המוטיבים אן יציב, 1 י ו- 2D Nanostructures בנוי מולקולות DNA מעגלי קטן

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט עבור T4 מצדו ולטיהור denaturing דף קטן מולקולות DNA מעגלי, חישול, ניתוח דף מקורית של אריחים מעגלית, בהרכבת AFM הדמיה של nanostructures ה-DNA 1 י ו- 2D, כמו גם agarose ג'ל אלקטרופורזה וטיהור צנטריפוגה של סופי אן nanostructures.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Guo, X., Wang, X. M., Xiao, S. J. Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules. J. Vis. Exp. (146), e58744, doi:10.3791/58744 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט של סינתזה של מולקולות DNA מעגלי קטנות, חישול של מעגלי DNA מוטיבים ובניית nanostructures DNA 1 י ו- 2D. במשך עשרות שנים, הפיתוח המואץ של ננוטכנולוגיית דנ א מיוחס השימוש DNAs ליניארית כמו למקורות ראשוניים. לדוגמה, המשבצת דאו (כפול מוצלב, antiparallel, מוזר. מסתבר חצי) היא ידועים כמו אבן בניין להקמת רשתות ה-DNA 2D; המבנה הליבה של DAO עשוי שתי oligonucleotides חד גדילי לינארי (הה), כמו שני חבלים עושה קשר סבתא יד ימין. במסמך זה, סוג חדש של אריחים DNA נקרא cDAO (בשילוב DAO) נבנים תוך שימוש קטן מעגלית ss-DNA של c64nt או c84nt (מעגלית 64 או 84 נוקלאוטידים) וגם סטרנד לגרדום מספר ליניארי האס. אס-DNAs כמו קווצות סיכות. Nanostructures 1D ו- 2D מושלם are התכנסו from cDAO אריחים: nanowires אינסופי, nanospirals, צינורות, nanoribbons; סופי ננו-מלבנים. פרוטוקולים מפורט מתוארים: 1) הכנה על ידי T4 ליגאז וטיהור על ידי denaturing עמוד (לזיהוי אלקטרופורזה בג'ל) של oligonucleotides עגול קטן, 2) חישול של אריחים מעגלית יציב, ואחריו ניתוח דף מקורית, 3) הרכבה של אינסוף 1 י nanowires, nanorings, nanospirals, פומפיה 2D אינסופי של צינוריות nanoribbons ו ננו 2D סופיים-מלבנים, ואחריו AFM (מיקרוסקופ כוח אטומי) הדמיה. השיטה היא פשוטה, חזקים, במחיר סביר עבור רוב מעבדות.

Introduction

היו בשימוש במולקולות דנ א כדי לבנות סוגים רבים של nanostructures במשך עשרות שנים. מוטיבים אופייניים כוללים דיי (מוצלב זוגי, antiparallel, אפילו חצי. מסתבר) ורווקה DAO אריחים1,2,3, אריחים כוכב4,5,6,7, תקועים (הה) אריחים8,9,10, ו- DNA אוריגמי11,12,13. אלה המוטיבים אן, פומפיה are התכנסו from ss ליניארי-DNAs. לאחרונה, אנחנו ואחרים דיווחו השימוש של האס. אס מעגלית-oligonucleotides כמו פיגומים לבנות מוטיבים, צינורות 1 י, ואת רשתות 2D14,15,16,17. על-ידי הוספת הולידיי לצומת (ג'ונסון)18,19,20,21 במרכז c64nt, זוג שני אריחים DAO בשילוב יכול להיות בנוי17. זה מוטיב cDAO חדש ונגזרותיו יציבים, DNA נוקשה מספיק כדי להרכיב 2D סורגים עד 3 × 5 מיקרומטר2. בנייר זה, אנו משתמשים מונח של "אריח מעגלית", אשר מוגדר יציב DNA מורכב מולקולה נבנה עם אחד לגרדום מעגלית ומקומות ליניארי של האס. אס-oligonucleotides, מונח אחר של "אריח ליניארי", אשר נבנה מתוך ערכה מלאה של ליניארי אס-oligonucleotides.

