نقل نحققها جبرلين الخلوية مستويات استخدام الطاقة الرنين فورستر NlsGPS1 بيوسينسور (بكى)

Developmental Biology
 

Summary

جبرلين تصور الاستشعار 1 (GPS1) هو الأولى فورستر الرنين الطاقة المستندة إلى نقل بيوسينسور لقياس مستويات الخلوية phytohormones جبرلين مع ارتفاع قرار الزمانية المكانية. هذا البروتوكول تقارير بشأن الطريقة التي تصور وتحديد مستويات جبرلين الخلوية باستخدام بيوسينسور nlsGPS1 وراثيا مرمزة في نبات هيبوكوتيلس وتلميحات الجذر.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Rizza, A., Walia, A., Tang, B., Jones, A. M. Visualizing Cellular Gibberellin Levels Using the nlsGPS1 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor. J. Vis. Exp. (143), e58739, doi:10.3791/58739 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

جبرلين فيتوهورموني (GA) هو جزيء إشارات صغيرة متنقلة، والذي يلعب دوراً رئيسيا في إنبات البذور، والاستطالة الخلوية، والتحولات التنموية في النباتات. جبرلين تصور الاستشعار 1 (GPS1) هو نقل الطاقة الرنين فورستر الأولى (الحنق)-على أساس بيوسينسور التي تتيح رصد مستويات GA الخلوية الحية في. بقياس نسبة انبعاثات fluorescence النووية المترجمة-GPS1 (nlsGPS1)، رسم الخرائط الزمانية المكانية التي تم توفيرها اندوجينوسلي ومناشئ GA التدرجات في أنواع مختلفة من الأنسجة الممكنة على المستوى خلوي. هذا البروتوكول سوف تصف كيفية صورة نسب الانبعاثات nlsGPS1 في ثلاث تجارب مثال: حالة ثابتة، قبل وبعد خارجية جبرلين A4 (GA4) العلاجات، وعلى مر وقت-دورة علاج. نحن نقدم أيضا أساليب تحليل نسب الانبعاثات nlsGPS1 باستخدام كل من فيجي وبرمجيات تجارية صورة مجهرية (ثلاثي الأبعاد) ثلاثية الأبعاد تصور وتحليل وشرح القيود والمزالق المحتملة لاستخدام nlsGPS1 لقياس مستويات جبرلين.

Introduction

الهرمونات النباتية تلعب دوراً أساسيا في نمو النبات والتنمية. وتخضع هذه الجزيئات الصغيرة، والمتنقلة إرسال الإشارات عادة على عدة مستويات، مثل تخليق الحيوي وتقويض والنقل القصيرة والطويلة distance1،2،،من34. وقد شحذ فهم مسارات إشارات هرمون والردود النسخي المصب على مر السنين. ومع ذلك، ربط الاستجابات الخلوية متنوعة من مسارات الإشارات هرمون مع المدخلات التنظيمية توجيه توزيعات هرمون، نطلب إجراء تقييم كمي الزمانية المكانية لمستويات الهرمونات على المستوى خلوي. الحنق على أجهزة استشعار العوامل البيولوجية التي يمكن أن تكشف عن فيتوهورمونيس يمكن النهوض بقدرة العلماء على تحديد مستويات الهرمونات على المستوى خلوي. أجهزة استشعار العوامل البيولوجية على أساس الحنق تتكون من زوج الحنق (المانحين ويقبلون البروتينات الفلورية) مرتبطة بمجال حسية التي تلزم يجند محددة أو يستجيب لحافز بيولوجية. لجزيء صغير أجهزة استشعار العوامل البيولوجية، مشغلات ملزم يجند conformational تغيير المجال الحسي الذي يؤدي إلى تغيير المسافة و/أو الاتجاه بين البروتينات الفلورية اثنين من زوج الحنق. يتم إنجاز إجراء تحليل راتيوميتريك من بيوسينسور الحنق مثيرة الجهة المانحة وقياس نسبة الانبعاثات fluorescence يقبلون على الجهات المانحة5،6. ملزم يجند قابلاً للاكتشاف كتغيير في هذه الانبعاثات نسبة7.

نحن مؤخرا بوضع biosensor المستندة إلى الحنق لهرمون مصنع "الغاز ga." هي فئة من الهرمونات التي يمكن أن تروج لإنبات البذور، والاستطالة الخلوية، والتحول التنموي من الخضري إلى مراحل المزهرة. بيوسينسور nlsGPS1 النووية المترجمة ويوفر نظرة ثاقبة الزمانية المكانية ديناميات GA في الأنسجة النباتية المختلفة. في خلايا نبات ، يربط GA القابلة للذوبان المستقبلات، قزم جبرلين غير متحسسة (GID)، والمجمع يدفع تدهور ديلا البروتينات التي تعمل المنظمين السلبية للجمعية العامة يشير إلى2. المجال GA الحسية من nlsGPS1 يتكون من مستقبلات نبات GA (AtGID1C) التي ترتبط اقتطاع حمض 74 أمينية بروتين ديلا (أتجاي) وعزز زوج الحنق تتكون من متغيرات ثنائي من أزرق كنيون البروتين المانحة و أفروديت (فينوس تنوعاً كودون جماعي) ك بروتين فلوري يقبلون8. بيوسينسور nlsGPS1 جهاز استشعار عالية تقارب GA النشطة بيولوجيا4 (كد = 24 نانومتر للجمعية العامة4)، وأنها يمكن أن تستخدم في مختلف أنواع الأنسجة لتعيين وتحديد التدرجات GA. لتجنب سوء الفهم من نبات GA مستويات المجراة في، وقد وضعنا أيضا البديل nonresponsive من nlsGPS1 (nlsGPS1-NR) لاستخدامها كعنصر سلبي. يحمل البروتين nlsGPS1-NR الطفرات في جيب GA الملزمة التي تعطل الربط من الجمعية العامة والطفرات في البروتين ديلا التي تعطل التفاعل مع دائرة المخابرات العامة مستقبلات بروتينات7،9. يمكن اعتبار أنماط نسبة الانبعاثات أو التغيرات التي لوحظت في خطوط nlsGPS1 و nlsGPS1-NR المصنوعات اليدوية التي لا تتصل مباشرة بأحداث الجمعية العامة ملزمة. من المهم أيضا أن نلاحظ أن nlsGPS1 ملزمة للجمعية العامة4 لا يمكن عكسها سريعاً، وذلك، نسب الانبعاثات nlsGPS1 الخلوية ينبغي إلا يفسر يمثلون أعلى تركيز الأخيرة للجمعية العامة في نواة معينة بدلاً من الوقت الحقيقي مستويات مستقرة. نتيجة لذلك، تحليلاً لتراجع مستويات ألجأ غير ممكن مع nlsGPS1.

هنا نقدم بروتوكول مفصل للاستفادة من بيوسينسور nlsGPS1 في خلايا المصنع النموذجي نبات، باستخدام النهج القائم على تصوير [كنفوكل] في الاستبانة. ينص البروتوكول على المعلومات على جذور النباتات التصوير وهيبوكوتيلس في حالة ثابتة، وعلى مر الوقت-الدورات. يمكن أن تستخدم أجهزة الاستشعار nlsGPS1 يحتمل أن تكون في مختلف أنواع الأنسجة، وكذلك عبر الأنواع النباتية، لتعيين وتحديد توزيعات GA.

Protocol

1-الأعمال التحضيرية

  1. إعداد ½ Murashige وسكوغ أجار pH من 5.7 مع لا السكروز (1 لتر).
    1. حل ز 2.2 من Murashige وسكوغ (MS) متوسطة القاعدية في 950 مل من الماء عالي النقاوة. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 5.7 مع 5 م كوه.
    2. تشكل الحل نهائي حجم 1 لتر ماء عالي النقاوة. تقسيم زجاجتين 500 مل، أجار مصنع 1% التي تحتوي على كل ذلك. اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  2. إعداد ¼ MS السائل في درجة الحموضة 5.7 مع لا السكروز (1 لتر).
    1. حل ز 1.1 من مرض التصلب العصبي المتعدد في 950 مل من الماء عالي النقاوة. ضبط الأس الهيدروجيني إلى 5.7 مع 5 م كوه. تشكل الحل نهائي حجم 1 لتر ماء عالي النقاوة. تقسم إلى اثنين 500 مل الزجاجات. اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  3. تعد الجمعية العامة4.
    1. حل GA4 في الإيثانول 70% لجعل تركيز نهائي 100 ملم ألجأ4 المخزون.
    2. لإعداد حل عملي، تضعف الأسهم4 ألجأ إلى 0.1 – 1 ميكرومتر في ¼ MS السائل pH 5.7.

2. نمو النبات

  1. تعقيم بذور نبات .
    1. العمل باستخدام غطاء كيميائية. بذور قاسمة (حوالي 200 البذور) في أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل. استخدم علامة مع حبر مقاوم للكلور ووضع الأنابيب مع أغطية مفتوحة داخل السفينة التعقيم (مربع كبير الذي يمكن أن تكون مختومة).
    2. ضع كوب 250 مل يحتوي على 50 مل من الماء عالي النقاوة و 50 مل من محلول هيبوكلوريت الصوديوم داخل السفينة التعقيم.
    3. أضف 3 مل حمض الهيدروكلوريك (HCl) إلى الكأس. ختم السفينة على الفور والسماح التعقيم بغاز الكلور ح 6 – 16.
    4. وبعد الكشف السفينة، إغلاق الأغطية جميع الأنابيب ميكروسينتريفوجي في الرف البذور. ويمكن تخزين بذور معقمة جافة حتى وقت الطلاء.
  2. زرع حوالي 20 معقمة نبات البذور على ألواح مربعة أجار ½ مرض التصلب العصبي المتعدد. ختم اللوحات مع الشريط الجراحي المسامية والتفاف عليها مع رقائق الألومنيوم. احتضان لهم عند 4 درجة مئوية لمدة 1-3 أيام للتقسيم الطبقي.
  3. لتصوير الجذر، نقل اللوحات إلى دائرة النمو في وضع رأسي لمدة 3 أيام مع ظروف النمو التالية: شروط طويلة أيام (LD، ح 16 من الضوء/8 ح من الظلام)؛ s-2120 µmol⋅m-1 شدة الضوء؛ درجة حرارة 22 درجة مئوية (خلال دورة الخفيفة) أو 18 درجة مئوية (خلال دورة الظلام)، 65% الرطوبة النسبية (RH).
  4. ل hypocotyl نابعة من الظلام: نقل اللوحات إلى الدائرة النمو لنبض ضوء من 1 – 4 ح لمزامنة الإنبات. التفاف اللوحات مع رقائق الألومنيوم ووضعها في دائرة النمو في وضع رأسي لمدة 3 أيام.

3-نموذج إعداد

  1. قياسات حالة ثابتة (الشكل 1A)
    1. على شريحة مجهر نظيفة، إضافة 50 ميليلتر من سائل ¼ مرض التصلب العصبي المتعدد (يطلق عليها من الآن فصاعدا كحل صورية). نقل الشتلات الإعراب عن nlsGPS1 من اللوحة إلى الشريحة بلطف.
    2. ساترة نظيفة وبقعة قطره الشحوم فراغ في كل ركن من ساترة. ضع ساترة لطف على الشتلات وإضافة حل إضافية وهمية لإزالة أي فقاعات الهواء بعناية.
  2. GA4 العلاج: تجربة التبادل الكيميائي (1B الرقم).
    1. قبل العلاج4 GA، استخدام 20 مل حقنه مليئة بفراغ الشحوم (تعلق على تلميح بيبيت) لرسم مستطيل (الطول: 3.5 سم، الارتفاع: 2.5 سم) مع طبقة موحدة من الشحوم فراغ على شريحة زجاجية نظيفة (الشكل 1B). للسماح بخيط رفيع من الشحوم فراغ، ينبغي خفض نصيحة بيبيت لفتحه من 1 ملم في القطر.
    2. إضافة 50 ميليلتر من الحل الوهمي للشريحة الزجاجية. مع الملقط نظيفة، اختيار الشتلات nlsGPS1 ووضعها بلطف على الحل صورية. لمنع أي ضرر، نقل الشتلات بدعم السفلي كوتيليدونس دون استيعاب الشتلة مع الملقط.
    3. ساترة نظيفة وبقعة قطره الشحوم فراغ في كل ركن من ساترة. استخدام الملقط، ضع ساترة في وسط المستطيل الشحوم فراغ. الآن مختومة ساترة على الجانبين المقابلة لحواف المستطيل الشحوم فراغ طويل.
    4. إضافة حل إضافية وهمية لملء الخزان وإزالة أي فقاعات الهواء داخل الخزان دون إزعاج seedling(s) داخل بعناية.
    5. الحصول على الصور قبل العلاج4 ألجأ استخدام مجهر [كنفوكل]. اتبع التعليمات كما هو موضح في المادة 4 من هذا البروتوكول.
    6. لعلاج4 GA، قم بإزالة الشريحة المجهر من المرحلة [كنفوكل]. تعيين جهاز ضبط وقت لمدة 20 دقيقة.
    7. بعد بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت، تبادل الحل المخزن المؤقت مع ¼ MS السائل الذي يحتوي على 1 ميكرومتر GA4. إضافة حل4 GA (حوالي 50 ميليلتر) من الجانب الأيسر من ساترة وإزالة الحل (صورية) السابقة من الجانب الأيمن. الحفاظ على تبادل حل محل الحل وهمية تماما، الذي يستغرق حوالي 10 دقيقة (الشكل 1B).
    8. ضع الشريحة الزجاجية مرة أخرى في مرحلة المجهر. انتظر 10 دقائق أخرى قبل الحصول على الصورة بعد الجمعية العامة.
  3. قم بإعداد دورة الوقت للأنسجة للفائدة
    ملاحظة: قد تكون الأنسجة ذات الاهتمام، على سبيل المثال، هيبوكوتيلس أو الجذور. نقوم بشكل روتيني الدورات الزمنية للتصوير بيوسينسور nlsGPS1 باستخدام نظام التروية تجارية (الشكل 1، انظر الجدول للمواد) أو من10،روتشيب،من711.
    1. إضافة 200 ميليلتر من حل وهمية إلى مركز القناة نضح-الشريحة الملصقة (انظر الجدول للمواد). بلطف اختيار شتلات nlsGPS1 ووضعها على الحل صورية في الشريحة-لزجة.
    2. استخدام الملقط، بلطف ضع ساترة الزجاج واستخدام المؤخرة الملقط، اضغط برفق على الحواف الخارجية ساترة حتى أن يشكل رابطة قوية مع المادة لزجة على الهامش الشريحة الملصقة.
    3. استخدام الكوع اثنين اللوير موصلات (مع قطر داخلي [معرف] 0.8 ملم) وأنابيب سيليكون (مع معرف 0.8 ملم)، الاتصال الشريحة الملصقة حقنه 20 مل وحاوية منفذ جمع الحل إلى الخارج. استخدم موصل قفل اللوير (مع معرف 0.8 ملم) للاتصال حقنه بأنابيب سيليكون.
    4. اضغط برفق حقنه تحتوي على الحل صورية يدوياً للسماح كافية الحل يمر عبر الدائرة بحيث لا توجد أي فقاعات الهواء التي تركت في الدائرة. وعقد حقنه على ضخ حقنه قابلة للبرمجة.
    5. تعيين معلمات مضخة محددة للمحاقن المستخدمة (أي.والقطر والحجم) جنبا إلى جنب مع معدل التدفق وفقا لدليل مزودة بالمضخة.
      ملاحظة: في هذا البروتوكول، تم استخدام معدل تدفق من 1 – 3 مل/ساعة، وهذا يمكن أن تتغير وفقا لمطالب التجريبية. بدء دورة الوقت قبل بدء تشغيل المضخة.
    6. للعلاج4 الجمعية العامة خلال دورة وقت (الشكل 1)، وقف التروية بإيقاف المضخة وتغيير حقنه بسائل ¼ MS المحتوية على واحدة جديدة تستكمل مع ألجأ4. المضي قدما في تصوير [كنفوكل] كما هو موضح في المقطع التالي.

4-الفحص المجهري

ملاحظة: ونحن أداء الليزر [كنفوكل] مجهرية.

  1. الحصول على الصور باستخدام مجهر [كنفوكل] مجهزة بأشعة الليزر لإجراء تصوير الحنق.
    ملاحظة: ل nlsGPS1، يتم تصويرها المتغيرات من البروتينات الفلورية السماوي (CFP) وبروتين فلوري الصفراء (يفب). في هذا البروتوكول، تستخدم المجاهر التجارية (انظر الجدول للموادالمدرجة كالمجهر 1 و 2) مع 10 x أو 20 x الجافة 0.70 متناسق مجمع APO خطة الأهداف.
  2. المجهر 1 واستخدام 448 nm والليزر الطول الموجي نانومتر 514 تثير الحراجية المعتمدة ويفب، على التوالي. اكتساب عمليات التفحص متسلسلة. تعيين (على سبيل المثال، HyD SMD) للكشف عن الكشف عن 460 – 500 نانومتر للحركة (المانحة الانبعاثات) و 525 – 560 نانومتر يفب (الحنق الانبعاث) بعد الإثارة للحركة. استخدام تسلسل ثاني، تعيين جهاز كشف للكشف عن 525 – 560 نانومتر يفب (الانبعاثات يفب) بعد إثارة يفب.
    ملاحظة: يتم استخدام هذه الأسفار يفب كعنصر تحكم تعبير، وكذلك في تجزئة النوى، لتوليد الأسطح باستخدام التصور صورة مجهرية ثلاثية الأبعاد التجارية وتحليل البرامج.
  3. مجهر 2 واستخدام 440 نانومتر وخطوط الليزر الطول الموجي نانومتر 514 تثير الحراجية المعتمدة ويفب، على التوالي. الحصول على هذين المسارين. للمسار 1، تعيين كاشفات (على سبيل المثال.أو ChS) للكشف عن 464 – 500 نانومتر للحركة (المانحة الانبعاثات) وشمال البحر الأبيض المتوسط 526 – 562 يفب (الحنق الانبعاث) بعد الإثارة للحركة. لتعقب 2، تعيين جهاز كشف للكشف عن نانومتر 526 – 562 يفب (الانبعاثات يفب) بعد إثارة يفب.
    ملاحظة: يتم استخدام هذه الأسفار يفب كعنصر تحكم تعبير، وكذلك في تجزئة النوى، لتوليد الأسطح في برنامج التحليل والتصور ثلاثي الأبعاد.
  4. الحصول على الصور باستخدام تنسيق بكسل 512 × 512 وقرارا من 12 بت.
  5. المكسب يحتاج إلى تعديل لقيمة العزم تجريبيا يسمح لإشارة جيدة في حين لا تشبع بكسل. لا يجب تغيير الكسب بين الانبعاثات الحراجية المعتمدة والحنق إزاء التجربة. تعيين الثقب لوحدة مهواة 1 (الاتحاد الأفريقي). ضع إيبيدي لزجة--الشريحة في مرحلة المجهر [كنفوكل]، والمضي قدما في التصوير كما سبق.
  6. في برنامج المجهر 1، بينما بتفحص حية نشطة، تستخدم في توهج أكثر من/تحت تقع في أعلى الجانب الأيسر من الشاشة صورة لتحديد ناقص وتشبع المنطقة من الفائدة. في برنامج مجهر 2، استخدام مؤشر مجموعة الموجودة على الجانب السفلي من الشاشة صورة لتحديد ناقص وتشبع المنطقة من الفائدة. لأي تحليل الصورة الكمية، ينبغي أن يكون هناك لا التشبع بكسل.
  7. تعيين z-المداخن مع حجم خطوة 1 ميكرومتر. يمكن تقليل z-قرار زيادة حجم الخطوة أو زادت سرعة زيادة اقتناء أو لزيادة عدد الوظائف/العينات التي يمكن تصويرها. لمجرى الزمن الآلي، ضبط الوقت جنبا إلى جنب مع z-المداخن (وضع إكسيزت من علامة التبويب وضع اقتناء) للحصول على الصور في فترات زمنية محددة.

5-صورة تحليل استخدام فيجي

ملاحظة: استخدام إيماجيج (فيجي) من الممكن لمعالجة بيانات التصوير وإنتاج الصور (2-د) ثنائي الأبعاد لنسبة الانبعاثات في شتلات نبات nlsGPS1. للحصول على أمثلة من الصور، انظر الشكل 2 أ، ج 2، 2E، ز 2، و 3A. في إيماجيج، من الممكن أن تجد كل أمر من هذا البروتوكول باستخدام وظيفة البحث. اضغط على شريط المسافة ول على لوحة مفاتيح الكمبيوتر. سيتم فتح نافذة جديدة؛ اكتب الأمر المطلوب في حقل البحث.

  1. اسحب الملف (الملفات أما من.lif أو.lsm) في فيجي (صورة ي) وفتح الصور كفرط المكدس.
  2. من القائمة الرئيسية، حدد الصورة > مكدس > المشروع Z و تحديد مجموع الشرائح لالتقاط كل بكسل بدلاً من بكسل ألمع فقط كما هو الحال في الإسقاط كحد أقصى.
  3. من القائمة الرئيسية، حدد العملية > خلفية استقطاع وتعيين نصف قطر الكرة المتداول إلى 50 بكسل. إلغاء تحديد أية خيارات أخرى ومعالجة جميع الصور الثلاث. هذه الخطوة إزالة الخلفية باستخدام خوارزمية "المتداول الكرة".
    ملاحظة: 50 بكسل تجريبيا مصممة لتشمل نواة كمقدمة.
  4. من القائمة الرئيسية، حدد الصورة > ألوان > تقسيم القنوات. سيتم فتح نوافذ جديدة ثلاثة: C1 SUM (قناة الحراجية المعتمدة)؛ مجموع C2 (قناة الحنق)، و مجموع C3 (قناة يفب).
  5. حدد الإطار C3 بالمبلغ ، ومن القائمة الرئيسية، حدد عملية > مرشحات > تمويه ضبابي وتطبيق "التمويه الضبابي" من 1 تقليل تشويش الصورة.
  6. من القائمة الرئيسية، حدد الصورة > ضبط > السطوع/ وحدد تلقائي.
  7. من القائمة الرئيسية، حدد العملية > تعزيز التباينو التشبع تعيين = 0.35.
  8. من القائمة الرئيسية، حدد الصورة > نوع > 8-بت ، وتحويل المداخن في صورة 8 بت.
  9. من القائمة الرئيسية، حدد الصورة > ضبط > عتبة صناعة السيارات المحلية. في عتبة السيارات المحلية، حدد المعلمات التالية: أسلوب فانسالكار، دائرة نصف قطرها = 15، المعلمة 1 = 0و المعلمة 2 = 0و الأبيض مكدس الذاكرة المؤقتة. في هذه الخطوة، يتم استخدام مكدسات يفب جعل قناع ثنائي.
  10. حدد الإطار C2 بالمبلغ ، ومن القائمة الرئيسية، حدد عملية > مرشحات > تمويه ضبابي وتطبيق "التمويه الضبابي" من 1.
  11. حدد الإطار C1 SUM ، ومن القائمة الرئيسية، حدد عملية > مرشحات > تمويه ضبابي وتطبيق "التمويه الضبابي" من 1.
  12. لإنشاء مكدس نسبة الانبعاثات من القناتين، من القائمة الرئيسية، حدد العملية > صورة الإله الحاسبة. في النافذة الجديدة التي تظهر، حدد المبلغ C2 كصورة 1، حدد تقسيم كعامل، وحدد C1 sum كالصورة 2.
  13. تأكد من تحديد إنشاء نافذة جديدة وتنسيق 32-بت. سوف تظهر نافذة جديدة المسماة نتيجة لمجموع C2.
  14. من القائمة الرئيسية، حدد الصورة > جدول البحث > 16_colors طرفية المستعملين المحليين.
  15. من القائمة الرئيسية، حدد العملية > صورة الإله الحاسبة. في النافذة الجديدة التي تظهر، حدد نتيجة لمجموع C2 كصورة 1، حدد ضرب كعامل، وحدد المبلغ C3 كالصورة 2. في هذه الخطوة، يتم ضرب القناع يفب ثنائي مع مكدس يفب/الحراجية المعتمدة لإظهار فقط بكسل موجودة في قناة التحكم يفب.
  16. من القائمة الرئيسية، حدد العملية > الرياضيات > تقسيم وتعيين القيمة إلى 255. في الإطار الجديد الذي يتم فتحه، حدد نعم لتحليل كافة الصور في المكدس. سوف تظهر صورة جديدة المسماة نتيجة للنتيجة في C2-مجموع.
  17. من القائمة الرئيسية، حدد الصورة > ضبط > السطوع/ وحدد تلقائي.
  18. من القائمة الرئيسية، حدد العملية > تعزيز التباين، وحدد نوع المشبعة = 0.35.
  19. من القائمة الرئيسية، حدد الصورة > ضبط > السطوع/، وتعيين قيم الحد الأدنى والحد الأقصى لالتقاط توزيع GA. خطوة اختيارية: حدد من القائمة الرئيسية، تحليل > أدوات > شريط المعايرة و شريط عرض لوط-المعايرة، وحفظ نتيجة للنتيجة في C2 المبلغ كملف.tiff.
  20. للحصول على قيم الانبعاثات النسب، من القائمة الرئيسية، حدد تحليل > تعيين القياس والتحديد يعني قيمة الرمادي و الانحراف المعياري.
  21. حدد الشكل المستطيل من شريط الأدوات ورسم طقة فائدة (العائد على الاستثمار). من القائمة الرئيسية، حدد تحليل > التدبير. نافذة جديدة سوف تقرير القيمة الوسطية من العائد على الاستثمار المحددة.
  22. نسخ ولصق القيم التي تم الحصول عليها في برنامج جداول البيانات (على سبيل المثال، Excel أو OriginPro) وجعل الرسم بياني لعلاج4 GA قبل وبعد التجربة أو الرسم بياني الخطي لدورة وقت التجربة.

6-صورة التحليل باستخدام برمجيات التحليل والتصور ثلاثي الأبعاد

ملاحظة: وميزة استخدام البرمجيات المختارة (انظر الجدول للمواد) هو جزء من الكائنات (مثل نوى) وإنشاء صور ثلاثية الأبعاد من كدسة z [كنفوكل]. للحصول على أمثلة من الصور، انظر الشكل 2B، 2D، 2 واو، ح 2، و 3B.

  1. افتح البرنامج وقم باستيراد الملف (ملفات.lif أو.lsm).
  2. أنوية الجزء استناداً إلى عنصر التحكم يفب الانبعاثات قناة باستخدام معالج السطوح. وتسمى كائنات مجزأة "الأسطح". تسمح هذه الخطوة تجزئة تحليل جميع فوكسيلس في نواة ككائن واحد أثناء إزالة الخلفية من فوكسيلس خارج النواة.
  3. معالج السطوح، تعيين الطرح الخلفية (التباين المحلي) إلى 3 ميكرومتر والعتبة بشكل افتراضي. قناع الانبعاثات الحراجية المعتمدة (المانحة الإثارة المانحة الانبعاثات [دكسدم]) وقنوات الانبعاثات (المانحة الإثارة يقبلون الانبعاثات [دكسام]) الحنق على الأسطح تم إنشاؤها باستخدام القناة (يقبلون الإثارة يقبلون الانبعاثات [عزام]) الانبعاثات يفب أساس.
  4. استخدام ملحق XT يعني نسبة كثافة لحساب نسبة الانبعاثات يقبلون الإثارة المانحة مقسوماً على المانحين الإثارة المانحة الانبعاثات (دكسام/دكسدم) بين قيم الكثافة الوسطية للسطوح الفردية في القناتين.
    ملاحظة: هذا التمديد متاح على الإنترنت للتحميل.
  5. لتلوين السطوح الفردية مع نسبة الانبعاثات nlsGPS1، حدد لون الترميز مع الإحصاءات، التي يتم تمثيلها كرمز عجلة ألوان. حدد يعني نسبة كثافة كنوع الإحصاءات.
  6. تصدير نسب القيم الفردية من الجدول، الذي تم العثور عليه تحت الرمز الإحصاءات .
  7. نسخ ولصق القيم في جدول بيانات وجعل الرسم بياني لقبل وبعد تجارب العلاج4 GA أو الرسم بياني خطي للوقت والتجارب بالطبع.

7-إحصائية تحليل

ملاحظة: انظر الشكل 3D لمؤامرة بيسوارم ومربع nlsGPS1 نسب الانبعاثات.

  1. افتح البرنامج ولصق نسبة الانبعاثات السطوح الأنوية كأعمدة Y.
  2. حدد أعمدة الفائدة وتحديد الإحصاءات > وصف الإحصاءات > اختبار الحالة الطبيعية معرفة ما إذا كان يتم توزيع العينات عادة. تشغيل اختبار الحياة الطبيعية وسيتم فتح نافذة جديدة وتقرير عن نتائج.
  3. إذا كان يتم توزيع العينات عادة، استخدام t-الاختبار كاختبار الإحصائية. حدد إحصائيات > اختبار الفرضية > اثنين--نموذج اختبار t في الصفوف وتشغيل t-اختبار.
  4. إذا لم يتم توزيع العينات عادة، حدد إحصائيات > اختبار "الفرضية الإحصائية" > اثنين--نموذج اختبار للفرق معرفة ما إذا كان الفرق بين العينات لا تختلف اختلافاً كبيرا.
  5. إذا لم يكن الفرق المختلفة إلى حد كبير، استخدم اختبار مان-ويتني U كاختبار الإحصائية. حدد إحصائيات > اختبار Nonparametric > اختبار مان-ويتني وتشغيل الاختبار.
  6. إذا كان الفرق المختلفة إلى حد كبير، استخدم اختبار كروسكال واليس ANOVA كاختبار الإحصائية. حدد إحصائيات > اختبار Nonparametric > اختبار كروسكال واليس ANOVA وتشغيل الاختبار.

Representative Results

باستخدام nlsGPS1، من الممكن لقياس مستويات4 GA الخلوي في الأنسجة قابلة للتصوير بالأسفار، بما في ذلك تلميحات الجذر ونابعة من الظلام هيبوكوتيلس (الشكل 2). في جذر نبات ، التدرج نسبة الانبعاثات nlsGPS1 يدل على انخفاض مستويات GA في مناطق ميريستيماتيك وشعبة وارتفاع مستويات GA في منطقة الاستطالة الراحل (الشكل 2 ألف و 2 باء). في المقابل، لم يلاحظ تدرج في نسبة انبعاثات في جذور nlsGPS1-NR، مما يوحي بأن التدرج GA الذاتية لا الحرفية (الشكل 2 و 2D). كما شكلت تدرج نسبة انبعاثات nlsGPS1 في هيبوكوتيلس نابعة من الظلام، مع مستويات منخفضة في كوتيليدونس وربط قمي ومستويات عالية في منطقة القاعدية الونجاتينج سريعاً من hypocotyl (الشكل 2E و 2F). في المقابل، لم يلاحظ تدرج في نسبة انبعاثات في هيبوكوتيلس nlsGPS1-NR (الشكل 2 وح 2). في جذور نبات وخلايا hypocotyl نابعة من الظلام، يرتبط الذاتية GA تراكم مع معدل الاستطالة الخلوية.

وعلاوة على ذلك، GA مناشئ الموردة4 يتراكم تفضيلي في منطقة الاستطالة مقارنة بمنطقة الشعبة من جذر نبات (الشكل 3)، مما يشير إلى أن nlsGPS1 يمكن استخدامها لدراسة الجمعية العامة الداخلية والخارجية الزخرفة.

أثناء وقت الدورة تجارب، nlsGPS1 تم وضعها في الدوائر لزجة الشريحة الشتلات و perfused مع سائل ¼ مرض التصلب العصبي المتعدد، تليها علاج مع 0.1 ميكرومتر GA4 لمدة 30 دقيقة. ويظهر شريط الفيديو سرعة تراكم خارجية GA4 في منطقة استطالة الجذر مقارنة بمنطقة الشعبة (1 فيديو).

Figure 1
رقم 1: نموذج التحضير لتصوير [كنفوكل]- إظهار هذه الأفرقة تمثيل تخطيطي لإعداد نموذج (A) تجربة حالة ثابتة، (ب) قبل وبعد GA خارجية4 العلاجات، واستخدام (ج) تجربة دورة وقت المعاملة لزجة-الشرائح (ج). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: GA التدرج في جذور نبات ونابعة من الظلام هيبوكوتيلس. حللت الصور ثنائية الأبعاد من nlsGPS1 (A) و (ج) nlsGPS1-NR الجذور باستخدام البرمجيات إيماجيج، وصور ثلاثية الأبعاد ل nlsGPS1 (ب) و (د) nlsGPS1-NR حللت باستخدام تجاري ثلاثي الأبعاد برنامج تحليل الصور. وأظهر كل التحليلات ذاتية GA4 التدرج في جذور نبات . حللت الصور ثنائية الأبعاد من nlsGPS1 (ه) و (ز) nlsGPS1-NR نابعة من الظلام هيبوكوتيل باستخدام البرمجيات إيماجيج، وصور ثلاثية الأبعاد ل nlsGPS1 (و) و (ح) nlsGPS1-NR تم تحليلها باستخدام برمجيات التحليل التجاري صورة ثلاثية الأبعاد. أظهرت كل التحليلات ذاتية GA4 التدرج في هيبوكوتيلس نابعة من الظلام. يعرض شريط طرفية التلون كاذبة من نسب الانبعاثات nlsGPS1. صور يفب ترد كعناصر تحكم التعبير. هيبوكوتيل الصور تم الحصول عليها استخدام الموقفين المرحلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: التدرج GA خارجية في جذور. أول فريقي إظهار (A) ثنائي الأبعاد وصور ثلاثية الأبعاد (ب) الجذر nlsGPS1 قبل و 20 دقيقة بعد معاملة خارجية GA4 (1 ميكرومتر). صور يفب ترد كعناصر تحكم التعبير. إظهار آخر فريقين (ج) المتوسط والانحراف المعياري والأرض بيسوارم ومربع (د) نسب الانبعاثات nlsGPS1 لنواة منطقة الاستطالة (منطقة التي تم تعريفها باستخدام إطار أبيض). في منطقة الاستطالة، كانت نسبة الانبعاثات nlsGPS1 أعلى بكثير بعد علاج4 GA (اختبار مان-ويتني U، * * * فقيمه < 0.0001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Video 1
الفيديو 1: التجربة نضح من الجذر nlsGPS1 باستخدام الشريحة الملصقة. يوضح هذا الفيديو صور ثلاثية الأبعاد من nlsGPS1 perfused مع سائل ¼ مرض التصلب العصبي المتعدد، وتعامل مع 0.1 ميكرومتر GA4 لمدة 30 دقيقة. في مجرى الزمن، اكتسب تصوير كل 10 دقيقة ح 3 مع الفواصل الزمنية التالية: 30 دقيقة من الحل صورية (الإطار t = 1، ر = 2، t = 3)، 30 دقيقة للعلاج4 ألجأ (الإطار تي = 4، ر = 5، تي = 6)، ح 2 من وهمية حتى شفويا (الإطار t = 7 إلى t = 18) الحل. وقبل اكتساب، كان perfused العينة مع الحل صورية ل 2 حاء الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Discussion

NlsGPS1 بيوسينسور GA المستندة إلى الحنق يوفر طريقة كمية للتقرير وقياس GA هرمون التدرجات في محطات متعددة الخلايا. أجهزة استشعار العوامل البيولوجية على أساس الحنق يمكن قياس ديناميات مع قرار الزمانية المكانية محسنة عبر الكشف المباشر الكتلي والقياس غير المباشر بالصحافيين النسخي أو إشارات البروتين-تدهور-المستندة إلى أساليب12، 13. يمكن أن يؤدي تصوير الخلوية ذات الدقة العالية في مختلف أنواع الأنسجة ثاقبة ذات معنى ألجأ البيولوجيا وشرارة فرضيات جديدة فيما يتعلق بتنظيم ودالة من تراكمات GA في سياق متعددة الخلايا. على سبيل المثال، رصد التغيرات في بيوسينسور nlsGPS1 في GA محددة السكروز، تقويضي، وطفرات النقل، وكذلك أثناء اضطرابات المستحث سباتيوتيمبورالي، يمكن أن تكون مفيدة للغاية لاختبار على وجه التحديد كيف يتم إنشاء التدرجات ألجأ في الجذر، والجذر عنوان الخلية الردود على التدرجات GA. يمكن استخدام أجهزة الاستشعار في الأنواع النموذجية والمحاصيل الأخرى لاختبار الحفاظ على الآليات التي تتحكم في عنصر التحكم بوساطة GA إنبات البذور، والاستطالة الخلوية، وازدهار.

الخطوات الحاسمة في تصوير المستندة إلى الحنق بيوسينسور nlsGPS1 هي أنه ينبغي عدم المشبعة 1) بكسل أثناء التحليل الكمي الحنق، معلمات 2) التصوير مثل "الكشف عن كسب" ينبغي أن تظل ثابتة لانبعاث المانحين (دكسدم) و يقبلون المشتريات من الانبعاثات (دكسام)، 3) ينبغي أن تستخدم خطوط nlsGPS1-NR التحكم ليستبعد المصنوعات اليدوية، و 4) ينبغي إعداد العينات للتقليل من الانجراف والقضايا المحورية التغيير. بالإضافة إلى ذلك، الظروف البيئية التي تزرع العينات مهمان للتحكم نظراً لمستويات GA حساسة للظروف البيئية مثل مدة الخفيفة وكثافة الضوء14،،من1516 ،17. القيد رئيسي لهذا النوع من التحليل أن نسبة الإشارة إلى الضوضاء عالية مطلوب للتصوير نظراً لزيادة الضجيج الكامنة في تصوير راتيوميتريك. وهكذا، تصوير nlsGPS1 لن يكون مفيداً للأنسجة والأعضاء التي ليست قابلة راتيوميتريك fluorescence مجهرية باستخدام البروتينات الفلورية السماوي والأصفر – الأنسجة العميقة وعلى سبيل المثال، حيث تم اكتشاف البروتينات الفلورية سيئة. من ناحية أخرى، قراءات راتيوميتريك غالباً ما يفضل على قراءات إينتينسيوميتريك، لأن عنصر تحكم داخلي مفيدة لاستبعاد الآثار الناجمة عن التغيرات في التعبير biosensor، والاستقرار، والسطوع، أو الكشف في خلية معينة، الأنسجة ، أو الشرط. على سبيل المثال، تآكل تصوير biosensor وتحليلات الصورة قد استخدمت أيضا لدراسة مجموعة متنوعة من يغاندس في مجموعة متنوعة من الأنسجة5،،من618،،من1920،. تجارب التصوير وتحليلات الصورة التي ذكرت هنا يمكن تعديلها لتناسب أساليب التصوير الجديدة، مثل الفحص المجهري الورقة الخفيفة، التي يمكن أن تسفر عن رؤى جديدة في، على سبيل المثال، أعمق جذور الأنسجة-أنواع.

بيوسينسور nlsGPS1 من الجيل الأول من جهاز استشعار عالية تقارب يوفر خريطة عالية الدقة للتدرجات GA التي يمكن أيضا تقريرا عن الزيادات داخل الخلايا في الجمعية العامة عقب خارجية GA العلاجات. واحد أوجه القصور الحالية في nlsGPS1 هو أن أجهزة الاستشعار لا يمكن عكسها سريعاً، وهكذا، تقارير ليس على مستويات مستقرة GA، لكن من المحتمل على تركيز GA الأخيرة الحد الأقصى في الحل من الفائدة. معدل الدوران الدقيق للاستشعار أيضا غير معروف وهذا، جنبا إلى جنب مع إمكانية الرجوع منخفضة، يحول دون الكشف عن عمليات الاستنفاد GA الذاتية التي يمكن أن يحدث خلال دقائق إلى بضع ساعات في بعض أنواع الأنسجة. من المهم أيضا أن نلاحظ أن nlsGPS1 لها صلة عالية للجمعية العامة4 (كد = 24 نانومتر) مقارنة بسائر أشكال ألجأ (GA3 كد= 240 نانومتر، GA1كد = 110 نيوتن متر) عند التصوير الأخرى الغاز النشطة بيولوجيا 7-يمكن هندستها أجيال المستقبل من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية ألجأ إلى زيادة إمكانية الرجوع مع الحفاظ على النسب العالية أو يحمل خصائص مختلفة لمختلف السلائف، النشطة بيولوجيا، أو كاتابوليتي غاز. 

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا العمل قد تلقت تمويلاً من مجلس البحوث الأوروبي (المنسق) ضمن أفق 2020 البحث والابتكار في البرنامج الاتحاد الأوروبي في (منحة اتفاق n ° 759282).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
nlsGPS1 Col0 Arabidopsis seeds NASC N2107734
nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis seeds NASC N2107735
Gibberellin A4 (GA4) Sigma G7276 dissolve in EtH 70% , and keep at -20 °C
sodium hypochlorite solution (Bleach) Fisher S/5040 HSRA 064
Hydrogen cloride HCl Sigma 31434
Micropore tape 3M 1530-1
ibidi sticky-slide Ibidi 81128 Luer 0.1 for root imaging
ibidi sticky-slide Ibidi 80168 Luer 0.2 for hypocotyl imaging
glass coverslip for sticky slides Ibidi 10812
Elbow Luer Connectors Ibidi 10802
silicone tubing Ibidi 108401
Luer Lock Connector Ibidi 10826
programmable syringe pump World Precision Instruments AL-1000
Vacuum grease Sigma 18405
Murashige and Skoog Basal Salts Duchefa M0221
Agar plant, 1 kg Melford P1001
Microscope slide ground edges, 76 mm x 26 mm, 1.0 mm to 1.2 mm thick Fisher Scientific 12383118
Cover slip No.1 1/2 glass 22 mm x 22 mm Fisher Scientific 12363138
Luer-slip Syringe 20 mL Fisher Scientific 10785126
3M Micropor Surgical Paper Tape Fisher Scientific 12787597
Potassium Hydroxide, 500 g Sigma Aldrich 221473-500G-D
Absolute Ethanol Fisher Scientific 10428671
Forceps Watchmaker 5 StSteel Scientific Laboratory Supplies INS4340
Scissors, 125 mm, stainless steel Fisher Scientific 12338099
Fitting reducer 0.5 to 1.6 Ibidi 10829
Leica SP8 Confocal laser microscope 1
Zeiss LSM 780 Confocal laser microscope 2
Imaris Bitplane 3D visualization and Analysis software
Fiji image analysis software
OriginPro Origin Lab Statistical Analysis Software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Binenbaum, J., Weinstain, R., Shani, E. Gibberellin Localization and Transport in Plants. Trends in Plant Science. 23, (5), 410-421 (2018).
  2. Sun, T. Gibberellin Metabolism, Perception and Signaling Pathways in Arabidopsis. The Arabidopsis Book. 6, 0103 (2008).
  3. Rieu, I., et al. Genetic Analysis Reveals That C19-GA 2-Oxidation Is a Major Gibberellin Inactivation Pathway in Arabidopsis. The Plant Cell Online. 20, (9), 2420-2436 (2008).
  4. Regnault, T., et al. The gibberellin precursor GA12 acts as a long-distance growth signal in Arabidopsis. Nature Plants. 1, 15073 (2015).
  5. Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors. Annual Review of Plant Biology. 63, (1), 663-706 (2012).
  6. Walia, A., Waadt, R., Jones, A. M. Genetically Encoded Biosensors in Plants: Pathways to Discovery. Annual Review of Plant Biology. 69, (1), 497-524 (2018).
  7. Rizza, A., Walia, A., Lanquar, V., Frommer, W. B., Jones, A. M. In vivo gibberellin gradients visualized in rapidly elongating tissues. Nature Plants. 3, (10), 803-813 (2017).
  8. Rizzo, M. A., Springer, G., Segawa, K., Zipfel, W. R., Piston, D. W. Optimization of pairings and detection conditions for measurement of FRET between cyan and yellow fluorescent proteins. Microscopy and Microanalysis. 12, (3), 238-254 (2006).
  9. Ueguchi-Tanaka, M., et al. GIBBERELLIN INSENSITIVE DWARF1 encodes a soluble receptor for gibberellin. Nature. 437, 693-698 (2005).
  10. Grossmann, G., et al. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip. Journal of Visualized Experiments. (65), 34290 (2012).
  11. Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23, (12), 4234-4240 (2011).
  12. Brunoud, G., et al. A novel sensor to map auxin response and distribution at high spatio-temporal resolution. Nature. 482, 103-106 (2012).
  13. Wang, N. N., Shin, M. C., Li, N. The GUS reporter-aided analysis of the promoter activities of Arabidopsis ACC synthase genes AtACS4, AtACS5, and AtACS7 induced by hormones and stresses. Journal of Experimental Botany. 56, (413), 909-920 (2005).
  14. Alabadi, D. Gibberellins Repress Photomorphogenesis in Darkness. Plant Physiology. 134, (3), 1050-1057 (2004).
  15. De Lucas, M., et al. A molecular framework for light and gibberellin control of cell elongation. Nature. 451, (7177), 480-484 (2008).
  16. Strasser, B., Sanchez-Lamas, M., Yanovsky, M. J., Casal, J. J., Cerdan, P. D. Arabidopsis thaliana life without phytochromes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107, (10), 4776-4781 (2010).
  17. Feng, S., et al. Coordinated regulation of Arabidopsis thaliana development by light and gibberellins. Nature. 451, 475-479 (2008).
  18. Choi, W. G., Swanson, S. J., Gilroy, S. High-resolution imaging of Ca2+, redox status, ROS and pH using GFP biosensors. Plant Journal. 70, (1), 118-128 (2012).
  19. Lanquar, V., et al. Dynamic imaging of cytosolic zinc in Arabidopsis roots combining FRET sensors and RootChip technology. New Phytologist. 202, (1), 198-208 (2014).
  20. Krebs, M., Schumacher, K. Live cell imaging of cytoplasmic and nuclear Ca2+ dynamics in Arabidopsis roots. Cold Spring Harbor. 2013, (8), 776-780 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics