インクジェットプリンター支援によってテスト自動チェッカー ボード配列および手動で時間を殺す方法抗菌の相乗効果

Immunology and Infection
 

Summary

抗菌相乗効果テストの組み合わせで使用される 2 つ以上の抗生物質の効果を評価するために使用し、は通常 2 つの方法のいずれかで実行されます: 市松模様配列または時間を殺すの試金。ここでは、自動、インク ジェット プリンターによる市松模様配列シナジー技術と古典的な時間殺すシナジー研究を提案します。

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Brennan-Krohn, T., Kirby, J. E. Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method. J. Vis. Exp. (146), e58636, doi:10.3791/58636 (2019).

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Abstract

多剤耐性 (MDR) 病原体の速度上昇を続けて、新しい抗菌薬の開発を上回っている、小説 MDR 菌治療への取り組みがますます必要になっています。このようなアプローチの 1 つは併用療法は、2 つ以上抗生物質はに対して感染症を治療するために使用の 1 つまたは両方の薬の効果がないかだけで。時の組み合わせで、2 つの薬を出す大きい添加剤の効果も相乗的と見なされます。相乗的な活性の in vitro で調査は薬剤の組み合わせの可能な有効性の評価に重要な最初のステップです。2 つのメインの in vitro 相乗効果試験方法が開発されている: 市松模様配列と時間を殺す研究。本稿で示す自動チェッカー ボード配列メソッド インク ジェット印刷技術を使用して、効率と標準的な手動時間殺すシナジー メソッドと同様に、この手法の精度を高めます。自動チェッカー ボード配列は、手動時間殺す研究相乗活性および殺害に追加、補足データを提供しますが、高スループット スクリーニング アッセイとして使用できます。

市松模様の配列は、標準最小発育阻止濃度 (MIC) テスト、細菌が抗生物質の組み合わせに異なる濃度で培養し、一晩インキュベートした後成長阻害の評価の変更です。市松模様配列の手動のパフォーマンスには、面倒でエラーを起こしやすい一連の計算と希釈が必要です。計算とボリュームは、インク ジェット プリンター技術を使用して自動化されている必要な抗生物質原液の塗布、自動化された方法でここで紹介。時間を殺す相乗効果の分析で細菌は一緒におよび個別に関心の抗生物質で孵化、定量培養の 24 時間にわたって間隔でサンプリングします。結果の組み合わせが相乗効果かどうか、それが殺菌、かどうかを決定し、抑制と細菌の殺害時間をかけてデータを提供します。

Introduction

多剤耐性 (MDR) 病原性細菌、特に MDR グラム陰性細菌カルバペネム耐性腸内細菌科 (CRE) などの普及は、成功した抗感染治療ますます限られた選択肢と臨床医を残しています。1、新規抗菌薬発見2,3の低迷のペースによって悪化問題。組み合わせで使用されている 2 つの薬が大きいよりも添加剤効果を発揮を抗菌薬の相乗効果は、これらの細菌が 1 つまたは両方の抵抗力がある時でさえ、MDR 細菌の治療で使用するため既存の抗生物質をサルベージの可能性を提供します抗生物質個別に。研究者 (自動化された相乗的な活性の証拠のための興味の効率的に画面抗菌薬併用するを許可このペーパーで説明したテクニックを提供体外のシナジーを併用する場合、テストの 2 つの相補的な方法市松模様の配列法) し、さらに抑制および選考 (マニュアル時殺菌法) で特定された有望な組み合わせによって示される殺害の動態を評価します。

In vitro における相乗効果をテストの最も一般的に使用される方法の 1 つは市松模様の配列分析、細菌に対して 2 種類の抗生物質の阻害活性を分離、最小発育阻止濃度 (MIC) テストの変更をテスト濃度の組み合わせ45の範囲。2 つの薬を一緒に使用する添加物の活動をより発揮、組み合わせは相乗6と見なされます。ただし、市松模様配列を手動で設定、一連計算と、骨の折れるとヒューマン エラーに対する脆弱性希釈、分注の手順にはが含まれます。これらの制約は主に抗生物質の組み合わせと分離された細菌の小さな数字の回顧的評価テストの相乗効果の使用を制限する効果があったし、の結果が常に研究7の間で一貫性のあるされていません。 8,9,10,11。さらに、複雑な相乗効果のテストの臨床微生物学研究室でその入手不可能と組み合わせ療法12,の臨床試験からの in vitro 相乗効果試験データの仮想不在貢献しています13

以前インク ジェット印刷技術を使用して、正確に私たちの研究室で開発した自動化されたマイクのテスト手法の使用し、一貫して少量を分配しましたが、効率性と市松模様の配列法のスループットを高めるためにマイクロタイター プレート14の井戸に抗生物質原液のプラットフォームには、複雑な計算や複数の分注ステップの必要があります。関連ソフトウェアを計算し、ユーザーは単に必要な濃度範囲を入力する場合市松模様の二次元配列を作成するために抗生物質の適切なボリュームと抗生物質の原液濃度を分配します。我々 は、当初 CRE 株15のコレクションに対してこのメソッドをテストし、その後16コリスチン耐性菌に対する活性のコリスチンを含む組み合わせのテストに焦点を当てています。コリスチンは一般に MDR グラム陰性病原菌17,18, とコリスチンの抵抗の治療で使用するために予約の最後の手段の薬剤既に MDR 細菌耐性がほぼパン19、最適なレンダリングします彼らは敏感な個別に薬を使用して新規治療戦略の開発のための候補者。コリスチンとタンパク質合成阻害の抗生物質ミノサイクリンの組み合わせがそれぞれ、これらの薬剤に抵抗力がある個別に推定上あったコリスチン発揮を阻害するので株に対しても、相乗効果の非常に高い率を持っていたことがわかった構造の違いもコリスチン耐性菌に対する効果。本稿では例として使用するこの組み合わせを選択しました。注記のうち、相乗効果のテストも使用できます個別に効果的な両方である 2 つの薬の効果を評価します。

自動チェッカー ボード配列メソッドを容易に急速に、高スループットの相乗試験。ただし、市松模様の配列メソッドには制限があります。変更されたマイクの試金としての細菌増殖抑制だけであり、殺害ではなくデータを提供し、時間をかけて効果が抗生物質のないデータを提供しません。対照的に、時間を殺すシナジー アッセイのマニュアルのパフォーマンスより労働集約的が 24 h 時間コース20,21上抑制と殺害の情報を提供します。市松模様の配列結果を確認して、相乗的な組み合わせがわかりましたが殺菌もあったかどうかを決定する菌の数を減らして時間を殺す分析を使いました。

