Visualizzazione livelli gibberellina cellulare utilizzando l'energia di risonanza di Förster NlsGPS1 Transfer (FRET) biosensore

Developmental Biology
 

Summary

Gibberellina percezione sensore 1 (GPS1) è il primo Förster risonanza energia basati su trasferimento biosensore per misurare i livelli cellulari di fitormoni gibberellina con un'alta risoluzione spazio-temporale. Questo protocollo segnala sul metodo per visualizzare e quantificare i livelli cellulari gibberellina utilizzando il biosensore codificato geneticamente nlsGPS1 in Arabidopsis ipocotili e punte delle radici.

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Rizza, A., Walia, A., Tang, B., Jones, A. M. Visualizing Cellular Gibberellin Levels Using the nlsGPS1 Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor. J. Vis. Exp. (143), e58739, doi:10.3791/58739 (2019).

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Abstract

La gibberellina di fitormoni (GA) è una molecola di segnalazione piccola, mobile che svolge un ruolo chiave nella germinazione dei semi, l'allungamento cellulare e transizioni inerente allo sviluppo in piante. Gibberellina percezione sensore 1 (GPS1) è il primo trasferimento di energia di Förster risonanza (FRET)-base di biosensore che consente il monitoraggio dei livelli cellulari di GA in vivo. Misurando un rapporto di emissione di fluorescenza del nucleare localizzato-GPS1 (nlsGPS1), è fattibile su scala cellulare spatiotemporal mappatura dei gradienti di GA in modo endogeno ed esogenicamente forniti in diversi tipi di tessuto. Questo protocollo descriverà come di immagini nlsGPS1 rapporti di emissione in tre esperimenti di esempio: allo steady-state, prima e dopo esogeno gibberellina A4 (GA4) trattamenti e sopra un corso di tempo di trattamento. Forniamo anche metodi per analizzare i rapporti di emissione nlsGPS1 utilizzando un software di visualizzazione e l'analisi di commerciale Micrografo tridimensionale (3D) e Fiji e spiegare i limiti e le insidie probabile dell'utilizzo di nlsGPS1 per quantificare i livelli gibberellina.

Introduction

Ormoni vegetali svolgono un ruolo fondamentale nella crescita delle piante e lo sviluppo. Queste molecole di segnalazione piccole, mobile in genere sono regolate a livelli diversi, ad esempio trasporto di breve e lunga distanza1,2,3,4biosintesi e catabolismo. La comprensione delle vie di segnalazione dell'ormone e a valle delle risposte trascrizionali ha affinato nel corso degli anni. Tuttavia, per collegare le diverse risposte cellulari delle vie di segnalazione dell'ormone con gli input normativi dirigere distribuzioni di ormone, richiediamo una spatiotemporal quantificazione dei livelli di ormone su scala cellulare. Basato su FRET biosensori in grado di rilevare fitormoni possono avanzare la capacità degli scienziati di quantificare i livelli di ormone su scala cellulare. Basato su FRET biosensori costituiti da una coppia FRET (donatore e accettore proteine fluorescenti) collegata a un dominio sensoriale che lega un ligando specifico o reagisce ad uno stimolo biologico. Per biosensori di piccola molecola, grippaggio del ligand innesca un cambiamento conformazionale del dominio sensoriale che si traduce in un cambiamento della distanza e/o di orientamento tra le due proteine fluorescenti della coppia FRET. Un'analisi di raziometrici di un biosensore FRET avviene emozionante il donatore e misurando il rapporto di emissione di fluorescenza del ricettore sopra donatore5,6. Grippaggio del ligand è rilevabile come un cambiamento in questo rapporto di emissione7.

Recentemente abbiamo sviluppato un biosensore basato su FRET per l'ormone vegetale GA. GAs sono una classe di ormoni che possono promuovere la germinazione del seme, l'allungamento cellulare e la transizione evolutiva da vegetativo alle fasi di fioritura. Il biosensore nlsGPS1 è nucleare localizzata e fornisce approfondimenti spatiotemporal dynamics GA nei tessuti vegetali diversi. In cellule di Arabidopsis , GA si lega ai recettori solubili, gibberellina-insensibile nano (GID), e il complesso induce la degradazione delle proteine DELLA che agiscono come regolatori negativi della GA segnalazione2. Il dominio sensoriale di GA di nlsGPS1 è costituito dal recettore di Arabidopsis GA (AtGID1C) collegato a un troncamento 74-ammino acido DELLA proteina (AtGAI) e una coppia FRET composta enhanced varianti di dimerizzazione di Cerulean come la proteina fluorescente di donatore e Afrodite (una codone-diversificato Venere) come il ricettore della proteina fluorescente8. Il biosensore nlsGPS1 è un sensore ad alta affinità per il bioactive GA4 (Kd = 24 nM per GA4) e può essere utilizzato in diversi tipi di tessuto per mappare e quantificare le sfumature GA. Per evitare errori di interpretazione dei livelli Arabidopsis GA in vivo, abbiamo anche sviluppato una variante nonresponsive del nlsGPS1 (nlsGPS1-NR) da utilizzare come controllo negativo. La proteina nlsGPS1-NR trasporta le mutazioni nella tasca GA-associazione che interrompono l'associazione di GA e mutazioni nella proteina DELLA che disturbare l'interazione con GID del ricevitore proteine7,9. Modelli di rapporto di emissione o cambiamenti osservati nelle linee nlsGPS1 e di nlsGPS1-NR possono essere considerati manufatti non direttamente legate alla GA-associazione di eventi. È anche importante notare che l'associazione nlsGPS1 a GA4 non è rapidamente reversibile, e pertanto, cellulare nlsGPS1 rapporti di emissione devono essere interpretati come che rappresenta la più alta concentrazione di recente di GA in un determinato nucleo piuttosto che in tempo reale livelli allo stato stazionario. Di conseguenza, un'analisi dei livelli di caduta GA non è possibile con nlsGPS1.

Qui forniamo un protocollo dettagliato per l'utilizzo di un biosensore di nlsGPS1 nelle cellule della pianta modello Arabidopsis, utilizzando approcci basati su imaging confocale a una risoluzione elevata. Il protocollo fornisce informazioni su formazione immagine pianta radici e ipocotili sia allo stato stazionario e sopra corsi di time. Il sensore nlsGPS1 potenzialmente poteva essere utilizzato in diversi tipi di tessuto, così come varie specie di pianta, per mappare e quantificare le distribuzioni di GA.

Protocol

1. preparati

  1. Preparare ½ Murashige e Skoog pH di agar 5.7 con senza saccarosio (1 L).
    1. Sciogliere 2,2 g di Murashige e Skoog (MS) medio basale in 950 mL di acqua ultrapura. Regolare il pH a 5,7 con 5 M di KOH.
    2. Compongono la soluzione ad un volume finale di 1 L con acqua ultrapura. Dividerlo in due bottiglie da 500 mL, ciascuna contenente agar pianta 1%. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 20 min.
  2. Preparare il ¼ MS liquido a pH 5,7 con senza saccarosio (1 L).
    1. Sciogliere 1,1 g di MS in 950 mL di acqua ultrapura. Regolare il pH a 5,7 con 5 M di KOH. Compongono la soluzione ad un volume finale di 1 L con acqua ultrapura. Dividerlo in due flaconi da 500 mL. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 20 min.
  3. Preparare GA4.
    1. Sciogliere la GA4 in etanolo al 70% per rendere una concentrazione finale di 100 millimetri GA4 stock.
    2. Per preparare la soluzione di lavoro, diluire lo stock di4 GA a 0,1 – 1 µM in ¼ MS pH liquido 5.7.

2. pianta crescita

  1. Sterilizzare i semi di Arabidopsis .
    1. Funziona tramite una cappa chimica. Aliquota di semi (circa 200 semi) in provette microcentrifuga da 2 mL. Usare un pennarello con inchiostro resistente al cloro e posizionare i tubi con coperchi aperti all'interno del recipiente di sterilizzazione (una grande scatola che può essere sigillato).
    2. Posizionare un becher da 250 mL contenente 50 mL di acqua ultrapura e 50 mL di soluzione di ipoclorito di sodio all'interno del recipiente di sterilizzazione.
    3. Aggiungere 3 mL di acido cloridrico concentrato (HCl) Becher. Immediatamente sigillare la nave e consentire la sterilizzazione di gas di cloro per 6 – 16 h.
    4. Dopo l'apertura delle prese il vaso, chiudere i coperchi di tutte le provette microcentrifuga nel rack seme. Sterilizzato semi possono essere conservati asciutto fino al momento di placcatura.
  2. Seminare circa 20 semi di Arabidopsis sterilizzati sui piatti quadrati di ½ MS agar. Sigillare le piastre con nastro chirurgico poroso e avvolgerli con carta stagnola. Incubare a loro a 4 ° C per 1 – 3 giorni per stratificazione.
  3. Per l'imaging di radice, le piastre di trasferimento alla camera di crescita in posizione verticale per 3 giorni con le seguenti condizioni di crescita: Condizioni di giorno lungo (LD, 16 h di luce/8 ore di buio); µmol⋅m 120-2s-1 intensità della luce; temperatura di 22 ° C (durante il ciclo di luce) o 18 ° C (durante il ciclo scuro), 65% di umidità relativa (RH).
  4. Per ipocotile buio-coltivato: le piastre di trasferimento alla camera di crescita per un impulso di luce di 1 – 4 h per sincronizzare la germinazione. Avvolgere le piastre con carta stagnola e metterli nella camera di crescita in posizione verticale per 3 giorni.

