잉크젯 프린터 기반으로 테스트 자동화 된 바둑판 배열 및 수동 시간 죽 일 방법 항균 시너지

Immunology and Infection
 

Summary

항균 시너지 테스트 조합에 사용 되는 두 개 이상의 항생제의 효과 평가 하는 데 사용 하 고는 일반적으로 두 가지 방법 중 하나에 의해 수행: 바둑판 배열 또는 시간 죽 일 분석 결과. 여기, 우리는 자동화 된, 잉크젯 프린터 기반 바둑판 배열 시너지 기술 및 고전적인 시간 죽이기 시너지 연구 제시.

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Brennan-Krohn, T., Kirby, J. E. Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method. J. Vis. Exp. (146), e58636, doi:10.3791/58636 (2019).

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Abstract

Multidrug 저항 (MDR) 병원 체의 속도 상승, 계속 새로운 제의 개발 능가 MDR 박테리아의 치료에 새로운 접근 필요 되 고 점점 더 있다. 이러한 방법 중 하나는 조합 치료에 두 개 이상의 항생제 치료에 대 한 감염을 함께 되는 마약 중 어느 하나 또는 모두 효과가 있을 수 있습니다 하지 혼자. 때 조합에 두 약물 발휘는 큰 첨가제 효과 보다 시너지 간주 됩니다. 시너지 활동의 체 외 조사 약물 조합 가능한 효능 평가에 중요 한 첫 단계 이다. 두 가지 주요 체 외 시너지 테스트 방법 개발 되었습니다: 바둑판 배열 및 시간 죽 일 연구. 이 문서에서 우리는 자동된 바둑판 배열 방법을 제시는 효율성과이 기술 표준 수동 시간 죽이기 시너지 방법의 정확도 높이기 위해 잉크젯 인쇄 기술의 사용. 자동화 된 바둑판 배열 수동 시간 죽 일 연구 시너지 활동 및 살인에 추가, 무료 데이터를 제공 하는 동안 높은 처리량 검사 분석 결과 검색할 수 있습니다.

바둑판 배열 박테리아 다른 농도 조합에 항생제와 인 큐베이 팅 및 숙박 부 화 후 성장 억제에 대 한 평가 표준 최소 억제 농도 (MIC) 테스트의 수정입니다. 바둑판 배열의 수동 성능 힘들고 오류가 일련을의 계산 및 희석이 필요합니다. 자동화 된 방법에서 제시 여기, 계산의 필요한 항생제 재고 솔루션 볼륨 잉크젯 프린터 기술을 통해 자동 분배. 시간 죽이기 시너지 분석 결과에서 박테리아 함께 개별적으로, 관심, 항생제와 함께 알을 품는 그리고 양적 문화에 대 한 24 시간에 걸쳐 샘플링 간격. 결과 조합 인지 시너지 및 살 균, 인지를 확인 하 고 시간이 지남에 저해 및 박테리아의 살해에 데이터를 제공 수 있습니다.

Introduction

Multidrug 저항 (MDR) 세균성 병원 체, 특히 MDR 그람 음성 박테리아 carbapenem 저항 Enterobacteriaceae (CRE) 등의 확산은 성공적인 조직과 치료 에 대 한 점점 더 제한 된 옵션 임상을 두고 있다 1, 소설 항균 약 발견2,3의 느린 속도 의해 악화 문제. 이러한 박테리아는 하나 또는 둘 다에 저항 하는 경우에 기존 항생제 MDR 박테리아의 치료에 사용 하기 위해 인양의 가능성을 제공 하는 조합에 사용 되는 두 약물 첨가제 보다 더 큰 효과 발휘 하는 항균 시너지 효과 항생제 개별적으로. 생체 외에서 시너지 효과 함께 사용 하는 경우, 테스트의 두 가지 보완적인 방법을 제공 하는이 문서에 설명 된 기술을 효율적으로 화면 항균 조합의 시너지 활동 (자동화의 증거에 대 한 관심을 조사 허용 바둑판 배열 방법) 그리고 더 억제 및 심사 단계 (수동 시간 죽 일 방법)에서 확인 된 유망한 조합에 의해 증명 하는 살인의 활동을 평가.

생체 외에서 시너지 테스트의 가장 일반적으로 사용 되는 방법 중 하나는 바둑판 배열 분석 결과, 두 개의 서로 다른 항생제는 세균에 대 한의 금지 활동 분리 최소 억제 농도 (MIC) 테스트의 수정 테스트 이상의 농도 조합4,5의 범위. 두 약물 첨가제 활동 함께 사용 하면 보다 큰 발휘, 결합 시너지6간주 됩니다. 그러나, 수동으로 바둑판 배열 설정 계산 diluting 및 pipetting 단계 및 힘들고 인간의 오류에 취약의 일련을 포함 한다. 이러한 제약 조건 테스트 항생제 조합과 세균 분리의 작은 숫자의 회 고 평가를 주로 하는 시너지 효과의 사용을 제한의 효과 없 그리고 결과 항상 연구7, 간에 일관 되지 않은 8,9,,1011. 또한, 시너지 테스트의 복잡도 기여 임상 미생물학 실험실에 그것의 불가능 하 조합 치료12, 의 임상 연구에서 생체 외에서 시너지 테스트 데이터의 가상 부재 13.

효율성과 바둑판 배열 방법의 처리량을 증가 하기 위하여 우리가 만든 자동된 마이크 테스팅 기술 이전 기술을 사용 하 여 잉크젯 인쇄를 정확 하 게 우리의 실험실에서 개발 사용 하 고 일관 되 게 작은 볼륨을 분배 결정 플레이트14에 우물으로 항생제 재고 솔루션. 플랫폼 복잡 한 계산 및 여러 pipetting 단계에 대 한 필요성을 obviates. 관련된 소프트웨어 계산 하 고 적절 한 양의 사용자는 단순히 원하는 농도 범위를 입력 하는 경우 2 차원 바둑판 배열을 만드는 항생제와 항생제의 재고 솔루션 농도 dispenses. 우리 처음 CRE 격리15 의 컬렉션에 대해이 메서드를 테스트 하 고 이후 colistin 포함 된 조합 colistin 저항 격리16에 대 한 활동에 대 한 테스트에 집중 했다. Colistin은 일반적으로 그람 음성 병원 균17,18, MDR과 colistin 저항의 치료에 사용 하기 위해 예약 하는 마지막 수단의 마약 렌더링 이미 MDR 박테리아 거의 팬 저항19, 이상적 이다 그들은 구분 하지 않습니다 개별적으로 약물을 사용 하 여 새로운 치료 전략의 개발을 위한 후보자. 우리 colistin과 단백질 합성 억제제 항생제 minocycline의 조합 시너지, 심지어에 대 한 내성을 했다이 약의 각각 개별적으로, 아마도 colistin 미치는 subinhibitory 때문에 긴장의 매우 높은 비율을 했다 발견 심지어 colistin 내성 박테리아에 permeabilizing 효력입니다. 이 문서에 예제로 사용 하 여이 조합을 선택 했습니다. 메모의 시너지 테스트 또한 사용할 수 있습니다 개별적으로 효과적인 둘 다는 두 약물의 향상 된 효능에 대 한 평가.

자동화 된 바둑판 배열 방법 신속 하 고 높은 처리량 시너지 테스트 수 있습니다. 그러나, 바둑판 배열 방법에 한계는 수 있습니다. 으로 수정된 마이크 분석 결과 데이터의 세균 성장 억제에만 그리고 살인에 제공 하지 않는 데이터 항생제 효과에 시간이 지남에. 대조적으로, 시간 죽이기 시너지 분석 실험의 수동 성과 더 많은 노동 집약 하지만 24 시간 코스20,21이상 억제와 살인에 정보를 제공 합니다. 우리는 사용 하는 시간-죽 여 분석 우리의 바둑판 배열 결과 확인 하 고 식별 시너지 조합 했다 살 균 여부 결정 하에 격리 된 것의 더 작은 수에.

두 바둑판 배열 및 시간-죽 여 시너지 방법 약물 조합의 활동에 귀중 한 정보를 제공 되며 내성 세균 병원 균에 대 한 잠재적인 새로운 치료 옵션을 평가에 특히 유용 합니다. 메서드는 또한 고유의 제한 사항이 있습니다. 표준 microbroth 희석 마이크 방법 1 2 배 희석22, 두 약물은 바둑판 배열에 함께 테스트 때 증가 알려진된 예상된 오류 범위를 하고있다. 시너지, 시너지 조합 약 1 / 4 그들의 각각 마이크6에 함께 활성 경우에 고려이 고려의 표준 정의 예상 변화, 그러한 변화 (어떤 결과를 생각 하지만 생물학과 기술적인 변동23의 조합)에서 필연적으로 생성 하지 확실히 시너지 결과의 신뢰성에 대 한 합니다. 시너지 테스트용 설립된 품질 관리 기준의 부족은 또한 현재 제한 이다. 아마도 모든 시너지 테스트 방법의 가장 중요 한 제한 때 생체 외에서 결과 임상 결과 사이 설립된 상관 관계의 부족 조합 환자24치료 하는 데 사용 됩니다. 간단 하 고 더 빠른 시너지 메서드를 여기에, 설명 하는 자동된 바둑판 배열 방법 테스트 하기 위해서는 더 나은 임상 시험 또는 환자 결과의 다른 평가 테스트 생체 외에서 시너지의 통합 촉진 수 있습니다. 미래에 생체 외에서 그리고 vivo에서 효과 사이의 관계를 특징.

우리가 여기에 제시 하는 자동화 된 바둑판 배열 메서드 높은 처리량 검열의 다양 한 조합에 대 한 옵션을 제공 하 고 시간의 주요 투자 없이, "높은 위험 높은 보상" 조합의 빠른 평가 허용 하 고 자원입니다. 우리는 이후에 설명 하는 시간-죽 일 방법 결합의 시너지 활동에 추가 지원 정보를 제공할 수 있습니다 고의 살 균 활동 및 항균 활동을 특성화 하는 데 도움이 수 있습니다.

Protocol

주의: 적절 한 안전 절차를 사용 하 여 박테리아를 작업할 때. 항상 장갑과 실험실 코트를 착용. Biosafety 캐비닛에 어로 졸 생성 될 경우 또는 고 위험 병원 체 작업에서 작업을 수행 합니다.

참고: 20 ~ 24 h, 실험을 시작 하기 전에 혈액 한 천 배지 (50% 글리세롤 재고 tryptic 간장 국물에-80 ° C에서 냉동 식민지 정화, 최소한 passaged 재고)에서 테스트할 세균 isolate(s) 밖으로 행진. 주변 공기에 35 ° C에서 접시를 품 어.

1. 잉크젯 프린터 기반 자동된 바둑판 배열 시너지

  1. 항균 소재 솔루션 (colistin minocycline)을 확인 합니다.
    1. 항생제 재고 솔루션 농도 항생제의 가용성에 따라 바둑판 배열에 최종 농도 원하는 결정 합니다. 10 mg/mL 주식 colistin minocycline이 예의 확인 합니다. CLSI m 100 문서를 사용 하 여 각 항생제25에 대 한 적절 한 용 매를 결정. Colistin minocycline는 모두 수용 성; D300 잉크젯 프린터 적절 한 수성 유체 취급에 대 한 계면 활성 제의 추가 필요로 하기 때문에 초순 이온된 물 0.3% 폴 20에에서 항생제를 분해.
    2. 계산 볼륨의 목표 재고 농도 얻는 데 필요한 용 매 및 항생제 가루 분석 균형을 사용 하 여 밖으로 무게.
      1. 항생제 (colistin 황산, minocycline 염) 소금으로 또는 수 화 된 형태로 (예: meropenem 안내), 제공 되는 경우 또는 그것은 더 적은을 제조 업체에 의해 보고 하는 경우 100% 순도 보다 수행 하는 힘 계산26 솔벤트 필요한 수량을 결정 합니다.
      2. 900 mg/mg의 명시 된 순도와 minocycline 염 산 염의이 예제를 따라:
        순도 시험: 900 mg/mg
        콘텐츠 물: 없음
        활성 분수: 0.926 (minocycline 염 산 염 (493.94 Da)의 분자량에 의해 minocycline (457.48 Da)의 분자량을 나누어 얻은).
        힘 = (분석 결과 순) * (1-물 콘텐츠) * (활성 분수)
        = (900 mg/mg) * (1) * (0.926) = 833.4 mg/mg 또는 83.34%
        다음과 같이 필요한 용 매의 볼륨 확인:
        볼륨 (mL) = [무게 (mg) * 힘 (mg/mg)] ÷ [농도 (mg/mL)]
        그래서, 예를 들어 minocycline 염 산 염 분말의 34.7 mg 재 지, 하는 경우 사용 다음 계산 용 매 10 mg/mL 해결책을 만들기 위해 필요한 볼륨을 결정 하기 위해:
        볼륨 = (34.7 m g) * (833.4 mg/mg) = 2.89 mL
        10000 mg/mL
    3. 15 mL 원뿔 튜브에 항생제 가루를 부 어 하 고 물 0.3% 폴 20의 적절 한 볼륨을 추가 합니다. 해산 하는와 동
    4. 0.5 mL microcentrifuge 튜브와 저장소 사용에 대 한 준비까지-80 ° C에 aliquot 항생제 재고 솔루션.
  2. 시너지 시너지 테스트에 대 한 재고를 사용 하기 전에 QC 결과 평가할 수 있도록 테스트 전에 적어도 하루 바둑판 배열 실험에 사용 하기 위해 항균 주식의 품질 관리 (QC)를 수행 합니다.
    참고:
    여기에 설명 된 QC 기법은 기술을 최소 억제 농도 (MIC) 개별 약물의 테스트에 사용할 것이 고 같은 수 사관에 대 한 관심의 모든 변종 사용할 수 있습니다.
    1. 세균 현 탁 액을 준비 합니다.
      1. 세균 현 탁 액을 준비 하는 동안 녹고 시작-80 ° C 냉동 고에서 각 항생제의 약 수를 걸릴. 소용돌이 항생제 솔루션을 한 번 해 동.
      2. 적절 한 품질 관리 부담을 선택 하 고 마약 테스트 되 고 허용 가능한 마이크 범위 CLSI M10025 표 5A-1 에 따라 결정. 여기 약, 를 사용 하 여 대장균 ATCC 25922; 이 긴장에 마이크 범위는 0.25-1 mg/mL minocycline 및 0.25-2 mg/mL colistin.
      3. 전체 품질 관리 범위를 포함 하는 테스트를 항생제 농도의 범위를 선택 합니다. ATCC 25922 minocycline 및 colistin 0.0156 mg/mL 8 mg/mL의 범위를 사용 합니다.
      4. 12 x 75 mm 둥근 바닥 유리 문화 관에 0.9% 염화 나트륨의 1 mL를 추가 합니다. ATCC 25922와 소용돌이 부드럽게 중단의 하룻밤 접시에서 하나 또는 두 개의 식민지를 선택 합니다.
      5. 맥 팔 랜드의 리더를 사용 하 여 박테리아의 농도 확인 하십시오. 읽고 0.5 맥 팔 랜드 탁도 달성 하기 위해 더 많은 0.9% 염화 나트륨 또는 더 많은 박테리아를 추가 하 여 필요에 따라 조정 합니다.
      6. CLSI27에서 권장하는대로 양이온 조정 뮬러-힌 튼 국물의 (CAMHB) 5 x 105 CFU/mL, 최종 세포 밀도 도달 하는 50 mL 원뿔 튜브에 30 mL에 현 탁 액 100 mL를 추가 하 여 0.5 맥 팔 랜드 서 스 펜 션의 1:300 희석을 확인 합니다.
      7. 살 균 inoculating 루프, 절연 행진 시작 inoculum inoculum 순도 확인 하 여 주변 공기에 35 ° C에서 품 어 혈액 한 천 배지 위에 한 방울을 사용 합니다.
    2. 제 d 300을 사용 하 여 평면 바닥, 광장-잘, 명확, 치료 384-잘 접시에 추가 합니다. 서 스 펜 션 준비26의 15 분 이내 접시에 추가 수 세균 현 탁 액을 준비 후 즉시이 단계를 수행 합니다.
      1. D300 잉크젯 프린터와 연결 된 컴퓨터를 켭니다. 소프트웨어 프로그램을 엽니다.
      2. 새 파일을 시작 합니다. 플레이트 그리드 이미지 위에 접시 1 를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 접시를 편집을 선택 합니다. 적절 한 판형 (384 잘) 및 추가 볼륨 (50 mL)을 선택 합니다.
      3. 왼쪽 패널에 체액 옆의 더하기 기호를 클릭 하 여 프로토콜에 체액 (즉, 항생제 주식)를 추가 합니다. 두 체액 (colistin 및 minocycline)를 추가 합니다.
        1. 액체 1 나타난 패널 가져갑니다 고 연필 편집을 클릭 합니다. 액체 "Colistin" 이름을, 클래스 변경 "수성 + 트윈 20", 10000, 농도 변경 및 농도 단위 mg/mL (참고 사진 농도 10mg/mL, 즉, 10000 mg/mL)를 변경. 농도 에서 디스 펜스 by를 두고 그들의 기본 설정에는 필드의 나머지 떠나. 확인을 클릭 합니다.
        2. 액체 2 (minocycline)에 대 한 위의 절차를 반복 합니다.
        3. 화면 상단에 있는 현재 프로토콜 탭을 클릭 하 고 마지막 잘 항생제 농도 사용 되는 단위를 확인 하기 위해 mg/mL 농도 (질량) 변경 합니다.
      4. 클릭 하 여, 눈금에서 10 웰 스를 선택한 다음 화면 상단에 적정 클릭. 지정 적정을 사용 하 여 선택 높은 농도, 유체 Colistin선택, 높은 농도 대 한 8 입력 (확인 단위는 mg/mL), 및 배포 에 대 한 1:2 (50%)을선택 합니다. 두고 기본 값에서 윈도우의 나머지 부분에 대 한 장소 확인을 클릭 합니다.
      5. Minocycline 적정을 생성 하는 minocycline에 대 한 위의 절차를 반복 합니다.
      6. 프로토콜을 저장 하 고 왼쪽 상단에 실행 버튼을 클릭 합니다.
      7. 시작 단추를 클릭 합니다. 384-잘 접시 접시 홀더 (뚜껑 제거)와 로드 하 고 로드 "로드 플레이트 1-시너지" 아래 프롬프트 누릅니다.
        참고: 이 프롬프트는 소프트웨어에 의해 선택 되 고 시너지 테스트 되 고 실행 하 고 표시 되지 않습니다. T8 + 카세트를 카세트 슬롯에 놓고 Loaded 로드 T8 + 카세트를 프롬프트 누릅니다.
      8. 프롬프트가 표시 되 면, 카세트에 표시 된 저수지에 항생제 재고 솔루션을 추가 합니다. 적절 한 로드 화면에서 지시 하 고 솔루션에 어떤 거품 되지 않도록 신중 하 게 분배. 각 솔루션 추가 후 채워진 단추를 누릅니다.
      9. 잉크젯 프린터는 각 잘 및 완료 된 실행 상자에 적절 한 볼륨에 항생제 주식 나타납니다 추가 했습니다, 일단 닫기를 클릭 하 고 제거 하십시오, D300 해제.
    3. 384-잘 접시에 세균 정지를 추가 하 고 접시를 품 어.
      1. 살 균 시 저수지로 이전 준비 세균 현 탁 액을 붓는 다.
      2. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 모든 항생제 포함 된 우물에 세균 현 탁 액 50 mL를 추가. 빈 영역; 박테리아 없이 CAMHB의 50 mL를 추가 이 부정적인 제어 됩니다 미디어의 무 균을 확인 하는 게.
      3. 35 ° C 주변 공기 인큐베이터에 접시를 놓고 16-20 h26품 어.
        참고: 외피의 다른 기간 해야 Enterobacteriaceae 보다 다른 유기 체는 테스트 되 고; CLSI m 10025 유기 체 관련 권장 사항을 참조 하십시오.
    4. 600 (OD600)의 광 밀도 microplate 리더에 접시를 읽기 및 결과 분석.
      1. ≥0.07 녹색, 성장, 및의 값이 있는 셀을 나타내는 OD600 값 셀 음영 스프레드시트 프로그램을 사용 하 여, < 0.07 빨강, 아니 성장을 나타내는.
        참고: 이러한 값 없는 성장과 상호;이 실험에 대 한 외경 판독 대 성장의 육안 검사에 따라 결정 되었다 혼자 미디어를 포함 하는 우물에서 OD600 판독 0.07 아래 일관 되 게 했다. 적절 한 차단 다른 접시 독자와 박테리아와 달라질 수 있습니다.
      2. 각 약물에 대 한 마이크를 결정 합니다. 마이크는 박테리아의 성장을 억제는 약물의 가장 낮은 농도 이다.입니다. 마이크 CLSI M100 문서25에 따라 예상된 품질 관리 범위 내 인 경우에, 재고 솔루션은 사용 하기에 적합.
  3. 바둑판 배열에 대 한 세균 현 탁 액을 준비 합니다.
    1. 세균 현 탁 액을 준비 하는 동안 녹고 시작-80 ° C 냉동 고에서 각 항생제의 약 수를 걸릴. 항생제를 되도록 한번 해 동 하는 소용돌이 솔루션에.
    2. 12 x 75 mm 둥근 바닥 유리 문화 관에 0.9% 염화 나트륨의 ~ 1 mL를 추가 합니다. (이 경우, E. 콜라이 긴장 FDA CDC 0494)에서 박테리아와 부드럽게이 0.9% 염화 나트륨을 일시 중단 하는 소용돌이의 하룻밤 접시에서 하나 또는 두 개의 식민지를 선택 합니다.
    3. 맥 팔 랜드의 리더를 사용 하 여 박테리아의 농도 확인 하십시오. 읽고 0.5 맥 팔 랜드 탁도 달성 하기 위해 더 많은 0.9% 염화 나트륨 또는 더 많은 박테리아를 추가 하 여 필요에 따라 조정 합니다.
    4. 5 x 105 CFU/mL27의 마지막 셀 밀도 도달 하는 50 mL 원뿔 튜브에 CAMHB의 30 mL를 100 mL의 정지를 추가 하 여 0.5 맥 팔 랜드 서 스 펜 션의 1:300 희석을 확인 합니다.
  4. 제 d 300을 사용 하 여 평면 바닥, 광장-잘, 명확, 치료 384-잘 접시에 추가 합니다.
    참고:
    정지 준비2615 분 이내 판에 추가 될 수 있는 세균 현 탁 액을 준비 후 즉시이 단계를 수행.
    1. 잉크젯 프린터를 켜십시오, 새 파일을 시작 하 고 단계 1.2.2.1-1.2.2.3는 프로토콜에 체액을 추가.
    2. 시너지 그리드를 생성 합니다.
      1. 화면 상단에 시너지 효과 아이콘을 클릭 하 고 단계를 통해 진행. 형식 에 대 한 함께 고려 하는 두 개 이상의 체액을 선택 합니다. 접시, 그것은 필요 하지 않습니다 어떤 우물;를 제외 하 클릭 하십시오 다음 이 단계를 변경 하지 않고.
      2. 적정 탭에서 항생제 농도 위치를 입력 합니다.
        1. Minocycline 0.031 mg/mL, y 축 아래로 아무 항생제와 부정적인 잘 이외에 32에서 배로 희석을 감소에 추가 하려면 왼쪽된 패널에서 사용 적정 레벨 12을 입력 합니다. 지정 적정 사용에 대 한 선택 높은 농도; 액체, 선택 Minocycline; 높은 농도, 32 (단위 mg/mL에서 설정 되어; 없으면, 시너지 효과 대화 상자를 닫습니다 및 현재 프로토콜 탭 변경 있는지 확인)를 입력 합니다. 0 값 상자가 선택 되어 있는지 확인 합니다. 1:2 (50%)로 분포 를 변경 합니다.
        2. Colistin 적정 수준 12 및 16의 높은 농도 사용 하 여 오른쪽 패널에 대해 이러한 단계를 반복 합니다. 다음을 클릭 합니다.
      3. 레이아웃 탭에서 레이아웃 표의 열과 행의 수를 결정 하는 처음 2 체액의 적정 수준을선택 합니다. 다음을 클릭 합니다. 격자에 예상 대로 표시 되 면 완료를 클릭 합니다.
    3. 프로토콜을 저장 한 다음 왼쪽 상단에 있는 실행 단추를 클릭 합니다.
    4. 시작 단추를 클릭 합니다. 384-잘 접시 접시 홀더 (뚜껑 제거)와 로드를 누르고 로드 부하 플레이트 1-시너지 프롬프트. T8 + 카세트를 카세트 슬롯에 놓고 Loaded 로드 T8 + 카세트를 프롬프트 누릅니다.
    5. 프롬프트가 표시 되 면, 카세트에 표시 된 저수지에 항생제 재고 솔루션을 추가 합니다. 적절 한 로드 화면에서 지시 하 고 솔루션에 어떤 거품 되지 않도록 신중 하 게 분배. 각 솔루션 추가 후 채워진 단추를 누릅니다.
    6. 각 잘 및 완료 된 실행 상자에 적절 한 볼륨에 항생제 주식 나타납니다 D300 디스펜서가 추가 되 면 끝내기를 클릭 합니다, 그리고 접시를 제거 하 고 D300 해제.
  5. 384-잘 접시에 세균 정지를 추가 하 고 접시를 품 어.
    1. 살 균 시 저수지로 이전 준비 세균 현 탁 액을 붓는 다.
    2. 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 바둑판 배열에 있는 모든 우물에 현 탁 액 50 mL를 추가. 빈 영역; 박테리아 없이 CAMHB의 50 mL를 추가 이 부정적인 제어 됩니다 미디어의 무 균을 확인 하는 게. 16-20 h2635 ° C 주변 공기 인큐베이터에서 품 어.
  6. 접시 세600 microplate 리더에 읽었고 바둑판 배열 결과 분석.
    1. 첫째, 순도 플레이트를 확인 하 고 테스트 중인 생물의 예상된 형태와 일치 하는 단일 형태학의 고립 된 식민지 인지 확인.
    2. 스프레드시트 프로그램을 사용 하 여, 세포 성장 및 단계 1.2.4.1 에서처럼 성장이 그늘.
    3. 각 약물에 대 한 마이크를 결정 합니다. 테스트 하는 가장 높은 농도에서 박테리아의 성장을 억제 하지 않는 약물에 대 한 마이크 규모 오프 될 여겨진다.
    4. 각 잘 성장 저해입니다, 각 항생제는 항생제의 마이크에 따라 소수 금지 농도 (FIC) 결정 ( 그림 1B 그림 2B참조).
      참고: FIC는 항생제에 잘 성장; 그것의 마이크 대기의 농도의 비율입니다. 그래서 잘 포함 4 mg/mL는 0.5 FIC 8 mg/mL의 마이크와 함께 약물, 그 약물의 잘 포함 8 mg/mL 1, FIC는.
    5. 각 잘 성장에 그 잘 약의 각각의 금융 합으로 대기에 대 한 소수 금지 농도 (FIC) 인덱스 값을 계산 합니다.
    6. 최저 FIC 성장에 저해 (최소 FIC)를 결정 합니다. 최소 FIC £0.5 이면 고려 결합 시너지; 경우 0.5-4, 결합 무관심; 고려 그리고 > 4, 대립 된 조합을 고려 하십시오. 조합에 대립 하지만 일부 농도 조합에 시너지 인 경우이 결과 참고 하지만 조합을 고려 전체 대립.

2. 시간-죽 여 시너지 테스트

  1. 항균 성 재고 솔루션을 확인 합니다. 앞으로 실험이이 단계를 수행 하는 경우 사용 하기 위해 준비까지-80 ° C에서 주식을 동결.
    1. 항생제 재고 솔루션 농도 항생제의 가용성에 따라 시간 죽 일 연구에 최종 농도 원하는 결정 합니다. 이 예제에서는 1 mg/mL의 농도에서 colistin 및 minocycline 주식을 확인 합니다. CLSI m 100 문서를 사용 하 여 각 항생제25에 대 한 적절 한 용 매를 결정. 물를 사용 하 여 colistin와 minocycline에 대 한 권장.
    2. 계산 볼륨의 목표 재고 농도 얻는 데 필요한 용 매 및 항생제 가루 분석 균형을 사용 하 여 밖으로 무게. 필요한 경우 1.1.2.1 위의 단계에서 설명한 대로 필요한 용 매의 수량을 결정 하기 전에 힘 계산을 수행 합니다.
    3. 붓고 항생제 가루 15 mL 원뿔 튜브 고 물의 적절 한 볼륨을 추가 합니다. 해산 하는와 동
  2. 항균의 QC를 수행 CLSI M0726일에 설명 된 수동 국물 microdilution 메서드를 사용 하 여 시간에 사용 하기 위해 주식 시너지 효과 실험을 죽 일. 적어도 하루 시너지 QC 결과 재고를 사용 하기 전에 검토 될 수 있다을 테스트 하기 전에이 단계를 수행 합니다.
    1. 적절 한 품질 관리 부담을 선택 하 고 마약 테스트 되 고 허용 가능한 마이크 범위 CLSI M10025 표 5A-1 에 따라 결정. 여기 약, 를 사용 하 여 대장균 ATCC 25922; 이 긴장에 마이크 범위는 0.25-1 mg/mL minocycline 및 0.25-2 mg/mL colistin.
    2. 항생제 포함 국물 microdilution 접시를 준비 합니다.
      1. 그래서 전체 품질 관리 범위에 포함 될 수 있습니다 테스트 하는 항생제의 가장 높은 농도 선택 합니다. ATCC 25922 minocycline 및 colistin 0.016 ~ 8 mg/mL의 범위를 사용 합니다.
      2. 두 번 필요 (때문에 박테리아의 1:1 희석된 될) 높은 농도에 CAMHB에서 작업 솔루션 항생제 주식 희석. 이 예제에서는 16 mg/mL에 10 mg/mL에서 모두 주식을 희석.
      3. 다중 채널 피 펫을 사용 하 여, 명확 하 고, 라운드-하단, 치료 96 잘 접시의 첫 번째 열에 잘에 항생제 정지 x 2의 각각의 100 mL를 추가 하 고 후속 열의 각 음을 (즉, 없이 항생제) 일반 국물의 50 mL를 추가.
      4. 포함 하는 항생제의 50 mL 제거 국물에서 첫 번째 열에서 잘 하 고 두 번째 열에 있는 우물에 추가. 항생제 농도 생성 내용을 절반 섞어 여러 번 왔다 갔다 피 펫의 첫 번째 열에 있는 농도.
      5. 있도록 직렬 2 배 희석, 각각 50 mL의 볼륨의 일련은 준비 단계 2.2.2.4 각 열을 반복 합니다. 항생제 carryover의 가능성을 제거 하려면 원하는 경우 변경 피펫으로 각 희석 단계 사이 팁. 참고 결과 농도 최종 농도 x 모든 여전히 2 그들은 이후에 세균 현 탁 액으로 1:1 희석된 될 것입니다.
      6. 이러한 부정 및 성장 제어 열 될 것입니다 마지막 두 개의 열을 어떤 항생제를 추가 하지 마십시오.
    3. 세균 현 탁 액을 준비 합니다.
      1. 1.2.1.5-1.2.1.6 단계에에서 설명 된 대로 대장균 ATCC 25922에서 0.9% 염화 나트륨의 하룻밤 접시에서 0.5 맥 팔 랜드 정지를 준비 합니다.
      2. CAMHB의 7.5 mL에 현 탁 액 50 mL를 추가 하 여 0.5 맥 팔 랜드 서 스 펜 션의 1:150 희석을 확인 합니다.
        참고: 최종 세균 현 탁 액 희석된 1:300 면 됩니다 그것은 항생제 솔루션, 5 x 105 CFU/mL27CLSI 권장 셀 밀도 도달와 1:1 혼합).
    4. 박테리아는 microplate에 추가 하 고 품 어.
      1. 11번째 열에서 제외 하 고 각 우물에 세균 현 탁 액 50 mL 추가 합니다. 11번째 열 (부정적인 제어 열)에 CAMHB의 50 mL를 추가 합니다.
      2. 16-20 h 35 ° C에서 접시를 품 어.
        참고: 외피의 다른 기간 해야 Enterobacteriaceae 보다 다른 유기 체는 테스트 되 고; CLSI m 10025 유기 체 관련 권장 사항을 참조 하십시오.
      3. 전송 된 빛을 사용 하 여 시각적으로 성장에 대해 읽었고, 각 항생제에 대 한 결정은 성장이; 가장 낮은 농도 이것은 마이크입니다. 에 대 한 자세한 내용은 마이크26의 시각적 해석 CLSI M07 문서를 참조 하십시오. 마이크는 예상된 품질 관리 범위 내 인 경우 재고 솔루션은 사용 하기에 적합.
  3. 초기 문화를 시작 합니다.
    1. 게는 0.5 0.9%의 살 균 시험 생물의 맥 팔 랜드 정지로 NaCl 위에서 설명한.
    2. 맥 팔 랜드 정지 25 mm x 150 mm 유리에 CAMHB의 5 mL 라운드 스테인리스 폐쇄와 소용돌이를 섞어 부드럽게 하단 문화 관 0.5의 100 mL를 추가 합니다.
    3. 살 균 inoculating 루프, 절연 행진 inoculum 순도 확인 하 여 주변 공기에 35 ° C에서 품 어 혈액 한 천 배지로 희석된 현 탁 액의 한 방울을 사용 합니다.
    4. 튜브에 폐쇄를 대체 하 고 로그 위상 성장 (단계 2.6.1 참조)에 도달할 때까지 적어도 3 h에 대 한 주변 공기에 35 ° C에서 통에 테스트 튜브 랙에서 품 어. 문화 인큐베이터에는 2.4 단계로 진행 합니다.
  4. 유리 문화 관 25 m m x 150 m m에서 항균 솔루션을 준비 합니다.
    1. 꺼내 항균 소재 aliquots-80 ° C 냉장고에서 해 동. 항생제를 되도록 한번 해 동 하는 소용돌이 솔루션에.
    2. 초기 문화 잠복기 동안 5 압력가 25 mm x 150 mm 유리 문화 관에 CAMHB의 10 mL를 추가 하 고 다음과 같이 항균 재고 솔루션을 추가.
      참고: 시너지 효과 연구에 대 한 하나 이상의 약물 이어야 한다 성장에는 영향을 주지 않는 농도에 개별적으로28; 곡선 이 시너지 연구 전에 개별 약물 농도의 효과 평가 하 여 결정할 수 있습니다.
      1. 1 관: 적절 한 양의 항생제 #1 대상 최종 항생제 농도를 추가 합니다. 이 경우에, 이것은이 예제에 사용 된 긴장에 대하여 효과적 이다 농도 1 mg/mL의 최종 colistin 농도를 1mg/mL colistin 주식의 10 mL를 추가 합니다.
      2. 2 관: 적절 한 양의 항생제 #2 시험 될 마지막 항생제 농도를 추가 합니다. 이 경우에, 1 mg/mL,이 예제에서 사용 되는 스트레인에 대 한 효과 농도의 최종 농도를 1mg/mL minocycline 주식의 10 mL를 추가 합니다.
      3. 3 관: 항생제 #1 항생제 #2 튜브 1과 2에에서 사용 되는 동일한 수량을 추가 합니다. 이 경우에, 1 mg/mL minocycline 주식의 10 mL 및 1 mg/mL colistin 재고의 10 mL를 추가 합니다.
      4. 4 관: 추가 없음 항생제; 이 성장 제어 튜브를 될 것입니다.
      5. 5 관: 추가 없음 항생제; 이 부정적인 제어 튜브를 될 것입니다.
  5. 행 B H 열 1-5의 멀티 채널 피 펫 멸 균 0.9% 염화 나트륨의 900 µ L을 추가 하 여 2 mL 웰 스와 96 깊은 잘 폴 리 프로필 렌 플레이트 직렬 희석에 대 한 준비.
  6. 시작 inoculum을 준비 하 고 관에 추가.
    1. 초기 문화 대 수 성장 단계 ( Klebsiella 균,이 예에 사용 된 유기 체를 위한 3 h)에 도달 했습니다, 제거 하 고 문화 관 쉐이 커에서 소용돌이 부드럽게, 서 스 펜 션의 ~ 1 mL를 전송 12 m m x 75 m m 유리 문화 관, 그리고 맥 팔 랜드 리더와 밀도 확인 합니다.
      1. 미만 1.0 맥 팔 랜드 이면 뿌리에 튜브를 반환 하 고 더 이상 품 어. 1.0 맥 팔 랜드 보다 큰 경우는 튜브에 CAMHB를 추가 소용돌이, 부드럽게 하 고 다시, 1.0 맥 팔 랜드에 정지 될 때까지 과정을 반복.
    2. 관 1-4에 1.0 맥 팔 랜드 서 스 펜 션의 100 mL와 소용돌이 부드럽게 추가 합니다.
  7. 각 문화에서 aliquots 샘플 하 고 ten-fold 희석 일련을 수행 합니다.
    1. (직후 관에 박테리아를 추가) 시간 0와 1, 2, 4, 6, 및 24 시간에서 되도록 살 균 피 펫 팁만 입력 튜브 하지 unsterile pipettor 샤프트 aliquot 철수 하는 동안 튜브를 기울임으로써 각 문화 관에서 150 mL aliquot를 제거 합니다. 이전 준비 96 깊은 잘 격판덮개의 첫 번째 행에 연속 우물에 각각, aliquots를 추가 합니다. 각 시간 지점에서 aliquots를 제거 직후 35 ° C 주변 공기 인큐베이터에서 통에 테스트 튜브 랙 튜브 반환 합니다.
    2. 100 mL 행 A에서에서 제거 행 B (900 mL의 0.9% 염화 나트륨을 포함), 추가 하 고 위쪽 및 아래쪽에 4-5 회 플라스틱 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여, 1시 10분을 만드는 혼합 희석. 각 희석 단계 잘못 높은 식민지 조사로 이어질 수 있는 박테리아의 carryover를 방지 하기 위해 다음과 같은 팁을 버리십시오.
    3. 각 행에 대 한 새로운 피 펫 팁 행 B H 단계 2.7.2를 반복 합니다.
  8. 플레이트 드롭 접시 방법29,30을 사용 하 여 식민지 카운트에 대 한 샘플을 희석.
    1. 뮬러-힌 튼 항생제 조건 및 도금을 희석 한 천 배지를 레이블을 지정 합니다.
    2. 멀티 채널 피 펫 및 extra-long 팁 (팁 정지에 도달 하는지 확인)을 사용 하, 1 열에 각 우물에서 10 mL을 제거 하 고 신중 하 게 레이블이 표시 된 접시에 행에 분배. 작은 (직경 100 m m) 접시를 사용 하는 경우 분배 접시; 당 3 행 (단일 열의 행 A H에서에서 상품의 구성) 대형 (150 m m 직경) 접시에 접시 당 8 행을 분배.
    3. 허용 완전히 건조 상품 (~ 15 분).
    4. 24 h에서 불 임에 대 한 테스트 판 중의 지정 된 영역에서 부정적인 제어 튜브에서 직접 찍은 10 mL 드롭 장소. 접시를 반전 하 고 주변 공기에 35 ° C에서 밤새 품 어.
  9. 식민지를 계산 하 고 셀 밀도 계산. 이중 계산 또는 누락 된 식민지를 피하기 위해 접시의 반전에 벌금-팁 영구 표시와 함께 식민지를 표시 합니다.
    1. 첫째, 순도 플레이트를 확인 하 고 테스트 중인 생물의 예상된 형태와 일치 하는 단일 형태학의 고립 된 식민지 인지 확인.
    2. 각 희석 시리즈 3-30 식민지 (희석 시리즈 당 일반적으로 1 개의 하락)와 방울을 식별 합니다. 이러한 상품에 식민지 세 고 희석 요인이 함께 수 기록.
      1. 3-30 식민지 희석 시리즈에 없는 상품 경우 계산으로 마지막 한 방울에 식민지 > 30 식민지와 함께 첫 번째 드롭 다운 < 3 식민지 (이 인접 한 방울 해야 합니다).
    3. 각 희석 시리즈에 대 한 다음 수식을 사용 하 여 드롭에서 식민지의 수에 따라 샘플에서 밀리 (CFU/mL) 당 단위를 형성 하는 식민지의 수를 계산: CFU/mL n= (1 /d) (100) n 은 식민지의 수 d 는 희석 요인 (undiluted 샘플 (A 행) 1, 0.1 또는 10-1 첫 번째 1:10 희석 (B 행), 0.01 또는 10-2 두 번째 1:10 희석 (C 행), 및, 및 사실에 대 한 상수 100 계정은 드롭의 총 볼륨 내가 s 10 mL, 최종 값 CFU/mL, 즉, CFU/1000 mL에에서 표현 하는 동안. 이 프로세스를 단순화 하기 위해 식민지 카운트에서 CFU/mL를 계산 하는 수식이 포함 된 스프레드시트를 사용 합니다.
      1. 희석 시리즈 어디 한 방울 이상 수 (또는 하락 범위에 빠진 두 방울 때문에 계산을 했다), 모든 계산된 상품에 대 한 최종 CFU/mL 수 평균.
      2. 검출 하 한 희석 시리즈를 위한 £300 CFU/mL로 300 CFU/mL (undiluted 드롭에서 3 식민지), 기록 및 플롯 식민지 수 되므로 < undiluted 드롭 3 식민지.
    4. 검사 시간 24;에서 무 균 제어 드롭 어떤 성장이이 드롭에서 관찰, 실험의 결과 사용 되어야 한다.
  10. 그래프 및 결과 분석.
    1. 3 항생제 포함 된 문화와 동일한 그래프에 성장 제어에서 성장 곡선을 플롯. X 축과 y 축에 로그 눈금을 사용 하 여 CFU/mL에 시간을 플롯 합니다.
    2. 24 시 조합 튜브와 24 시간에서 가장 활발 한 단일 에이전트 CFU/mL에서 차이 계산 합니다. 차이 ≥2 로그10인 경우에, 조합을 고려 하십시오는 시너지. 다음 24 시간에 그리고 시간 0에 조합 튜브 CFU/mL에서 차이 계산 합니다. 차이 ≥3 로그10인 경우에, 조합을 고려 하십시오는 살 균.

Representative Results

그림 1A 는 바둑판 배열 시너지 실험 0-32의 농도에 minocycline에 μ g/mL 0-16 μ g/mL의 농도에서 colistin 결합 되었고 대장균 스트레인 FDA CDC 0494에 대 한 테스트에서 그리드를 제공 합니다. 값은 광학 밀도 600 nm (OD600)에서 spectrophotometric 신호를 나타냅니다. 웰 스 (육안 검사에 의해 아무의 성장에 해당)는 0.07 아래 세600 값은 회색된 빨강, OD600 값 (육안 검사에 의해 성장에 해당)는 0.07 우물은 회색된 녹색 동안. 각 약물에 대 한 최소 억제 농도 (MIC, 굵게)은 박테리아의 성장을 억제 하는 약물의 가장 낮은 농도가 이다. Minocycline에 대 한 32 μ g/mL, 이며 colistin, 8 μ g/mL입니다. 음영 그림 1B에 유지 하지만 성장 저해입니다 우물 안에 값 소수 금지 농도 (FIC) 인덱스 값으로 대체 됩니다. 이 다음과 같이 결정 됩니다: 각 잘에서 각 약물의 소수 억제 농도 인덱스 (FIC)은 약물의 마이크에 의해 잘에 항생제의 농도 나누어 계산 하 고는 FIC 두 금융을 합산 하 여 계산 됩니다. FIC 값이 0.5, 시너지 효과 대 한 구분 이라고 여겨진다, 웰 스 깨진 선 테두리 표시 됩니다 그리고 FIC 최소값 (0.094)와 잘 굵게. FIC 최소값 시너지 범위에 있기 때문에 조합은 시너지 간주 됩니다.

그림 2A그림 2B 격자 그림 1A1B 그림에서 그들에 유사한 보여주지만,이 경우에 조합 입증 하지 않습니다 격리 테스트 (K. 균 분리 BIDMC 4)에 대 한 시너지 효과 때문에 최소 FIC 성장 대기는 이다 1 > 0.5.

그림 3 여러 건너뛴된 웰 스 (Enterobacter cloacae 복잡 한 격리 BIDMC 27) 발생 한 바둑판 시너지 그리드에서 광학 밀도 수치를 보여 줍니다. 건너뛴된 우물 우물 세균성 성장 항생제의 높은 농도와 인접 한 우물에 세균 성장의 존재에도 불구 하 고 대기는. 표준 마이크 테스트 뿐만에 알려져,이 현상 이며 세균성 성장 특성에서 생물 다양성으로 인해 잘 잘 세균성 inoculum23 의 작은 차이에 항생제의 감도에 , 31 , 32. 경우 하나 이상의 건너뛴 바둑판 배열에서 잘 발생, 우리는 결과 삭제 하 고 분석 결과 반복.

3 조합 공화국 균 에 대 한 테스트의 시간-죽 여 시너지 결과 그림 4 선물 예 BIDMC 32 격리 합니다. 식민지 수 y에 로그 눈금에 표시 됩니다-축 및 시간, 시간, x-축. 24 h에 튜브에 빨간 바와, 24 h 튜브 사이 박테리아의 농도 차이 동안 일러스트는 박테리아의 농도 약물 조합 포함 된 튜브에 시작 inoculum의 차이 조합 및 혼자 가장 활발 한 에이전트를 포함 하는 튜브에 파란색 바와 그림입니다. 그림 4A colistin minocycline;의 조합에서 결과 보여줍니다. 이 결합은 시너지 (조합 하 고 가장 활성 에이전트 혼자 ≥2 로그10 CFU/mL 24 h에서 노출 하는 박테리아의 농도 사이의 차이) 및 살 균 (감소 inoculum 24 h ≥3 로그10 에서 농도에 시작 CFU/mL). 그림 4B colistin clindamycin의 조합, 시너지 했지만 살 균 했다 조합에서 결과 표시 합니다. 이 조합은 마약 혼자, 그러나 그들을 죽이지 않았어요도 박테리아의 성장을 억제. 그림 4C colistin 리스로 마이 신, 살 균도 시너지는의 조합에서 결과 표시 합니다.

Figure 1
그림 1: 바둑판 배열 보여주는 시너지 (minocycline + colistin FDA CDC 0494 변형 대장균 에 대 한 테스트) 결과. 바둑판 배열 (A) Spectrophotometric 판독 및 성장 해석. 셀의 값은 광학 밀도 값 600 nm (OD600). OD600 값 0.07 (육안 검사에 의해 성장이 해당) 아래 셀 셀 세600 값 0.07 (육안 검사에 의해 성장에 해당)는 회색된 녹색 회색된 빨강, 있습니다. (B) 소수 억제 농도 지 수 (FIC) 계산 합니다. 음영을 나타내는 성장 또는 성장이 유지 되었습니다. Colistin 및 x-와 yminocycline 값-축, 각각, 지금 대표 소수 금지 농도 (FIC), 또는 해당 열 또는 행 최소 억제 농도 (약물의 농도의 비율 마이크) 혼자 약의. 각 셀에 값이 있는 FIC또는 두의 금융 합 잘에 마약. 큰 깨진된 라인 경계 상자는 FIC 0.5와 웰 스를 포함합니다. 두꺼운 경계 셀은 최저 FIC 는 성장 저해입니다, 나는 최소 FIC잘을 나타냅니다. 최소 FIC 0.5 이므로, 결합 시너지 간주 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 바둑판 배열 결과 시너지 (minocycline + colistin K. 균 에 대 한 테스트 BIDMC 4 격리)을 입증 하지 않는 조합입니다. 바둑판 배열 결과 그림 1A에 대 한 설명 된 대로의 600 nm 및 성장 해석에서 (A) 광학 밀도 값. (B) 소수 금지 농도 (FIC) 인덱스 계산 그림 1A에 대 한 설명. 최소 FIC 때문에 > 0.5, 조합으로 간주 되지 않습니다 시너지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 바둑판 배열 결과 때문에 해석할 수 있지 않은 웰 스 (minocycline + colistin Enterobacter cloacae 복잡 한에 대 한 테스트 분리 BIDMC 27) 생략. 바둑판 배열 결과 그림 1A에 대 한 설명 된 대로의 600 nm 및 성장 해석에서 광학 밀도 값. 세균성 성장 항생제의 높은 농도와 인접 한 우물에 성장의 존재에도 불구 하 고 대기 건너뛴된 웰 스는 설명 했다. 결과 해석할, 하지 않으며 실험을 반복 해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 시간 죽이기 시너지 결과 3 조합 공화국 균 격리 BIDMC 32에 대 한 테스트입니다. 식민지 수 y에 로그 눈금에 표시 됩니다-축 및 시간, 시간, x-축. 튜브에 24 h에 조합에는 박테리아의 농도 시작 inoculum의 차이 빨간 바와 그림입니다. 24 h에서 농도에 inoculum을 시작부터 감소 ≥3 로그10 CFU/mL 인 경우에, 조합은 살 균으로 간주 됩니다. 24 h는 조합을 포함 하는 튜브와 튜브 혼자 가장 활발 한 에이전트를 포함 하는 박테리아의 농도 차이 파란색 바와; 그림입니다. ≥2 로그10 CFU/mL 감소는, 결합 시너지 간주 됩니다. (A) Colistin (중부 표준시) + minocycline (최소), 시너지 효과 살 균 조합. (B) Colistin + clindamycin (CLI), 시너지만 아니라 살 균 조합. (C) Colistin + 리스로 마이 신 (ERY), 시너지도 살 균 조합. 이러한 결과 colistin 포함의 시너지 활동의 연구의 일환으로 처음 출판 되었다 조합 colistin 저항 Enterobacteriaceae, 우리가 그 colistin을 시연에 대 한 했다의 숫자와 함께 시너지 항생제만 개별적으로 활성화 되는 (예: clindamycin) 또는 주로 (예:에 리스로 마이)16그람 양성 세균 대 한. (리스로 마이 신, 스트레인에 대 한 바둑판 배열에 의해 시너지는 하지만 선정 되지 않은 시간-죽 여 그래서 그것은 비-시너지 조합 예를 들어 여기.) 우리는 가설 colistin 그람 음성 외부 막의 permeabilization에 의해 행동 알려져, clindamycin과 같은 약물의 항목을 수 있도록 colistin 내성 그람 음성 박테리아에 하위 permeabilizing 효력을 미치는 일반적으로 그람 음성 세포를 입력할 수 없습니다. 이 그림의 (A) 패널 브 레 넌 Krohn, Pironti, 그리고 커비 201816, 저작권 © 미국 사회 미생물학, 항균 성 대리인 및 화학요법에 대 한 수정 된 62(10), 2018, pii: e00873-18, doi: 10.1128/AAC.00873-18. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

여기 설명 하는 두 가지 방법 모두는 그들의 개별 활동에 비해 사용 하는 제 활동에 대 한 정보를 제공 합니다. 자동된, 잉크젯 프린터 기반 디지털 시간 죽 일 방법은 더 밀접 하 게 같은에서 해당 프로토콜을와 하는 동안 임상 미생물학 절차 핸드북33에서 설명 하는 방법의 적응은 분배 방법 34참조.

바둑판 배열 방법에서 각 잘 추가할 항균 재고의 필요한 볼륨 뿐만 아니라 이러한 볼륨의 분배를 결정 하는 계산 자동화 된다, 따라서 설명서에 발생 하는 오류의 주요 잠재적인 소스 중 일부를 제거 바둑판 배열입니다. 그러나 여전히 필수적 이다,, 그는 탐정 결정 원래 주식 의도 농도에서 만들어집니다 목표 최종 농도 D300 소프트웨어에 올바르게 입력 됩니다. 384-잘 접시에 웰 스 항균 정지 처음에 어려울 수 있습니다 및 개호 추가 되도록 그 피 펫 팁 적절 한 우물을 입력 하 고 우물의 가장자리를 그 액체에서 물보라를 하지 않습니다. 자동된 액체 처리기 증가 속도 정확성 있는 세균 현 탁 액 우물에 추가 하는 휴대용 멀티 채널 피 펫 대신 사용할 수 있습니다. 프로토콜에 설명 된 대로 D300 계면 활성 제, 폴 20 (P-20), 적절 한 액체 처리의 추가 요구 한다. 다른 계면 활성 제, 폴 80, 0.002%의 농도에 colistin 마이크와 유기 체를 위한 colistin 마이크 낮은 지적 하고있다 < 표준 국물 microdilution 분석 실험에서 2 µ g/mL. 35 , 36 우리의 실험실 이전 시연 하는 농도 0.0015% 했다 D300 기반 마이크와 비교 결과에 영향을 주지 않습니다 P-20 BMD14참조. 여기에 제시 된 분석 결과 예제에서 최대 P-20 농도 0.0014%입니다.

일부 바둑판 배열 분석 우리가 발생 한 1 개의 문제는 건너뛴된 우물의 많은 수 이었다. 이 특정 항생제로 과도 한 속도로 발생 했습니다. 특히, carbapenem 저항 Enterobacteriaceae의 컬렉션에 대 한 조합의 화면에서 우리는 동안 발견 521 재판 (9.4%)의 49 여러 건너뛴된 웰 스, 인해 사용할 수 없었던 2 12 항생제의 테스트 (fosfomycin 및 cefepime) 46 이러한 시련 (94%)를 차지 했다. 이러한 증가 속도 inoculum 효과31,,3237될 약물에 더 가능성이 있을 수 있습니다. 노트, CLSI 국물 희석25 결과의 신뢰성에 대 한 우려 때문에이 약으로는 신뢰할 수 없는 결과 설명할 수 있습니다이 방법으로 fosfomycin를 테스트 권장 하지 않습니다. 일부 수정 탐정 찾아보십시오 자동된 바둑판 메서드를 만들 수 있습니다. 제 경우 워크플로 실험실 내에서 이유를 빈 우물에 보다는 오히려 이미 세균 현 탁 액을 포함 하는 접시에 적절 될 수 있습니다. 384-잘 접시는 여기 사용 되었다, 하는 동안 메서드 수 있습니다 또한 실시 96 잘 접시 분석 잘 볼륨의 적절 한 수정에. 96 잘 접시 형식의 특히 inoculum에 작은 변화에 민감한 항생제에 대 한 줄이는 건너뛴된 우물에 도움이 수 있습니다. FIC내가계산할 때 마이크가 상황에서 규모 (즉, 테스트 보다 더 높은), 약물 테스트는 테스트 되 고 유 기체의 유형에 대해 개별적으로 활동이 상황 등 있을 수 있습니다. 이러한 경우에는 FIC 수 수에 따라 계산 마이크 테스트 하는 가장 높은 농도 보다 높은 한 희석을 가정. 이것은 가장 보수적인 전략 저해 시너지 테스트 중 관찰은 어떤 희석에 대 한 최대 가능한 FIC 값을 가정 합니다. 예를 들어 실제 마이크 대신 위의 두 배로 희석 했다 높은 농도 테스트, 다음 해당 금융 고 보수적인 할당 보다 낮은 두 배 것.

정확 하 게 분석 결과 시간-죽 일에에서 약의 살 균 활동 평가, 특히 때 세포 벽 활성 항생제는 테스트28문화 로그 단계 성장 될 필수적 이다. 떨고 가진 외피의 3 시간 (K. 균),이 예제에 사용 되는 빠르게 성장 하 고 박테리아에 대 한 적절 한이 성장 단계에 도달 했지만 다른 양의 시간 다른 생물에 필요한 수 있습니다. 일반적으로 문화는 가시만 하지 무 겁 게 탁 표시 되어야 합니다. 시간의 적절 한 금액은 식민지 수 직렬 시간 포인트 (예: 매 30 분 4-6 시간)38에서 성장 곡선을 구성 하 여 확인할 수 있습니다. 시간 죽이기 연구에서 의도 시작 inoculum도 중요 하다. 시작 inoculum의 대상 농도 약 5 x 105 1 x 106 CFU/mL입니다. 여기에 설명 된 희석 (미디어 10 mL에 1.0 맥 팔 랜드 서 스 펜 션의 100 μ) Klebsiella 균 및 우리가 그것을 테스트는 다른 Enterobacteriaceae 종이이 inoculum을 생성 합니다. 다른 유기 체를 사용 하 여 실험에서 시작 inocula의 밀도 크게 이것 보다 낮거나 높은 경우 다른 희석 필요할 수 있습니다. (특정된 종에 필요한 적절 한 희석 수 확인할 수 0.5 또는 1.0 맥 팔 랜드 정지의 격판덮개 조사를 수행 하 여이 탁 대표는 초기 정지 해야 하는 금액을 계산 하는 얼마나 많은 유기 체를 확인 하 적절 한 최종 농도 도달 희석.) 있으면, 시너지 연구에서 접시의 검토, 항생제 포함 된 튜브의 시작 inoculum 성장 제어의 시작 inoculum 보다 훨씬 낮은 되었습니다,이 중 항생제 carryover 나타낼 수 있습니다 또는 매우 신속한 죽 여 박테리아의 도금에 대 한 항생제 포함 된 튜브에 박테리아의 추가와 제거는 약 수의 짧은 시간에. 낮은 후속 희석에 식민지의 수보다 undiluted 드롭 시리즈에 있는 식민지의 실제 수 이면이 항생제 carryover 효과 제안 합니다. 다른 옵션 전체 플레이트38 이상의 단일 약 수를 확산 하거나 샘플 아래로 회전 하 고, 상쾌한를 제거 하 고 다시39도금 전에 메 마른 염 분에서 중단을 포함 하 여이 효과 방지 하기 위한 설명 되어 있다. 각 시간이 시점에서 시간 죽 일 방법에서 그것은 또한 효율적으로 하지만 정확 하 게 각 문화 관에서 한 약 수를 제거 하 고 직렬 희석을 수행 하는 조사에 대 한 중요 한. 이 과정 동안, 특히에, 발생 하는 초기 시간 점 동안 지연 장기간 동안 문화 되지 않습니다 발생할 수 있습니다 incubated 고 흔들리고, 부주의 한 분배 및 직렬 희석 부정확 한 접시를 이어질 수 있는 반면 계산합니다. 확산 판 방법 접시 계산, 각 희석의 100 μ 전체 한 천 격판덮개 전염 됩니다에 비해 설명 드롭 플레이트 메서드는 훨씬 더 빠른, 훨씬 적은 수의 한 천 배지, 필요 하 고 최대도 빠른 계산에 대 한 허용 각 드롭에 대 한 식민지의 수 수는 30, 최대 300 식민지 일반적으로 확산 판에서 계산 될 수 있는 반면입니다. 그러나, 확산 판 메서드 수 사관이 기술을 더 편하다면 옵션 또한입니다. 상품 멀티 채널 피 펫 분배 후 서로 확산, 단일-채널 피 펫 더 넓게 간격 둔된 상품의 개별 응용 프로그램 대신 수행할 수 있습니다. 우리의 경험에 과도 한 확산을 줄이기 위해 듯 방울을 분배 하기 전에 4 ° C에서 격판덮개를 냉각.

여기서 설명의 한 가지 한계는 두 가지 유형의 시너지 효과 분석 결과 (바둑판 배열 및 시간-죽 일)의 결과 항상 조화 된, 이후 가장 시너지는 기사로 출판된 한 메서드 또는 다른 보다는 모두 함께 사용, 그것은 수 있습니다. 두 가지 유형의 분석에서 데이터를 통합 하는 방법을 알고 어려울. 때문에 우리가 개발 자동화 된 바둑판 배열 방법 간단 하 고 높은 처리량, 우리 사용 효과 스크린의 일종으로 격리의 큰 숫자에 대 한 조합을 테스트 하 고 어떤 농도 조합 했다 시너지 결정 하. 우리는 다음 조합 및 농도 바둑판 배열에서 효과적인 선택 시간 죽 일 연구의 더 작은 수 수행. 메모의 바둑판 분석 결과 일반적으로 수행 microbroth 희석 배율에 시간-죽 일 분석 결과 사용 큰 볼륨 (와 유사한 macrobroth 희석), 때문에 우리는 발견 금융 때때로 두 방법 사이 다른와 더 높은 일반적으로 필요한 시간 죽 일 분석 결과에서 활동을 설명 하 한 농도 이 현상을 언급 되었습니다 이전 macrobroth 및 microbroth 희석 마이크 시험 결과 그람 음성 이십시오26 한 때 더 큰 inocula (시간 죽 일 연구에 사용)는 비교에 사용 되는 표준 inoculum와 비교 했을 때 microbroth 희석과 바둑판 배열32분석 실험. 바둑판 배열의 특정 한계 microbroth 희석 마이크 테스트22에 내재 된 다양성 이다. FIC차단 시너지 계정으로이 변화 하면서 수학적6 같은 가변성 필연적으로 제기 하지 신뢰성과 바둑판 배열 결과의 일관성에 대 한 우려.

테스트 방법 (인공 성장 매체, 정적 항생제 농도, 그리고 제한 된 시간 코스에 박테리아의 경작을 포함 하 여) 모든 체 외 시너지에 제한으로 인해 이러한 방법으로 얻은 결과 확인 해야 합니다 및 추가 보조 기술을 사용 하 여 평가. 이러한 방법을 포함 체 외 pharmacokinetic/pharmacodynamic (PK/PD) 연구 (예를 들어, 빈 섬유 감염 모델40), 동물 모델, 그리고, 궁극적으로, 인간의 PK/PD 및 효능 연구. 여기, 잠재적인 시너지 활동 화면 조합에 있는 급속 한 메서드를 제공 하 여 설명 하는 자동화 된 바둑판 배열 방법을 더 허용 이러한 기술 활용 대상. 더 생체 외에서 매개 변수 및 임상 결과 사이 관계의 더 잘 체계적인 조사로 모든 이러한 방법의 자동화 확장에 중요 한 것을 테스트 하 고 그것의 임상 적용을 증가 하는 시너지 효과 사용 하 여.

Disclosures

D300 디지털 디스펜서와 관련된 소모품 Tecan (모리스 빌, 노스캐롤라이나)에 의해 제공 되었다. Tecan 연구 설계, 데이터 수집/해석, 원고 준비, 또는 게시 하는 결정에 있는 역할을 했다.

Acknowledgments

Thea 브 레 넌-Krohn 여는 유 니스 케네디 슈 라이버 건강의 국립 연구소 아동 지원 및 훈련 그랜트 (T32HD055148), 알레르기 국립 연구소와 전염병 교육 그랜트 (인간 발달 소아과 감염 증 연구 T32AI007061), 보스턴 어린이 병원 사무실 교수 개발 교수 경력 개발의 친교, 그리고는 알레르기 국립 연구소와 전염병 경력 개발 상 (1K08AI132716). J.E.K.는 알레르기 국립 연구소와 전염병의 보너스 번호 R33 AI119114에서 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Escherichia coli strain ATCC 25922 ATCC 25922 QC strain
0.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1605-0000
1 L 0.22 µm bottle-top filter Thermo Scientific Nalgene 597-4520
12 mm x 75 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Fisherbrand 14-961-26
15 mL conical tubes Phenix SS-PH15
15 x 100 mm or 15 x 150 mm Mueller Hinton agar plates Thermo Scientific R01620 or R04050
25 mm stainless steel closures for 25 x 150 mm glass culture tubes Bellco 2005-02512
25 x 150 mm borosilicate glass round bottom culture tubes Bellco 2011-25150
348-well sterile clear, flat-bottom, untreated microplates with lids Greiner Bio-One 781186
50 mL conical tubes Phenix SS-PH50
50 mL sterile reagent reservoirs Corning 4870
96 deep well polypropylene microplate with 2 mL wells Fisherbrand 12-566-612
96-well sterile clear, round-bottom, untreated microplates with lids Evergreen 222-8032-01R
Cation adjusted Mueller Hinton broth BD Diagnostics 212322
Colistin sulfate Alfa Aesar J60915
D300e Control Software HP/Tecan
DensiCHEK Plus McFarland reader bioMérieux 21250
Excel spreadsheet software Microsoft
Extra long SHARP 10 µL Precision Barrier Tips Denville Scientific P1096-FR
HP D300 digital dispenser HP/Tecan
HP D300 T8+ cassettes HP/Tecan 30097370
Minocycline hydrochloride Chem-Impex 14302
Picus 12-channel 10-300 µL pipette Sartorius 735461
Polysorbate 20 Fisher Bioreagents BP-337 Brand name: Tween 20
Sodium chloride Fisher Chemical S271
Spectrophotometer Tecan Infinite M1000 PRO
Xplorer 12-channel 50-1200 µL pipette Eppendorf 2231000328

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References

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