머릿속 세포 지 베 렐 린 레벨 NlsGPS1 포스터 공명 에너지를 사용 하 여 전송 (무서 워) 바이오 센서

Developmental Biology
 

Summary

지 베 렐 린 인식 센서 1 (GPS1)는 첫 번째 포스터 공명 에너지 전송 기반 바이오 센서 측정 지 베 렐 린 phytohormones spatiotemporal 고해상도 세포 수준 이다. 이 프로토콜은 시각화 하 고 애기 hypocotyls 및 루트 팁 유전자 인코딩된 nlsGPS1 바이오 센서를 사용 하 여 셀룰러 지 베 렐 린 레벨 계량 방법에 보고 합니다.

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Rizza, A., Walia, A., Tang, B., Jones, A. M. Visualizing Cellular Gibberellin Levels Using the nlsGPS1 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor. J. Vis. Exp. (143), e58739, doi:10.3791/58739 (2019).

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Abstract

Phytohormone 지 베 렐 린 (GA)은 식물에서 씨 발 아, 세포 신장, 및 발달 전환에 중요 한 역할을 재생 하는 작은, 모바일 신호 분자 이다. 지 베 렐 린 인식 센서 1 (GPS1)은 첫 번째 포스터 공명 에너지 전달 (무서 워)-vivo에서 세포가 레벨의 모니터링 수 있는 바이오 센서를 기반으로. 핵 지역화 GPS1 (nlsGPS1)의 형광 방출 비율을 측정 하 여 다른 조직 유형에서 endogenously 및 것 제공 조지아 그라디언트 spatiotemporal 매핑은 세포 수준에서 가능 합니다. 이 프로토콜 3 예제 실험에서 nlsGPS1 방출 비율을 이미지 하는 방법을 설명 합니다: 정상, 전 후 외 인 지 베 렐 린 A4 (GA4) 치료, 그리고 치료 시간 코스. 우리는 또한 nlsGPS1 방출 비율 피지, 상업 3 차원 (3 차원) 현미경 사진 시각화 및 분석 소프트웨어를 사용 하 여 분석 하 고 제한 및 nlsGPS1를 사용 하 여 지 베 렐 린 수준의 척도 가능성이 함정을 설명 하는 메서드를 제공 합니다.

Introduction

식물 호르몬은 식물의 성장과 개발에 근본적인 역할을 한다. 이 작은, 모바일 신호 분자는 생 합성, 놓을, 짧은 및 긴 distance 전송1,2,,34등 여러 수준에서 일반적으로 통제 된다. 호르몬 신호 경로 및 다운스트림 transcriptional 응답 이해 년 동안 날카롭게 했다. 그러나, 호르몬 분배를 감독 하는 규제 입력 호르몬 신호 통로의 다양 한 세포질 응답을 연결, 셀룰러 규모 호르몬 수준의 spatiotemporal 정량화를 요구 합니다. 무서 워 기반 바이오 센서 phytohormones를 감지할 수 있는 세포 규모 호르몬 수준을 정할 수 과학자 사전 수 있습니다. 특정 ligand 바인딩 또는 생물 학적 자극에 반응 하는 감각 도메인에 연결 된 무서 워 쌍 (기증자 및 수락자 형광 단백질) 무서 워 기반 바이오 센서에 의하여 이루어져 있다. 작은 분자 바이오 센서에 대 한 ligand 바인딩 방향 무서 워 쌍의 두 가지 형광 단백질 사이의 거리의 변화 귀착되는 감각 영역의 구조적 변화를 트리거합니다. 무서 워 바이오 센서의 비율 분석 기증자 흥분과 기증자5,6이상의 수락자의 형광 방출 비율을 측정 하 여 수행 됩니다. Ligand 바인딩은이 방출 비율7에 변화로 감지입니다.

우리는 최근 식물 호르몬 ga. 가스는 종자 발 아, 세포 신장, 그리고 식물에서 꽃 단계 발달 전환 홍보할 수 있는 호르몬의 클래스에 대 한 무서 워 기반 바이오 센서 개발. NlsGPS1 바이오 센서는 핵 언어와 다양 한 식물 조직에가 역학에 spatiotemporal 통찰력을 제공. 애기 셀에가 녹는 수용 체, 지 베 렐 린을 구분 하지 않는 난쟁이 (GID), 한다 복잡 한 유도 신호2의 부정적인 레 귤 레이 터로 동작 하는 델라 단백질의 저하. 애기 가 수용 체 (AtGID1C) 델라 단백질 (AtGAI)의 74-아미노 산 잘림에 연결 된 nlsGPS1의 조지아 감각 도메인 구성 고 무서 워 쌍의 구성 된 기증자 형광 단백질으로 리안의 이합체 화 변형 및 수락자 형광 단백질8로 아프로디테 (codon 다양 금성). NlsGPS1 바이오 센서는 생리 활성 GA4 에 대 한 높은 선호도 센서 (Kd = 24가4nM) 및 다양 한 조직-종류 지도 및 조지아 그라디언트 계량에 이용 될 수 있다. Vivo에서 애기 가 레벨의 오해를 피하기 위해, 우리는 또한 개발 nlsGPS1의 응답 하지 않습니다 변종 (nlsGPS1-NR) 부정적인 컨트롤로 사용 하. NlsGPS1-NR 단백질 돌연변이 바인딩 주머니에 조지아의 바인딩을 방해 하는 및 GID 수용 체 단백질7,9와 상호 작용을 방해 하는 델라 단백질에 돌연변이 운반 합니다. 방출 비율 패턴 또는 nlsGPS1 및 nlsGPS1 NR 라인에서 변경이 바인딩 이벤트에 직접 관련 된 유물을 간주 수 있습니다. 그것은 또한 조지아4 nlsGPS1 바인딩 하지 빠르게 가역 이며 따라서, 세포 nlsGPS1 방출 비율 대표는 최근 밀집이 주어진된 핵 보다는 실시간으로 해석 되어야 하는 것이 중요 정상 상태 수준입니다. 결과적으로, 떨어지는 레벨의 분석 nlsGPS1와 수는 없습니다.

여기 우리 애기는 고해상도에 confocal 영상 기반 접근을 사용 하 여 모델 식물의 셀에 nlsGPS1 바이오 센서를 이용 하 여 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 프로토콜 이미징 식물 뿌리와 안정 된 상태에서 및 시간-과정을 통해 hypocotyls에 정보를 제공합니다. 지도 및 조지아 배포판 계량 식물 종에서 뿐만 아니라 다양 한 조직 유형, nlsGPS1 센서를 활용할 수 잠재적으로.

Protocol

1입니다. 준비

  1. ½ Skoog와 村 重 한 pH 5.7 아무 자당 (1 L)를 준비 합니다.
    1. 초순의 950 ml에서 Skoog (MS)와 村 重 기저 매체의 2.2 g 용 해. 5 m 코 5.7에 pH를 조정 합니다.
    2. 솔루션을 초순 물 1 L의 최종 볼륨을 확인 합니다. 두 500 mL 병, 각 포함 1% 공장 agar 나눕니다. 20 분 동안 121 ° C에 고압입니다.
  2. ¼ MS 액체 pH 5.7 아무 자당 (1 L)와 준비 합니다.
    1. 초순의 950 ml에서 MS의 1.1 g을 분해. 5 m 코 5.7에 pH를 조정 합니다. 솔루션을 초순 물 1 L의 최종 볼륨을 확인 합니다. 2 개의 500 mL 병으로 나눕니다. 20 분 동안 121 ° C에 고압입니다.
  3. 조지아4를 준비 합니다.
    1. 조지아4 에탄올 최종 농도 100 mM가4 주식을 70%에서 디졸브.
    2. 0.1-1 조지아4 주식 희석 작업 솔루션을 준비, ¼ MS 액체 pH 5.7 µ M.

2. 식물 성장

  1. 애기 씨 소독.
    1. 화학 후드를 사용 하 여 작동 합니다. 약 수 2 mL microcentrifuge 튜브로 (약 200 씨앗) 씨앗. 염소 저항 잉크 마커를 사용 하 고 살 균 선박 (밀봉 될 수 있다 큰 상자) 내부 오픈 뚜껑 튜브를 배치.
    2. 초순의 및 염소 살 균 선박 내부 솔루션 50 mL 50 mL를 포함 하는 250 mL 비 커를 배치 합니다.
    3. 비 커에 집중된 한 염 산 (HCl)의 3 mL를 추가 합니다. 즉시 배를 밀봉 하 고 6-16 h에 대 한 염소 가스에 의해 살 균을 허용 합니다.
    4. 선박을 개봉한 후 씨 선반에서 모든 microcentrifuge 튜브의 뚜껑을 닫습니다. 소독된 씨앗은 도금의 시간까지 건조 저장할 수 있습니다.
  2. 약 20 소독된 애기 씨앗 ½ MS agar 사각형 접시에 뿌린. 다공성 외과 테이프와 플레이트를 봉인 하 고 알루미늄 호 일 그들을 포장. 계층에 대 한 1-3 일 동안 그들을 4 ° C에서 품 어.
  3. 루트 이미징에 대 한 번호판을 전송 수직 위치에 성장 챔버 다음 성장 조건 3 일: 긴-하루의 조건 (LD, 어둠 속의 빛/8 h 16 h); 120 µmol⋅m-2s-1 빛의 강도; 22 ° C (광 주기) 또는 (어두운 주기), 동안 18 ° C의 온도 65% 상대 습도 (RH).
  4. 어두운 성장 hypocotyl에 대 한: 발 아를 동기화 하려면 1-4 h의 빛 펄스에 대 한 성장 챔버에 접시를 전송. 알루미늄 호 일 접시를 포장 하 고 3 일 동안 수직 위치에서 성장 챔버에 배치.

3. 샘플 준비

  1. 정상 상태 측정 (그림 1A)
    1. 깨끗 한 현미경 슬라이드에서 ¼ MS 액체 (지금부터 모의 솔루션으로 불리)의 50 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 슬라이드에 접시에서 nlsGPS1을 표현 하는 묘를 전송 합니다.
    2. 깨끗 한 coverslip 고는 coverslip의 각 모서리에 진공 기름 한 방울을 자리. 묘 목에 부드럽게 배치 하는 coverslip 고 신중 하 게 모든 기포를 제거 하는 여분의 모의 솔루션을 추가 합니다.
  2. GA4 치료: 화학 교환 실험 (그림 1B).
    1. 조지아4 치료 전에 사각형을 그릴 (피펫으로 팁에 부착) 진공 기름 가득 20 mL 주사기를 사용 하 여 (길이: 3.5 c m, 높이: 2.5 c m)는 깨끗 한 유리 슬라이드 (그림 1B)에 진공 그리스의 균일 한 층으로. 진공 그리스의 좋은 라인에 대 한 있도록 피펫으로 팁 직경에서 1 m m의 개방을 잘라 되어야 합니다.
    2. 유리 슬라이드에 모의 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다. 깨끗 한 집게와 nlsGPS1 묘를 선택 하 고 부드럽게 모의 솔루션에 그들을 배치. 어떤 손상을 방지 하는 집게와 묘 종을 파악 하지 않고는 cotyledons의 밑바닥을 지원 하 여 묘를 전송.
    3. 깨끗 한 coverslip 고는 coverslip의 각 모서리에 진공 기름 한 방울을 자리. 집게를 사용 하는 coverslip 진공 그리스 사각형의 중앙에 놓습니다. 이제는 coverslip 진공 그리스 사각형의 긴 모서리에 해당 하는 두 가지 측면에서 밀봉 된다.
    4. 신중 하 게 하는 저수지를 작성 하 고 내부 seedling(s)를 방해 하지 않고 저수지 내의 모든 기포를 제거 추가 모의 솔루션을 추가 합니다.
    5. 조지아4 치료 confocal 현미경을 사용 하 여 이미지를 취득 합니다. 이 프로토콜의 섹션 4에에서 설명 된 대로 지침을 따릅니다.
    6. 조지아4 치료 confocal 무대에서 현미경 슬라이드를 제거 합니다. 20 분 타이머를 설정 합니다.
    7. 시작 후 타이머, ¼ MS 액체 1 µ M가4포함 된 버퍼 솔루션을 교환 합니다. 조지아4 솔루션 (약 50 µ L)는 coverslip의 왼쪽에서 추가 하 고 오른쪽에서 이전 (모의) 솔루션을 제거. (그림 1B) 약 10 분 소요 모의 솔루션을 완전히 대체 하는 솔루션을 교환에 계속.
    8. 현미경 단계에 다시 유리 슬라이드를 놓습니다. 후가 이미지를 취득 하기 전에 또 다른 10 분을 기다립니다.
  3. 관심의 조직에 대 한 시간 코스의 설정
    참고: 관심의 조직 수 있습니다, 예를 들어, hypocotyls 또는 뿌리. 우리는 정기적으로 이미징 상업 관류 시스템을 사용 하 여 nlsGPS1 바이오 센서에 대 한 시간 코스를 수행 (그림 1C, 재료의 표참조) 또는 RootChip7,,1011.
    1. 스티커-슬라이드의 관류 채널의 센터 모의 솔루션의 200 µ L를 추가 ( 재료의 표참조). 부드럽게 nlsGPS1 묘를 선택 하 고 스티커-슬라이드에서 모의 솔루션에 그들을 배치.
    2. 집게를 사용 하 여 부드럽게 유리 coverslip 놓고, 스티커-슬라이드의 주변에 스티커 물자를 가진 강한 유대를 형성 하는 coverslip의 외부 가장자리에 부드럽게 눌러는 집게의 뒷면을 사용 하 여.
    3. 두 팔꿈치 루어를 사용 하 여 커넥터 (와 내부 [ID]의 직경 0.8 m m)와 (0.8 m m의 ID)로 실리콘 튜브 연결 끈 적-슬라이드 20 mL 주사기를 유출 솔루션을 수집 하는 콘센트 컨테이너. 실리콘 튜브에 주사기를 연결 하는 Luer 잠금 커넥터 (0.8 m m의 ID)를 사용 합니다.
    4. 부드럽게 수동으로 챔버에 남아 아무 기포는 챔버를 통과 하는 충분 한 솔루션 수 있도록 모의 솔루션이 포함 된 주사기를 누릅니다. 놓고 프로그래밍 가능한 주사기 펌프에 주사기를 개최 합니다.
    5. 주사기 사용 (즉,., 직경 및 볼륨) 함께 펌프와 함께 제공 된 설명서에 따라 유량에 펌프 매개 변수 특정 설정 합니다.
      참고: 이 프로토콜에서 1-3 mL/h의 유량 사용 되었다, 그리고이 실험적인 요구에 따라 변경 될 수 있습니다. 펌프를 시작 하 여 시간 과정을 시작 합니다.
    6. 치료를 위해 조지아4 시간 과정 (그림 1C), 펌프를 일시 중지 하 여는 관류를 중지 하 고 조지아4보충 새로운 한 포함 ¼ MS 액체 주사기를 변경 합니다. 다음 섹션에서와 같이 confocal 영상 진행.

4입니다. 현미경

참고: 우리는 레이저 confocal 현미경 검사 법을 수행합니다.

  1. 무서 워 이미징 수행을 갖춘 레이저 confocal 현미경을 사용 하 여 이미지를 취득 합니다.
    참고: NlsGPS1에 대 한 청록색 형광 단백질 (CFP)와 노란 형광 성 단백질 (YFP)의 이체는 몇 군데. 이 프로토콜에서 상업 현미경 ( 테이블의 자료, 현미경 1과 2로 참조) 10 배 또는 20 x 건조 0.70 고조파 복합 APO 계획 목표와 함께 사용 됩니다.
  2. 현미경 1, 사용 448 nm와 514 nm 파장 레이저 자극 CFP와 YFP, 각각. 순차적 검사를 취득 합니다. CFP의 흥분 후 CFP (기증자 방출)에 대 한 460-500 nm와 525-560 nm YFP (무서 워 방출)에 대 한 감지 검출기 (예: 유압 SMD)를 설정 합니다. 두 번째 시퀀스를 사용 하 여 YFP 여기 후 525-560 nm YFP (YFP 방출)에 대 한 검출 하는 검출기를 설정 합니다.
    참고: 이 YFP 형광 표면 상업적인 3 차원 현미경 사진 시각화 및 분석 소프트웨어를 사용 하 여 생성 하는 식 컨트롤 뿐만 아니라 핵, 세그먼트에 사용 됩니다.
  3. 현미경 2, 사용 440 nm와 514 nm 파장 레이저 라인 자극 CFP와 YFP, 각각. 두 트랙을 얻을. 트랙 1, CFP의 흥분 후 YFP (무서 워 방출)에 대 한 CFP (기증자 방출)에 대 한 464-500 nm와 526-562 nm 감지 검출기 (예:., ChS)을 설정 합니다. 에 대 한 트랙 2, YFP 여기 후 YFP (YFP 방출)에 대 한 526-562 nm를 검출 하는 검출기를 설정.
    참고: 이 YFP 형광 표면 3 차원 시각화 및 분석 소프트웨어에서 생성 하는 식 컨트롤 뿐만 아니라 핵, 세그먼트에 사용 됩니다.
  4. 512 x 512 픽셀의 형식, 12 비트 해상도 사용 하 여 이미지를 취득 합니다.
  5. 이득을 하지 픽셀을 흠뻑 젖 게 하는 동안 좋은 신호를 허용 하는 경험적으로 결정된 값으로 조정 될 필요가 있다. 이득 사이 CFP와 무서 워 방출 실험을 통해 변경할 수 없습니다. 1 공기 단위 (AU) pinhole을 설정 합니다. Confocal 현미경의 단계에서 IBIDI 스티커-슬라이드를 놓고 이전에 표시 된 이미지와 함께 진행 합니다.
  6. 현미경 1 소프트웨어에서 활성 라이브 검색에 활용 이상/아래 노을 이미지 화면의 왼쪽 상단에 있는 부족 및 채도의 관심 영역을 결정 하. 현미경 2 소프트웨어에서 범위 표시기 이미지 화면 하단에 있는 부족 및 관심 영역의 채도 결정 하기 위해 사용 합니다. 모든 양적 이미지 분석 픽셀 채도 없음 있어야 합니다.
  7. 1 μ m의 스텝 크기와 z-스택을 설정 합니다. 단계 크기 증가 z 해상도 대 한 감소 하거나 인수 또는 몇 군데 수 위치/샘플 수를 증가 하는 증가 속도가 증가 수 있습니다. 자동된 시간 과정에 대 한 설정된 시간 간격으로 이미지를 얻으려고 z-스택 (수집 모드 탭에서 xyzt 모드)와 함께 시간을 설정 합니다.

5. 이미지 분석 피지를 사용 하 여

참고: ImageJ (피지)를 사용 하 여 이미징 데이터를 처리 하 고 애기 모 종에 nlsGPS1 방출 비율의 2 차원 (2 차원) 이미지를 생성 가능 하다. 이미지의 예 그림 2A, 2c, 2E, 2 세대3A를 참조. ImageJ,에서는 검색 기능을 사용 하 여이 프로토콜의 각 명령을 찾을 수입니다. 컴퓨터 키보드에는 스페이스 바와 L을 누릅니다. 새 창이 열립니다. 검색 필드에 필요한 명령을 입력 합니다.

  1. 피지 (이미지 J)으로 (.lif 또는.lsm 파일) 파일을 끌어서 하이퍼 스택으로 이미지를 엽니다.
  2. 주 메뉴에서 이미지 선택 > 스택 > Z 프로젝트 및 선택 합계 조각 최대 투영에서 밝은 픽셀만 보다는 오히려 모든 픽셀을 잡으려고.
  3. 주 메뉴에서 선택 하는 프로세스 > 빼기 배경 및 설정 롤링 볼 반지름 50 픽셀을. 다른 모든 옵션의 선택을 취소 하 고 모든 세 개의 이미지를 처리 합니다. 이 단계는 "롤링 볼" 알고리즘을 사용 하 여 백그라운드를 제거 합니다.
    참고: 50 픽셀 경험적으로 전경으로 핵을 포함 하도록 결정 되었다.
  4. 주 메뉴에서 이미지 선택 > 색상 > 분할 채널. 3 새로운 창이 열립니다: C1-합 (CFP 채널); C2-합계 (무서 워 채널), 및 C3-합 (YFP 채널).
  5. C3-합 창을 선택 하 고, 주 메뉴에서 선택 하는 프로세스 > 필터 > 가우시안 블러 이미지 노이즈를 줄이기 위해 1 가우스 블러를 적용.
  6. 주 메뉴에서 선택 이미지 > 조정 > 밝기/명암 대비 와 선택 자동.
  7. 주 메뉴에서 프로세스 를 선택 > 설정의 포화대비 향상, 0.35 =.
  8. 메인 메뉴에서 이미지 선택 > 형식 > 8-비트 및 8 비트 이미지 스택 변환.
  9. 주 메뉴에서 선택 이미지 > 조정 > 자동-로컬 임계값. 자동 로컬 임계값에서 다음 매개 변수를 선택 합니다: Phansalkar 방법, 반경 = 15, 매개 변수 1 = 0, 매개 변수 2 = 0, 및 백색 스택. 이 단계에서는 YFP 스택 이진 마스크를 만드는 데 사용 됩니다.
  10. C2-합 창을 선택 하 고, 주 메뉴에서 선택 하는 프로세스 > 필터 > 가우시안 흐림 1 가우스 블러를 적용.
  11. C1-합 창을 선택 하 고, 메인 메뉴에서 프로세스 를 선택 > 필터 > 가우시안 흐림 1 가우스 블러를 적용.
  12. 주 메뉴에서 2 개의 채널에서 방출 비율 스택 생성을 선택 하는 프로세스 > 이미지 계산기. 새 창에서 표시 될 1 이미지로 선택 C2-합 연산자, 분할 을 선택 하 고 이미지 2 C1 합계 선택 합니다.
  13. 새 창 만들기 및 32 비트 형식 선택 되었는지 확인 합니다. 새 창 명명 된 결과의 C2-합계표시 됩니다.
  14. 주 메뉴에서 이미지 선택 > 조회 테이블 > LUT 16_colors.
  15. 주 메뉴에서 선택 하는 프로세스 > 이미지 계산기. 새 창에서 표시 될 1 이미지로 선택 결과의 C2-합 연산자, 곱하기 를 선택 하 고 이미지 2 c 3 합 선택 합니다. 이 단계에서는 YFP 이진 마스크 YFP 제어 채널에 있는 픽셀만 표시 YFP/c f P 스택 증식 이다.
  16. 주 메뉴에서 선택 하는 프로세스 > 수학 > 분할 하 고 255 값 설정. 새로운 창이 열리면에서 를 스택의 모든 이미지 분석을 선택 합니다. 새로운 이미지를 명명 된 결과의 결과의 C2-합계표시 됩니다.
  17. 주 메뉴에서 선택 이미지 > 조정 > 밝기/명암 대비 와 선택 자동.
  18. 주 메뉴에서 선택 하는 프로세스 > 대비 향상, 그리고 선택 유형 포화 0.35 =.
  19. 주 메뉴에서 이미지 선택 > 조정 > 밝기/대비및 최소 및 최대 값을 설정된 캡처 조지아 분포. 선택적 단계: 메인 메뉴에서 분석 을 선택 > 도구 > 교정 바쇼 LUT 교정 바, 결과의 결과의 C2-합계 를.tiff 파일로 저장 하 고.
  20. 방출의 값을 가져올 비율, 주 메뉴에서 선택 분석 > 측정을 설정 하 고 선택 회색에 대 한 평균값표준 편차.
  21. 도구 모음에서 사각형 셰이프를 선택 하 고 (ROI) 관심 영역을 그립니다. 주 메뉴에서 선택 분석 > 측정. 새 창에서 선택한 투자 수익 평균 값을 보고 합니다.
  22. 복사 하 고 스프레드시트 소프트웨어 (예: Excel 또는 OriginPro)에 얻은 값을 붙여 실험 전 후가4 치료에 대 한 히스토그램 또는 선 그래프 시간 과정에 대 한 실험.

6. 이미지 분석 3 차원 시각화 및 분석 소프트웨어를 사용 하 여

참고: 선택된 된 소프트웨어를 사용 하는 이점은 (참조 자료 테이블) 개체 (예: 핵) 세그먼트를 confocal z 스택의 3 차원 이미지를 생성입니다. 이미지의 예를 그림 2B, 2D, 2 층, 2 시간3B참조.

  1. 소프트웨어 열고 파일 (.lif 또는.lsm 파일)을 가져옵니다.
  2. 표면 마법사를 사용 하 여 컨트롤 YFP 방출 채널에 따라 세그먼트. 세그먼트 개체 "표면" 불린다. 이 세분화 단계 핵 외부 복에서 배경 제거 하는 동안 하나의 개체로 핵에서 모든 복의 분석을 허용 합니다.
  3. 표면 마법사에서 3 µ m을 기본값으로 임계 처리 배경 빼기 (로컬 대비)을 설정 합니다. C f P 방출 (기증자 여기 기증자 방출 [DxDm]) 및 무서 워 방출 (기증자 여기 수락자 방출 [DxAm]) 채널 YFP 방출 (수락자 여기 수락자 방출 [AxAm]) 채널을 사용 하 여 만든 표면에 따라 마스크.
  4. 확장 XT 의미 강도 비율 를 사용 하 여 두 채널에 개별 서피스의 평균 강도 값 사이의 기증자 여기 기증자 방출 (DxAm/DxDm)로 나눈 기증자 여기 수락자 방출의 비율을 계산.
    참고: 이 확장은 온라인 다운로드.
  5. NlsGPS1 방출 비율 개별 서피스, 색상 색상 통계 코딩, 컬러 휠 아이콘으로 표시 되는 선택 합니다. 통계 유형으로 강도 비율을 의미 를 선택 합니다.
  6. 통계 아이콘 아래 발견 되는 테이블에서 개별 값의 비율을 내보냅니다.
  7. 복사 하 고 값을 스프레드시트에 붙여 조지아4 치료 실험 전과 후에 대 한 히스토그램 또는 과정 실험 시간에 대 한 선형 그래프.

7. 통계 분석

참고: NlsGPS1 방출 비율의 beeswarm 상자 줄거리 3D 그림 을 참조 하십시오.

  1. 소프트웨어 열고 Y 열으로 핵 표면 방출 비율을 붙여 넣습니다.
  2. 관심의 열을 선택 하 고 통계 를 선택 > 통계 설명 > 정상 테스트 샘플 일반적으로 배포 하는지 여부를 알아야. 정상 테스트를 실행 하 고 새 창이 열리고 결과 보고.
  3. 샘플은 일반적으로 배포 되는 경우 사용 하는 t-통계 테스트로 테스트. 통계 를 선택 > 가설 테스트 > 행에 2-표본 t-검정 및 실행 t-테스트.
  4. 예제 일반적으로 배포 되지 않은 경우 선택 통계 > 통계 가설 테스트 > 2 표본 분산에 대 한 테스트 샘플 사이의 편차는 크게 다른 지 여부를 알아야.
  5. 분산을 크게 다른 경우, 사용 하 여 테스트 하는 맨-휘트니 U 통계 테스트로. 통계 를 선택 > 비패라메트릭 테스트 > 맨-휘트니 테스트 및 실행 테스트.
  6. 분산 크게 다른 경우 사용 하 여 Kruskal 월리스 ANOVA 테스트 통계 테스트로. 통계 를 선택 > 비패라메트릭 테스트 > Kruskal 월리스 ANOVA 테스트 및 실행 테스트.

Representative Results

NlsGPS1를 사용 하 여, 의무가 형광 이미징, 루트 팁 및 어두운 성장 hypocotyls (그림 2)를 포함 하 여 조직에서 세포가4 레벨을 측정 가능 하다. 애기 루트에 nlsGPS1 방출 비율 그라데이션 meristematic과 영역에서가 저급 및 높은 늦게 신장 영역 (그림 2A2B)에 나타내는 것입니다. 대조적으로, 방출 비율 그라데이션 하지 내 생 GA 그라디언트는 인 위 (그림 2C2D) 아니다는 것을 제안 하는 nlsGPS1-NR 뿌리에서 관찰 되었다. NlsGPS1 방출 비율 그라디언트는 cotyledons 및 꼭대기 걸에 낮은 레벨 및 hypocotyl (그림 2E2F)의 급속 하 게 늘이는 기초 지역에서 높은 수준의 어두운 성장 hypocotyls에서 또한 형성 되었다. 대조적으로, 방출 비율 그라데이션 하지 nlsGPS1 NR hypocotyls (그림 2G2 H)에서 관찰 되었다. 애기 뿌리와 어두운 성장 hypocotyl 세포에서 내 생 GA 축적 셀룰러 연신 율 상관.

또한, 것 공급된가4 축적 우선적으로 애기 루트 (그림 3)의 부 지에 비해 신장 지역에서 내 인 성 및 외 인가 공부 하는 nlsGPS1를 사용할 수 있습니다 나타내는 패턴.

0.1 µ M와 치료를 다음 시간 과정 실험, nlsGPS1 묘 스티커 슬라이드 챔버에 배치 되었고 ¼ MS 액체 끼얹는다 동안 30 분 동안가4 . 동영상 분할 영역 (비디오 1)에 비해 루트 신장 지역에서 외 인 조지아4 의 빠른 축적을 보여줍니다.

Figure 1
그림 1: 샘플 confocal 영상에 대 한 준비. 이러한 패널 표시 (A) (B) 정상 상태 실험 전 후 외 인 조지아4 치료, 및 (C)는 치료 시간 과정 실험을 사용 하 여 샘플 준비의 도식 표현 스티커-슬라이드 (C)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 조지아 그라데이션 애기 뿌리에 어두운 성장 hypocotyls. NlsGPS1 (A)와 (C) nlsGPS1 NR 뿌리의 2 차원 이미지 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 분석 했다 및 3 차원 이미지 (B) nlsGPS1 (D) nlsGPS1-NR의 3 차원 상업을 사용 하 여 분석 했다 이미지 분석 소프트웨어입니다. 두 분석 내 생 GA4 애기 뿌리에 그라데이션 보였다. (E) nlsGPS1 (G) nlsGPS1 NR 어두운 성장 hypocotyl의 2 차원 이미지 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 분석 했다 그리고 (F) nlsGPS1 (H) nlsGPS1-NR의 3 차원 이미지를 사용 하 여 분석 했다는 상업적인 3 차원 이미지 분석 소프트웨어입니다. 두 분석 내 생 GA4 어두운 성장 hypocotyls에 그라데이션 보였다. LUT 바 nlsGPS1 방출 비율의 잘못 된 색을 표시합니다. YFP 이미지 식 컨트롤으로 보고 됩니다. Hypocotyl 이미지 두 단계 위치를 사용 하 여 인수 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 뿌리에서 외 인 조지아 그라데이션. 첫 번째 두 개의 패널 표시 (A) 2 차원 및 nlsGPS1 루트 전에 세가4 (1 µ M)의 치료 후 20 분의 (B) 3 차원 이미지. YFP 이미지 식 컨트롤으로 보고 됩니다. 마지막 두 개의 패널 표시 (C) 평균 및 표준 편차 및 신장 영역 (흰색 프레임으로 정의 되는 영역)의 핵에 대 한 nlsGPS1 방출 비율의 (D) beeswarm 상자 줄거리. 신장 지역에 nlsGPS1 방출 비율 조지아4 치료 후 훨씬 더 높은 했다 (맨-휘트니 U 테스트 * * * P-값 < 0.0001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Video 1
비디오 1: 스티커 슬라이드를 사용 하 여 nlsGPS1 루트의 관류 실험. 이 비디오는 nlsGPS1 ¼ MS 액체 끼얹는다 고 0.1 µ M가4 30 분 치료의 3 차원 이미지를 보여줍니다. 시간 과정에서 영상 획득 다음과 같은 간격으로 3 시간 마다 10 분: 모의 솔루션의 30 분 ( t 프레임 = 1, t = 2, t = 3), 조지아4 치료의 30 분 (프레임 t = 4, t = 5, t = 6), 모의의 2 h 그래서 lution (프레임 t = t 로 7 = 18) 솔루션. 인수, 이전 샘플은 2 h. 가이 비디오를 보려면 여기를 클릭 하십시오에 대 한 모의 솔루션 끼얹는다. (다운로드 오른쪽 클릭.)

Discussion

GA 무서 워 기반 바이오 센서 nlsGPS1 보고 및 다세포 식물에 조지아 호르몬 그라디언트를 측정 하는 양적 방법을 제공 합니다. 질량 분석 및 transcriptional 기자 또는 신호 단백질-저하-기반 방법12, 간접 측정 하 여 직접 검색을 통해 향상 된 spatiotemporal 해상도 역학 계량 수 무서 워 기반 바이오 센서 13. 다양 한 조직의 종류에 고해상도 세포 이미징 조지아로 의미 있는 통찰력 규정과 다세포 컨텍스트에서 축적의 기능에 대 한 생물학과 스파크 새로운 가설을 얻을 수 있습니다. 예를 들어 nlsGPS1 바이오 센서 catabolic, 특정가 생 합성 및 전송 돌연변이 뿐만 아니라 spatiotemporally 유발된 물결, 동안에 변화를 모니터링 수 구체적으로 어떻게가 그라디언트는 설립에 테스트를 매우 유익 루트 및 주소 루트 셀 조지아 그라디언트에 대 한 응답. 센서 테스트 씨앗 발 아, 세포 신장, 및 꽃의 GA 중재 컨트롤을 제어 하는 메커니즘의 보존을 다른 모델 및 작물 종에 사용 될 수 있습니다.

NlsGPS1 바이오 센서의 무서 워 기반 영상에서 중요 한 단계는, 1) 픽셀 양적 무서 워 분석 중 포화 하지 해야, "감지기 이득" 2) 이미징 매개 기증자 방출 (DxDm)에 대 한 상수 유지 되어야 한다 고 수락자 방출 (DxAm) 인수, 3) 제어 nlsGPS1 NR 라인 유물, 및 4를 배제 하기 위해 사용 해야 합니다) 샘플 드리프트와 초점 변경 문제를 최소화 하기 위해 준비 되어야 한다. 또한, 샘플 재배 되 고 있는 환경 조건에 이후가 빛 기간 및 빛의 강도14,,1516 같은 환경 조건에 민감한 제어 하는 것이 중요 17. 분석의이 종류의 주요 한계는 높은 신호 대 잡음 비율 영상 잡음 비율 영상에 있는 증가 때문에 필요한입니다. 따라서, nlsGPS1 이미징 조직 및 장기는 청록색과 노란색 형광 단백질을 사용 하 여 비율 형광 현미경 검사 법에 순종 하는 데 유용 되지 것입니다-예를 들어 깊은 조직 형광 단백질 제대로 감지 되었습니다. 다른 한편으로, 비율 정보는 종종 선호 intensiometric 판독을 통해 내부 통제 규칙 유물에 따른 바이오 센서 식, 안정성, 밝기, 또는 주어진된 셀, 조직에에서 여 형태소 분석을 하는 데 도움이 있기 때문에 또는 조건. 예를 들어 바이오 센서 이미징 초조해 하 고 이미지 분석은 또한 조직5,6,,1819,20,의 다양 한 ligands의 다양 한 연구에 이용 되었다. 이미징 실험 및 이미지 분석 여기 보고, 예를 들어 깊은 루트 조직-형식에 새로운 통찰력을 얻을 수 있는 빛 시트 현미경 같은 새로운 이미징 방법에 맞게 수정할 수 있습니다.

1 세대 nlsGPS1 바이오 센서는 또한 조지아 exogenous 조지아 치료 따르는 세포내 증가에 보고할 수 있는 조지아 그라디언트의 고해상도 지도 제공 하는 높은 선호도 센서입니다. NlsGPS1의 현재 한계 중 하나는 센서는 빠르게 되돌릴 수 및, 따라서, 정상이 레벨에 아니지만, 가능성, 관심의 솔루션에 최대 최근 조지아 농도 보고입니다. 센서에 대 한 정확한 이직 률 이기도 하지 알려진와이, 낮은 가역 결합 일어나 고 있을 수 있습니다 내 생 GA 달콤하게의 감지 하는 걸로 어떤 조직 종류에는 몇 시간 분 이내. 그것은 또한 그 nlsGPS1가4 에 대 한 높은 선호도가지고 주의 하는 것이 중요 (Kd = 24 nM) 다른가 형태에 비해 (GA3 Kd= 240 nM, 조지아1Kd = 110 nM) 다른 생리 활성 가스 이미징 하는 경우 7. 조지아 바이오 센서의 미래 세대는 높은 선호도 유지 하면서 가역을 증가 하거나 다양 한 전조, 생리, 또는 catabolite 가스에 대 한 서로 다른 특이성을 전시 설계 될 수 있다. 

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램 (보조금 계약 n ° 759282) 유럽 연구 회의 (ERC)에서 자금을 받고 있다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
nlsGPS1 Col0 Arabidopsis seeds NASC N2107734
nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis seeds NASC N2107735
Gibberellin A4 (GA4) Sigma G7276 dissolve in EtH 70% , and keep at -20 °C
sodium hypochlorite solution (Bleach) Fisher S/5040 HSRA 064
Hydrogen cloride HCl Sigma 31434
Micropore tape 3M 1530-1
ibidi sticky-slide Ibidi 81128 Luer 0.1 for root imaging
ibidi sticky-slide Ibidi 80168 Luer 0.2 for hypocotyl imaging
glass coverslip for sticky slides Ibidi 10812
Elbow Luer Connectors Ibidi 10802
silicone tubing Ibidi 108401
Luer Lock Connector Ibidi 10826
programmable syringe pump World Precision Instruments AL-1000
Vacuum grease Sigma 18405
Murashige and Skoog Basal Salts Duchefa M0221
Agar plant, 1 kg Melford P1001
Microscope slide ground edges, 76 mm x 26 mm, 1.0 mm to 1.2 mm thick Fisher Scientific 12383118
Cover slip No.1 1/2 glass 22 mm x 22 mm Fisher Scientific 12363138
Luer-slip Syringe 20 mL Fisher Scientific 10785126
3M Micropor Surgical Paper Tape Fisher Scientific 12787597
Potassium Hydroxide, 500 g Sigma Aldrich 221473-500G-D
Absolute Ethanol Fisher Scientific 10428671
Forceps Watchmaker 5 StSteel Scientific Laboratory Supplies INS4340
Scissors, 125 mm, stainless steel Fisher Scientific 12338099
Fitting reducer 0.5 to 1.6 Ibidi 10829
Leica SP8 Confocal laser microscope 1
Zeiss LSM 780 Confocal laser microscope 2
Imaris Bitplane 3D visualization and Analysis software
Fiji image analysis software
OriginPro Origin Lab Statistical Analysis Software

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References

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