פרוטוקול זה מדגים כיצד לבנות חמישה סוגים של ה-DNA nanostructures עם מולקולות DNA מעגלי קטן כמו פיגומים: nanowires c64nt ו- c84nt 1 י 1) אינסופי, אינסוף 2) 2D cDAO-c64nt-O, cDAO-c64nt-E (-O מייצגת מספר אי-זוגי של 5. מסתבר חצי ו- E פומפיה מייצג מספר זוגי של חצי-הופכת 4), 3) אינסופי 2D cDAO-c84nt-O ו- cDAO-c84nt-E פומפיה, 4) סופית 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O ו- 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O מלבנים, 5) אינסופי 1 י acDAO-c64nt-E nanorings ו- nanospirals (עיין איור 3-5 סכמטי ציורים, תמונות של חמישה סוגי הדנ א nanostructures לעיל). 1 י c64nt ו- c84nt nanowires are התכנסו from כל לגרדום c64nt ו- c84nt הקשורים עם שתי סיכות ליניארי בהתאמה. כל אריח מעגלית של cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c74nt או cDAO-c84nt הוא annealed מ שלה לגרדום המתאים של c64nt, c74nt או c84nt עם ארבע סיכות ליניארי בהתאמה. פומפיה 2D אינסופי הם התאספו מאותו סוג? של שני אריחים מעגלית עם רצפים שונים. פומפיה מלבן 2D סופית שני are התכנסו from שתי ערכות של 32 אריחים תת מעגלית בהתאמה. כדי לחסוך כסף, c64nt רק אחד רציף, c74nt ו- c84nt משמש לגרדום המתאימים בזמן המסוכך שונות משמשות anneal של 32 cDAO-c64nt, cDAO 12-c74nt, ואריחי cDAO 20-c84nt מעגלית משנה בהתאמה בשלב הראשון אריח תת מחזק, אז מערבבים יחד המתאימים 32 מעגלית תת האריחים ולהחיל בסריג השני חישול שלב להרכיב את סופי 5 × 6 cDAO-c64nt-O ו- 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O רשתות, בהתאמה. . בהחלט, וסודרו באופן שונה פיגומים מעגלית ניתן לאמץ להרכיב מגוון רחב של גודל סופי nanostructures, אולם זה יעלה יותר כסף, עמל. Nanorings acDAO-c64nt-E 1D אינסופי של nanospirals הם annealed האריחים רציף אחד אסימטרי acDAO-c64nt עם חיבורי ליניארי של מספר זוגי של חצי 4. מסתבר. ישנן שתי גישות להרכיב אינסוף פומפיה 2D האריחים מעגלית של cDAO-c64nt ו- cDAO-c84nt, אשר נבדלים על ידי מרחקים intertile של מספר זוגי של 4 ומספר אי-זוגי של חצי 5. מסתבר בהתאמה. לשעבר דורש כל האריחים ייושר באופן זהה; האחרון דורש ניטור פניהם של שני האריחים הסמוכים לאורך הצירים הסליל. אם המשבצת מישורי, כגון cDAO-c64nt הנוקשה, שתי הגישות יפיק nanoribbons מישורי; אם המשבצת מעוקם לכיוון בכיוון אחד, כגון cDAO-c84nt, חיבור intertile של מספר זוגי של 4 פונה חצי יפיק צינוריות, ואילו החיבור intertile של מספר אי-זוגי של 5 פונה חצי יפיקו מישורי nanoribbons בשל חיסול מוטה-עקמומיות הצמיחה על ידי יישור חלופי של אריחים מעוקל. הרכבה מוצלחת של nanostructures ה-DNA 1 י ו- 2D האריחים מעגלית מציין מספר יתרונות של גישה חדשה זו: לאכוף את יציבות, קשיחות של אריחים מעגלית על אריחים ליניארי, אריחים כיראלי להרכבת סימטרית nanostructures כגון nanorings, nanoribbons, חזיונות חדשים על להבין את מכניקת הדנ א ואת מבנה מולקולרי, וכו '.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת DNAs עגול