市松模様配列と時間を殺すの相乗効果の両方の方法は薬の組み合わせのアクティビティに関する貴重な情報を提供、非常に耐性の細菌性病原体の潜在的な新規治療オプションの評価に特に有用です。また、方法には制約があります。標準 microbroth 希釈マイク法 1 2 倍希釈の22、市松模様の配列で一緒に 2 つの薬をテストするときに増加した知られている誤差範囲があります。相乗的組み合わせ薬が一緒に 4 分の 1 がそれぞれマイクで6、アクティブな場合にのみ考慮これを考慮した相乗効果の標準的な定義 (結果と考えられているそのような変動が変動が期待生物的および技術的な変動23の組み合わせ) から必然的に生成確かに相乗効果の結果の信頼性について。相乗効果をテストするための品質管理基準の欠如も現在の制限です。おそらくすべての相乗効果試験方法の最も重要な制限は、24患者の治療に使用される組み合わせの in vitro の結果と臨床転帰の間確立された相関の欠如です。ここで説明自動チェッカー ボード配列メソッドなどのメソッドをテストより簡単なとより迅速なシナジーが体外の相乗効果がより良いために臨床試験や患者の転帰の他の評価テストの統合を促進するかもしれない生体外でそして生体内での効果、将来的に関係を特徴付けます。

ここで紹介する自動チェッカー ボード配列法はさまざまな組み合わせの高速スクリーニングのためのオプションを提供しています、時間の主要な投資をせず、珍しい「高リスク ・高報酬」組み合わせ迅速に評価することができますし、、リソース。その後示すために、時間を殺す方法の組み合わせの相乗的な活性の追加の支援情報を提供し、その殺菌力と抗菌速度を特徴付けることができます。

Protocol

注意:細菌を操作するときは、適切な安全手順を使用します。すべての回で、手袋、白衣を着用します。バイオ セーフティ キャビネット エアロゾルが生成される場合や危険度の高い病原体での作業を実行します。

注:実験を開始する前に 20 に 24 h、血液寒天培地プレート (50% のグリセロール ストックとトリプシンの醤油スープで-80 ° C で凍結植民地精製、最小限代継在庫) からテストする細菌の isolate(s) を連勝。周囲の空気に 35 ° C でプレートを孵化させなさい。

1. インク ジェット プリンターによる自動チェッカー ボード配列の相乗効果

  1. 抗菌溶液 (コリスチンとミノサイクリン) を作る。
    1. 抗生物質原液濃度抗生物質の溶解性に基づくし、市松模様配列の最終濃度を必要に応じて決定します。コリスチンとこの例でミノサイクリンの 10 mg/mL 株を作る。CLSI M100 ドキュメントを使用して、各抗生物質25適切な溶剤を決定します。コリスチンとミノサイクリンの両方は、水溶性。D300 のインク ジェット プリンターは、適切な水性流体の界面活性剤の添加を必要とするため、0.3% ポリソルベート 20 を超高純度の脱イオン水に抗生物質を溶解します。
    2. 分析用天秤を用いた抗生物質の粉末を量りし、目標株価濃度を得るために必要な溶媒の量を計算します。
      1. 抗生物質が水和した形 (例えばメロペネム三水和物)、塩 (コリスチン硫酸、塩酸ミノサイクリンなど) として指定される場合、またはそれが少ないを持っている製造業者によって報告された場合 100% の純度よりも実行する力計算26必要な溶媒の量を決定します。
      2. 900 mg/mg の記載されている純度塩酸ミノサイクリンのこの例に従ってください。
        アッセイの純度: 900 mg/mg
        水分: どれも
        活性分画: 0.926 (ミノサイクリン塩酸塩 (493.94 Da) の分子量でミノサイクリン (457.48 Da) の分子量で除して得た)。
        効力 (試金純度) を = * (1-含水率) * (活性分画)
        (900 mg/mg) を = * (1) * (0.926) = 833.4 mg/mg または 83.34%
        次のように必要な溶媒の量を決定します。
        ボリューム (mL) = [重量 (mg) * 効力 (mg)] ÷ [濃度 (mg/mL)]
        だから、たとえば場合 34.7 mg ミノサイクリン塩酸塩パウダーを計り、使用して次の計算 10 mg/mL の溶液を作るために必要な溶媒の量を決定します。
        ボリューム = (34.7 mg) * (833.4 mg/mg) = 2.89 mL
        10,000 mg/mL
    3. 15 mL の円錐管に抗生物質の粉末を注ぐし、水プラス 0.3% ポリソルベート 20 の適切なボリュームを追加します。渦溶解するまで。
    4. 0.5 mL 遠心管との使用のための準備ができるまで-80 ° C でストアに、分注の抗生物質の原液。
  2. 相乗試験 QC 結果は相乗効果をテストするため、在庫を使用する前に評価できるようにする前に、少なくとも 1 日市松模様配列実験で使用するため抗菌薬の在庫の品質管理 (QC) を実行します。
    メモ:
    ここで説明した QC 手法は各薬剤の最小発育阻止濃度 (MIC) をテストするために使用するだろう、そのよう捜査官に関心の任意の系統で使える技法と同じです。
    1. 細菌懸濁液を準備します。
      1. 細菌懸濁液を準備している間融解を開始する-80 ° C のフリーザーの各抗生物質株式の因数を取り出してください。渦に確実にソリューションで抗生物質一度融解したもの。
      2. 適切な QC ひずみを選択し、CLSI M10025表 5A 1に基づいてテスト対象薬の MIC 範囲を決定します。薬はここで,大腸菌ATCC 25922;この株の MIC 範囲は 0.25-1 mg/mL ミノサイクリンと 0.25 2 mg/コリスチンの mL。
      3. QC 範囲全体を含むテストする抗生物質の濃度の範囲を選択します。ATCC 25922 のミノサイクリンおよびコリスチン 0.0156 mg/mL を 8 mg/mL の範囲を使用します。
      4. 12 mm x 75 mm 底部ガラス文化チューブ ラウンド 0.9% 塩化ナトリウムの 1 つの mL を追加します。ATCC 25922 と渦穏やかで中断の一晩プレートから 1 つまたは 2 つのコロニーを選択します。
      5. マクファーランド リーダーを使用して細菌の濃度を確認してください。読んで 0.5 マクファーランド濁度を達成するためにより多くの 0.9% 塩化ナトリウムまたはより多くの細菌を追加して必要に応じて調整します。
      6. CLSI27の推奨どおり 5 x 105 CFU/mL の最終的な細胞密度に到達する 50 mL のコニカル チューブに陽イオン調整ミューラー ・ ヒントン スープ (CAMHB) を 30 mL に懸濁液を 100 mL を追加することによって 0.5 マクファーランド懸濁液の 1: 300 希釈を行います。
      7. 滅菌接種ループ分離連勝開始腐生菌純度を確認し, 大気中の 35 ° C で血液寒天培地プレート上にドロップを使用してください。
    2. D300 を使用して底が抜けた、井戸、明確な未処理の 384 ウェル プレートに抗菌剤を追加します。プレート準備26の 15 分以内に懸濁液を追加できるように細菌懸濁液を準備した直後に、この手順を実行します。
      1. D300 のインクジェットプリンターと関連付けられたコンピューターを入れます。ソフトウェア プログラムを開きます。
      2. 新しいファイルを開始します。上記プレート グリッドの画像、板 1を右クリックし、プレートを編集を選択します。適切なプレート型 (384 の井戸) と追加ボリューム (50 mL) を選択します。
      3. プロトコルに流体 (すなわち、抗生物質株式) を追加するには、左側のパネルに流体の横にあるプラス記号をクリックします。2 つの流体 (コリスチン、ミノサイクリン) を追加します。
        1. 編集する鉛筆をクリックして、流体 1 に登場したパネルの上に合わせます。流体「コリスチン」の名、クラスへの変更は「水 + トゥイーン 20"10,000、濃度を変更と濃度の単位を mg/mL (ストック濃度は 10 mg/mL、すなわち、10,000 mg/mL) に変更。濃度ディスペンス by を残し、彼らのデフォルトの設定でフィールドの残りの部分を残します。[Ok]をクリックします。
        2. 液 2 (ミノサイクリン) に上記の手順を繰り返します。
        3. 画面の上部に現在のプロトコルタブをクリックし、最終も抗生物質濃度に使用する単位を決定するmグラム/mL の濃度 (質量)に変更します。
      4. 10 井戸をクリックしてドラッグすると、グリッドで選択をクリックし、画面の上部に滴定最高濃度滴定を使用して指定選択最高濃度コリスチンを選択、 8を入力 (単位は mg/mL を確認してください)、および配布1:2 (50%)を選択します。ウィンドウの残りの部分のための場所し、 [ok]をクリックして値をデフォルトをまま。
      5. ミノサイクリン滴定を生成するミノサイクリンの上記手順を繰り返します。
      6. プロトコルを保存し、左上の [実行] ボタンをクリックします。
      7. [スタート] ボタンをクリックします。プレート ホルダー (ふた削除) で 384 ウェル プレートに読み込むし、プロンプトロード「ロード プレート 1-シナジー」の下を押します。
        注:このプロンプトは、ソフトウェアによって選択され、相乗効果テストが行われていることを示しません。カセット スロットに T8 + カセットを置き、 T8 + カセットの負荷の下でロードのプロンプトを押します。
      8. プロンプトが表示されたら、カセットに示された貯水池に抗生物質の原液を追加します。適切な読み込みの画面指示に従い、ソリューションの任意の気泡を避けるために慎重に調剤。各ソリューションを追加すると後、は、充填ボタンを押します。
      9. 抗生物質入荷各ウェルと実行完了ボックスに適切なボリュームが表示されますインク ジェット プリンターが追加される、[閉じる] をクリックして、プレートを取り外します、D300 をオフにします。
    3. 384 ウェル プレートに細菌懸濁液を追加し、プレートをインキュベートします。
      1. 事前に準備された細菌懸濁液を滅菌試薬槽に注ぐ。
      2. マルチ チャンネル ピペットを使用して、すべての抗生物質を含む井戸に細菌懸濁液 50 mL を追加します。空のよく; 細菌なし CAMHB の 50 mL を追加します。ネガティブ コントロールになりますこれもメディアの不稔を確認します。
      3. 35 ° C 周囲の空気のインキュベーターでプレートを置き、16-20 h26間インキュベートします。
        注:腸内細菌科以外の生物がテストされている; 場合、インキュベーションの別の有効期間が必要生物固有の推奨事項の CLSI M10025を参照してください。
    4. 600 (外径600) の光学密度のマイクロ プレート リーダーのプレートを読むし、結果を分析します。
      1. ≥0.07 緑色の成長との値を持つセルの OD600値を持つセルをシェード スプレッドシート プログラムを使用すると、< 0.07 赤、成長がないことを示します。
        注: これらの値は、ない成長と OD 測定のためのこれらの実験との相関関係対成長の目視検査に基づいて決定されますメディアだけを含む井戸から OD600測定値は 0.07 以下一貫していた。適切なヒューズは、異なるプレート リーダーと細菌と異なる場合があります。
      2. 各薬剤の MIC を決定します。マイクは、細菌の増殖を抑制する薬の最小濃度です。マイクは、CLSI M100 文書25によると予想される QC の範囲内は、原液は使用のために適切です。
  3. 市松模様配列の細菌懸濁液を準備します。
    1. 細菌懸濁液を準備している間融解を開始する-80 ° C のフリーザーの各抗生物質株式の因数を取り出してください。抗生物質を確保するため一度融解したもの渦ソリューションは。
    2. 12 mm x 75 mm 底部ガラス文化チューブ ラウンド 0.9% 塩化ナトリウムの 〜 1 mL を追加します。(この場合、エシェリヒア属大腸菌の緊張で FDA CDC 0494) 細菌および 0.9% の塩化ナトリウムで、これらを中断する優しく渦の一晩プレートから 1 つまたは 2 つのコロニーを選択します。
    3. マクファーランド リーダーを使用して細菌の濃度を確認してください。読んで 0.5 マクファーランド濁度を達成するためにより多くの 0.9% 塩化ナトリウムまたはより多くの細菌を追加して必要に応じて調整します。
    4. 5 x 105 CFU/mL27の最終的な細胞密度に到達する 50 mL のコニカル チューブに CAMHB 30 mL に懸濁液を 100 mL を追加して 0.5 マクファーランド懸濁液の 1: 300 希釈を行います。
  4. D300 を使用して底が抜けた、井戸、明確な未処理の 384 ウェル プレートに抗菌剤を追加します。
    注:
    準備26の 15 分以内懸濁液をプレートに追加できるように細菌懸濁液を準備した直後にこの手順を実行します。
    1. インク ジェット プリンターの電源を新しいファイルを起動し、流体を手順 1.2.2.1-1.2.2.3 のようにプロトコルに追加します。
    2. シナジーのグリッドが生成されます。
      1. 画面の上部に相乗効果アイコンをクリックし、手順を続行します。タイプ一緒に因数分解 2 つまたはより多くの流体を選択します。プレート、必ずしもすべての井戸を除外する必要はありません。この手順の変更を加えずに次へをクリックします。
      2. 滴定] タブで抗生物質濃度と配置を入力します。
        1. 0.031 mg/mL、 y軸をない抗生物質で否定的な井戸のほかに 32 から 2 倍希釈の増減ミノサイクリンを追加するために、滴定レベルの左側のパネルで 12 を入力します。滴定を使用して指定すると、最も高い濃度を選択します。流体ミノサイクリン; を選択します。最高濃度32 (単位 mg/mL に設定されます; それがにない場合相乗効果] ダイアログ ボックスを閉じ、現在のプロトコル] タブで変更を確認してください) を入力します。0 は、値のボックスがチェックされていることを確認します。分布を 1:2 (50%) に変更します。
        2. コリスチン 12 滴レベルおよび 16 の最高濃度を使用して、右側のパネルでこれらの手順を繰り返します。[次へ] をクリックします。
      3. [レイアウト] タブで、最初 2 液の滴定レベル決定レイアウト グリッドの行と列の数を選択します。[次へ] をクリックします。期待どおりに、グリッドが表示されている場合は、完了をクリックします。
    3. プロトコルを保存し、左上の [実行] ボタンをクリックします。
    4. [スタート] ボタンをクリックします。(蓋をはずさない) と 384 ウェル プレートをプレート ホルダーに読み込むし、プロンプトロードロード プレート 1-シナジーの下を押します。カセット スロットに T8 + カセットを置き、 T8 + カセットの負荷の下でロードのプロンプトを押します。
    5. プロンプトが表示されたら、カセットに示された貯水池に抗生物質の原液を追加します。適切な読み込みの画面指示に従い、ソリューションの任意の気泡を避けるために慎重に調剤。各ソリューションを追加すると後、は、充填ボタンを押します。
    6. D300 ディスペンサーの抗生物質入荷各ウェルと実行完了ボックスに適切なボリュームが表示されます追加が終了をクリックして、プレートを取り外します、D300 をオフにします。
  5. 384 ウェル プレートに細菌懸濁液を追加し、プレートをインキュベートします。
    1. 事前に準備された細菌懸濁液を滅菌試薬槽に注ぐ。
    2. マルチ チャンネル ピペットを使用して、市松模様配列のすべての井戸に懸濁液 50 mL を追加します。空のよく; 細菌なし CAMHB の 50 mL を追加します。ネガティブ コントロールになりますこれもメディアの不稔を確認します。16-20 h2635 ° C 周囲の空気のインキュベーターで孵化させなさい。
  6. 外径600マイクロ プレート リーダーのプレートを読み、市松模様の配列結果を分析します。
    1. まず、純度プレートを確認し、隔離されたコロニーがテストされている生物の予想される形態との一貫性のある単一の形態であることを確認します。
    2. スプレッドシート プログラムを使用すると、成長やステップ 1.2.4.1 のように成長を示すセルに網かけ。
    3. 各薬剤の MIC を決定します。最高濃度テストで細菌の増殖を阻害しない薬物、マイクは、スケールをオフにすると見なされます。
    4. 各成長が阻害されるとその抗生物質の MIC に基づいて各抗生物質のため (FIC) 小数の発育阻止濃度を決定 (図 1 b2 b 図参照)。
      注:ラフィックがそのマイク; ために成長を阻害、よく抗生物質の濃度の比だから 8 mg/mL のマイクを持つ薬剤、その薬のも含む 8 mg/mL はよく含む 4 mg/mL は 0.5 の FIC の 1、FIC にしています。
    5. よくで薬のそれぞれの FICs の合計としての成長が阻害される各ウェルの小数の発育阻止濃度 (FIC) インデックス値を計算します。
    6. 最低 FIC は成長が抑制 (最小 FIC) を決定します。£0.5、最小 FIC場合検討組み合わせ相乗効果。場合は 0.5-4、無関心、組み合わせを検討そして、もし > 4、組み合わせを敵対的検討してください。組み合わせは他で拮抗が、いくつかの濃度の組み合わせで相乗効果、この結果に注意してくださいが、拮抗の全体的な組み合わせを考慮します。

2. 時間を殺す相乗試験

  1. 抗菌溶液を作る。実験前にこの手順を実行すると、使用する準備ができるまで-80 ° C で株を凍結します。
    1. 抗生物質原液濃度抗生物質の溶解性に基づくし、時間を殺す研究の最終濃度を必要に応じて決定します。この例では、1 Mg/ml の濃度でコリスチンとミノサイクリンの株を作る。CLSI M100 ドキュメントを使用して、各抗生物質25適切な溶剤を決定します。コリスチンとミノサイクリンの両方を推奨されているように、水を使用します。
    2. 分析用天秤を用いた抗生物質の粉末を量りし、目標株価濃度を得るために必要な溶媒の量を計算します。必要な場合は、1.1.2.1 上記の手順で説明するように、必要な溶媒の量を決定する前に力の計算を行います。
    3. 円錐管 15 mL に抗生物質のパウダーを注ぐし、水の適切な量を追加します。渦溶解するまで。
  2. CLSI M0726で説明している手動スープ微量液体希釈法を使用して抗菌の QC を実行時間で使用するため株式を殺す相乗効果実験。シナジー株式を使用する前に QC 結果を確認できるようにするをテストする前に、少なくとも 1 日この手順を実行します。
    1. 適切な QC ひずみを選択し、CLSI M10025表 5A 1に基づいてテスト対象薬の MIC 範囲を決定します。薬はここで,大腸菌ATCC 25922;この株の MIC 範囲は 0.25-1 mg/mL ミノサイクリンと 0.25 2 mg/コリスチンの mL。
    2. 抗生物質を含むスープの希釈プレートを準備します。
      1. QC 範囲全体を含めることができるようにテストする抗生物質の最高濃度を選択します。ATCC 25922 のミノサイクリンとコリスチンの 0.016 に 8 mg/mL の範囲を使用します。
      2. 2 回(細菌の懸濁液と希釈 1:1 であろう) ために必要な最高の濃度で CAMHB で実用的なソリューションに抗生物質の株式を希釈します。この例では、16 mg/mL に 10 mg/mL から両方の株式を希釈します。
      3. マルチ チャンネル ピペットを使用して、明確な丸底、未処理の 96 ウェル プレートの最初の列には井戸に抗生物質懸濁液 x 2 のそれぞれの 100 mL を追加し、列目以降の各ウェルに (すなわち、抗生物質) なしプレーン スープ 50 mL を追加します。
      4. 抗生物質を含む 50 mL を削除それぞれからスープも最初の列と 2 列目のウェルに追加。ピペットを上下に数回半分抗生物質濃度を生成するコンテンツを混在させることの最初の列に集中します。
      5. 2.2.2.4 各列でのステップを繰り返して、シリアルの 2 倍希釈をそれぞれ 50 mL の量のシリーズを用意しています。抗生物質の持ち越しの可能性を排除するために必要な場合は、各希釈段階間ヒントを変更ピペット。その後細菌懸濁液を希釈 1:1 となります結果濃度が最終濃度 x すべてのまだ 2 であることに注意してください。
      6. 負と成長コントロール列になります、最終的な 2 つの列に任意の抗生物質を追加しないでください。
    3. 細菌懸濁液を準備します。
      1. 手順 1.2.1.5-1.2.1.6 で説明したようにエシェリヒア属大腸菌ATCC 25922 で 0.9% の塩化ナトリウムの一晩板から 0.5 マクファーランド懸濁液を準備します。
      2. CAMHB 7.5 mL を 50 mL の懸濁液を追加することによって 0.5 マクファーランド懸濁液の 1: 150 希釈を行います。
        注:最終の細菌懸濁液希釈 1: 300 となりますそれは 5 x 105 CFU/mL27CLSI 推奨細胞密度に到達、抗生物質溶液を 1:1 の混合)。
    4. マイクロ プレートに細菌を加えて孵化させなさい。
      1. 11th列の各ウェルに以外の細菌懸濁液 50 mL を追加します。CAMHB の 50 mL を 11番目列 (ネガティブ コントロール列) に追加します。
      2. 16-20 h 35 ° C でプレートを孵化させなさい。
        注:腸内細菌科以外の生物がテストされている; 場合、インキュベーションの別の有効期間が必要生物固有の推奨事項の CLSI M10025を参照してください。
      3. 視覚的に透過光を用いた成長用プレートを読むし、各抗生物質のため成長はありません最低濃度を決定します。これは、マイクです。マイク26の視覚的な解釈の詳細については、CLSI M07 ドキュメントを参照してください。マイクが予想される QC の範囲内にある場合、原液は使用適しています。
  3. 初期培養を開始します。
    1. 0.5 を作る生殖不能の 0.9% で試験生物のマクファーランドを懸濁液として塩化ナトリウムは上記します。
    2. マクファーランド懸濁液 5 ml CAMHB の 25 × 150 mm のガラスにラウンド ステンレス鋼の閉鎖とミックスに優しく渦下培養管 0.5 100 mL を追加します。
    3. 滅菌接種ループ分離連勝して接種純度を確認し、, 大気中の 35 ° C で血液寒天培地プレート上に希薄懸濁液のドロップを使用してください。
    4. 閉鎖チューブを交換し、(手順 2.6.1 参照) 対数相成長に到達するまで、少なくとも 3 時間の周囲の空気の 35 ° C でシェーカーで試験管ラックで孵化させなさい。文化のインキュベーター中 2.4 の手順に進みます。
  4. ガラス培養管 25 mm × 150 mm で抗菌ソリューションを準備します。
    1. 雪解けに-80 ° C のフリーザーから抗菌株式因数を取り出します。抗生物質を確保するため一度融解したもの渦ソリューションは。
    2. 初期文化が培養中 5 オートクレーブ 25 × 150 mm のガラス文化のチューブに CAMHB 10 mL を追加し、抗菌溶液を次のように追加します。
      注:必要があります相乗効果の研究では、少なくとも 1 つの薬剤、成長に影響しない濃度で個別にカーブ28これは、相乗効果の研究の前に個々 の薬剤濃度に及ぼす影響を評価することによって決定できます。
      1. チューブ 1: ターゲットの最終的な抗菌薬濃度を取得抗生物質 #1 の適切な量を追加します。この場合、これはこの例で使用するひずみに対して効果的ではない濃度として 10 mL、1 Mg/ml の濃度が最終コリスチン 1 mg/mL コリスチン株式を追加します。
      2. チューブ 2: テストする最後の抗生の集中を取得する抗生物質の #2 の適切な量を追加します。この場合、この例で使用されているひずみに対して効果的です濃度 1 mg/mL の濃度が最後に 1 mg/mL ミノサイクリン株式の 10 mL を追加します。
      3. チューブ 3: 抗生物質 #1 抗生物質 #2 チューブ 1 と 2 で使用されるのと同じ量を追加します。この場合、1 mg/mL ミノサイクリン株式の 10 mL と 1 mg/mL コリスチン株式の 10 mL を追加します。
      4. チューブ 4: を追加しない抗生物質;これは成長制御管になります。
      5. チューブ 5: を追加しない抗生物質;これは否定的な制御管になります。
  5. シリアル希薄の 2 mL 井戸 96 ウェルマイクロプレート ポリプロピレン板を準備するには、行 B H 列 1-5 のマルチ チャンネル ピペットに 900 μ L の滅菌 0.9% 塩化ナトリウムを追加します。
  6. 開始接種材料を準備し、チューブに追加します。
    1. 初期の文化は、対数増殖期 (肺炎桿菌、この例で使用されている生物の ~ 3 h) に達したら、培養管を削除、シェーカーから渦優しく、〜 1 mL の懸濁液の管に転送 12 × 75 mm ガラス文化とマクファーランド リーダーと密度を確認します。
      1. 場合未満 1.0 マクファーランドは、シェーカーにリターン チューブとより長く孵化します。マクファーランド 1.0 より大きい場合は、チューブに CAMHB を追加渦優しく、再サンプル、懸濁液が 1.0 マクファーランドになるまで繰り返します。
    2. チューブ 1 4 1.0 マクファーランド懸濁液 100 mL と渦をそっと追加します。
  7. それぞれの文化から因数をサンプルし、シリアルの 10 倍希釈を行います。
    1. (管に細菌を追加) した直後に時間 0、1、2、4、6、24 h で、滅菌ピペット チップだけ割り切れる撤退中にチューブと無菌ではない pipettor シャフトではありませんが入力されるように、管を傾けることによって各カルチャ チューブから 150 mL 分注を削除します。事前に準備された 96 ディープウェル プレートの最初の行に連続して井戸にそれぞれ因数を追加します。各時点での因数を削除した直後に 35 ° C 周囲の空気のインキュベーターでシェーカーで試験管ラックにチューブを返します。
    2. マルチ チャンネル ピペットを使用して、行 A から 100 mL を削除、行 (0.9% 塩化ナトリウムの 900 mL を含む) の B に追加し、上下に 4-5 回をピペット、1:10 を作成するミックス希釈。虚偽の高コロニー数につながることができる細菌のキャリー オーバーを防ぐために各希釈段階を次のヒントを破棄します。
    3. 行 B H 行ごとに新しいピペット チップの 2.7.2 のステップを繰り返します。
  8. プレートは、コロニー カウント ドロップ プレート法29,30を使用してサンプルを希釈しました。
    1. ミューラー ・ ヒントン寒天抗生物質条件とめっきされる希釈ラベル
    2. マルチ チャンネル ピペットと長めのヒント (ヒントが懸濁液に達することを確認) を使用して、1 列の各ウェルから 10 mL を削除し、適切にラベル付けされたプレートの上に連続で慎重に調剤します。小さな (直径 100 mm) 板を使用する場合プレートあたり 3 行 (それぞれ単一列の行 A H から滴から成る) を分配します。(150 φ) 大皿プレートあたりの 8 行を調剤します。
    3. 完全に乾燥するが値下がりしましたを許可する (~ 15 分)。
    4. 24 h で、無菌試験にプレートの 1 つの指定された領域のネガティブ コントロール チューブから直接撮影した 10 mL のドロップを配置します。板を反転し、周囲の空気に 35 ° C で一晩インキュベートします。
  9. コロニーをカウントし、細胞密度を計算します。ダブル カウントまたは不足している植民地を避けるためにプレートの裏面にファイン ・ チップの永久的なマーカーと植民地をマークします。
    1. まず、純度プレートを確認し、隔離されたコロニーがテストされている生物の予想される形態との一貫性のある単一の形態であることを確認します。
    2. 各希釈系列 3-30 植民地 (通常希釈系列ごとに 1 つのドロップ) で滴を特定します。これらの低下のコロニーをカウントし、希釈倍率と一緒にカウントを記録します。
      1. 3 30 植民地で希釈系列の低下しない場合、カウントの最後の一滴の植民地 > 30 の植民地との最初のドロップ < 3 植民地 (これらは隣接する低下する必要があります)。
    3. 各希釈系列のサンプルでは次の数式を使用してドロップでコロニー数に基づくコロニー (CFU/mL) の 1 ミリリットルあたりの単位数を計算: CFU/mL = n(1/d) (100) nは、コロニーの数dは希釈倍率 (原液サンプル (A 行) の 1、0.1 または 10-1最初 1:10 の希釈 (列 B)、0.01 または 10-2第二 1:10 の希釈 (C の行) と、実際の定数 100 アカウントをドロップ量私s 10 mL、最終値 CFU/mL、すなわち、CFU/1,000 mL の中。このプロセスを簡素化するコロニー カウントから CFU/mL を計算する数式を含むワークシートを使用します。
      1. 希釈系列どこよりも 1 つのドロップは数えられる (または 2 滴いたためにカウントされるドロップ落ちない範囲で)、すべてカウント低下の最終的な CFU/mL 数の平均値します。
      2. 検出下限値は 300 CFU/mL (原液ドロップ 3 植民地)、レコードとプロット コロニー カウント £300 CFU/mL の希釈系列があるので < 原液ドロップ 3 植民地。
    4. 検査時間 24; から不妊コントロール ドロップこのドロップで任意の成長を観察すると、実験の結果は使用しないでください。
  10. グラフし、結果の分析します。
    1. 3 つの抗生物質を含む文化と同じグラフで成長制御から成長曲線をプロットします。X軸とy軸に対数目盛を使用して CFU/mL に時間をプロットします。
    2. 24 時組み合わせチューブと 24 時間で最もアクティブな単一エージェント CFU/mL の差を計算します。違いは ≥2 ログ10場合の組み合わせは相乗効果の検討してください。24 時と時間 0 の組み合わせのチューブの CFU/mL の違いを計算すること。違いが 3 ログ10の場合の組み合わせは殺菌の検討してください。

Representative Results

図 1A 0 32 の濃度であるミノサイクリンの μ g/mL が 0-16 μ g/mL の濃度でコリスチン併用、大腸菌 FDA CDC 0494に対してテストされた市松模様配列の相乗効果実験からのグリッドが表示されます。値は、(外径600) 光学密度 600 nm 吸光光度測定値を表します。(目視による成長なしに対応) から 0.07 下外径600値と井戸が、OD600値 0.07 (目視による成長に対応) すると井戸が緑色、赤色で表示。各薬剤の最小発育阻止濃度 (MIC; 太字) 細菌の増殖を阻害する薬の最低濃度であります。ミノサイクリン、これは 32 μ g/mL とコリスチン、8 μ g/mL です。シェーディングは、図 1 bで保持されますが、成長が阻害される井戸内の値は、小数の発育阻止濃度 (FIC) インデックス値で置き換えられます。これらは次のように決定されます: 各ウェルに各薬品の小数の発育阻止濃度指数 (FIC) は薬剤の MIC、よく抗生物質の濃度で割って算出し、FIC はは 2 つの FICs の合計によって計算されます。FICの値を 0.5、相乗効果のためのカットオフとされる井戸が壊れて線の境界線で示されます、最小値を持つ FIC(0.094) 井戸は太字で表示されます。最小 FIC値は相乗効果の範囲なので組み合わせは相乗的であると見なされます。

図 2 aおよび図 2 bを示すグリッド図 1 a 図 1 bのそれらに類似しているが、この場合の組み合わせを示していないテスト分離 (k分離 BIDMC 4) に対する相乗効果のため、最小 FICの成長を抑制するはである 1 > 0.5。

図 3は、いくつかスキップされた井戸が発生した (エンテロバクター cloacae複雑な分離 BIDMC 27) 市松シナジー グリッドから光学密度の測定値を示しています。スキップされた井戸がある井戸抗生物質の高濃度の隣接する井戸における細菌増殖の存在にもかかわらず、細菌の増殖を抑制します。標準的なマイクもテストで発生すること知られているこの現象はから細菌の増殖特性の生物学的変動可能性があります同様によく、菌23の小さな違いにいくつかの抗生物質の感受性に,31,32します。 1 つ以上スキップも市松模様配列で発生した、我々 は結果を破棄され、アッセイを繰り返されます。

図 4プレゼントkに対してテストした 3 つの組み合わせの時間を殺すの相乗効果の結果の例は、BIDMC 32 を分離します。コロニー カウント、 yに対数スケールで示されます-軸と時間、 x-軸。薬の組み合わせと 24 h でその管の細菌の集中を含む管内開始接種の違いは赤いバーと番号、チューブ間の 24 h での細菌の濃度差によって示されています。最も活動的な 1 つのエージェントだけを含む管との組み合わせを含む青色のバーと番号で示されています。図 4 aは、コリスチンとミノサイクリン; の組み合わせから結果を示しています。この組み合わせは相乗 (細菌の組み合わせ及び最もアクティブなエージェントだけで ≥2 ログ10 CFU/mL で 24 h の濃度差) と殺菌 (衰退 24 h 3 ログ10濃度に接種を始めてからCFU/mL)。図 4 bは、コリスチンとクリンダマイシンの組み合わせ、相乗効果が、なかった殺菌の組み合わせから結果を示しています。この組み合わせは、どちらも薬だけでしたが、それらを殺していない細菌の増殖を阻害しました。コリスチンとエリスロマイシン、殺菌も相乗効果もなかったの組み合わせから結果を図 4に示します。

Figure 1
図 1: 市松模様配列 (ミノサイクリン + コリスチン大腸菌に対してテストひずみ FDA CDC 0494) 示す相乗効果を結果します。チェッカー ボード配列の (A) 吸光光度読み出しと成長の解釈。セルの値が 600 で光学濃度測定値 nm (外径600)。(目視による成長なしに対応) 0.07 以下 OD600の値を持つセルは、(目視による成長に対応) 外径600値 0.07 を持つセルが緑色、赤色で表示。(B) 小数阻害濃度 (FIC) インデックス計算。成長か成長なしを示す陰影が残されています。コリスチンとミノサイクリンxyの値の軸はそれぞれ、今に小数の発育阻止濃度 (FIC) は、またはその列または最小発育阻止濃度 (行で薬の濃度の比を表すMIC) 単独で薬物の。各セルの値は、FIC は、または 2 つの FICs の合計がよく中医薬品します。大型の壊れた線枠線のボックス、FIC0.5 と井戸を囲みます。厚い隣接セルを示します最低 FIC はの成長が抑制され、または最小 FIC はも。最小 FIC はは 0.5、組み合わせは相乗的であると見なされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: (ミノサイクリン + コリスチンkに対してテスト BIDMC 4 を分離) の相乗効果を示していない組み合わせの市松模様の配列の結果。(A) 光密度値チェッカー ボード配列結果図 1 aのとおりの 600 nm と成長の解釈で。(B) 小数の発育阻止濃度 (FIC) インデックス計算図 1 aのとおりです。最小 FIC はだ > 0.5、組み合わせを相乗的には考慮されません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 市松模様配列結果が解釈するためスキップ (ミノサイクリン + コリスチンエンテロバクター cloacae複雑なに対してテスト分離 BIDMC 27) 井戸。チェッカー ボード配列結果図 1 aのとおりの 600 nm と成長の解釈で光密度値。抗生物質の高濃度の隣接する井戸の成長の存在にもかかわらず、細菌の増殖を抑制、いくつかスキップされた井戸の例を示します。結果は、解釈であり、繰り返されるニーズを実験します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: k分離 BIDMC 32 に対してテストした 3 つの組み合わせの相乗効果結果を時間を殺す。コロニー カウント、 yに対数スケールで示されます-軸と時間、 x-軸。チューブの 24 h の組み合わせで細菌の集中そして開始の接種材料の違いは、赤いバーと番号で示されています。24 h で濃度に接種を始めてから減少が 3 ログ10 CFU/mL の組み合わせが殺菌と見なされます。24 h の組み合わせを含むチューブと単独で最も活動的な 1 つのエージェントを含むチューブの間に細菌の濃度の違いが青色のバーと数字によって示されています。≥2 ログ10 CFU/mL 低減、組み合わせは相乗的であると見なされます。(A) コリスチン (CST) + ミノサイクリン (分)、相乗効果と殺菌の組み合わせ。(B) コリスチン + クリンダマイシン (CLI) 相乗効果がない殺菌の組み合わせ。(C) コリスチン + エリスロマイシン (ERY)、相乗効果も殺菌の組み合わせ。これらの結果はコリスチン含むの相乗的な活性の研究の一環として公開された最初コリスチン耐性腸内細菌科、そのコリスチンを実証我々 に対しての組み合わせは相乗効果の数個別にのみアクティブになっている抗生物質 (例えばクリンダマイシン) または主に (例えばエリスロマイシン) グラム陽性菌16に対して。(エリスロマイシンは、ひずみに対して市松模様配列によって、相乗的が時間殺す、だからそれは選択されていない非相乗的組み合わせの例としてここで)。私たちと仮定コリスチンは、グラム陰性菌の外膜の透過によって行動する知られている、クリンダマイシンなどの薬物のエントリを許可するコリスチン耐性のグラム陰性菌の抗生物質 permeabilizing の効果を発揮グラム陰性菌の細胞は通常入力できません。この図のパネル (A)、ブレナン クローン、Pironti、および星のカービィ 2018年16著作権 © アメリカ微生物学、抗菌剤、化学療法学会から変更された 62(10)、2018、pii: e00873-18 土井: 10.1128/AAC.00873-18。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Discussion

ここで説明する 2 つの方法両方は彼らの個々 の活動と比較しての組み合わせで使用される抗菌薬のアクティビティに関する情報を提供します。自動、インク ジェット プリンタによるデジタル時間 kill メソッドより密接に同じ対応するプロトコルに続く中33臨床微生物学手続きハンドブック」で説明した方法の適応は、塗布方式34を参照します。

市松模様の配列メソッドで必要な量の各ウェルに加える抗菌株式だけでなく、これらのボリュームの調剤を割り出すための計算が自動化され、したがって手動で検出されたエラーの主要な潜在的なソースのいくつかを排除すること市松模様の配列。しかし、捜査官は、元株式が目的の濃度に作られています、目標の最終濃度が D300 ソフトウェアに正しく入力されている判断が不可欠です。384 ウェル プレートでの井戸に抗菌のサスペンションが最初に挑戦することができ、注意が必要ですを追加して、そのピペットを確保するためのヒントは、適切な井戸を入力、その液体にスプラッシュ井戸の端までないです。自動液体ハンドラーは、速度と精度の細菌懸濁液が井戸に追加されますを高めるため手持ちのマルチ チャンネル ピペットの代わりに使用できます。プロトコルに記載されている、D300 の適切な液体処理ポリソルベート 20 (P-20)、界面活性剤の添加が必要です。異なる界面活性剤、ポリソルベート 80、0.002% の濃度ではコリスチンのマイクで生物のコリスチン マイクを下げるため指摘されている < 標準液微量液体希釈法で 2 μ g/mL。35,36本研究室以前実証 0.0015% が D300 補助マイクと比較結果に影響しない低濃度で P-20 BMD14を参照します。ここで紹介のアッセイ例、最大 P-20 は濃度は 0.0014% です。

いくつかのチェッカー ボードの配列の試金で発生した問題の 1 つはだったスキップされた井戸の数が多いです。これは、特定の抗生物質に不均衡なレートで発生しました。具体的には、カルバペネム耐性腸内細菌科のコレクションに対して組み合わせ画面で分かった 521 試験 (9.4%) の 49 中複数のスキップされた井戸のため使用できなくなった 2 12 抗生物質のテスト (ホスホマイシンとセフェピム) 46 これらの試験 (94%) を占めています。このような増加率は、特に接種効果31,32,37を受けやすい薬の可能性が高い可能性があります。注記のうち、CLSI ではホスホマイシンをスープの希釈の25の結果の信頼性についての懸念のためにこの薬で見て信頼性の低い結果を説明するかもしれないこの方法でテストをお勧めしません。治験責任医師の好みに応じて自動チェッカー ボード メソッドにいくつかの変更が可能です。これが研究室内のワークフローの理由のために望ましい場合空井戸ではなく、既に細菌懸濁液を含んでいる版を使用して抗菌剤を省くことができます。384 ウェル プレートは、ここで使用した、メソッドは、よくボリュームの適切な変更の 96 ウェル プレート アッセイ行うことが。96 ウェル プレート形式の使用は、特に接種の小さな変化に敏感である抗生物質のため削減スキップされた井戸で助けるかもしれない。FIC はを計算するときマイクが状況をスケール (すなわち、テストよりも高い)、テストされている薬物は、テストされている生物の種類に対して個別に活動がない状況を含むかもしれません。これらのケースで、FIC が計算されますベース マイクが 1 つ希釈テスト最高の濃度よりも高い。これは最も保守的な戦略は、希釈する相乗効果のテスト中に抑制を観察する場所の最大可能な FIC 値を想定しています。たとえば場合実際マイク代わりに上記 2 つの 2 倍希釈最高濃度テスト、対応する FICs は保守的な割り当ておよびのより低い 2 倍になります。

時間を殺すアッセイで薬の殺菌活性を正確に評価するには、アクティブな抗生物質の細胞壁はテスト28されるときに特に対数相成長で文化ができることが重要です。揺れと孵化の 3 時間 (k)、この例で使用される急速に成長している細菌のこの成長期に到達する適切なだったが、時間の異なる量の異なる生物の必要があります。一般に、文化は目に見えないが、重くない濁った表示されます。シリアル時間ポイント (例えば、毎 30 分 4-6 時間)38で撮影したコロニー数と成長曲線を作成することにより時間の適切な量を決定ことができます。時間を殺す研究目的開始接種も重要です。開始菌の濃度は約 5 × 105 1 × 106 CFU/mL です。ここで説明した希釈 (1.0 マクファーランド メディアの 10 mL で懸濁液 100 μ L) は、肺炎桿菌や他の腸内細菌科の種を我々 はそれをテストしているのこの菌を生成します。別の生物を用いた実験開始接種の密度は大幅これより高いまたは低い、別の希釈が必要かもしれない。(特定の種のために必要な適切な希釈を判別できる 0.5 または 1.0 マクファーランド サスペンションのプレート数を実行することによってこの濁度を表し、算定した初期の懸濁液がある必要がありますどのように多くの生物を決定します。適切な最終濃度に到達する希薄化後)。このいずれかの抗生物質の持ち越しが発生する可能性がある場合、プレート カウントの相乗効果研究からのレビュー、抗生物質含有チューブのいずれかの開始の接種がある成長制御の開始の接種よりかなり低いこと、または非常にめっき用抗生物質含有チューブへの細菌の追加および削除、因数の間の短い時間で細菌の急速な殺害。シリーズの原液のドロップで植民地の実際の数が低くその後希釈でのコロニー数よりも、これは抗生物質持ち越し効果を示唆しています。さまざまなオプションは、この効果は、1 つの因数を広がって全体プレート38サンプルを回転または、上清を除去、39をめっき前に滅菌生理食塩水で再懸濁などを防止するために記載されています。各時間の時点での時間を殺す方法、効率的に、正確に各カルチャ チューブから、因数を削除しシリアル希薄を実行調査官の重要なもです。この過程で、特に、立て続けに発生する早期の時点の間に遅延がその中に文化はない長時間につながることが培養され、動揺、不注意な調剤およびシリアルの希薄は不正確なプレートにつながるに対しカウントします。各希釈の 100 μ L が全体寒天プレート上で広がっている、プレート カウントの拡散板法と比較して記載されているドロップ プレートははるかに多く急速に寒天の少数を必要とし、高速カウント、最大値としては、可算各ドロップのコロニー数は 30、拡散板から最大 300 コロニーをカウント通常ことができます一方です。しかし、拡散プレート法はオプションも捜査官がこの手法でより快適な場合です。滴は、マルチ チャンネル ピペットで分注後お互いに広がりより広く間隔をあけられたシングル チャンネル ピペット滴の個々 のアプリケーションが代わりに実行できます。我々 の経験で滴を塗布する前に 4 ° C でプレートを冷却過剰な広がりを抑えるように見えた。

ここで説明する手法の 1 つの制限は、シナジー分析 (市松模様配列と時間を殺す) の 2 つの種類の結果は常に一致ではなく、ほとんど公開の記事を相乗効果は、一緒に 1 つの方法または他よりもむしろ両方を使用、のでそれがすることができます。試金の 2 種類のデータを統合する方法を知ることは困難であります。我々 が開発した自動チェッカー ボード配列方法は簡単、高スループット、我々 として使用している有効画面の種類に対して分離株の大きい数の組み合わせをテストするのには、どの濃度の組み合わせが相乗効果を決定するため。我々 は、組み合わせとされていた市松模様の配列に効果的な濃度を選択する時間を殺す研究のより小さい数を実行されます。注記のうち、時間殺すアッセイ (macrobroth 希釈と同様) より大きなボリュームを使用して、市松模様の試金は microbroth 希釈規模で通常実行されるためことが判明した FICs 時々 2 つのメソッド間で異なると高い一般的に動作をデモする時間殺すアッセイに必要な濃度。この現象は、macrobroth と microbroth の希釈マイク アッセイ結果グラム陰性桿菌26の大規模接種 (時間を殺す研究で使用される) と比較した時で使用される標準的な接種と比較すると以前指摘されていますmicrobroth の希釈と市松の配列は、32を試金します。Microbroth 希釈テスト22マイク固有の変動は, 市松模様配列の固有の制限です。FICヒューズこの可変性のシナジー アカウントの中数学6そのような変動必然的に発生するもので信頼性と市松模様配列の結果の整合性についての懸念。

試験方法 (人工培、静的抗生物質濃度と期間限定コースの細菌の耕作を含む) すべての in vitro 相乗効果に固有の制限があるためこれらの方法によって得られた結果を確認する必要があり、さらに補足の技術を使用して評価されます。このようなメソッドの in vitro 薬物動態/薬力学 (PK/PD) 研究 (例えば、中空糸感染モデル40)、動物モデルを含めると、最終的には、PK/PD と有効性の研究。潜在的な相乗的活動のため画面の組み合わせに、迅速法を提供することによって、ここで説明自動チェッカー ボード配列メソッドを使用するより多くのこれらの技術の利用を対象とします。さらに in vitro におけるパラメーターと臨床転帰の関係のよりも体系的な調査として、これらのメソッドのすべてのオートメーションはスケーリングに重要なるテストとその臨床への適用性を増加の相乗効果の使用をアップします。

Disclosures

D300 デジタル ディスペンサーと関連付けられている消耗品は、テカンジャパン (モリスヴィル, ノースカロライナ) によって提供されました。テカンジャパン研究デザイン、データ収集/解析、原稿を準備する、または発行するという決定の役割がなかった。

Acknowledgments

テア ・ ブレナン-クローンによって、ユーニス · ケネディ シュライバー国立衛生研究所の子を支えられたし、発達小児感染症研究研修助成金 (T32HD055148)、国立研究所のアレルギーと感染症研修助成金 (T32AI007061)、ボストン子供病院部開発部キャリア開発局親睦と国立研究所のアレルギー ・感染症キャリア開発賞 (1K08AI132716)。J.E.K. は、国立研究所のアレルギーと感染症受賞番号 R33 AI119114 の下で健康の国民の協会によって支持されました。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Escherichia coli strain ATCC 25922 ATCC 25922 QC strain
0.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1605-0000
1 L 0.22 µm bottle-top filter Thermo Scientific Nalgene 597-4520
12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Fisherbrand 14-961-26
15 mL conical tubes Phenix SS-PH15
15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates Thermo Scientific R01620 or R04050
25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes Bellco 2005-02512
25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Bellco 2011-25150
348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids Greiner Bio-One 781186
50 mL conical tubes Phenix SS-PH50
50 mL sterile reagent reservoirs Corning 4870
96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells Fisherbrand 12-566-612
96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids Evergreen 222-8032-01R
Cation adjusted Mueller Hinton broth BD Diagnostics 212322
Colistin sulfate Alfa Aesar J60915
D300e Control Software HP/Tecan
DensiCHEK Plus McFarland reader bioMérieux 21250
Excel spreadsheet software Microsoft
Extra long SHARP 10 µL Precision Barrier Tips Denville Scientific P1096-FR
HP D300 digital dispenser HP/Tecan
HP D300 T8+ cassettes HP/Tecan 30097370
Minocycline hydrochloride Chem-Impex 14302
Picus 12-channel 10-300 µL pipette Sartorius 735461
Polysorbate 20 Fisher Bioreagents BP-337 Brand name: Tween 20
Sodium chloride Fisher Chemical S271
Spectrophotometer Tecan Infinite M1000 PRO
Xplorer 12-channel 50-1200 µL pipette Eppendorf 2231000328

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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