3. preparazione del campione

  1. Misure di stato stazionario (Figura 1A)
    1. Su un vetrino pulito, aggiungere 50 µ l di liquido ¼ MS (d'ora in poi definito come soluzione finto). Trasferire delicatamente piantine esprimendo nlsGPS1 dalla piastra alla diapositiva.
    2. Prendere un coprioggetto pulito e posto una goccia di grasso per vuoto su ogni angolo del coprivetrino. Posizionare delicatamente il vetrino coprioggetto sopra i semenzali e attentamente aggiungere extra finto soluzione per rimuovere eventuali bolle d'aria.
  2. Trattamento4 GA: esperimento di scambio chimico (Figura 1B).
    1. Prima del trattamento di4 GA, utilizzare una siringa da 20 mL riempita con grasso per vuoto (attaccato ad un puntale) per disegnare un rettangolo (lunghezza: 3,5 cm, altezza: 2,5 cm) con uno strato uniforme di grasso per vuoto su un vetrino pulito (Figura 1B). Per consentire una linea sottile di grasso per vuoto, il puntale deve essere tagliato per avere un'apertura di 1 mm di diametro.
    2. Aggiungere 50 µ l di soluzione finto sul vetrino. Con una pinza pulita, scegliere le piantine di nlsGPS1 e delicatamente metterli sulla soluzione finta. Per evitare eventuali danni, trasferire le piantine sostenendo le parti sottostanti dei cotiledoni senza afferrare la piantina con il forcipe.
    3. Prendere un coprioggetto pulito e posto una goccia di grasso per vuoto su ogni angolo del coprivetrino. Utilizzando le pinze, posizionare il vetrino coprioggetto al centro del rettangolo vuoto grasso. Ora il coprioggetto è sigillato sui due lati corrispondenti ai bordi lunghi del rettangolo grasso per vuoto.
    4. Aggiungere con cautela extra finto soluzione per riempire il serbatoio e rimuovere eventuali bolle d'aria all'interno del serbatoio senza disturbare il seedling(s) all'interno.
    5. Acquisire le immagini prima del trattamento di4 GA utilizzando un microscopio confocale. Seguire le istruzioni come descritto nella sezione 4 del presente protocollo.
    6. Per il trattamento di4 GA, rimuovere il vetrino da microscopio dal palco confocale. Impostare un timer per 20 min.
    7. Dopo l'avvio del timer, è possibile scambiare la soluzione tampone con ¼ MS liquido contenente 1 µM GA4. Aggiungere la soluzione di4 GA (circa 50 µ l) dal lato sinistro del coprivetrino e rimuovere la precedente soluzione (finta) dal lato destro. Tenere a scambiare la soluzione per sostituire la soluzione finta completamente, che dura circa 10 min (Figura 1B).
    8. Riposizionare il vetrino sul tavolino del microscopio. Attendere altri 10 min prima di acquisire l'immagine di dopo-GA.
  3. Messa a punto di un corso a tempo per il tessuto di interesse
    Nota: Il tessuto di interesse potrebbe essere, per esempio, ipocotili o radici. Eseguiamo regolarmente corsi di time per l'imaging nlsGPS1 biosensore utilizzando un sistema di perfusione commerciale (Figura 1, Vedi Tabella materiali) o un RootChip7,10,11.
    1. Aggiungere 200 µ l di soluzione finto al centro del canale di aspersione della diapositiva-appiccicoso (Vedi Tabella materiali). Delicatamente scegliere nlsGPS1 piantine e metterli sulla soluzione finta nella appiccicoso-diapositiva.
    2. Usando il forcipe, delicatamente posizionare il vetrino coprioggetti e, utilizzando il retro delle pinze, premere delicatamente sui bordi esterni del coprivetrino affinché si forma un forte legame con il materiale appiccicoso sulla periferia della appiccicoso-diapositiva.
    3. Utilizzando due gomito Luer connettori (con un diametro interno [ID] di 0,8 mm) e la tubazione del silicone (con un ID di 0,8 mm), collegare l'appiccicoso-diapositiva di una siringa da 20 mL e di un contenitore di uscita raccogliendo la soluzione di deflusso. Utilizzare il raccordo luer lock (con un ID di 0,8 mm) per collegare la siringa per la tubazione del silicone.
    4. Premere delicatamente la siringa contenente la soluzione finta manualmente per lasciare che la soluzione abbastanza passare attraverso la camera in modo che non ci sono senza bolle d'aria nella camera a sinistra. Posizionare e tenere la siringa sulla pompa siringa programmabile.
    5. Impostare i parametri di pompa specifici alla siringa utilizzata (cioè., diametro e volume) insieme con la portata secondo il manuale fornito con la pompa.
      Nota: In questo protocollo, è stata utilizzata una portata di 1 – 3 mL/h, e questo può essere cambiato secondo le esigenze sperimentali. Avviare il corso di tempo di avviamento della pompa.
    6. Per il trattamento di4 GA durante un corso a tempo (Figura 1), interrompere la perfusione mettendo in pausa la pompa e cambiare la siringa con un nuovo contenente un liquido ¼ MS completato con GA4. Procedere con la formazione immagine confocal come illustrato nella sezione successiva.

4. microscopia

Nota: Eseguiamo la microscopia laser confocale.

  1. Acquisire immagini utilizzando un microscopio confocale equipaggiato con laser per eseguire imaging FRET.
    Nota: Per nlsGPS1, sono Imaging varianti di ciano proteina fluorescente (CFP) e la proteina fluorescente gialla (YFP). In questo protocollo, microscopi commerciale (Vedi Tabella materiali, elencati come microscopio 1 e 2) sono utilizzati con x 10 o 20 x obiettivi a secco 0,70 armonici composti piano APO.
  2. Per microscopio 1, uso 448 nm e 514 nm lunghezza d'onda laser per eccitare la PCP e YFP, rispettivamente. Acquisire scansioni sequenziali. Impostare rivelatori (ad es., HyD SMD) per 460-500 nm per PCP (emissione del donatore) e 525 – 560 nm per YFP (FRET emissione) di rilevare dopo l'eccitazione della PCP. Utilizzando una seconda sequenza, impostare un rivelatore per rilevare 525 – 560 nm per YFP (emissione di YFP) dopo l'eccitazione di YFP.
    Nota: Questa fluorescenza YFP viene utilizzata come un controllo di espressione, così come nel segmentare i nuclei, per generare le superfici utilizzando un software di analisi e visualizzazione 3D commerciale microfotografia.
  3. Per microscopio 2, uso 440 nm e 514 nm lunghezza d'onda laser linee per eccitare la PCP e YFP, rispettivamente. Acquisire due tracce. Per traccia 1, impostare rivelatori (ad es.., ChS) per rilevare 464 – 500 nm per PCP (emissione del donatore) e 526 – 562 nm per YFP (emissione FRET) dopo l'eccitazione della PCP. Per tenere traccia 2, impostare un rilevatore di rilevare 526 – 562 nm per YFP (emissione di YFP) dopo l'eccitazione di YFP.
    Nota: Questa fluorescenza YFP viene utilizzata come un controllo di espressione, così come nel segmentare i nuclei, per generare superfici nel software di analisi e la visualizzazione 3D.
  4. Acquisire immagini utilizzando un formato di 512 x 512 pixel e una risoluzione di 12 bit.
  5. Il guadagno deve essere regolata a un valore determinato empiricamente che consente un buon segnale ma non saturare pixel. Il guadagno non deve essere modificato tra PCP e FRET emissione sopra l'esperimento. Impostare il foro stenopeico 1 unità arioso (AU). Porre il IBIDI appiccicoso-vetrino nella fase del microscopio confocale e procedere con imaging come precedentemente indicato.
  6. Nel software microscopio 1, mentre in un active scan in tempo reale, utilizzare bagliore sopra/sotto si trova sulla parte superiore sinistra della schermata dell'immagine per determinare la sottoesposizione e la saturazione della regione di interesse. Nel software microscopio 2, utilizzare Gamma indicatore situato sul lato inferiore dello schermo immagine per determinare la sottoesposizione e la saturazione della regione di interesse. Per qualsiasi analisi di immagine quantitativa, non ci dovrebbe essere nessuna saturazione di pixel.
  7. Impostare gli z-stack con un passo di 1 μm. La dimensione del passo può essere ridotto per una maggiore risoluzione di z o aumentata per incrementare la velocità di acquisizione o di aumentare il numero di posizioni/campioni che possono essere imaged. Per il corso di tempo automatico, impostare il tempo con gli z-stack (xyzt modalità nella scheda modalità di acquisizione) per acquisire le immagini a intervalli di tempo impostato.

5. image Analysis utilizzando Fiji

Nota: Usando ImageJ (Fiji) è possibile elaborare dati di imaging e produrre immagini bidimensionali (2D) del rapporto dell'emissione nlsGPS1 nei semenzali di Arabidopsis . Per esempi di immagini, vedere Figura 2A, 2C, 2E, 2Ge 3A. In ImageJ, è possibile trovare ogni comando del presente protocollo utilizzando la funzione di ricerca. Premere la barra spaziatrice e L sulla tastiera del computer. Si aprirà una nuova finestra; digitare il comando desiderato nel campo di ricerca.

  1. Trascinare il file (file o .lif o .lsm) in Fiji (figura J) e aprire le immagini come iper-stack.
  2. Dal menu principale, selezionare immagine > Pila > progetto Z e selezionare fette di somma per catturare tutti i pixel anziché solo i pixel più luminosi come proiezione Max.
  3. Dal menu principale, selezionare processo > Sottrai sfondo e impostare il raggio di rotolamento sfere a 50 pixel. Deseleziona tutte le altre opzioni ed elaborare tutte le immagini di tre. Questo passaggio rimuove sfondo utilizzando l'algoritmo "rolling ball".
    Nota: 50 pixel è stato determinato empiricamente per includere i nuclei come primo piano.
  4. Dal menu principale, selezionare immagine > colore > canali Split. Tre nuove finestre aprirà: C1-somma (canale PCP); C2-somma (Tasto canale) e C3-somma (canale YFP).
  5. Selezionare la finestra di C3-somma e, dal menu principale, selezionare processo > filtri > Sfocatura gaussiana e applicare una sfocatura gaussiana di 1 per ridurre il rumore dell'immagine.
  6. Dal menu principale, selezionare immagine > regolazione > Luminosità/contrasto e selezionare auto.
  7. Dal menu principale, selezionare processo > Migliora contrastoe set saturi = 0,35.
  8. Dal menu principale, selezionare immagine > tipo > 8 bit e convertire gli stack in un'immagine a 8 bit.
  9. Dal menu principale, selezionare immagine > regolazione > Soglia Auto-locale. Della Soglia di Auto-locale, selezionare i seguenti parametri: Phansalkar metodo, raggio = 15, parametro 1 = 0, parametro 2 = 0e stack di bianco. In questo passaggio, gli stack di YFP vengono utilizzati per fare una maschera binaria.
  10. Selezionare la finestra di C2-somma e, dal menu principale, selezionare processo > filtri > Sfocatura gaussiana e applicare una sfocatura gaussiana di 1.
  11. Selezionare la finestra C1-somma e, dal menu principale, selezionare processo > filtri > Sfocatura gaussiana e applicare una sfocatura gaussiana di 1.
  12. Per creare lo stack di rapporto di emissione da due canali, dal menu principale, selezionare processo > Immagine calcolatrice. Nella nuova finestra che apparirà, selezionare C2-somma come immagine 1, selezionare dividere come operatore e selezionare C1 somma come immagine 2.
  13. Assicurarsi di selezionare Crea una nuova finestra e il formato a 32 bit. Una nuova finestra denominata Risultato di C2-somma.
  14. Dal menu principale, selezionare immagine > tabella di ricerca > LUT 16_colors.
  15. Dal menu principale, selezionare processo > Immagine calcolatrice. Nella nuova finestra che apparirà, selezionare Risultato di C2-somma come immagine 1, selezionare moltiplica come operatore e selezionare C3-somma come immagine 2. In questo passaggio, la maschera YFP binaria viene moltiplicata per lo stack YFP/CFP per mostrare solo i pixel presenti nel canale di controllo di YFP.
  16. Dal menu principale, selezionare processo > matematica > dividere e impostare il valore su 255. Nella nuova finestra che si apre, selezionare per analizzare tutte le immagini nella pila. Una nuova immagine apparirà denominato Risultato del risultato di C2-somma.
  17. Dal menu principale, selezionare immagine > regolazione > Luminosità/contrasto e selezionare automatico.
  18. Dal menu principale, selezionare processo > Migliora contrastoe selezionare tipo saturata = 0,35.
  19. Dal menu principale, selezionare immagine > regolazione > Luminosità/contrastoe impostare valori minimi e massimi per acquisire la distribuzione di GA. Passaggio facoltativo: dal menu principale, selezionare Analyze > strumenti > Barra di calibrazione e Visualizza LUT-taratura bare salvare il Risultato del risultato di C2-somma come un file TIFF.
  20. Per ottenere i valori dell'emissione rapporti, dal menu principale, selezionare Analyze > impostare misura e selezionare grigio valore medio e Deviazione Standard.
  21. Selezionare la forma di rettangolo sulla barra degli strumenti e disegnare un'area di interesse (ROI). Dal menu principale, selezionare Analyze > misura. Una nuova finestra riporterà il valore medio dalle ROI selezionato.
  22. Copiare e incollare i valori ottenuti nel software del foglio elettronico (Excel o OriginPro) e fare un istogramma per un trattamento prima e dopo GA4 sperimentare o un grafico per un corso di tempo sperimentare.

6. image Analysis utilizzando Software di analisi e visualizzazione 3-d

Nota: Il vantaggio di utilizzare il software selezionato (Vedi Tabella materiali) sono quello di segmentare gli oggetti (ad esempio, i nuclei) e creare immagini 3D da uno z-stack confocale. Per esempi di immagini, vedere Figura 2B, 2D, 2F, 2he 3B.

  1. Aprire il software e importare il file (file o .lif o .lsm).
  2. Nuclei di segmento basati sul canale di emissione di YFP controllo utilizzando la procedura guidata di superfici. Gli oggetti segmentati chiamati "superfici". Questo passaggio di segmentazione permette l'analisi di tutti i voxel in un nucleo come un unico oggetto, eliminando il background di voxel di fuori del nucleo.
  3. Nella procedura guidata di superfici, impostata la sottrazione di sfondo (contrasto locale) 3 µm e la soglia predefinita. Mascherare l'emissione di PCP ([DxDm] di emissione del donatore di eccitazione di donatore) e FRET canali di emissione (emissione di accettore di eccitazione di donatore [DxAm]) basati sulle superfici create utilizzando il canale YFP emissione (emissione di accettore di eccitazione di acceptor [AxAm]).
  4. Utilizzare l'estensione del Rapporto di intensità significa XT per calcolare un rapporto di emissione di donatore eccitazione acceptor diviso dall'emissione di donatore di eccitazione donatore (DxAm/DxDm) tra i valori di intensità media delle singole superfici in due canali.
    Nota: Questa estensione è disponibile online per il download.
  5. Per colorare le superfici individuali con il rapporto di emissione nlsGPS1, selezionare colore codifica con statistiche, che è rappresentato come un'icona ruota colori. Selezionare il rapporto di intensità medio come tipo di statistiche.
  6. Esportare i rapporti dei singoli valori dalla tabella, che si trova sotto l'icona di statistiche .
  7. Copiare e incollare i valori in un foglio di calcolo e fare un istogramma per prima e dopo GA4 trattamento esperimenti o un grafico lineare per tempo corso esperimenti.

7. elaborazione statistica

Nota: Vedere Figura 3D per un terreno beeswarm e casella di nlsGPS1 rapporti di emissione.

  1. Aprire il software e incollare il rapporto di emissione delle superfici i nuclei come colonne di Y.
  2. Selezionare le colonne di interesse e selezionare statistiche > Statistiche Descrizione > test di normalità di sapere se i campioni siano distribuiti normalmente. Eseguire il test di normalità e una nuova finestra si aprirà e riferire i risultati.
  3. Se i campioni sono normalmente distribuiti, utilizzare il t-test come test statistici. Selezionare statistiche > test di ipotesi > t-test di due campioni su righe ed Esegui il t-test.
  4. Se i campioni non sono normalmente distribuiti, selezionare statistiche > test di ipotesi statistiche > due campioni di test per la varianza di sapere se la varianza tra i campioni non è significativamente diversa.
  5. Se la varianza non è significativamente diversa, utilizzare il test di Mann-Whitney U come test statistico. Selezionare statistiche > Test non parametrici > test di Mann-Whitney ed Esegui il test.
  6. Se la varianza è significativamente diversa, usare Kruskal Wallis ANOVA test come test statistico. Selezionare statistiche > Test non parametrici > test di Kruskal Wallis ANOVA ed eseguire il test.

Representative Results

Utilizzando nlsGPS1, è possibile misurare i livelli cellulari di4 GA nei tessuti suscettibili di formazione immagine di fluorescenza, compreso punte delle radici e buio-grown ipocotili (Figura 2). Nella radice Arabidopsis , il gradiente di rapporto di emissione nlsGPS1 è indicativo di bassi livelli di GA nelle zone meristematiche e divisione e livelli elevati di GA nella zona di allungamento tardo (Figura 2A e 2B). Al contrario, una pendenza di rapporto di emissione non è stata osservata nelle radici di nlsGPS1-NR, suggerendo che il gradiente di GA endogeno non è un artefatto (Figura 2 e 2D). Una sfumatura di rapporto di emissione nlsGPS1 inoltre è stata formata nel buio-grown ipocotili, con bassi livelli a cotiledoni e il gancio apicale e livelli elevati nella regione basale rapidamente prolungando l'ipocotile (Figura 2E e 2F). Al contrario, una pendenza di rapporto di emissione non è stata osservata negli ipocotili nlsGPS1-NR (Figura 2 e H 2). In Arabidopsis radici sia cresciuta buio ipocotile cellule, accumulazione endogena di GA correlato con il tasso di allungamento cellulare.

Inoltre, esogenicamente fornito GA4 accumula preferenzialmente nella zona di allungamento rispetto alla zona di divisione della radice Arabidopsis (Figura 3), che indica che nlsGPS1 può essere usato per studiare GA endogeno ed esogeno patterning.

Durante tempo corso esperimenti, nlsGPS1 piantine sono stati disposti negli alloggiamenti di appiccicoso-slide e irrorati con ¼ MS liquido, seguita da un trattamento con 0.1 µM GA4 per 30 min. Il video mostra un accumulo più veloce di esogeno GA4 nella zona di allungamento della radice rispetto alla zona di divisione (Video 1).

Figure 1
Figura 1: preparazione per l'imaging confocale. Questi pannelli mostrano una rappresentazione schematica della preparazione del campione per (A), un esperimento di stato stazionario, (B) prima e dopo esogeno GA4 trattamenti e per l'utilizzo di (C), un esperimento di corso tempo di trattamento appiccicoso-diapositive (C). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Il gradiente di GA nelle radici di Arabidopsis e buio-grown ipocotili. Immagini bidimensionali di nlsGPS1 (A) e (C) nlsGPS1-NR radici sono stati analizzati utilizzando il software ImageJ e immagini tridimensionali di nlsGPS1 (B) e (D) nlsGPS1-NR sono stati analizzati usando una pubblicità tridimensionale software di analisi di immagine. Entrambe le analisi hanno mostrato un endogeno GA4 gradienti nelle radici di Arabidopsis . Immagini bidimensionali di nlsGPS1 (E) e ipocotile di buio-coltivate nlsGPS1-NR (G) sono stati analizzati utilizzando il software ImageJ e immagini tridimensionali di nlsGPS1 (F) e (H) nlsGPS1-NR sono stati analizzati utilizzando il software di analisi di immagine tridimensionale commerciale. Entrambe le analisi hanno mostrato un endogeno GA4 sfumatura nel buio-grown ipocotili. La barra LUT Visualizza la falsa colorazione dei rapporti di emissione di nlsGPS1. Immagini YFP vengono segnalati come controlli espressione. Ipocotile immagini sono state acquisite utilizzando due posizioni di fase. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: il gradiente di GA esogeno nelle radici. Il primo spettacolo di due pannelli (A) bidimensionale e (B) immagini tridimensionali di una radice di nlsGPS1 prima e 20 minuti dopo il trattamento di esogeno GA4 (1 µM). Immagini YFP vengono segnalati come controlli espressione. La Vedi ultimi due pannelli (C), la media e la deviazione standard e la (D) beeswarm e casella trama di rapporti di emissione di nlsGPS1 per i nuclei della zona di allungamento (la regione che viene definita con una cornice bianca). Nella zona di allungamento, il rapporto di emissione nlsGPS1 era significativamente più alto dopo il trattamento di GA4 (prova di Mann-Whitney U, * * * P-valore < 0,0001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1
Video 1: esperimento di aspersione della radice di nlsGPS1 utilizzando appiccicoso-diapositiva. Questo video mostra immagini tridimensionali di nlsGPS1 irrorati con ¼ MS liquido e trattati con 0,1 µM GA4 per 30 min. Nel corso di tempo, la formazione immagine è stata acquisita ogni 10 min per 3 h con i seguenti intervalli: 30 min di soluzione finto (telaio t = 1, t = 2, t = 3), 30 min di trattamento4 GA (telaio t = 4, t = 5, t = 6), 2 h di sbeffeggiare così luzione (telaio t = 7 per t = 18) soluzione. Prima dell'acquisizione, il campione è stato irrorato con finto soluzione per 2 h. Clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)

Discussion

Il nlsGPS1 di biosensore basato su FRET GA fornisce un metodo quantitativo per segnalare e misurare le pendenze di ormone GA nella piante pluricellulari. Basato su FRET biosensori in grado di quantificare dinamiche con una migliore risoluzione spazio-temporale sulla rilevazione diretta tramite spettrometria di massa e la misura indiretta di reporter trascrizionale o segnalazione proteina-degradazione-metodi basati su12, 13. Imaging ad alta risoluzione cellulare in diversi tipi di tessuto può produrre significativi approfondimenti GA biologia e spark nuove ipotesi per quanto riguarda la regolazione e la funzione delle accumulazioni di GA in un contesto pluricellulare. Ad esempio, monitorare i cambiamenti nei nlsGPS1 biosensore specifico GA biosintetico, catabolico e mutanti di trasporto, così come durante perturbazioni spatiotemporally indotti, potrebbe essere molto informato per testare in modo specifico come gradienti di GA sono stabiliti in la radice e la radice di indirizzo delle cellule risposte a gradienti di GA. Il sensore può essere utilizzato in altre specie modello e raccolto per testare la conservazione dei meccanismi che controllano il controllo GA-mediata di germinazione del seme, l'allungamento cellulare e fioritura.

I passaggi critici nell'imaging del biosensore nlsGPS1 basato su FRET sono che 1) i pixel non dovrebbero essere saturo durante l'analisi quantitativa di FRET, parametri 2) imaging come "rivelatore guadagno" dovrebbero essere mantenuti costanti per l'emissione del donatore (DxDm) e acquisizioni di emissione (DxAm) di accettore, 3) linee nlsGPS1-NR di controllo devono essere utilizzati per escludere artefatti e 4) campioni devono essere preparati per minimizzare drift e problemi di cambiamento focale. Inoltre, le condizioni ambientali in cui sono cresciuti campioni sono importanti per controllare poiché i livelli di GA sono sensibili alle condizioni ambientali come luce durata e intensità della luce14,15,16 ,17. Una limitazione fondamentale di questo tipo di analisi è che un elevato rapporto segnale-rumore è necessario per l'imaging a causa l'aumento della rumorosità insiti nell'imaging raziometrici. Così, nlsGPS1 imaging non sarà utile per i tessuti e gli organi che non sono favorevoli alla microscopia a fluorescenza raziometrici utilizzando proteine fluorescenti ciano e gialle — ad esempio, nei tessuti più profondi dove le proteine fluorescenti sono scarsamente rilevate. D'altra parte, raziometrico letture sono spesso preferite sopra intensiometric letture, perché un controllo interno è utile per escludere manufatti derivanti da cambiamenti nell'espressione di biosensore, stabilità, luminosità o individuabilità in una data cellula, tessuto , o condizione. Ad esempio, FRET imaging biosensore e analisi di immagine inoltre sono stati usati per studiare una varietà di ligandi in una varietà di tessuti5,6,18,19,20,. L'imaging esperimenti e analisi di immagine segnalati qui possono essere modificati per soddisfare i nuovi metodi di imaging, come la microscopia foglio leggero, che potrebbe produrre nuove conoscenze in, ad esempio, più profonda radice-tipi di tessuto.

Il biosensore di prima generazione nlsGPS1 è un sensore di alto-affinità che fornisce una mappa ad alta risoluzione delle pendenze di GA che può anche segnalare sull'aumento intracellulare in seguito Trattamenti esogeni GA GA. Uno dei limiti attuali di nlsGPS1 è che il sensore non è rapidamente reversibile e, così, rapporti non-livelli allo stato stazionario GA ma, probabilmente, la massima concentrazione di GA risale nella soluzione di interesse. Il turnover di preciso per il sensore è anche non conosciuto e questo, combinato con bassa reversibilità, osta ad una rilevazione di svuotamenti GA endogeni che potrebbe accadere in un minuti a un paio d'ore in alcuni tipi di tessuto. È anche importante notare che nlsGPS1 ha un'alta affinità per GA4 (Kd = 24 nM) rispetto ad altre forme di GA (GA3 Kd= 240 nM, GA1Kd = 110 nM) quando altri GAs bioattivi di imaging 7. le generazioni future di biosensori GA possono essere progettate per aumentare la reversibilità mantenendo alta affinità o esibiscono diverse specificità per i vari precursore, bioattivi, o dei cataboliti GAs. 

Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del programma ricerca e innovazione di Horizon 2020 dell'Unione europea (accordo di finanziamento n ° 759282).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
nlsGPS1 Col0 Arabidopsis seeds NASC N2107734
nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis seeds NASC N2107735
Gibberellin A4 (GA4) Sigma G7276 dissolve in EtH 70% , and keep at -20 °C
sodium hypochlorite solution (Bleach) Fisher S/5040 HSRA 064
Hydrogen cloride HCl Sigma 31434
Micropore tape 3M 1530-1
ibidi sticky-slide Ibidi 81128 Luer 0.1 for root imaging
ibidi sticky-slide Ibidi 80168 Luer 0.2 for hypocotyl imaging
glass coverslip for sticky slides Ibidi 10812
Elbow Luer Connectors Ibidi 10802
silicone tubing Ibidi 108401
Luer Lock Connector Ibidi 10826
programmable syringe pump World Precision Instruments AL-1000
Vacuum grease Sigma 18405
Murashige and Skoog Basal Salts Duchefa M0221
Agar plant, 1 kg Melford P1001
Microscope slide ground edges, 76 mm x 26 mm, 1.0 mm to 1.2 mm thick Fisher Scientific 12383118
Cover slip No.1 1/2 glass 22 mm x 22 mm Fisher Scientific 12363138
Luer-slip Syringe 20 mL Fisher Scientific 10785126
3M Micropor Surgical Paper Tape Fisher Scientific 12787597
Potassium Hydroxide, 500 g Sigma Aldrich 221473-500G-D
Absolute Ethanol Fisher Scientific 10428671
Forceps Watchmaker 5 StSteel Scientific Laboratory Supplies INS4340
Scissors, 125 mm, stainless steel Fisher Scientific 12338099
Fitting reducer 0.5 to 1.6 Ibidi 10829
Leica SP8 Confocal laser microscope 1
Zeiss LSM 780 Confocal laser microscope 2
Imaris Bitplane 3D visualization and Analysis software
Fiji image analysis software
OriginPro Origin Lab Statistical Analysis Software

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References

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