  1. השתמש כל DNAs ליניאריים הניתנים על ידי חברות מסחריות ישירות ללא טיהור נוסף.
  2. Centrifuge דגימות ה-DNA ב 5000 g × במשך 5 דקות כדי לאסוף את כל כדורי ה-DNA בחלק התחתון של הצינורות. הוסף אמצעי אחסון המתאים טה מאגר (10 מ"מ טריס, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0) כדי להמיס את ה-DNA.
  3. למדוד את הריכוז של "a" ng/µL עבור כל הפתרונות ss-DNA בעזרת ספקטרומטר UV מיקרו של 260 ננומטר. להמיר ng/µL "a" "b" מיקרומטר בעקבות b = × 103 / (לנטישה המשקל המולקולרי של ה-DNA). התאימו את כמות פתרון טה להפוך 10 מיקרומטר דנ א מניות פתרון.
  4. השתמש T4 DNA ליגאז כדי לחבר את קצות 3' ו 5' 5'-phosphorylated ליניארית DNA תבניות ( איור 1) c64nt, c74nt, c84nt מסופקים ישירות של חברות מסחריות.
  5. מערבבים את 5'-phosphorylated ליניארית נ (3.5 מיקרומטר) ו שלה המתאימים סד נ (4.5 מיקרומטר) במאגר טה µL 80 ב- 200 µL PCR מבחנה15. דגירה הצינור בבקבוק תרמו פתוח מלא במים 95 ° C. לקרר מים חמים לטמפרטורת החדר (25 ° C) במשך 2-3 שעות תחת האווירה במעבדה.
  6. להוסיף µL 10 x T4 10 מאגר (660 מ"מ טריס-HCl, 66 מ מ MgCl2, 100 מ מ DTT, ATP 1 מ מ), 10 µL של T4 ליגאז (300 U µL) לתערובת לאמצעי הסופי של µL 100. דגירה את התערובת בתוך thermocycler 16 שעות ב-16 ° c
    הערה: האמור לעיל DNA ריכוז ונפח התגובה של µL ~ 100 הממוטבות מצדו גבוהה ויעילות את התשואה גבוהה של cyclization הנכון oligo-מונומר. להפעיל צינורות שתיים או יותר של תגובות מצדו באותו הזמן על פי הנבחנים. הליך חלופי הדגירה מצדו מחליף שלב 1.6 הוא 4 שעות ב 25 º C.
  7. לאחר הדגירה, בטל את ליגאז T4 במים 95 מעלות צלזיוס למשך 5 minminutes. לאחר מכן להעביר הצינור אמבט קרח מים, תקופת דגירה של 5 דקות להתקרר.
  8. להוסיף 10 µL של 10 x אקסונוקלאז אני מאגר ו 10 µL של אקסונוקלאז אני (5 U µL) לתערובת quenched דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים למשך 30 דקות באופן סלקטיבי לעכל את DNAs ליניארית הנותרים ולעזוב את DNAs circularized ללא פגע.
  9. הכינו 10% denaturing דף ג'ל.
    1. ללבוש כפפות גומי ומשקפת בעת הכנת את הג'ל דף בשכונה fume. להוסיף 2 מיליליטר 10 מ ל 6.67 של 30% (w/v) אקרילאמיד/bisacrylamide פתרון (19:1), x TAE· מאגר מ ג (40 מ"מ. טריס, 40 מ מ HAc, 1 מ"מ EDTA, pH 8.0, 12.5 מ מ Mg(Ac)2), 8.4 גר' אוריאה (ז 7) ומים יונים לאמצעי הסופי של 20 מ בשפופרת צנטרפוגה 40 מ.
      התראה: הפתרון אקרילאמיד/bisacrylamide פתרון (19:1) 30% (w/v) הוא רעיל.
    2. הוסף 20 µL של tetramethylethylenediamine (TEMED), µL 100 של קירור (APS, 10% w/v) 40 מ ל צינור לפני העברת הפתרון ג'ל אלקטרופורזה במערכת באופן מיידי. להוסיף 1.5 מ מ עבה עם המסרק 10-. טוב. יש להמתין לפחות 20 דקות עד הפתרון ג'ל פני השטח למוצק.
    3. הגדר מתח קבוע של 80 V עבור ג'ל של 85 × 80 × 1.5 מ מ3 (רוחב × גובה × עובי). להוסיף 1 x TAE· Mg מאגר מערכת אלקטרופורזה, prerun את הג'ל במשך 20 דקות ב V 10/ס.
  10. . שימי את ה-PCR מ 1.8 שלב ב 95 ° C מים במשך 5 דקות כדי להשבית אקסונוקלאז אני. לאחר מכן להעביר הצינור אמבט קרח מים, תקופת דגירה של עוד 5 דקות.
  11. להוסיף 20 µL של formamide בצינור נפח סופי של 140 µL ומערבבים את הפתרון. להפיץ את הפתרון 7-9 דף denaturing ג'ל בארות באותה מידה עם 16-20 µL עבור כל ג'ל טוב. לערבב 2 µL של טעינת צבען (0.05% bromophenol כחול, 0.05% קסילן cyanol FF, 60% גליצרול, 10 מ מ טריס-HCl, 60 מ מ EDTA, pH 7.6) עם µL 8 מ- DNA ליניארי קודמן המתאים (10 מיקרומטר) ולהזריק את התערובת עד לבאר נפרד לצורך סימוכין.
    הערה: התוספת של formamide היא להגביר את הצפיפות של הפתרון טעינה עבור לשקוע לקרקעית של הג'ל דף. ובכן, גם כדי לבטל שיוך של זוגיות קצת תקועים DNA משקעים.
  12. להפעיל את הג'ל על 2 h 10 V/ס מ, תפסיק לרוץ כאשר קסילן cyanol FF הוא במיקום 2/3 של לוח הזכוכית בעין בלתי מזוינת.
  13. ללבוש כפפות גומי ומשקפת כדי להגן על עור ועיניים. קח את הג'ל מתוך לוח הזכוכית. להניח את הג'ל על צלחת TLC (שכבה דקה כרומטוגרפיה) פלורסנט. לחתוך את הלהקות ג'ל היעד על ידי סכין גילוח בדיוק כמו מוצללת על ידי הקרנת UV (איור 2).
    התראה: האור האולטרה סגול מזיק לעיניים, עורות.
    הערה: תחת הקרנת UV-254 ננומטר, דנ א לקלוט את האור ואת הטל צל על צלחת TLC. ה-DNA מעגלי רץ לאט יותר המתאימים קודמן ליניארי ה-DNA שלו. כמה DNAs ליניארית מעוכל, לא רצויים מעגלית DNAs בכמויות קטנות אשר מקיפים את הלהקה היעד מוצלל תזהם את ה-DNA מעגלי אם הם נאספו.
  14. העברת הלהקות ג'ל לתוך צינור microcentrifuge 2.0 mL. האוויר יבש או מכה יבשה הלהקות ג'ל, ואז מועכים את ג'לים לתוך עיסה באמצעות מרית או מוט זכוכית שעברו שיטוח. ודא שהג'ל נהרס לחלוטין לתוך עיסה, אשר הינה קריטית התשואה הגבוהה של ה-DNA מעגלי. הוסף פעמיים של ג'ל יונים נפח המים לתוך הצינור, לנער את הצינור בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
  15. לסנן את התערובת כדי לאסוף את supernatants בשפופרת microcentrifuge 2.0 mL. לשחזר דנ שיורית על ידי שטיפה עם נפח קטן של מים יונים ומסנן שוב כדי לשלב את supernatants.
  16. לחלץ את eluent עם נפח שווה של n-butanol. חזור על הליך זה עד האחסון מימית מופחתת לכ-200 µL.
  17. להוסיף 500 µL של כוהל מוחלט (−20 ° C) ו 20 µL של NaOAc מ' 3 (pH 5.1) לתערובת עבור ה-DNA משקעים. אחסן את הצינורית על −20 ° C למשך 30 דקות.
  18. Centrifuge את הצינור ב 12,000 g × 10 דקות ב 4 ° C, למחוק את תגובת שיקוע. התמיסה DNA הנותרים הוא כ-100 µL בצינור.
  19. µL 600 של 75% אתנול (−20 ° C) להוסיף הצינור ואחסן אותו על −20 ° C למשך 30 דקות. ואז צנטריפוגה ב 12,000 × g 10 דקות ב 4 ° C, למחוק את תגובת שיקוע. התמיסה DNA הנותרים הוא פתרון µL כ-100 בצינור שוב. חזור על התהליך פעמיים.
  20. לאחר צנטריפוגה אחרון, להשליך את תגובת שיקוע ככל האפשר. יבש את השאריות עם רכז ואקום.
  21. מאגר ה-DNA מעגלי מטוהרים בצינור-−20 מעלות צלזיוס.
  22. Resuspend ה-DNA מעגלי במאגר טה לעשות 10 מיקרומטר מעגלית דנ א מניות פתרון על פי שלב 1.3 בעת הצורך.

2. חישול של מכלול פתרונות

  1. להכין סיר אחד חישול כל אריח או nanostructural הרכבה פתרון של c64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, HJ-c84nt, tHJ-c84nt, cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c84nt, c64nt, c84nt ו- acDAO-c64nt-E עם קבוצת DNAs ליניארית ולא עגול מעוצב.
    1. עבור כל הפתרונות הרכבה, לערבב 2 µL 10 x TAE· מאגר מ"ג, 1 µL של כל פתרון מניות ה-DNA של ערכה של גדילי לינארי, מעגלית שוויון יחסי טוחנת, המאגר הנוסף טה במבחנה 200 µL PCR כדי ריכוז סופי של גדיל אחד-0.5 מיקרומטר, נפח סופי של 20 µL. Anneal את הפתרון הרכבה ב תרמו בקבוק של 95 ° C עד 25 ° C מעל 48 שעות.
  2. להכין כל פתרון הרכבה של 2D פומפיה אינסופי של cDAO-c64nt-E, cDAO-c64nt-O, cDAO-c84nt-E cDAO-c84nt-O עם סט מעוצב של DNAs ליניארית ועוד שני שלבים חישול.
    1. הכן קודמן אריח תת הרכבה פתרון על ידי ערבוב 2 µL 10 x TAE· מאגר מ"ג, 1 µL של כל פתרון מניות ה-DNA של ערכה של גדילי לינארי, מעגלית שוויון יחסי טוחנת, המאגר הנוסף טה במבחנה 200 µL PCR ריכוז סופי של 0.5 מיקרומטר על גדיל אחד, נפח סופי של 20 µL. בשלב הראשון אריח תת מחזק, anneal כל פתרון אריח תת קודמן thermocycler ה-PCR באמצעות שיטת קירור מהיר לינארית מ 95 ° C עד 25 ° C מעל 2.5 h.
    2. להכין כל פתרון הרכבה של פומפיה אינסופי 4 לעיל על ידי ערבוב 10 µL של כל אחד שני פתרונות אריח המשנה המתאימה יחד כדי ריכוז סופי של 0.25 מיקרומטר על גדיל אחד. בסריג השני חישול שלב, anneal את התערובת 20 µL ב thermocycler PCR באמצעות שיטת קירור איטי של השוהים ב 50 מעלות צלזיוס במשך שעתיים ולצינון בשיעור של 0.1 º C לכל 5 דקות כדי 20 ° C, כ- 24 שעות בסך הכל.
      הערה: שני ניסויים במקביל ניתן להפעיל בו זמנית או לאחר מכן בשלב השני מחזק עבור כל סריג אינסופי 2D.
  3. היכונו שני שלבים חישול פתרונות הרכבה של שני מכלולים מלבן סופיים של 5 × 6 cDAO-c64nt-O ו 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O.
    1. הכן קודמן אריח תת הרכבה פתרון על ידי ערבוב µL 1 של 10 x TAE· מאגר Mg, 0.5 µL של כל פתרון מניות ה-DNA של ערכה של גדילי לינארי, מעגלית שוויון יחסי טוחנת, המאגר הנוסף טה במבחנה 200 µL PCR ריכוז סופי של 0.5 מיקרומטר על גדיל אחד, נפח סופי של 10 µL. בשלב הראשון מחזק, anneal כל פתרון אריח תת קודמן thermocycler ה-PCR באמצעות שיטת קירור מהיר לינארית מ 95 ° C עד 25 ° C מעל 2.5 h.
    2. להכין מלבן סופיים סריג הרכבה פתרון על ידי ערבוב 32 x (2 µL של כל פתרון האריח משנה) ביחד במבחנה 200 µL PCR כדי ריכוז סופי של ~ 15 ננומטר ועבור כל אריח תת נפח סופי של 64 µL. בשלב השני מחזק, anneal את התערובת 64 µL ב thermocycler PCR באמצעות שיטת קירור איטי של השוהים ב 50 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, לצנן בשיעור של 0.1 º C כל 5 דקות עד 20 ° C, כ-24 שעות בסך הכל.
      הערה: חמישה ניסויים במקביל ניתן להפעיל בו זמנית או לאחר מכן בשלב השני מחזק להרכבה כל מלבן סופיים.

3. ניתוח דף

  1. להכין דף יליד 10% בעקבות צעד 1.9 חוץ הרכיב אוריאה.
  2. עבור דגימות הבקרה של c64bp, c84bp, להוסיף 2 µL של כל פתרון הרכבה µL 1 של טעינת לצבוע כדי µL 3 מאגר טה כפקדי בנפרד. לכל אחת הרכבות אחרות מופיע באיור3, להוסיף 1 µL של כל פתרון הרכבה µL 1 של טעינת לצבוע כדי 4 µL טה מאגר.
  3. להזריק כל אחד הפתרונות שלעיל כדי ג'ל טוב. להוסיף 5 µL של סמן הדנ א (25-500 bp) באר נפרד לצורך סימוכין.
  4. הפעל את הג'ל במשך כ 4 שעות ב 10 V ס באמבט מי קרח. Cyanol קסילן FF יפעל מתוך לוח הזכוכית.
  5. ללבוש כפפות גומי ומשקפת כדי להגן על עור ועיניים. קח את הג'ל מתוך לוח הזכוכית, לטבול אותו ב- 100 מ של מים יונים עם 10 µL של כתם ג'ל חומצת גרעין למשך 30 דקות.
    התראה: הפתרון הכתם חומצת גרעין ג'ל הוא רעיל.
  6. לצפות את הג'ל תחת UV מערכת הדמיה, לצלם תמונה של הג'ל ויטראז'ים (איור 3).

4. טיהור של סורגים סופיים

  1. להכין יליד agarose 2% ג'ל אלקטרופורזה טיהור של סורגים סופיים.
    1. לערבב 1 גר' אבקת agarose, 5 מיליליטר 10 x TBE· מאגר מ ג (89 מ"מ. טריס, 89 מ"מ פנמיות, 2 מ מ EDTA, pH 8.0, 12.5 מ מ Mg(Ac)2), 2 µL של חומצות גרעין ג'ל כתם של 47.5 מ ל מים יונים בבקבוק 250 מ ל משולש. מרתיחים את התערובת עד הבועות הופכים קטן וצפוף. להוסיף מים חמים בתוך הבקבוק הנפח הכולל של 50 מ ל וריכוז של 2% agarose.
    2. ללבוש כפפות עבות. יוצקים את הפתרון ג'ל לתוך קופסת פלסטיק ג'ל של 7 x 10 x 1 ס מ3 (רוחב אורך × × עובי). הכנס מסרק סמיך, 12-ובכן ג'ל 1.5 מ מ. המתן הג'ל להתקרר לטמפרטורת החדר. במידת הצורך, לשים את הג'ל במקרר 4 ° C.
      התראה: להיות מודעים רותח כי הפתרון הוא חם מאוד.
    3. להוסיף 0.5 x TBE· מאגר מ ג של מערכת אלקטרופורזה. Prerun את הג'ל של 5 V/ס מ במשך 20 דקות באמבט מי קרח על מתח קבוע של 50 V.
    4. מזריקים µL 20 של הפתרון סופיים סריג מוכן בשלב 2.3 בג'ל agarose כל טוב ולהוסיף 5 µL של סמן הדנ א (100-3,000 bp) נפרד היטב. הפעל את הג'ל כבר שעתיים ב 5 V ס באמבט מי קרח.
    5. ללבוש כפפות גומי ומשקפת כדי להגן על עור ועיניים. גזור המטרה ג'ל להקות עם עמדה דומה דה מרקר bp 1,000 תחת אור UV ופרוסות אותם לתוך בסדר חלקים ולמקם את ג'לים כתוש לתוך עמודה מסנן8.
    6. Centrifuge את העמודה ב x 2,000 g למשך 5 דקות ב 4 º C. לחלץ את הפתרון מדגם באמצעות המדור. לאסוף את הפתרון עבור הדמיה AFM.
  2. לטהר פומפיה סופית על ידי משקעים פג.
    1. מערבבים 50 µL של הפתרון סופיים סריג מוכן בשלב 2.3 עם אמצעי אחסון שווה של 15% PEG8000 (w/v) מאגר (20 מ"מ Mg(Ac)2, 5 מ מ טריס, 1 מ"מ EDTA ו 505 מ"מ NaCl)22. Centrifuge הפתרון ב × 18,000 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    2. הסר את תגובת שיקוע והוסף µL 100 מאגר פג. חזור על צנטריפוגה.
    3. לאחר הסרת את תגובת שיקוע, לפזר את גלולה 1 x TAE· מאגר מ"ג עבור הדמיה AFM.
      הערה: טיהור הוא הכרחי עבור פומפיה סופיים של 5 × 6 cDAO-c64nt-O, 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O AFM הדמיה ויישומים אחרים. אם התשואה נמוכה מדי, להגדיל את מהירות צנטריפוגה. אם המוצר אינו טהור מספיק, חזור על שלב 4.2.2.

5. AFM הדמיה

  1. ננו-חוט c64nt, ננו-חוט c84nt, acDAO-c64nt-E, פומפיה 2D אינסופי של cDAO-c64nt-E(O), cDAO-c84nt-E(O), להפקיד μL 2 מדגם annealed על משטח נציץ cleaved טרי. להשאיר למשך 2 דקות בשביל ספיחה של רשתות ה-DNA אל פני השטח נציץ. רוחצים את השטח עם 100 µL של מים יונים פעמיים את לייבש אותו על ידי אוויר דחוס.
  2. להשיג AFM תמונות של סורגים DNA אינסופי באוויר על-ידי סריקת פני השטח נציץ עם הגששים AFM משולש תחת במצב הקשה. להגדיר את הפרמטרים הבאים עבור סריקה: סריקה בגודל של 0.5 ~ 5 מיקרומטר, לסרוק ברזולוציה של קווים 512, וסרוק בשיעור של 3.5 הרץ (איור 4).
  3. עבור רשתות ה-DNA סופיים של 5 × 6 × cDAO-c64nt-O ו- 5 6 cDAO-c74 & c84nt-O, להפקיד µL 80 1 x TAE· מאגר מ ג על משטח נציץ cleaved טרי. µL 5 דוגמאות סופיים להוסיף למאגר. להשאיר למשך 2 דקות בשביל ספיחה של רשתות ה-DNA אל פני השטח נציץ. להוסיף עוד 50 µL 1 x TAE· מאגר מ ג על החללית AFM.
  4. להשיג AFM תמונות של סורגים DNA סופיים בנוזל על-ידי סריקת פני השטח נציץ עם הגששים AFM משולש תחת במצב הקשה. להגדיר את הפרמטרים הבאים עבור סריקה: סריקה בגודל של 0.5-1 מיקרומטר, לסרוק ברזולוציה של 256 קווי, וסרוק בשיעור של 1.5 Hz (איור 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ה-DNA מעגלי נע לאט יותר ה-DNA ליניארי שלו קודמן denaturing דף (איור 2) כי הנקבובית את ה-dna מעגלי הוא שחדר, מפגר מאת ג'ל הסיבים23,24,25. יעילות התגובה מצדו הנכון עבור oligo-מונומר cyclization תלוי המצע רצף, ריכוז, טמפרטורת התגובה, זמן, וכו '. כמו הריכוז של הקדמה DNA ליניארי גבוה מספיק מיקרומטר בסביבות 3.5, המוצרים cyclization של c64nt (או c84nt), ההתייחסות קודמן פרוטוקול זה יכול להיות ישירות מוצלל כרצועות בצלחת TLC תחת אור UV בלי למות. אם הלהקות של DNA מעגלי מעורפלות או בלתי נראה, המציין כשל של התגובה מצדו או תשואה מוצר נמוך יותר. לפעמים יש שתי להקות מעל הלהקה קודמן ליניארי, בהתייחס טבעת oligo-דיימר נוספים מלבד הטבעת הנכונה oligo-מונומר. . פשוט תעזוב את הלהקות גבוה ולאסוף התחתונות. ניתן לראות את המוצרים DNA מעגלי מטוהרים אבקה לבנה בצינור לאחר ייבוש ואקום. למעט הדף denaturing, טוהר דנ א גם ניתן למדוד באמצעות ספקטרומטר UV. שיא הקליטה של ה-DNA הוא 260 ננומטר. שני הקריטריונים הסטנדרטיים טוהר DNA הן היחס הקליטה של 280 ננומטר/260 nm ב 1.8 של 280 ננומטר nm/230 בדרך כלל בטווח של 2.0-2.2. אם היחס שתי לעיל לסטות מהערכים סטנדרטי, השרידים צריך להיות מופקים שוב 1.18 השלבים הבאים-1.20. התשואות של c64nt ו c84nt עבור cyclization הנכון oligo-מונומר נמדדים טווח 30-60% על פי פרוטוקול זה.

ניתוח דף יליד מספק הרבה מידע אודות מצב הרכבה של מונומר או פולימר, קשיחות, טוהר, היציבות של המוטיב ועוד (איור 3). המשפחות הרכבה c64nt של c64bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, cDAO-c64nt acDAO-c64nt יש רק אחד הלהקה ברור ונקי עבור כל הרכבה, המייצגים הם מוטיבים מונומר יציב. כל המשפחות הרכבה c84nt של אריחים HJ-c84nt tHJ-c84nt, cDAO-c84nt יש מריחות סביב להקות הראשי שלהם, המציינת את תוצרי לוואי משנית חוץ המוטיבים מונומר היעד. ללא קשר לוואי משנית של שגוי עמיתים, הניתנים להרכבה מעולה cDAO-c84nt-O (E) פומפיה עם תפוקה גבוהה. כדי לקבל תמונה ברורה ונקייה אלקטרופורזה, טעינת אמצעי האחסון צריך להיות לא יותר מ 10 µL ואת כמות הדנ א צריך להיות 0.01 ~ 0.02 µg/mL.

ההצלחה של ניסויים ולבסוף מוערך על-ידי nanostructures DNA 1 י ו- 2D עם תמונה על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי (איור 4 , איור 5). כל הרכבה יש תכונות מורפולוגיות משלו בסולם מיקרומטר כגון nanowires, צינורות, nanospirals, nanoribbons, וכו '. יתר על כן, הטקסטורות מפורט של ההרכבות DNA בסולם ננומטר בקורלציה לגודלן אריח מעגלית תיאורטי, הארגון מצבי טוב מאוד בהתאמה הם המפתח עבור אימות של הרכבה מוצלחת ונכונה. לכן, יש להשיג תמונות AFM פנורמי והן ברזולוציה גבוהה במיקרומטר ו ננומטר. הבחירות של AFM שיטות וזונדים מכריעים לתמונות AFM באיכות גבוהה. הכוח הסריקה צריך להיות מותאם מהן קטנות 50 pN26. אם הכוח הסריקה הוא גדול מדי, זה היה פוגע הדפוסים nanostructural דנ א. ניקיון סביבתי הוא פרמטר מפתח אחר לצאת נקי ויפה תמונה ברזולוציה גבוהה AFM בנוזל. כל מאגרי חייב להיות מסונן על-ידי מסנן מיקרומטר 0.22; המכשיר מחזיק, פינצטה חייב להיות בידי דטרגנט ושטף במים יונים. אם הסביבה מזוהם על ידי פסולת חלקיקים, קצה המקדח ניזוקה או נצמדה על ידי חלקיקים במאגר, ובכך משפיע על האיכות של AFM תמונות.

Figure 1
איור 1 . סינתזת ה-DNA מעגלי. תזרים מייצג איך מתפתח זמן 5'-phosphorylated oligonucleotide ליניארית בכחול כדי מולקולה DNA מעגלי. שני הגדילים אדום קצר מייצגים את oligonucleotides סד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 . Denaturing דף צילום של ה-DNA cyclization מוצרים תחת אולטרא סגול בלי למות. להקה DNA ליניארי 64nt קודמן הוא השביל שמאל, מוצריה cyclization של 64nt מעגלית דנ א (c64nt) מופיעים כרצועות 9-האופקי באותה רמת סמטאות 9 אחרים. הלהקות 9 של c64nt תהיה מנותקת עבור בהסתרה מעגלית DNAs. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3- יליד דף תמונות לאחר מודלים כפול-הסליל הגוסס סכמטי של אריחים מעגלית. שני פולימרים של ננו-חוט c64nt, ננו-חוט c84nt מיוצגים על ידי הפשוטה מתקפלים יחידת התאים שלהם, שבו השניים מיושר הנקודות לעיל מתחת לכל תא יחידה לציין את היישור אינסופי של יחידת תאים אנכי למעלה ואני למטה, עם מרחקים שווים בין דופלקסים כדי nanowires טופס. אריחים מעגלית מונומר של c64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, HJ-c84nt tHJ-c84nt ב א) יש אין המסוכך בולטות מתוך טבעות שלהם, בעוד cDAO-c64nt acDAO-c64nt, cDAO-c84nt ב) יש שני הסתיימה בלאנט 10 bp המסוכך בהתאמה. עבור רצפים, עיין בטבלה של רצפי דנ א. איור זה השתנה מ שפורסמו בעבר איור17אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
באיור 4. AFM תמונות של טיפוסי 1 י ו- 2D אינסופי הרכבות ה-DNA שנסרקו באוויר. א) c64nt ננו-חוט אינסופי ב) acDAO-c64nt-E, אינסופי ג) cDAO-c64nt-E, אינסופי ד) cDAO-c64nt-O, E) אינסופי cDAO-c84nt-E, F) אינסופי cDAO-c84nt-O הם annealed מאת סופך לכידות. כל הפרטים מרקם בתמונות AFM אלה עולים בקנה אחד עם אריחים בגדלים של הארגון מצבי טוב מאוד. עבור רצפים, עיין בטבלה של רצפי דנ א. איור זה השתנה מ שפורסמו בעבר איור17אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 . AFM תמונות מכלולים מלבן סופיים שנסרקו בנוזל. הרכבה סופית מלבן של א) 5 × 6 cDAO-c64nt-O הוא מורכב של אריחים תת 32 cDAO-c64nt, ו cDAO × 6 ב) 5-c74 & 84nt-O מורכב cDAO 12-c74nt ו- 20 אריחים תת cDAO-c84nt. עבור רצפים, עיין בטבלה של רצפי דנ א. איור זה השתנה מ שפורסמו בעבר איור17אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

טבלה של רצפי דנ א. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקולים הציג באופן זה דגש במאמר על הסינתזה של מולקולות DNA מעגלי קטנות, ההרכבה של דנ א nanostructures. רוב העיצובים DNA וסודרו באופן אקראי ניתן להשתמש בפרוטוקול זה. טוהר DNAs מעגלית היא קריטית להצלחת הרכבות ה-DNA. ניתן לשפר את התשואה הפקה של cyclization על-ידי הורדת הריכוז של DNA ליניארי 5'-phosphorylated; עם זאת, זה יהיה להגדיל את עומס העבודה כדי לייצר כמויות זהה של DNAs מעגלית. האורך של גדילי הדנ א סד משפיעה גם על התגובה הנכונה מצדו, זה ממוטבת כדי להיות בסביבות 20 נוקלאוטידים זמן הן c64nt והן c84nt.

הריכוז המתאים של קטיונים מגנזיום (למשל., 12.5 מ מ) בפתרון במהלך ואחרי הרכבה חשוב מאוד היווצרות ותחזוקה של דנ א nanostructures. לכן, ריכוז הקטיון מגנזיום של 12.5 מ מ נשמרת תמיד במהלך תהליכי חישול, יליד דף, agarose בג'ל, פג מאגר צנטריפוגה purifications, הדמיה AFM, וכו '.

עבור הרכבות מלבן סופיים של 5 × 6 cDAO-c64nt-O, 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O, הטיהור ג'ל agarose אינו משפיע על הפרטים מרקם, בזמן הטיהור צנטריפוגה מאגר פג פוגעת הפרטים מרקם של דנ א nanostructures ב AFM תמונות ברזולוציה גבוהה.

תנצלו היציבות ואת קשיחות של אריחים מעגלית, זה הרבה יותר קל לייצר מאורגן היטב, פומפיה 2D גבישי יחיד גדול ממודולים מעגלית מאשר אריחים ליניארי, אוריגמי scaffolded9,11, למרות עבודה נוספת יש צורך לסנתז ולטהר את מולקולות DNA מעגלי. עם ה-DNA מעגלי אחד בלבד כמו באותו מבנה ליבה, ורבים מודולים המעגלית יכול להיווצר עם המסוכך שונים; על-ידי cohesions סופך ספציפי של המסוכך על nanostructures סופי יכול להיות בנוי; אסטרטגיה זו מצמצמת את עומס העבודה והעלות של nanostructures סופיים. יתרון משמעותי אחד nanostructures ה-DNA מעגלי הוא הרזולוציה של מבנים משניות ושלישוניות של מולקולות DNA ורכיבי מפתח שלהם כגון הולידיי צומת מן הפרטים מרקם של סורגים גבישי יחיד. 1 י, nanostructures מימד בנוי מ מודולים מעגלית ושימושיהם פוטנציאליים ב ביולוגיה, רפואה ו ננו-הנדסה יהפוך בן משפחה חדש של ננוטכנולוגיית דנ א בעתיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgments

. אנחנו אסירי תודה על התמיכה הכספית של NSFC (מענקים מס ' 91753134 ו- 21571100), ואוניברסיטת מדינת מפתח מעבדה של Bioelectronics של דרום-מזרח.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T4 ligase TaKaRa 2011A
T4 buffer TaKaRa 2011A
TE buffer Sangon B548106
Thermo bottle Thermos SK-3000
Thermo cycler Bio Gener GE4852T
Exonuclease I TaKaRa 2650A
Exonuclease I buffer TaKaRa 2650A
30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) Sangon B546016
TAE premix podwer Sangon B540023
Mg(Ac)2·4H2O Nanjing Chemical Reagent C0190550223
Urea Sangon A510907
TEMED BBI A100761
Ammonium Persulfate Nanjing Chemical Reagent 13041920295
Power supply Beijing Liuyi DYY-8C
Water bath Sumsung DK-S12
Formamide BBI A100314
DNA Marker (25~500 bp) Sangon B600303
DNA Marker (100~3000 bp) Sangon B500347
Loading buffer Sangon B548313
PAGE electrophoresis systerm Beijing Liuyi 24DN
Filter ASD 5010-2225 0.22 µM
UV imaging System Tanon 2500R
n-butanol Sangon A501800
Absolute Ethanol SCR 10009257
NaOAc Nanjing Chemical Reagent 12032610459
Centrifuge eppendorf Centrifuge 5424R
Vacuum concentrator CHRIST RVC 2-18
Ultraviolet spectrum Allsheng Nano-100
nucleic acid stain Biotium 16G1010 GelRed
Agarose Biowest G-10
Agarose electrophoresis systerm Beijing Liuyi DYCP-31CN
Heating Plate Jiangsu Jintan DB-1
TBE premix podwer  Sangon B540024
filter column Bio-Rad 7326165 Freeze 'N Squeeze column
AFM Bruker Dimension FastScan
PEG8000 BBI A100159
Mica Ted Pella BP50
triangular AFM probe in air Bruker FastScan-C
triangular AFM probe in fulid Bruker ScanAsyst-fluid+
DNA strands Sangon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsu-Ju, F., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32, (13), 3211-3220 (1993).
  2. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394, (6693), 539-544 (1998).
  3. Liu, F., Sha, R., Seeman, N. C. Modifying the surface features of two-dimensional DNA crystals. Journal of the American Chemical Society. 121, (5), 917-922 (1999).
  4. Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301, (5641), 1882-1884 (2003).
  5. Liu, D., Wang, M., Deng, Z., Walulu, R., Mao, C. Tensegrity: Construction of rigid DNA triangles with flexible four-arm DNA junctions. Journal of the American Chemical Society. 126, (8), 2324-2325 (2004).
  6. Tian, C., Li, X., Liu, Z., Jiang, W., Wang, G., Mao, C. Directed self-assembly of DNA tiles into complex nanocages. Angewandte Chemie: International Edition. 53, (31), 8041-8044 (2014).
  7. Wang, P., et al. Retrosynthetic analysis-guided breaking tile symmetry for the assembly of complex DNA nanostructures. Journal of the American Chemical Society. 138, (41), 13579-13585 (2016).
  8. Ke, Y., Ong, L. L., Shih, W. M., Yin, P. Three-dimensional structures self-assembled from DNA bricks. Science. 338, (6111), 1177-1183 (2012).
  9. Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485, (7400), 623-626 (2012).
  10. Ke, Y., et al. DNA brick crystals with prescribed depths. Nature Chemistry. 6, (11), 994-1002 (2014).
  11. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, (7082), 297-302 (2006).
  12. Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459, (7245), 414-418 (2009).
  13. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325, (5941), 725-730 (2009).
  14. Ackermann, D., Schmidt, T. L., Hannam, J. S., Purohit, C. S., Heckel, A., Famulok, M. A double-stranded DNA rotaxane. Nature Nanotechnology. 5, (6), 436-442 (2010).
  15. Zheng, H., Xiao, M., Yan, Q., Ma, Y., Xiao, S. J. Small circular DNA molecules act as rigid motifs to build DNA nanotubes. Journal of the American Chemical Society. 136, (29), 10194-10197 (2014).
  16. Wang, M., Huang, H., Zhang, Z., Xiao, S. J. 2D DNA lattices constructed from two-tile DAE-O systems possessing circular central strands. Nanoscale. 8, (45), 18870-18875 (2016).
  17. Guo, X., Wang, X. M., Wei, S., Xiao, S. J. Construction of a holliday junction in small circular DNA molecules for stable motifs and two-dimensional lattices. ChemBioChem. 19, (13), 1379-1385 (2018).
  18. Holliday, R. A mechanism for gene conversion in fungi. Genet. Res. 5, (2), 282-304 (1964).
  19. Duckett, D. R., et al. The structure of the Holliday junction. Structure and Methods, Human Genome Initiative and DNA Recombination. 1, (1), 157-181 (1990).
  20. Ariyoshi, M., Vassylyev, D. G., Iwasaki, H., Nakamura, H., Shinagawa, H., Morikawa, K. Atomic structure of the RuvC resolvase: A holliday junction-specific endonuclease from E. coli. Cell. 78, (6), 1063-1072 (1994).
  21. Eichman, B. F., Vargason, J. M., Mooers, B. H., Ho, P. S. The Holliday junction in an inverted repeat DNA sequence: sequence effects on the structure of four-way junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (8), 3971-3976 (2000).
  22. Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie: International Edition. 53, (47), 12735-12740 (2014).
  23. de Gennes, P. G. Reptation of a polymer chain in the presence of fixed obstacles. The Journal of Chemical Physics. 55, (2), 572-579 (1971).
  24. Slater, G. W., Noolandi, J. New biased reptation model for charged polymers. Physical Review Letters. 55, (15), 1579 (1985).
  25. Lilley, D. M. J. Analysis of branched nucleic acid structure using comparative gel electrophoresis. Quarterly Reviews of Biophysics. 41, (1), 1-39 (2008).
  26. Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve-based AFM. Nature Protocols. 9, (5), 1113-1130 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics