullanarak yapılabilir (aşağıdaki eğitimde özetlenmiştir).
      8. Merkezde seçili hücreler güzel gerçek hücre membranlarına karşılık geldiğinde, ParticleStack bir. tiff dosyası olarak kaydedin > > Tiff olarak kaydedin . Oluşturulan hücre maskesinin yüklenmesini ve Surface Manager 'da daha önce 1.1.3 ve 1,2 bölümünde (Ayrıca 2.2.3 ve 2,3 bölümlerde ayrıntılı olarak açıklanan) yapılan aktomiozin analizini gerçekleştirmek için devam edin.
    3. Oluşturulan hücre maskesinin Surface Manager 'a yüklenmesi
      1. Yüzey Yöneticisi eklentisi zaten kullanılan Fiji kurulumunda yüklüyse, adım 2 ' ye geçin. Yoksa, Viktorinova et al.16takip edin. Geliştiriciler için sadece kaynak kodu da15kullanılabilir.
      2. Eklentiler segmentasyon Surface Manager (3B)öğesini tıklatarak yüzey Yöneticisi 'ni açın.
        Not: Surface Manager penceresi sağdaki birkaç eylem düğmelerini ve soldaki boş bir pencereyi görüntüler. Tüm eylem düğmelerini görmek için, pencerenin yüksekliğini/genişliğine uzatmak için gerekli olabilir. Zaman dilimlerinin z-dilimleri olarak görüneceğini unutmayın.
      3. İlgili ParticleStack. tif dosyasını, dosya > aracılığıyla Surface Manager 'a açın ve açılacak resmi seçin (örn. ek dosya 3' ten ParticleStack2. tif).
      4. Surface Manager 'da, anahat görüntüsünü oku düğmesini tıklatın ve jakarlı dizinini% 60 olarak ayarlayın.
        Not: ParticleStack. tif dosyasının yüklenmesi, bilgisayar gücüne bağlı olarak birkaç dakikaya kadar sürebilir.
      5. Yüklendikten sonra her hücre bir S numarası ile atanır ve yüzey Yöneticisi penceresinin sol kısmında görünecektir (şekil 7a).
        Not: Tüm hücrelerin anahatları ve hücre adlarını göstermek için, yüzey Yöneticisi penceresinin alt kısmındaki Tümünü göster ve etiketleri göster onay kutularını işaretleyin. Hücre numaraları kendi doğruluğu için kontrol edildikten sonra bu işlevi kullanmak için önerilir.
      6. İlk S numarasını tıklayın; ParticleStack. tif öğesinden alınan hücre anahattı TLM 'de görünür. TLM genelinde hücre anahat kalitesi için alınan her S numarasını kontrol edin ve yanlış hücre anahatları görüntüleyen istenmeyen hücreleri kaldırın. Bunu yapmak için, hücre anahattı vurgulayın ve düğmeyi tıklatın Delete.
        Not: Aynı zamanda hassas hücre anahatları için düzeltmek ve yeni hücre anahatları eklemek mümkündür. Bu, tartışma bölümünde açıklanmıştır.
      7. Tüm düzeltilmiş hücreleri, diske kaydet düğmesine basarak RoiSet. zip dosyası olarak kaydedin.
        Not: Oturumun kesintiye uğraması gerekiyorsa, RoiSet. zip dosyasını daha sonra Surface Manager 'a yüklemek mümkündür: Dosya üzerinden Fiji 'de BIR tlm açın > açın ve bir TLMseçin. Surface Manager 'ı aşağıdaki gibi açın: Plugins segmentasyon Surface Manager (3D). Diskten yükle düğmesini tıklatarak ve uygun roiset. zip dosyasını (örn. TestMovie2_RoiSet. zip) seçerek Ilgili roiset. zip ' i yükleyin. Yüklenen hücre maskelerinin yüklenmiş TLM 'ye karşılık geldiğini iki kez kontrol edin.
  3. Yüzey yöneticisinde akomyosin darbeleri Analizi
    Not: Fiji açın ve bir TLM ve karşılık gelen hücre maskesi Surface Manager 'da açık olduğundan emin olun. Fiji yüklü ve güncel ve Surface Manager Plugin (https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager) yüklü olduğundan emin olun.
    1. Dosya > Open ile bir TLM açın ve açmak için bir TLM seçin (örn., TestMovie2_bleach. tif). Eklentiler segmentasyon Surface Manager (3D)aracılığıyla yüzey Yöneticisi eklentisi yükleyin. Burada öğretici oluşturulan kaydedilmiş hücre maskesini yükleyin (örn., ParticlesStack2. tif) dosya > ve seçin bir hücre maskesi (örn., ParticlesStack2. tif). İlgili YG 'yi yükleyin (örn., TestMovie2_RoiSet. zip).
    2. Seçilen TLM 'de ilgilendiğiniz kanala geçin.
      Not: Kanallar arasında ayrım yapmak için TLM 'nin etrafında belirtilen renk kodunu izleyin.
    3. Yüzey Yöneticisi 'nde, Ortalama gri değer Slice tarafından Slice (şekil 7b) adlı pencereyi elde etmek için İstatistikler düğmesini tıklatın. Belirtilen hücre içindeki belirli bir analiz kanalındaki aktomiozin sinyallerinin ortalama/medyan yoğunluğu değerlerinin zaman içinde özetlendiğini, aynı zamanda hücre alanı ve hücre şekline ilişkin diğer parametrelerin de görüntüleneceğini unutmayın.
      Not: Yoğunluk değerleri A.U.; hücre alanı pikseldir ve kare mikrometre içine dönüştürülmesi gerekir.
    4. Elde edilen değerleri bir elektronik tablo dosyası olarak kaydedin: Istatistik penceresine tıklayın, dosya ≫ farklı Kaydet.
      Not: Elde edilen istatistiksel değerleri daha sonra aşağıdaki gibi doğrulamak mümkündür. Fiji 'de çamaşır suyu düzeltilmiş TLM açın. Yüzey Yöneticisi 'ni açın. Diskten yük düğmesine basarak ve dosyayı açmak için karşılık gelen RoiSet. ZIP TLM yükleyin. Hücre anahatları olan kaydedilmiş maske yüklenir ve hücrelerin adları sol yüzey Yöneticisi penceresinde görünecektir. İstatistik değerleri için istatistik düğmesini tıklatın.
      Not: Bireysel hücre içi akomyosin sinyallerinin manuel analizineilişkin olarak, doku ölçeğinde alt hücresel akomyosin sinyallerinin manuel olarak analizini yapmak mümkün değildir. Tartışma bölümünde vurgulanacak şekilde, yarı doku ölçeğinde bireysel akomyosin sinyallerinin analizi için optimizasyon gereklidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokol bilim adamlarının epitel dokularda akomyosin ağlarının davranışlarını araştırmasını sağlar. Bu sadece yerel hücresel ölçekte (birkaç hücre) aktomiozin davranışının ayrıntılı bir analizi doku ölçeği (birçok hücre) benzer bir analiz ile birleştirildiğinde mümkündür. Ancak, epitelyal dokular genellikle kavisli ve bu dokuların ince bir tabaka çıkarma daha önce kolayca mümkün değildi, Drosophila yumurta odalarında gösterildiği gibi (Şekil 1). Burada sunulan protokol, kullanıcıların hem bu ölçeklerde (Şekil 2) aktomiozin davranışını analiz etmeyi açıklayan basit talimatlar sağlar.

Bu protokolün ilk bölümü, Surface Manager eklentisini kullanarak akomyosin darbeleri analiziyle ilgili talimatlara odaklanır (Şekil 3). Ayrıca, yerel hücresel ölçekte bireysel akomyosin davranışını el ile nasıl çözümleyebileceğini de açıklar (Şekil 4). Bu protokolün ikinci bölümü, elipsoid yüzey projeksiyon eklentisini (Şekil 5 ve Şekil 6) kullanarak ince bir epitelyal doku katmanının nasıl ayıklanacağını açıklar. Ancak o zaman yüzey Yöneticisi eklentisini kullanarak doku ölçeğinde akomyosin darbeleri analiz etmek mümkündür (Şekil 7). Temsilcilik sonuçları ve dönen kontrol ve statik fat2 mutant Drosophila yumurta odalarındaki aktomiozin davranışının karşılaştırılması yerel hücresel ve doku ölçeğinde Şekil 8 ' de ve karşılık gelen Film 1' de gösterilir. Film 2, Film 3, film 4, film 5ve film 6 (Ayrıntılar için bkz: Şekil 8).

Figure 1
Şekil 1: eğri doku yüzeyinin ince tabakasının seçici olarak çıkarılması. (A) çevresel olarak kavisli epitellerde akomyosin ağları ile ilgili yeterli bilgi elde etmek için, kavisli folikül epitelyum (gri) için gösterildiği gibi görünür bir dokunun çoğunluğu üzerinde derin bir z yığını (pembe) elde etmek gereklidir. Drosophila yumurta odaları. (A ') Ancak, böyle bir z-yığını basit bir projeksiyon folikül hücrelerde tüm aktomiozin ağlar karıştırma yol açar. Myosin II MRLC ile görselleştirilen:: GFP (yeşil) güçlü ifade iç (apical) bu tür bir z-projeksiyon folikül hücrelerin bölge ve bazal (dış) yan, neredeyse hiçbir bilgi gösterir nerede Myosin II sağlam bir düzlemsel hücre polarite fenotipi görüntüler, ama onun sinyal yoğunluğu düşük12. Gibi panel a 'gösterildiği gibi karıştırma önlemek için, biz bir Kullanıcı dostu geliştirdik, Fiji tabanlı eklenti BigDataViewer18 Içinde ellipsoid yüzey projeksiyon denilen (B) tanımlı, ince bir tabaka seçici ekstraksiyon (pembe ), folikül epitelin bazal (dış) tarafındaki seçilmiş bir ekstraksiyonda myosin II (yeşil) için gösterildiği gibi eğri epitelyuma (B ') göre aktomiozin. A ' ve B 'panellerde MYOSIN II (MRLC:: Gfp) sinyalinin farkını karşılaştırın. Bpanelinde MYOSIN II düzlemsel polarize desen unutmayın. Hücre anahatları kırmızı renkte. Ön taraf solda. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .

Figure 2
Şekil 2: yerel hücresel ve doku kantarlarında düzlemsel polarize aktomiozin ağı. Farklı ölçeklerde aktomiozin görüntülenmesi, farklı sayıda epitelyal hücrelerin analizini sağlar, yani (A) yerel hücresel ölçekte 15 hücreye kadar ve (B) 50-100, kültürlü folikül epitelin doku ölçeğinde hücreler Drosophila yumurta odaları. Nonmuscle Myosin II MRLC ile görselleştirildi:: GFP (yeşil) ve kullanılan transjenik hat genotipi malzeme tablosundabelirtilir. Hücre anahatları Magenta şeklindedir. Ön taraf solda. Ölçek çubukları = 5 μm (A); 50 μm (B). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: yerel hücresel ölçekte yüzey yöneticisinde Myosin II darbeleri analizine bir örnek. (A) bir parçacık yığını Surface Manager 'a yüklenir. TLM 'deki tanımlanan tüm hücrelerin yüzey Yöneticisi penceresinde göründüğünü unutmayın. TLM boyunca tüm istenmeyen veya tamamlanmamış hücreleri silmek önemlidir. (B) Seçilen hücreler Için MYOSIN II (mrlc:: Gfp) üzerinde elde edilen Istatistikler, yüzey Yöneticisi 'nde Slice tarafından ortalama gri değeri Slice olarak adlandırılan pencerede gösterilir. MRLC:: GFP yeşil renkte gösterilir, hücresel membranların kırmızıdır. Ön taraf solda. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: yerel hücresel ölçekte bireysel Myosin II sinyallerinin manuel analizine örnek olarak. (A) seçilen 30 s uzunluğundaki alt film (B) zaman projeksiyonunun yanında yerleştirilir. Zaman projeksiyonunun üzerine Myosin II (MRLC:: GFP) daha uzun yörünge hatları gösterir (bkz. Panel B) bireysel hücreler içinde tek bir zaman diliminden daha (bkz. Panel A). Hücrelerdeki bireysel çizgiler, yumurta odalarının anterior-posterior eksenine göre açısal yönü için analiz edilmelidir. (C) Fiji 'nin 0 ° – 360 ° değil, sadece 0 ° – 180 ° ' ye kadar işaret eden sinyaller için 0 ° – 179 ° ' ye kadar ölçmez olduğunu unutmayın. 0 ° ' nın analiz edilen bir görüntünün sağında atipik olarak yerleştirildiğini unutmayın. (D) bu bilgilere dayanarak, (pembe) veya karşı (sarı), belirli bir yumurta odasında epitel rotasyon yönü ile hareket hatları bir içinde mevcut olup olmadığını analiz sinyalleri simetri kırma belirlemek için Binned olmalıdır ve sonra da analiz edilen dokuda birden fazla hücre için. MRLC:: GFP yeşil renkte gösterilir, hücresel membranların kırmızıdır. Ön taraf solda. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: bir elipsoid doku ölçeğinde uygun üretme örneği. Bigdataviewer 'da elipsoid yüzey projeksiyon eklentisini kullanarak bir yumurta odasına elipsoid sığdırmak için, taranan dokuların çoğunu içeren bir sınırlayıcı kutu (a) tanımlamak için gereklidir. Daha sonra, en uygun elipsoid uygun nesil için bir önkoşul olan sinyal noktalarını tanımlamak önemlidir (B). (C) elipsoid uygun değil ve güzel bir yumurta odası çevreleyen değil, bu (D) kötü doku tabakası ekstraksiyon sonuçlanır. Şekil 6' da çıkarma ve daha sonra projeksiyon sonuçlarına bakın. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: yanlış ve optimum elipsoid uyum ve ilgili yüzey projeksiyonlarının karşılaştırılması. (A) elipsoid düzgün takılmadığında, (B) son yüzey projeksiyonu, analiz edilen dokunun ince tabakasında tam sinyal verisi sağlamayacaktır. (C) ancak, optimum şekilde takılırken, dokuda ince bir tabakanın eşit sinyal algılanmasını garanti eder. (D) optimum yüzey projeksiyonunun, zamanla Şekil 8' de gösterildiği gibi ayrılabilen, yüzeye yansıtılan bir z-yığını olarak birkaç ince katman içerdiğini unutmayın. Myosin II sinyalleri (MRLC:: GFP, beyaz) ve membran sinyalleri (beyaz) başlangıçta projeksiyon önce birleştirilir (paneller A ve C), ancak yüzey projeksiyon kendisi üzerine, bu kanallar AYRıLıR (myosin II projeksiyonları bkz: panellerde B ve D). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: doku ölçeğinde yüzey yöneticisinde Myosin II darbeleri analizine bir örnek. (A) bir parçacık yığını Surface Manager 'a yüklenir. TLM 'deki tanımlanan tüm hücrelerin yüzey Yöneticisi penceresinde göründüğünü unutmayın. TLM boyunca tüm istenmeyen veya tamamlanmamış hücreleri silmek önemlidir. (B) zaman içinde seçilen hücreler Için MYOSIN II (mrlc:: Gfp) darbeleri (ortalama veya medyan) elde edilen Istatistikler, yüzey yöneticisinde dilim tarafından orta gri değer dilimi olarak adlandırılan pencerede gösterilir. Daha güçlü Myosin II noktaların içsel Myosin II yoğunluğunun son ölçüsünü etkileyebilecek olduğunu unutmayın. Bu Myosin II noktaların hücre anahattı ötesinde bir hatalı hücre anahat tanımı oluşturulan hücre maskesi olduğu geçirmek için görünebilir sorunu sonuçlanır. MRLC:: GFP yeşil renkte gösterilir, hücresel membranların kırmızıdır. Ön taraf üstte. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8: Drosophila folikül epitelyuma BIR myosin II ağının temsili sonuçları. Dinamik myosin II (mrlc:: Gfp) davranışı (A ve B) yerel hücresel ölçekte ve (C-F) denetim ve fat2 mutant Drosophila Egg Chambers için doku ölçeğinde temsili örnekler. Kullanılan genotiplerle ilgili ayrıntılı bilgi için malzeme tablosunu görün. MRLC:: GFP sinyallerinin (yeşil) kontrol yumurta odalarının anterior-posterior (AP) eksenine dik hareket ettiğini unutmayın. Bu polarite fat2 mutant yumurta odalarında kaybolur ve anisotropik MYOSIN II darbeleri/salınımlar12yol açar. Küçük MRLC el ile Analizi:: GFP sinyalleri (~ 300 μm) ve protokolde açıklandığı gibi onların açısal yönlü hareketinin miktarının, MRLC simetri kırma:: GFP sinyalleri epitelyal yönüne karşı bir tercih ile görülebilir bir analiz yumurta odası12 (Şekil 4) döndürme. İlgili filmler şunlardır: panel A = Film 1, panel B = Film 2, panel C = Film 3, panel D = film 4, panel E = film 5, ve panel F = Film 6. Hücre anahatları Magenta olarak gösterilir. Ön taraf solda. Ölçek çubukları = 5 μm (A ve B) ve 50 μm (C-F). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Yerel hücresel ölçekte kısa süreli yüksek hızlı görüntüleme için önerilen Parametreler:
ı. Kültür ortamına serbestçe yerleştirilen ilgi dokusu (Yani kapak fişi, esnek battaniye vb.)
ıı. 63x sayısal diyafram ile su amacı > = 1,3
ııı. İnverted Konfokal mikroskop
ıv. Tek düzlem
V. 6-12 s zaman aralıkları
Vı. 5-10 dakika TLMs
Vıı. 100MB 'a kadar TLM başına veri depolama gereksinimi
Doku ölçeğinde uzun süreli düşük hızlı görüntüleme için önerilen Parametreler:
ı. Kültür ortamına serbestçe yerleştirilen ilgi dokusu (Yani kapak fişi, esnek battaniye vb.)
ıı. 40X su hedefleri ve sayısal diyafram > = 1,3
ııı. Ters dönen disk mikroskobu
ıv. z-yığınları bir yumurta odasının yarısını elde etmek
V. 60 s zaman aralıkları
Vı. En az 30 dakika TLMs
Vıı. Veri depolama gereksinimi CA. 1GB

Tablo 1: önerilen görüntüleme parametreleri.

Movie 1
Film 1: Myosin II (MRLC:: GFP) temsilcisi dinamik davranışı bir kontrol Drosophila yumurta odasında hücresel ölçekte. Unutmayın ki MRLC:: GFP (yeşil) yumurta odalarının AP eksenine dik hareket etmeyi tercih eder. Hücre anahatları Macenta içinde. Bazal görünümü. Ön taraf solda. Ölçek çubuğu = 5 μm. Bu videoyu görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın. İndirmek için sağ tıklatın.

Movie 2
Film 2: Myosin II (MRLC:: GFP) temsilcisi dinamik davranışı Fat2 mutant Drosophila yumurta odasında hücresel ölçekte. Unutmayın ki MRLC:: GFP darbeleri (yeşil) ve artık statik yumurta odaları AP eksenine dik hizalanmış düzlemsel. Hücre anahatları Macenta içinde. Bazal görünümü. Ön taraf solda. Ölçek çubuğu = 5 μm. Bu videoyu görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın. İndirmek için sağ tıklatın.

Movie 3
Film 3: Bazal Myosin II (MRLC:: GFP) temsilcisi dinamik davranışı bir kontrol Drosophila yumurta odasında doku ölçekte. Sadece ince bazal (dış) MRLC:: GFP tabakasının, bir yumurta odasının folikül epitelinin neredeyse yarısından elde edildiğini unutmayın. MRLC:: GFP yeşil ve hücre anahatları Magenta bulunmaktadır. Elde edilen MRLC ayrıntı düzeyinde fark dikkat:: GFP sinyal davranışı burada (doku ölçeği temsil eden) Film 1 (hücresel ölçek temsil eden) kıyasla. Ön taraf solda. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu videoyu görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın. İndirmek için sağ tıklatın.

Movie 4
Film 4: Bir Fat2 mutant Drosophila yumurta odasında doku ölçeğinde bazal MYOSIN II (MRLC:: Gfp) temsilcisi dinamik davranışı. Not MRLC:: GFP (yeşil) güçlü bir fat2 mutant yumurta odasının folikül epitelin neredeyse yarısını bazal tarafında darbe ve epitelyal rotasyon teşvik etmek için gerekli senkronize kuvvet oluşturmak için başarısız. Hücre anahatları Macenta içinde. Ön taraf solda. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu videoyu görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın. İndirmek için sağ tıklatın.

Movie 5
Film 5: Bir kontrol Drosophila yumurta odasında doku ölçeğinde apikal myosin II (mrlc:: Gfp) temsilcisi dinamik davranışı. Sadece ince bir mrlc:: Gfp tabakası, bir yumurta odasının folikül epitelinin neredeyse yarısını apikal (iç) taraftan çıkartılır. Unutmayın ki mrlc:: GFP (yeşil), folikül epitelin bazal tarafına kıyasla ( Film 3' te gösterildiği gibi) apikal tarafında farklı dinamik davranışlar gösterir. Hücre anahatları Macenta içinde. Ön taraf solda. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu videoyu görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın. İndirmek için sağ tıklatın.

Movie 6
Film 6: apikal myosin II (mrlc:: Gfp) temsilcisi dinamik davranışı Fat2 mutant Drosophila yumurta odasında doku ölçeğinde. MRLC değiştirilmiş dinamik davranış:: GFP (yeşil) bir statik fat2 mutant yumurta odasının folikül epitelin neredeyse yarısında ince bir apikal bölgeden çıkarılan. Hücre anahatları Macenta içinde. Ön taraf solda. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu videoyu görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın. İndirmek için sağ tıklatın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yumurta odalarının diseksiyonu ve kültürü için kritik adımlar ve sorun giderme

Eğer çok fazla sinekler küçük bir şişeye yerleştirilir, sinek gıda 2 – 3 gün sonra büyük miktarlarda besleme larvaları ve yetişkin sinek gıda sıkışıp almak sinek nedeniyle çamurlu açabilirsiniz. Böyle bir durumda, bu sineklerin geri kalanını taze yiyeceklerle yeni bir şişeye çevirin ve sayısını küçültür. Özellikle, gıda sıkışmış kadın hariç.

Schneider karışımı (SM) önceden hazırlanmalı ve 4 °C ' de ~ 14 gün depolanabilir. Eski bir karışımı yumurta odaları yüzeyine zarar verebilecek kristaller içerebilir unutmayın. Her zaman yeni eklenen insülin ile SM karıştırın ve oda sıcaklığına ulaşmak için yeterli zaman sağlar. Bu soğuk şok karşı yumurta odaları korur, hangi mikrotübüller büyüme üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olabilir ve sitroiskelet düzlemsel hizalama (gelişmekte olan Drosophila kanat19görüldüğü gibi).

Yumurta odaları ve seçilmiş ovarioles çok kırılgan ve küçük büyüklüğü nedeniyle, SMı (insülin ile SM) içinde yüzen olabilir. Onları kendiliğinden SMı lavabo izin tavsiye edilir. Onlar da genellikle diseksiyon forseps/kaktüs aracına sopa. Böyle bir durumda, onları hafifçe SMı hareket ettirerek diseksiyon cihazlardan kendilerini serbest bırakın. Her zaman doğrudan sıkılması ve dokunmadan kaçının. Gerekirse, bu yumurta odaları/ovarioles diğer protokolden hariç.

Bir diseksiyon stereokapsam hasarlı yumurta odaları/ovarioles tanımlanması için güvenilir değildir, yumurta odaları/ovarioles bir Konfokal/iplik disk mikroskop altında bir CellMask veya FM 4-64 boya kullanılarak kontrol edilmelidir. Hasarlı yumurta odaları, hasarlı yumurta odası dokusu arka planına kıyasla aşırı renklendirme gösterir. Asla güçlü boya yamaları ile bir TLM elde.

Yumurta odalarının in vitro canlı görüntüleme için kritik adımlar ve sorun giderme

Eğer serbestçe SMı içinde yumurta odaları yerleştirilmiş hala hareket, hala kas levha ve enkaz SMı yüzen herhangi bir göz ardı kalıntıları olup olmadığını görmek için Konfokal mikroskop altında tekrar kontrol edin. Bunları kaldırın ve yeniden deneyin. Yumurta odaları,% 90 istikrarlı ve sonraki görüntüleme sırasında hareketli olmalıdır.

Seçilen yumurta odası/ovariole stabil olduğundan emin olmak için, 1 dakika boyunca yüksek hızlı görüntüleme (6 s aralıkları) kullanın. kararsız yumurta odaları bu noktadan hareket ederdi. Ancak, görüntülenmiş yumurta odasının potansiyel olarak beklenmeyen bir hareketini yavaşça düzeltebilmek için tüm zaman aşımı kaydını izlemek tavsiye edilir. Bu mikroskopik sahne hareket ettirerek yapılabilir/tablo, hangi kültürlü yumurta odaları ile Petri çanak tutar/ovarioles, orijinal konuma böylece faiz yumurta odası yeniden görüntülenmiş, odaklı pencere.

Görüntülenmiş yumurta odasının ani ve beklenmeyen bir hareketi görünürse görüntülemenin durdurulmayı durdurun. Mikroskop masasının yastıklamasını kontrol edin ve satın alma süresi boyunca mikroskop yakınında dolaşmadan kaçının, bu da neden olduğu titreşimler nedeniyle görüntü alımının bozulmasına neden olabilir.

Hücre membranı boya 30 dakika sonra görünür değilse ve kullanılan lazer hattı doğruysa, boya daha ekleyin ve bir sonraki satın alma için konsantrasyonunu artırın.

Eğer akomyosin sinyalleri bulanık görünüyorsa, kullanılan hedefin NA 'yı kontrol edin. 1,3 'den düşük bir NA, görüntüleme kalitesini azaltacaktır. Ayrıca, kullanılan daldırma yağı su 63x hedefe doğru uygulandığından emin olun. Gerekirse ekleyin veya değiştirin.

Yumurta odaları küçültmek ve gözlenen hücre zarları deforme olursa, kapak düzgün kapalı olup olmadığını kontrol edin. Kapak eksik veya düzgün kapalı ise, yumurta odaları satın alma süresi boyunca SMı buharlaşma nedeniyle kuru olabilir.

Yumurta odalarının dönüşü yavaşlarsa veya durursa, lazer gücünü azaltın. Yumurta odasında bir delik görünüyorsa, lazer tarafından yandı. Lazer gücünü azaltın.

Eğer aktomiozin TLM satın alma sırasında 2 dakika sonra çamaşır suyu sinyalleri, lazer gücünü azaltmak ve mikroskop yazılım sinyal amplifikasyon artırın.

Bir yumurta odasının folikül epitelin bir TLM elde edilmiştir sonra, bu yumurta odasının aynı doku bölgesinde tekrar görüntüleme önlemek için tavsiye edilir. Ancak, yumurta odaları AP ekseninin etrafında döndürülürken, 30 dakika sonra bu hasarlı yumurta odasını kullanarak bir TLM satın almayı tekrar etmek mümkündür. Bir yumurta odasında folikül Epitelyumu görüntülemede, diğer yumurta odaları aynı ovariole veya SMı 'de başka bir ovariole içinde bulunsa bile ağartılmış/hasar görmez.

Tüm bu gereksinimler karşılanırsa, başarılı bir şekilde görüntülenmiş yumurta odalarının yüzdesi 6 – 8 aşamalarında% 90 –% 100, 3 – 5 aşamalar için% 50 –% 60 ve 1 – 2 arasında% 20-% 30 ' a kadar olmalıdır. Başarısızlık özellikle yumurta odaları hareketi veya onların diseksiyon/manipülasyon sırasında onlara zarar kaynaklanmaktadır.

Kritik adımlar ve veri işleme için sorun giderme

Fiji 'de sağlanan komut dosyasını kullanarak maske oluşturma sırasında, bir TLM gerçek hücre membranlarını yansıtmaz oluşturulan hücre anahatları bir yeri vardır olabilir. Bu genellikle yüksek arka plan gürültüsü neden olur, özellikle boyalar hücre zarları leke kullanıldığında. Böyle bir durumda, istenmeyen hücrenin sıkıcı düzeltilmesini önlemek için oluşturulan maskeyi özetleyen, segmentasyon yeniden çalıştırın ve parametreleri en uygun şekilde ayarlayın. Bu, tahmini gürültü toleransı parametresini ayarlayarak yapılabilir.

Hücre anahatları içeren ParticleStack. tif dosyalarından birini Surface Manager 'a yüklerken, yükleme süresi doğrusal olarak hücre anahatları sayısına göre ölçeklenir ve birkaç dakika sürebilir. Yükleme bozulur veya yanlış ise, tekrarlayın. Yükleme penceresinin odağı olduğundan ve başka bir program kullanılmakta olduğundan emin olun.

Bazen bir hücre anahattı bazı çerçevelerde düzeltilmesi gerekir; Böyle bir durumda, fırça düğmesini kullanın. Fareyi hücre membranı etrafında sürükleyerek, belirli bir çerçevede doğru hücre anahattı çizin. TLM farklı bir çerçeveye taşıyın ve sonra düzeltme ile zaman dilimine dönün: yanlış hücre anahat şimdi değiştirilmesi gerekir. Ardından, bunu düzeltmek için bir sonraki kareye tekrar gidin. Fırça aracı şimdi silme moduna geçer. Gerekirse, varolan hücre anahattını iterek ve sonra yeni bir hücre anahattı oluşturmak için + Ekle düğmesine basarak bir sonraki zaman dilimindeki anahatları düzeltin. Yüzey Yöneticisi penceresinden eski S numarasını silin ve gerekirse Yeniden Adlandır düğmesine basarak yeni hücre anahattı yeniden adlandırın.

Bir TLM boyunca önemli bir hücrenin tamamı eksikse, seçimini kaldırmaçokgeni'ne basarak yeni bir maske anahattı oluşturun. Hücre membranı boyunca tıklayarak TLM 'nin ilk karesinde yeni bir hücre anahattı oluşturun. Ardından, TLM 'nin son karesine gidin ve seçili hücre için aynı şeyi yapın. Filmi zamanında çalıştırarak, hücre anahatları interpolasyonlu olacaktır. Gerekirse fırça aracıyla düzeltin. Bittiğinde, + Ekle düğmesine basın ve Yeniden Adlandır düğmesine basarak hücre anahattı yeniden adlandırın. Yeni bir hücre anahat oluşturmak için daha fazla puan/tıklama, daha iyi interpolasyon çalışır.

Epitelyal dönme yanı sıra, TLD 'Ler bazen istenmeyen hareketinden etkilenir. Bu nedenle, bu TLMs böyle doku drift için düzeltmek için tavsiye edilir. Bunu yaparak, TLMs Ayrıca yumurta odalarının epitelyal dönüşü için düzeltilmiştir ve hücre zarları katı hale gelir. Bu, akomyosin sinyallerinin manuel analizini kolaylaştırır. Ancak, böyle bir yaklaşım bilim adamlarının gözlenen akomyosin sinyalleri hareket veya hücre membranı göreli statik olup olmadığını ayırt etmek için izin vermez. Akomyosin sinyallerinin statik ve aktif hareketleri arasında bir ayrım böyle bir analizin amacı ise, hiçbir doku drift düzeltmesi uygulanmamalıdır. Biz aktomiozin sinyalleri çoğunluğu aktif hücre membranı göreceli olarak hareket ve bunların sadece küçük bir kısmı statik görünür bulundu.

Alt hücresel akomyosin sinyallerinin analizi için kritik adımlar ve sorun giderme

Oluşturulan istatistikler, aykırı değerler içeriyorsa, tüm veri kümesine göre son derece düşük veya yüksek değerlerin hücrelerdeki davranışı gerçekten yansıttığını ve eserler olmadığını emin olun. Bu, düşük/yüksek değerin ölçüldüğü zaman, aykırı değerleri içeren hücreyi tanımlayarak ve hücre anahat kalitesini kontrol ederek yapılabilir. Genellikle, bu tür aşırı değerleri yanlış başka bir hücrenin bir kısmını ölçmek arızalı hücre anahatları sonuçlanır. Bu, özellikle büyük Bloblar komşu hücrenin hücre anahatlarıyla çakışırken belirgin olabilir. Böyle bir durumda, hücre anahatları düzeltmek ve ölçümü tekrarlamak için çok önemlidir.

Miktarını kolaylaştırmak için, belirli bir hücre yüzeyinde sinyalleri analiz edin ve tüm hücreler bir alt filmde analiz edilinceye kadar tek tek devam edin. Alt hücresel akomyosin sinyallerinin manuel analizinin sonuçları, bir hücrede simetri kırılması ve belirli bir yumurta odası göstermeyebilir. Biz akomyosin açıkça doku hareketinin < 10% dönen yumurta odaları (aşamaları 6 – 8) göreli simetri kırmak değildir yaşadık. Bu yüzde Stage 412civarında arttı. Ayrıca, bir yumurta odası12' de akomyosin sinyal hareketinin tercih edilen yönünü tanımlamada 5 dakika veya 10 dakika analiz edilip edilmediğini fark ettik.

Eğri dokulardan aktomiozin sinyallerinin seçici olarak çıkarılması için kritik adımlar ve sorun giderme

Bloblar (tanımlanan sinyaller) yanlış boyutu hiçbir blob 'lar neden olur ve program sonraki adımda dondurur. Bu durumda, Force-Fiji çıkın ve yeni eklenti ellipsoid yüzey projeksiyonyeniden başlatın. Program COMPUTEtuşuna bastıktan sonra tepki vermiyorsa aynı işlemi yapın. Bu genellikle uygun olmayan parametrelerin seçildiğini gösteren bir göstergesidir.

Eğer çok fazla Bloblar varsa ve/onlar analiz yumurta odasının bir tarafına doğru konsantre iseniz, bu tasarlanmış elipsoid etkileyebilir ve yumurta odası için doğru uygun sağlamaz. Blob teşhis geri dönün ve yumurta odasının x-, y-ve z-ekseni seçimi ile kombinasyon halinde boyutlarını ayarlamaya çalışın. Uygun olmayan kesme mesafesi ayarları kullanıldığında, iyi bir elipsoid Sığdır oluşturmak için bir başarısızlık da genellikle oluşur.

Elde edilen projeksiyonlar bazen yanlış odaklı görünebilir, ya da belki elde edilen z uçağı aslında yumurta odasının yüzeyine yakın hücre katmanları arasında hareket eder. Bu genellikle elipsoid bir bölge yumurta odasından çok uzak ayarlanır bir kötü sığdırma elipsoid bir işaretidir. Böylece yumurta odası çevresi aynı mesafeyi korur elipsoid sığdırmak için deneyin.

Yöntemin sınırlamaları ve yeni yaklaşımlar

Yumurta odalarının bu ücretsiz kültürü, bir yumurta odasının yüzeyinin ince düzleştirilmesi atlar. Bu amaçla, bu yöntemin avantajları ve dezavantajları vardır. Konfoksel mikroskopi kullanırken, kullanıcıların kısa bir süre için yumurta odalarının çevresi hücrelerde aktomiozin davranışını güvenilir bir şekilde ortaya çıkarır yüksek çözünürlüklü ve yüksek hızlı görüntüleme ile sağlar (5 – 10 dk). Ancak, bunu yaparak, zaman içinde Konfokal mikroskobik ile görüntülenmiş tek bir düzlemin boyutunu sınırlar. Genel olarak, kadar görüntü mümkündür ~ 15 basamaklada yumurta odası başına hücreleri 6-8 ama sadece yaklaşık iki hücre aşamaları 1 – 5 yumurta odalarında. Bu nedenle, bu yöntemi burada sadece yerel hücresel ölçek için uygun olarak tanımlamıştır.

Tek bir konfokaş düzlemin sınırlı boyutundan kaynaklanan bu boyut sınırlarını aşmak için, doku ölçeğinde kullanılmak üzere elipsoid yüzey projeksiyon denilen alternatif bir Fiji tabanlı yaklaşım geliştirdik. Bu, iplik disk mikroskobu ile doku ölçeğinde yumurta odalarının yarı interaktif bir yüzey ekstraksiyonu ile birleştirir. Bu şekilde, akomyosin sinyalleri, analiz edilen bir yumurta odasından 50 ' den fazla-100 hücre için aynı anda elde edilebilir. Bu yaklaşım elde edilen veri (~ giga bayt) çok büyük veri kümeleri üretir dikkat etmek önemlidir, daha düşük bir çözünürlüğe sahip (bir 40X vs. bir 63x amacı kullanır), ve aynı zamanda daha yavaş bir görüntüleme hızı sağlar (o alır ~ 60 s bir yumurta çatal dokusunun yarısını taramak için [aşama 6 – 8] ve bu şekilde, sınırlı konfetit düzlem yönteminden 10X daha yavaştır).

Parametrized yüzeylerden katmanlı projeksiyonları ayıklamak için mevcut diğer yazılımlar ile karşılaştırıldığında, bu protokol için geliştirilen eklenti, sürecin her aşamasında kullanım kolaylığı ve interaktif görsel geribildirim üzerinde duruldu. Chen et al.21tarafından kullanılan MATLAB tabanlı ımsane20gibi diğer araçlar, çok çeşitli parametrized ve nonparametrized yüzey modellerini ve çeşitli projeksiyon yöntemlerini ele alarak odaklanır. Örneğin, ımsane önceden işlenen ve belirli bir şekilde hizalanacak veri gerektirir ve kısmen ara adımlarda dış araçlar gerektirir. Buna karşılık, burada sunulan eklenti herhangi bir 3D/4D/5D görüntü (sıra) bu dış önişleme olmadan Fiji açılabilir kolları. Imsane, MATLAB komut dosyalarını düzenleyerek oldukça yapılandırılabilir (programlanabilir) olmakla beraber, burada tartışılan belirli bir soruna uyarlanmış bir iş akışında en az sayıda seçenek sunuyoruz. Etkileşimli iş akışının her adımı, gerekirse hemen görsel olarak denetlenecek ve ayarlanabilen sonuçlar sağlar.

Bu görüntüleme yaklaşımlarının, yerel hücresel veya doku ölçeği, belirli bir deney için en iyisidir olarak karar, tamamen bilimsel soruya cevap (yani, daha yüksek vs daha düşük çözünürlük; kısa vs uzun edinme süresi) bağlıdır. Bu iki ölçek arasında iyi bir uzlaşma her iki yaklaşımı birleştirmek için olabilir, böylece yarı doku ölçekte akomyosin sinyalleri görüntüleme kazanıyor (yani, 20-30 hücreler). Bu bir iplik disk mikroskop, NA ≥ 1,3 ile bir su 63x lens ve bir yumurta odasının 20-30 hücreleri için z-yığını ayarları kuruldu gerektirir. Bu kadar sığ z-yığını (bir yumurta odasının bir yarısını satın almak için gerekli z-yığını aksine) 60 s altında daha hızlı tarama sağlar. Burada elde edilen zaman, görüntüleme hızını hızlandırmak için ya da bireysel z-yığınları arasında bir örnek kurtarma (zaman interleaves) için tekrarlanan z yığını edinme için kullanılabilir. İkincisi ile, dönen yumurta odaları TLMs daha uzun bir edinme süresi (> 30 dk) elde edilebilir. Bu yarı doku yaklaşımı, akomyosin sinyalleri için yeterli çözünürlüğü ve daha uzun zaman dilimlerinde aynı anda daha fazla hücrenin görüntülenmesi için garanti eder.

Gelecekteki uygulamalar ve vizyon

Her iki tarif yöntemleri (yerel hücresel ve doku ölçeği) basit ve düşük maliyetli bir yaklaşım (mikroskop cihazlar hariç) aktomiozin ağ üzerinde sınırlı yan etkileri ile sağlamak ve uygulanabilir ve kolayca diğer disseke hayvan dokularında benimsenebilir. Burada tek ön koşul bir petri çanak bir ilgi kavisli doku, mevcut transgenes ve işaretçileri veya etiketleme yöntemleri için mevcut bir kültür protokolüdür.

Hafif sac floresan mikroskopisi22ile birlikte, aynı zamanda Toto içinde görüntü aktomiozin makine mümkün (yani, görüntü tam dış çevresel yüzey Drosophila yumurta odaları aynı anda ve daha sonra eklenti ellipsoid yüzey ekstraksiyonkullanarak açılmak). Ancak, akomyosin sinyallerinin yüksek hızda görüntülenmesi için uygunluk açısından çözülmesi gereken birkaç sınırlama vardır, yani 1) düşük nokta erime agaroz veya görüntüleme sırasında bir kapiller yapışması yumurta odaları gömme; ii) yeterli akomyosin sinyal çözünürlüğü sağlamaz kullanılan su lensler düşük sayısal diyafram; iii) yüksek hızlı görüntüleme engelleyen yumurta odaları, çeşitli açıları elde etmek için gerekli ek zaman.

Bu amaçla, epitelyal doku ve kullanılan mikroskobik lenslerin iyileştirilmesi ile tarama hızı gibi mikroskop parametrelerinin arıtması ile, akomyosin makinenin ayrıntılı analizi, gelecekte, etkinleştirmek, öngörülebilir uzun zaman dilimlerinde doku ve Toto ölçekte elde edilecek yüksek çözünürlüklü sonuçlar vaat ediyor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Yazarlar çok Miriam Osterfield için bir yaklaşım Celeste Berg laboratuar4kabul kullanarak yumurta odaları in vitro yaşam görüntüleme onu tavsiye paylaşımı için minnettar. Ayrıca, hücre segmentasyonunu sağlayan Fiji senaryosu için Sebastian Tosi 'ye teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Schneider Medium Gibco 21720-024 [+]-Glutamine
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140-122  [+] 10.000 Units/mL Penicillin [+] 10.000 µg/mL Streptomycin
Fetal Bovine Serum Sigma  F135 Heat inactivated
Insulin Solution Human Sigma  I9278
50 mL Falcon tubes Eppendorf sterile
Millex-GV filter Millipore SLGV033NS 33 mm
Glass Bottom Microwell Dishes MatTek Corporation P35G-1.5-14-C 35 mm Petri dish, 14 mm Microwell, No. 1.5 cover glass
Forceps A. Dumont & Fils  #55
CellMask Deep Red (cell membrane dye) Invitrogen C10046
FM4-64 (cell membrane dye) ThermoFisher/Invitrogen T13320
Depression dissection slide Fisher Scientific 12-560B
Microscopic equipment
Steromicroscope e.g. Zeiss Stemi SV 6
Inverted confocal microscope e.g. Zeiss/Olympus
Spinning disc microscope e.g. Zeiss/Andor
Microscopic glass/cover glass e.g. Thermo Scientific/Menzel Glas
Cactus tool
Wironit needle holder Hammacher 9160020
Cactus spine Echinocactus grusonii/barrel cactus
Drosophila stocks used in the manuscript
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP For detail see Rauzi et al.: Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodeling. Nature 2010, Vol. 468, pg. 1110-1115.
AX3/AX3; sqh-MRLC::GFP/sqh-MRLC::GFP; fat258D/fat2103C For detail see Viktorinova et al.: Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLoS Genetics 2017, Vol. 13, Issue 11, pg. e1007107.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (60), e3679 (2012).
  2. Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68, 207-217 (2014).
  3. Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Ovaries. Methods of Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
  4. Peters, N. C., Berg, C. A. In Vitro Culturing and Live Imaging of Drosophila Egg Chambers: A History and Adaptable Method. Methods of Molecular Biology. 35-68 (2016).
  5. Spradling, A. C. Developmental Genetics of Oogenesis. The Development of Drosophila melanogaster, Volume 1. Bate, M., Arias, A. M. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 1-70 (1993).
  6. Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
  7. Andersen, D., Horne-Badovinac, S. Influence of ovarian muscle contraction and oocyte growth on egg chamber elongation in Drosophila. Development. 143, 1375-1387 (2016).
  8. Pokrywka, N. J. Live imaging of GFP-labeled proteins in Drosophila oocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50044 (2013).
  9. Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, 2467-2473 (2007).
  10. Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 267, 320-341 (2004).
  11. Cetera, M., et al. Epithelial rotation promotes the global alignment of contractile actin bundles during Drosophila egg chamber elongation. Nature Communications. 5, 5511 (2014).
  12. Viktorinova, I., Henry, I., Tomancak, P. Epithelial rotation is preceded by planar symmetry breaking of actomyosin and protects epithelial tissue from cell deformations. PLOS Genetics. 13, e1007107 (2017).
  13. Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Planar polarized actomyosin contractile flows control epithelial junction remodelling. Nature. 468, 1110-1114 (2010).
  14. Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis. Developmental Biology. 393, 209-226 (2014).
  15. Haase, R. Surface manager. Available from: https://git.mpi-cbg.de/tomancaklab/surface_manager (2018).
  16. Viktorinova, I., Haase, R., Pietzsch, T., Henry, I., Tomancak, P. Actomyosin dynamics: Required Software and dependencies. Available from: https://git.mpi-cbg.de/scicomp/viktorinova_et_al_actomyosin_dynamics/blob/master/Software/Software_installation.md#surface-manager-and-ellipsoid-surface-projection-plugins (2018).
  17. Pietzsch, T. BigDataViewer. Available from: https://imagej.net/BigDataViewer (2017).
  18. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
  19. Turner, C. M., Adler, P. N. Distinct roles for the actin and microtubule cytoskeletons in the morphogenesis of epidermal hairs during wing development in Drosophila. Mechanisms of Development. 70, 181-192 (1998).
  20. Heemskerk, I., Streichan, S. J. Tissue cartography: compressing bio-image data by dimensional reduction. Nature Methods. 12, 1139-1142 (2015).
  21. Chen, D. Y., Lipari, K. R., Dehghan, Y., Streichan, S. J., Bilder, D. Symmetry Breaking in an Edgeless Epithelium by Fat2-Regulated Microtubule Polarity. Cell Reports. 15, 1125-1133 (2016).
  22. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics