Nanoparticelle di ossido di ferro rivestite con Polyethyleneimine come un veicolo per la consegna di piccolo RNA interferente ai macrofagi In Vitro e In Vivo

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Summary

Descriviamo un metodo di utilizzo polyethyleneimine (PEI)-rivestito di nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico per macrofagi trasfezione con siRNA. Queste nanoparticelle è in grado di fornire in modo efficiente siRNA di espressione del gene bersaglio macrofagi in vitro e in vivo e silenzio.

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Jia, N., Wu, H., Duan, J., Wei, C., Wang, K., Zhang, Y., Mao, X. Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (144), e58660, doi:10.3791/58660 (2019).

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Abstract

A causa del loro ruolo critico nella regolazione della risposta immunitaria, i macrofagi sono stati continuamente oggetto di intensa ricerca e rappresentano un promettente bersaglio terapeutico in molti disturbi, quali malattie autoimmuni, aterosclerosi e cancro. Silenziamento genico RNAi-mediata è un valido approccio di scelta per sonda e modificare la funzione del macrofago; Tuttavia, la transfezione di macrofagi con siRNA è spesso considerata di essere tecnicamente impegnativo e, attualmente, sono disponibili alcune metodologie dedicati al trasferimento siRNA ai macrofagi. Qui, presentiamo un protocollo di utilizzo di nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico rivestite con polyethyleneimine (PEI-SPIONs) come veicolo per la somministrazione mirata di siRNA di macrofagi. PEI-SPIONs sono capaci di legare e di condensazione completamente siRNA quando il rapporto di peso di Fe: siRNA raggiunge 4 e sopra. In vitro, queste nanoparticelle possono fornire in modo efficiente siRNA in macrofagi primari, così come nella linea cellulare del 264,7 macrofago-come, senza compromettere la vitalità cellulare presso la dose ottimale per la transfezione, e, in definitiva, essi inducono destinazione di siRNA-mediata del silenziamento genico. Oltre ad essere usato per trasfezione con siRNA in vitro , PEI-SPIONs sono anche uno strumento promettente per la consegna di siRNA a macrofagi in vivo. In considerazione di sue caratteristiche unite di proprietà magnetiche e capacità di silenziamento genico, sistematicamente amministrati PEI-SPION/siRNA particelle dovrebbero non solo di modulare la funzione dei macrofagi, ma anche per attivare i macrofagi a essere imaged e tracciati. In sostanza, PEI-SPIONs rappresentano una piattaforma nonviral semplice, sicura ed efficace per la consegna di siRNA ai macrofagi sia in vitro che in vivo.

Introduction

I macrofagi sono un tipo di cellule immuni innate distribuiti in tutti i tessuti del corpo, anche se in quantità diverse. Producendo una varietà di citochine e altri mediatori, giocano ruoli critici nella difesa ospite contro l'invasione di microrganismi patogeni, nella riparazione del tessuto dopo la lesione e nel mantenimento di omeostasi del tessuto1. A causa della loro importanza, i macrofagi sono stati continuamente oggetto di intensa ricerca. Tuttavia, nonostante la sua prevalenza negli studi di funzione e regolazione genica, silenziamento genico siRNA-mediata è meno probabilità di riuscire a macrofagi perché queste cellule — in particolare, macrofagi primari — spesso sono difficili a transfect. Ciò può essere ascritto ad un grado relativamente elevato di tossicità associata con approcci di transfezione più consolidati in cui la membrana cellulare è chimicamente (ad es., con polimeri e lipidi) o fisicamente (ad es., mediante elettroporazione e pistole di gene) interrotto per consentire siRNA molecole attraversano la membrana, riducendone drasticamente vitalità2,3 dei macrofagi. Inoltre, i macrofagi sono dedicati fagociti ricchi di enzimi degradativi. Questi enzimi possono danneggiare l'integrità del siRNA, indebolendo la sua efficienza silenziamento anche se siRNA gene-specifico è stato consegnato in cella3,4. Di conseguenza, un sistema di consegna efficace del macrofago-mirati siRNA ha bisogno proteggere l'integrità e la stabilità di siRNA durante la consegna4.

È sempre più evidente che i macrofagi disfunzionali siano implicati nell'iniziazione e progressione di alcuni comuni disturbi clinici come cancro, aterosclerosi e malattie autoimmuni. Per questo motivo, modulando la funzione del macrofago con, per esempio, siRNA, sta emergendo come una metodologia attraente per il trattamento di questi disturbi5,6,7. Nonostante i progressi realizzati, una sfida importante della strategia di trattamento basati su siRNA è la specificità di povera cella di siRNA sistematicamente amministrato e l'assorbimento di siRNA insufficiente da parte dei macrofagi, che di conseguenza portare a effetti collaterali indesiderati. Confrontato con acido nucleico libero terapeutica che in genere mancano della selettività cellulare ottimale e spesso portare a effetti avversi, caricati nanoparticelle (NPs), a causa della loro tendenza spontanea di essere catturato dal sistema reticoloendoteliale, fuori bersaglio possono essere progettati per il targeting passivo a macrofagi in vivo, permettendo una migliore efficacia terapeutica con effetti collaterali minimi8. NPs corrente esplorato per il rilascio di molecole di RNA includono nanovettori inorganici e liposomi vari polimeri9. Tra loro, polyethyleneimine (PEI), un tipo di polimeri cationici in grado di legare e di condensazione di acidi nucleici in NPs stabilizzato, Mostra il RNA più alto offrendo capacità9,10. PEI protegge gli acidi nucleici da degradazione enzimatici e non enzimatici, media il loro trasferimento attraverso la membrana cellulare e promuove il loro rilascio intracellulare. Anche se inizialmente introdotto come un reagente di consegna di DNA, PEI successivamente è stata dimostrata per essere una piattaforma attraente per in vivo siRNA consegna, o in locale o sistemica9,10.

Nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico (SPIONs) hanno mostrato grande promessa nel campo della biomedicina, a causa delle loro proprietà magnetiche, biocompatibilità, dimensioni paragonabili agli oggetti biologicamente importanti, alto rapporto superficie-zona--volume e facilmente adattabile superficie per agente allegato11. Per esempio, a causa della loro utilità potenziale come un agente di contrasto e di rapido assorbimento da parte dei macrofagi, SPIONs sono emersi come uno strumento clinico a immagine del tessuto macrofagi12. Mentre SPIONs inoltre sono stati studiati estesamente come acido nucleico consegna veicoli11,13,14,15, a nostra conoscenza, la letteratura contiene pochi rapporti di SPIONs come vettore per consegna del macrofago-mirati siRNA. Per la consegna del gene di SPIONs, la loro superficie è solitamente rivestita con uno strato di polimeri cationici idrofilici su cui caricati negativa degli acidi nucleici può essere elettrostaticamente attratto e legati. Qui, presentiamo un metodo per la sintesi di SPIONs cui superficie viene modificata con basso peso molecolare (10 kDa), ramificata PEI (PEI-SPIONs). Questi nanoplatforms magnetico sono quindi impiegati per condensare siRNA, formando dei complessi PEI-SPION/siRNA che permettono il trasporto di siRNA nella cellula. Abbiamo ragione quella spontanea fagocitosi di SPIONs dalle cellule del sistema reticoloendoteliale16, accoppiato con la forte capacità di associazione e condensazione di acidi nucleici da PEI, rende PEI-SPIONs adatto per il trasporto efficiente di siRNA in macrofagi. I dati presentati qui sostengono la fattibilità del silenziamento genico PEI-SPION/siRNA-mediata nei macrofagi in cultura come pure in vivo.

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Protocol

Tutti i metodi che coinvolgono animali vivi sono stati eseguiti in conformità con l'animale con cautela e linee guida di Southeast University, Cina.

1. preparazione del PEI-SPIONs

  1. Preparazione dell'acido oleico-modificato SPIONs
    1. Sciogliere FeCl3•6H2O e FeSO4•7H2, O nell'acqua sotto la protezione di N2.
      1. Aggiungere 28 g di FeCl3•6H2O e 20 g di FeSO4•7H2O in 80 mL di acqua deionizzata in un becher. Introdurre l'acqua attraverso una condotta di vetro N2 e mescolare fino a sciolta la materia solida.
      2. Riscaldare la miscela di reazione a 72 ° C ad una velocità di agitazione di 800 giri/min, seguita dalla aggiunta di 40 mL di acqua ammoniacale (28%). Mescolare per 5 min.
    2. Aggiungere goccia a goccia 9 mL di acido oleico nella soluzione di cui sopra e mescolate a 72 ° C per 3 h.
    3. Raffreddare la soluzione risultante a temperatura ambiente (TA). Precipitare la soluzione tramite separazione magnetica.
    4. Lavare il precipitato contenente SPIONs 3 x con alcool etilico assoluto e, quindi, disperdere il precipitato in 100 mL di N-esano.
  2. Preparazione di dimercaptosuccinic acido-modificati SPIONs
    1. Aggiungere 800 mg di acido oleico (OA)-modificato SPIONs distribuiti in 200 mL di N-esano, e 400 mg di acido dimercaptosuccinic (DMSA) dispersi in 200 mL di acetone, in un pallone a tre colli in un bagno di acqua a 60 ° C.
      Nota: Per determinare la concentrazione di OA-modificato SPION ottenuti nel passaggio precedente, prendere un piccolo volume (ad es. 1 mL) della dispersione SPION, volatilizzare il N-esano e pesare la polvere risultante.
    2. Aggiungere 200 µ l di trietilammina goccia a goccia nella soluzione di cui sopra con agitazione a 1.000 giri/min e riflusso.
    3. Dopo 5 h di agitazione e di riflusso, è possibile ottenere un precipitato nero di separazione magnetica.
    4. Regolando il pH della soluzione con idrossido di tetrametilammonio si disperdono in modo omogeneo la SPIONs idrofile in acqua deionizzata.
  3. Preparazione di PEI-SPIONs
    1. Aggiungere goccia a goccia soluzione colloidale SPION DMSA-modificato nella soluzione di PEI (10 kDa) in un matraccio da tre colli di 500 mL sotto agitazione meccanica a 1.000 giri/min per 2h (WFe: WPEI = 1:3).
      Nota: Il costo e le dimensioni di PEI-SPIONs variano a seconda della percentuale di WFe a WPEI. Il WFe: WPEI rapporto di 1:3 può essere un buon punto di partenza per la sintetizzazione PEI-SPIONs adatto per la consegna di siRNA.
    2. Aggiungere la soluzione risultante in una provetta di ultrafiltrazione avendo un peso molecolare di taglio di 100 kDa e un contenuto di 15 mL; quindi, centrifugare a 5.400 x g per 10 min fino a quando la soluzione rimanente è di 1 mL. Aggiungere acqua deionizzata alla soluzione per rendere il volume 15ml nuovamente e ripetere la procedura sopra 10 x per ottenere il prodotto finale. Quindi, filtrare la soluzione attraverso un filtro di 0,22 μm e conservare il prodotto finale a 4 ° C.
    3. Determinare la concentrazione di Fe di PEI-SPIONs con il metodo colorimetrico utilizzando fenantrolina17. PEI-SPIONs di diluire con acqua deionizzata sterile ad una concentrazione di 1 mg Fe/mL e conservarla a 4 ° C.
    4. Diluire 10 μL della soluzione di PEI-SPION (1 mg Fe/mL) a 1 mL con acqua deionizzata; quindi, verificare le dimensioni idrodinamico e potenziale zeta da un dispositivo dinamico di luce-dispersione.
      Nota: Preparare il PEI-SPIONs nella gamma di circa 30-50 nm. In questo intervallo di grandezza, l'effetto della dimensione del NP sull'associazione di siRNA e l'assorbimento cellulare non sembra essere significativo. PEI-SPIONs cuscinetto un potenziale zeta media oltre + 37 mV può essere tossico nell'intervallo delle dosi per la transfezione, e dovrebbe essere effettuata un'analisi di citotossicità per garantire la sicurezza. La carica superficiale e idrodinamica dimensioni delle nanoparticelle possono essere controllati all'interno di un intervallo desiderato regolando la percentuale di PEI.

2. preparazione ed elettroforesi del Gel dell'agarosi di PEI-SPION/siRNA NPs

  1. SiRNA diluito con acqua priva di RNAsi per ottenere una concentrazione finale di 20 μM (0,26 μg/μL).
  2. Preparare le provette microcentrifuga RNAsi-libera cinque etichettati 0, 1, 2, 4 e 8. Le etichette rappresentano rapporti di peso diverso Fe: siRNA. Dispensare 3 μL di soluzione di siRNA a tutte le provette (~0.8 μg di siRNA/tubo).
  3. Aggiungere 0, 0.8, 1.6, 3.2, e 6,4 μg di Fe sottoforma di PEI-SPIONs ai tubi etichettati 0, 1, 2, 4 e 8, rispettivamente. Tenere il volume totale del campione di ogni tubo meno di 20 μL. Mescolare pipettando delicatamente su e giù.
  4. Incubare le miscele a temperatura ambiente per 30 minuti per permettere la formazione di complessi di PEI-SPION/siRNA. Durante questo periodo, fare un 3% di agarosio gel con elevata purezza dell'agarosi.
    Nota: Ulteriori PEI-SPION/siRNA complessi con altri rapporti di Fe: siRNA (ad esempio, 5 o 6) possono essere preparati e testati.
  5. Aggiungere 1 μL di tampone di DNA-caricamento a 5 μL di campione: 6x e mescolare con cautela. Caricare tutti i campioni ed eseguire l'elettroforesi a 5 V/cm fino a quando il blu di bromofenolo migra fino a due terzi della lunghezza del gel. Macchia il gel con bromuro di etidio (EB) per 15-20 min.
    Nota: Il tampone di elettroforesi preparati al momento e la soluzione EB deve essere utilizzati.
  6. Visualizzate le fasce di siRNA sotto un UV sistema di imaging. Controllare i rapporti di Fe: siRNA a quali complessi di forme di siRNA con PEI-SPIONs e, di conseguenza, le bande che rappresentano gratis siRNA sono ritardati o non rilevabili.

3. la transfezione di macrofagi RAW 264.7 In Vitro

  1. Macrofago-come le cellule RAW 264.7 di cultura del mouse in un piatto di 10 cm utilizzando DMEM completano Media contenente 10% siero bovino fetale (FBS) a 100 U/mL di penicillina per 100 μg/mL streptomicina a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 .
  2. Un giorno prima la transfezione, aspirare medio dalle cellule e risciacquarli con soluzione tampone fosfato (pH 7,4). Aggiungere 1 mL di tripsina 0,25% per il piatto di 10 cm. Tripsinizzano RAW 264.7 celle per circa 5-10 min a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 .
  3. Quando la maggior parte delle cellule hanno staccato (dopo 5-10 min), aggiungere 5 mL di terreno completo DMEM al piatto per inattivare la tripsina. Dispensare su e giù per disperdere i mazzi delle cellule in cellule singole.
  4. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica sterile di 15 mL. Centrifugare a 300 x g per 3 min a RT. rimuovere il surnatante.
  5. Risospendere le cellule con 5 mL di terreno completo nuovo DMEM e contare le celle.
  6. Cellule di4 piastra 9 x 10 per bene in una piastra a 6 pozzetti con 2 mL di terreno DMEM completo e incubare a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 per circa 24 h.
    Nota: Se si utilizza una piastra di dimensioni diverse, regolare la densità cellulare placcato proporzionale alla relativa superficie affinché le cellule raggiungere confluency di 80% al momento della trasfezione.
  7. Quando confluency di cella è 80%, rimuovere il supporto dalle cellule e sostituirlo con 1 mL di terreno completo DMEM per pozzetto. Restituire la piastra nell'incubatore fino a PEI-SPION/siRNA complessi sono stati preparati e sono pronti all'uso (circa 30 min).
  8. Preparare il PEI-SPION/siRNA complessi: calcolare la quantità di complessi di PEI-SPION/siRNA necessario per un esperimento di transfezione. In un tubo del microcentrifuge RNAsi-libera 1,5 mL, mescolare una quantità appropriata di PEI-SPIONs con siRNA un rapporto determinato Fe: siRNA. Per esempio, per preparare il PEI-SPION/siRNA NPs contenente 100 µ g di Fe con un rapporto di Fe: siRNA di 4, aggiungere 100 µ l (1 mg Fe/mL) di PEI-SPIONs a 96 μL di siRNA (0,26 μg/μL), seguita da mescolando delicatamente con una micropipetta. Incubare per 30 minuti a TA.
    Nota: Preparare un volume di PEI-SPION/siRNA complesso che è 10% oltre la massa totale finale per tenere conto di eventuali perdite accidentali. Fare PEI-SPION/siRNA complessi rapporti di bassa Fe: siRNA, sotto il quale molecole di siRNA sono completamente caricati su PEI-SPIONs e, quindi, piccole quantità di PEI-SPIONs può essere utilizzato per ridurre al minimo il potenziale citotossicità. Esperimenti pilota (analisi di ritardo del gel) per l'ottimizzazione del rapporto Fe: siRNA sono necessari.
  9. Prendere la piastra 6 pozzetti dall'incubatrice (punto 3.7). Aggiungere un volume richiesto di PEI-SPION/siRNA complesso goccia a goccia in ciascun pozzetto e agitare la piastra con cautela per garantire una distribuzione uniforme. Riporre la piastra nell'incubatore fino alla valutazione del cellulare assorbimento o gene atterramento efficienza (d 1-3).
    Nota: Macrofagi trasfezione con siRNA/PEI-SPION ad una concentrazione di ~ 15 μg Fe/mL possono massimizzare efficienza di trasfezione riducendo potenziali citotossicità.

4. consegna sistemica di siRNA ai macrofagi nei ratti con artrite sperimentale

  1. Ottenere specifiche di Wistar maschio esenti da patogeni che sono vecchio 7 settimane. Habituate i ratti per 7 d prima dell'uso e di fornire loro con acqua e cibo adeguato. Indurre l'artrite ausiliaria (AA) nei ratti come descritto in precedenza18.
  2. Preparare il PEI-SPION/siRNA complessi come descritto al punto 3.8.
  3. Iniettare il NPs PEI-SPION/siRNA (0,3 mg di siRNA/kg) nell'AA ratti tramite vena caudale. Valutare l'assorbimento cellulare tramite, per esempio, citometria a flusso, tessuto biodistribuzione tramite, per esempio, una fluorescenza in tempo reale sistema di imaging o effetti terapeutici sulla base, per esempio, clinici, istologici e radiografici 18punti di analisi all'orario desiderato.
    Nota: Per gli studi di biodistribuzione cellulari e tissutali, trattare i ratti con una singola iniezione di NPs desiderata; per gli studi terapeutici, iniettare i ratti con NPs per essere testato 1 volta a settimana per tre settimane consecutive.

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Representative Results

La dimensione e la zeta potenziale di PEI-SPIONs preparato con questo protocollo sono stati nella gamma di 29-48 nm (indice di polidispersione: 0.12 - 0.23) e 30-48 mV, rispettivamente. Erano stabili in acqua a 4 ° C per oltre 12 mesi senza aggregazione ovvio. Per valutare la loro capacità di associazione di siRNA, PEI-SPIONs sono stati mescolati con siRNA a vari rapporti di peso Fe: siRNA. La figura 1 Mostra che quando il rapporto di peso di Fe: siRNA raggiunge 4 e sopra, completamente la banda di siRNA gratuito era mancante, implicando associazione successo siRNA a PEI-SPIONs. Delle principali preoccupazioni di PEI in applicazione biomedica è la sua tossicità, che è un risultato di forte carica positiva, specialmente alle alti pesi molecolari e le dosi elevate. Come mostrato in Figura 2A, PEI-SPIONs con un zeta potenziale di 30,5 e 37 mV non ha esibito apparente citotossicità alle concentrazioni fino a 30 μg Fe/mL, che è circa duplice superiore alla concentrazione (15 μg Fe/mL) normalmente utilizzato per la transfezione delle cellule. Tuttavia, PEI-SPIONs con un potenziale zeta di 48 mV erano tossici anche alla dose più bassa ha esaminata (10 μg Fe/mL). Di conseguenza, PEI-SPIONs possiedono una tossicità di carica-dipendente. Poiché non è importante per l'assorbimento di NP da macrofagi19carica cationica, suggeriamo che PEI-SPIONs con un potenziale zeta media non superiore a + 37 mV sono utilizzati per il trasferimento di siRNA, sebbene siRNA associazione farebbe diminuire la carica in una certa misura e alleviare la citotossicità18.

Per verificare la potenziale applicazione di PEI-SPIONs per la consegna di siRNA ai macrofagi, la trasfezione in vitro è stata effettuata con la linea cellulare del macrofago murino 264,7. Come analizzato tramite citometria a flusso, oltre il 90% delle cellule transfected con fluorescente contrassegnati PEI-SPION/siRNA complessi a 15 µ g Fe/mL (Figura 2B). Per quanto riguarda l'efficienza di trasfezione, non c'era in realtà la differenza tra PEI-SPION/siRNA NPs formata a Fe: siRNA rapporti di peso di 4 e 8, anche se, a quest'ultima condizione, i parlamenti nazionali che si sono formati erano di dimensioni più ridotte e più deboli in carica positiva perché una minore quantità di siRNA è stata caricata per particella. Abbiamo anche valutato l'effetto della concentrazione di PEI-SPION/siRNA sull'internalizzazione cellulare dalla macchiatura blu di Prussia. Come illustrato nella Figura 2, le macchie blue all'interno delle cellule trasfettate erano minimamente rilevabile a 7,5 µ g di Fe/mL, ma chiaramente visibile a 15 µ g Fe/mL. È interessante notare che, aumentando la concentrazione di PEI-SPION/siRNA a 32 µ g Fe/mL non ha aumentato l'intensità di colorazione, probabilmente perché l'assorbimento di PEI-SPION/siRNA era saturo alle concentrazioni intorno 15 µ g Fe/mL. Inoltre, la capacità di PEI-SPIONs per mediare il trasferimento di siRNA è stata confermata in macrofagi primari18, e il metodo presentato qui ha avuto un'efficienza di trasfezione di siRNA alta in macrofagi peritoneali del ratto, equivalenti a quella in RAW 264.7 cellule. I macrofagi peritoneali transfettati con PEI-SPIONs che harboring specifici siRNA hanno mostrato una diminuzione significativa nel livello di mRNA bersaglio rispetto ai non specifico siRNA (Figura 2D), implicando che siRNA potrebbe fuoriuscire dalle vescicole di endocitosi nella citoplasma e raggiungere il macchinario di RNAi.

Abbiamo tradotto anche studiato in vivo assorbimento cellulare di sistematicamente amministrati PEI-SPION/siRNA complessi in ratti con adiuvante artrite18. Abbiamo analizzato l'efficienza di trasfezione di PEI-SPION/siRNA in fagociti macrofagi e linfociti T nonphagocytic. Come mostrato nella Figura 3, cellule CD11b + ha preso PEI-SPION/siRNA complessi in modo più efficiente di cellule CD3 + in qualsiasi punto del tempo in tutti gli organi esaminati, che indica che PEI-SPION/siRNA NPs target preferenzialmente macrofagi18. In particolare, un accumulo ad alto livello di NPs è stato osservato nelle articolazioni infiammate18, suggerendo che il PEI-SPION può essere una piattaforma attraente per la consegna sistematica del siRNA therapeutics nell'artrite reumatoide in cui la patogenesi è legata alla disfunzione del macrofago e per quali siRNA locale amministrazione non è una scelta preferita a causa del coinvolgimento di più organi della malattia.

Figure 1
Figura 1: elettroforesi del gel dell'agarosi di PEI-SPION/siRNA complessi formata a vari rapporti di Fe: siRNA (w/w). Un rapporto Fe: siRNA di 0 rappresenta duplex del siRNA gratis senza PEI-SPIONS. La dimensione media e il potenziale zeta del gratuito PEI-SPIONs usato qui erano 30 nm e 45 mV. siRNA completamente potrebbe associare a PEI-SPIONs quando il rapporto Fe: siRNA raggiunge 4 e, soprattutto, coerente con i risultati precedenti utilizzando PEI-SPIONs con una dimensione media di 48 nm e un potenziale zeta di 30,5 mV18. L'assenza di bande ritardati (complessi di PEI-SPION/siRNA) può riflettere inaccessibilità dei siRNA a EB durante la colorazione, un'indicazione di siRNA forte associazione e/o la capacità di condensazione di PEI-SPIONs. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: caratterizzazione biologica di PEI-SPION e PEI-SPION/siRNA NPs. (A), questo pannello mostra un'analisi di attuabilità delle cellule. Le 264,7 cellule sono state trattate per 16 h con le dosi indicate di PEI-SPIONs cuscinetto potenziale zeta diverse e, quindi, è stata eseguita un'analisi MTS. L'attuabilità delle cellule è stato normalizzato contro il controllo (nessuna esposizione di particella). I dati sono la media ± SD di pozzetti duplicati. (B), questo pannello mostra un'analisi cytometric di flusso dell'assorbimento PEI-SPION/Cy3-siRNA di 264.7 celle grezze. Le cellule sono state incubate per 24 h con 15 µ g Fe/mL (pannello superiore) o 5 μg Fe/mL (pannello inferiore) di PEI-SPIONs complessato con siRNA Cy3-etichettati con un rapporto di Fe: siRNA (w/w) di 4 e 8, rispettivamente. Non specifico (NC) siRNA rappresenta siRNA fluorescente non. M2: gated regione; Cy3 pe-h: l'intensità di fluorescenza. L'efficienza di trasfezione di siRNA di PEI-SPIONs usato qui (37,8 nm, 48 mV) era simile a uno studio precedente utilizzando PEI-SPIONs con una dimensione media di 48 nm e un potenziale zeta di 30,5 mV18. (C), questo pannello mostra un'analisi dell'assorbimento PEI-SPION/siRNA visualizzando i depositi di ferro cellulare. Le 264,7 cellule sono state incubate con 7.5, 15 e 32 μg Fe/mL PEI-SPIONs (48 nm, 30.5 mV) complessato con siRNA (Fe: siRNA = 8) e colorate con blu di Prussia. Le barre di scala sono 20 μm. (D) questo pannello mostra una validazione in vitro dell'efficienza silenziamento del siRNA consegnato da PEI-SPIONs. Un ratto di siRNA-targeting specifico catena β-15 recettore del-2 è stato caricato sul PEI-SPIONs (48 nm, 30.5 mV) a Fe: siRNA = 8 e, quindi, trasfettati in macrofagi peritoneali del ratto. Un siRNA NC è stato usato come controllo. L'effetto il silenziamento genico è stato valutato mediante PCR quantitativa. Le cellule sono state incubate con i complessi alle 15 μg Fe/mL. I dati sono la media ± SD dei pozzi in triplice copia. Pannello D è stato modificato da Duan et al. 18 con autorizzazione dell'editore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: In vivo l'assorbimento cellulare di PEI-SPION/siRNA NPs. Tre artritici ratti sono stati iniettati per via endovenosa con una singola dose di 0,3 mg/kg Cy3-siRNA formulato con PEI-SPION (48 nm, 30.5 mV). Un topo iniettato con PBS è stato utilizzato come controllo. Sangue, milza, fegato, reni e articolazioni infiammate sono stati raccolti a 2, 8 e 24 h dopo l'iniezione. L'assorbimento cellulare di PEI-SPION/Cy3-siRNA NPs è stata valutata da citometria a flusso utilizzando (A) anti-CD3 e gli anticorpi monoclonali anti-CD11b (B). Le percentuali sono di Cy3-siRNA assorbimento all'interno del cancello CD3 + o cellule CD11b +. I risultati mostrati qui sono rappresentativi di due esperimenti indipendenti. Questa figura è stata modificata da Duan et al. 18 con autorizzazione dell'editore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

I macrofagi sono refrattari a transfect da approcci nonviral comunemente utilizzati, quali l'elettroporazione, liposomi cationici e specie del lipido. Qui abbiamo descritto un metodo affidabile ed efficiente per transfect macrofagi con siRNA. Utilizzando il presente protocollo, oltre 90% di macrofago-come 264.7 celle grezze (Figura 2B) e macrofagi peritoneali di ratto18 può essere trasfettate con siRNA senza significativa compromissione dell'attuabilità delle cellule. Questo metodo dipende dalla piattaforma di consegna PEI-SPION, che è un nanocarrier composto da un nucleo di ossido di ferro e un guscio di PEI. Così, il primo passo fondamentale del protocollo è la sintesi di PEI-SPIONs adatto per la consegna di siRNA. Solitamente, rivestite su PEI SPIONs sono preparati da SPIONs rivestite con acido oleico secondo un metodo di ligando-scambio in cui l'acido oleico è scambiato direttamente dalla superficie del SPIONs da PEI o suoi derivati15, generando idrofila NPs con una carica positiva superficie. Nel caso presentato qui, l'acido oleico ricoperto sulla superficie del SPIONs è stato sostituito da acido dimercaptosuccinic solubile in acqua e poi PEI è stato caricato su superfici SPION attraverso interazioni elettrostatiche. Questo metodo è dolce e facile da preparare in grandi quantità, e NPs sintetizzati hanno un'eccellente stabilità in acqua20. È ben noto che PEI è citotossico, e la tossicità correla fortemente con il suo peso molecolare21. Per garantire la sicurezza, una considerazione importante quando sintetizzando PEI-SPIONs è che queste particelle sono rivestite con basso peso molecolare PEI, che è 10 kDa in questo protocollo. L'effetto tossico indesiderato della PEI è principalmente mediata dalla sua carica positiva; di conseguenza, la misura del potenziale zeta di PEI-SPIONs è essenziale, e il valore deve non essere superiore a 37 mV. Una diminuzione della carica positiva può essere raggiunto semplicemente riducendo il contenuto di PEI. Un altro passo fondamentale per la riuscita applicazione di questo sistema di consegna di siRNA è l'ottimizzazione del rapporto Fe: siRNA da gel di ritardo. Sembra ragionevole fare PEI-SPION/siRNA complessi rapporti di bassa Fe: siRNA sotto quale siRNA molecole sono ancora in grado di legarsi a PEI-SPIONs. In questa circostanza, piccole quantità di PEI-SPIONs può essere utilizzato, minimizzando così la sua citotossicità potenziale.

Nel caso in cui un'efficienza silenziamento desiderata o l'effetto terapeutico non è prodotto, verificare l'efficienza di trasfezione di microscopia di flusso cytometry o fluorescenza utilizzando il vettore caricato con un siRNA fluorescente contrassegnato. In alternativa, l'assorbimento di PEI-SPION/siRNA può essere esaminato dalla macchiatura blu di Prussia convenzionale, che è abbastanza sensibile per rilevare i singoli granuli di ferro nelle cellule. Se l'efficienza di trasfezione è infatti bassa, può essere necessaria per ottimizzare le condizioni di transfezione come densità cellulare, tempo di transfezione e la dose di particelle PEI-SPION/siRNA. Il numero di passaggio delle cellule può anche interessare l'efficienza di trasfezione22. Nella maggior parte dei casi, un effetto di silenziamento insufficiente non è causato da un insufficiente assorbimento di PEI-SPION/siRNA, come l'attuale sistema di PEI-SPION è stato dimostrato per agevolare un trasferimento efficace siRNA ai macrofagi. A volte, combinando diversi siRNA targeting per lo stesso gene può essere una buona strategia per migliorare l'efficienza di atterramento. È interessante nota che, sebbene RNAi si verifica in genere entro 24 h dalla transfezione, l'inizio e la durata del silenziamento genico dipendono il tasso di turnover del target, il tasso di diluizione e longevità di siRNA e anche la concentrazione di siero nel mezzo. Così, tempo corso esperimenti possono essere necessaria per determinare con precisione il punto di tempo di effetto massimo2,22. Per applicazione in vivo , l'efficacia terapeutica dipende anche dal fatto che, e in quale misura, la destinazione di siRNA contribuisce a fenotipi patologici; così, la scelta di un target di siRNA appropriata è fondamentale per i risultati attesi.

Ci sono diversi vantaggi di questo protocollo per la consegna di siRNA ai macrofagi. (1) il metodo è facile da eseguire, è un modo economico per produrre PEI-SPIONs in grandi quantità, e NPs prodotte sono stabili in acqua per oltre 12 mesi se sono conservati a 4 ° C. (2) fagocitosi spontanea di SPIONs dai macrofagi facilitano un trasferimento efficace PEI-SPION-mediata siRNA, conseguente transfezione ad alta efficienza. Si prevede che oltre 264.7 celle grezze e macrofagi peritoneali del ratto, questo approccio è applicabile ad altre linee cellulari del macrofago e macrofagi primari, purché la dose per la transfezione è ottimizzata. (3) transfezione di siRNA è veloce e facile da condurre rispetto ad altri metodi di transfezione del macrofago come nucleofection, che richiede tempo e richiede un dispositivo di Nucleofactor2. (4) PEI-SPION può essere un veicolo ideale per la consegna di siRNA sistemica del macrofago-mirati a determinati modelli di malattia. I macrofagi svolgono un ruolo critico nello sviluppo e nella progressione di vari disordini infiammatori cronici, come pure i tumori; e una cospicua caratteristica istologica di queste malattie è i vasi sanguigni anormali con endotelio che perde. Quindi, a causa della permeabilità migliorata e l'effetto di ritenzione, sistematicamente amministrati caricati NPs tendono ad accumularsi in tessuti malati e vengono prontamente catturati dai macrofagi locali, portando a una maggiore specificità, ridotto di effetti collaterali e migliorato efficacia terapeutica. In un modello del ratto dell'artrite ausiliaria, iniettato per via endovenosa PEI-SPION/siRNA complessi sono presi da circa il 40% delle cellule CD11b + durante le prime 24 ore dopo l'iniezione di18. Al contrario, quando liposoma cationico è stato utilizzato come vettore per la consegna di siRNA sistemica in topi, meno del 5% delle cellule CD11b + nelle articolazioni artritiche intrappolato il siRNA lipoplessi23. Inoltre, grazie alle loro proprietà magnetiche, l'applicazione di un campo magnetico esterno può ulteriormente facilitare l'accumulo di PEI-SPION/siRNA complessi nei tessuti bersaglio e aumentare il loro assorbimento cellulare. Inoltre degno di nota è che tali NPs siRNA-caricato può essere utilizzato non solo per la modulazione della funzione dei macrofagi, ma anche per formazione immagine del macrofago per fornire informazioni diagnostiche, l'efficacia del trattamento di monitor e prevedere risultati clinici12 dei pazienti.

Tuttavia, esistono limitazioni connesse con questo protocollo. Il sistema di PEI-SPION esibisce una gamma ristretta di dosaggio per la consegna di siRNA. L'assorbimento massimo durante RAW 264.7 cellule sono state esposte a PEI - SPION/siRNA ad una concentrazione di 15 µ g Fe/mL (Figura 2B e 2C). Aumento della concentrazione di PEI-SPION/siRNA a 32 µ g Fe/mL non ha provocato un aumento nell'assorbimento cellulare (Figura 2) ma, al contrario, potrebbe aumentare il rischio di indurre la morte delle cellule dovuto la tossicità intrinseca di PEI. D'altra parte, diminuendo PEI-SPION/siRNA a 5 o 7,5 µ g Fe/mL ovviamente ridotto relativo assorbimento dalle cellule RAW 264.7 (Figura 2B e 2C). Quindi, proponiamo che la concentrazione ottimale di PEI-SPION/siRNA per la transfezione in vitro del macrofago è ~ 15 µ g Fe/mL (la concentrazione finale in un pozzo). Un'altra limitazione che deve essere preso in considerazione è il possibile effetto di PEI-SPIONs sulla attività del macrofago. Le nanoparticelle possono indurre la risposta immunitaria24, a seconda della loro modificazione superficiale, carica superficiale, dimensioni, forma e anche la metodologia utilizzata per sintetizzarli. Mulens-Arias et al ha recentemente segnalato che rivestite con PEI SPIONs innescare macrofago attivazione25. Il metodo di sintesi di PEI-SPION qui presentati significativamente diverso da quello di Mulens-Arias et al., e pertanto, se PEI-SPIONs preparato basato sul grilletto presente protocollo attivazione macrofagica attende ulteriore indagine. Tuttavia, per affrontare in modo inequivocabile questa preoccupazione, ci suggeriscono che, oltre la PEI-SPION complessato con siRNA scramble, il veicolo stesso (solo PEI-SPION) può servire come un altro controllo quando si utilizza il presente protocollo. Infine, questo protocollo non è adatto per la consegna del DNA grazie alle sue dimensioni relativamente grandi.

In sintesi, abbiamo presentato qui un metodo di utilizzo rivestite su PEI SPIONs come un veicolo per la transfezione di siRNA in macrofagi. Questi NPs può fornire in modo efficiente siRNA in linee cellulari immortalizzate macrofago, così come in macrofagi primari in vitroe funzionalmente indurre silenziamento genico senza colpire l'attuabilità delle cellule presso la dose ottimale per la transfezione. Inoltre, PEI-SPIONs possono essere utilizzati per la fornitura di siRNA in vivo ai macrofagi, rendendo possibile l'immagine, così come modulare, la cui disfunzione contribuisce allo sviluppo e alla progressione dei disordini infiammatori cronici molti macrofagi e cancri.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato dal National Natural Science Foundation of China (81772308) e nazionali chiave di ricerca e sviluppo programma della Cina (n. 2017YFA0205502).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Gibco C11995500BT Warm in 37°C water bath before use
Fetal bovine serum Gibco A31608-02
Penicillin/streptomycin (1.5 ml) Gibco 15140122
Tetrazolium-based MTS assay kit Promega G3582 For cytotoxicity analysis
RAW 264.7 cell line Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China TCM13
Tissue culture plates (6-well) Corning 3516
Tissue culture dishes (10 cm) Corning 430167
RNase-free tubes (1.5 ml) AXYGEN MCT-150-C
Centrifuge tubes (15 ml) Corning 430791
Trypsin Gibco 25200-056
Wistar rats Shanghai Experimental Animal Center of Chinese
Academy of Sciences
Bacillus Calmette–Guérin freeze-dried powder National
Institutes for Food and Drug Control, China
for inducing adjuvant arthritis in rats
siRNA GenePharma (Shanghai, China)
Cy3-siRNA RiboBio (Guangzhou, China)
Polyethyleneimine (10 kDa) Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. E107079
Ammonia water Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. A112077
Oleic acid Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. O108484
Dimethylsulfoxide Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. D103272
FeSO4•7H2O Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10012118
FeCl3•6H2O Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10011918
Dimercaptosuccinic acid Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. D107254
ultrafiltration tube Millipore UFC910096
Tetramethylammonium hydroxide solution Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. T100882
Particle size and zeta potential analyzer Malvern, England Nano ZS90

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References

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