Motifs d’ADN stable, 1D et 2D Nanostructures construit à partir de molécules d’ADN circulaire petit

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Cet article présente un protocole détaillé pour ligature de T4 et de la dénaturation PAGE purification de petites molécules d’ADN circulaires, recuit et gel natif analyse de pages de tuiles circulaires, le montage et l’imagerie AFM de nanostructures ADN 1D et 2D, ainsi que d’agarose électrophorèse et centrifugation purification des nanostructures d’ADN finie.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Guo, X., Wang, X. M., Xiao, S. J. Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules. J. Vis. Exp. (146), e58744, doi:10.3791/58744 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Cet article présente un protocole détaillé pour la synthèse de petites molécules d’ADN circulaires, recuit de motifs d’ADN circulaire et la construction de nanostructures ADN 1D et 2D. Au cours des dernières décennies, l’essor des nanotechnologies ADN est attribuée à l’utilisation d’ADN linéaire comme les matériaux de source. Par exemple, la tuile DAO (double crossover, demi-tours antiparallèles, impaires) est bien connue comme un bloc de construction pour la construction de grilles d’ADN 2D ; la structure de base du DAO est issue de deux oligonucléotides monocaténaire linéaire (ss), comme deux cordes en faisant un nœud de granny main droite. Dans les présentes, un nouveau type de tuiles d’ADN appelé Badc (couplé DAO) sont construites en utilisant un petit ss-ADN circulaire de c64nt ou c84nt (circulaires 64 ou 84 nucléotides) comme le brin d’échafaudage et de plusieurs ss-DNAs linéaire comme les brins discontinues. Parfait nanostructures 1D et 2D sont assemblés à partir de Badc tuiles : nanofils infinie, nanospirals, nanotubes, nanorubans ; et finis nano-rectangles. Des protocoles détaillés sont décrites : préparation 1) par ligase T4 et purification par dénaturation PAGE (sur gel de polyacrylamide) des petits oligonucléotides circulaires, 2) recuit de tuiles circulaires stables, suivie de native analyse de PAGE, 3) assemblage de nanofils de 1D infinie, nanorings, nanospirals, infinies treillis 2D de nanotubes et nanorubans et finis 2D nano-rectangles, suivie d’imagerie de l’AFM (Atomic Force Microscopy). La méthode est simple, robuste et abordable pour la plupart des laboratoires.

Introduction

Molécules d’ADN ont été utilisés pour construire beaucoup de genres de nanostructures au cours des dernières décennies. Des motifs typiques incluent DAE (double croisé, antiparallèles, même demi-tours) et DAO carreaux1,2,3, tuiles étoiles4,5,6,7, simples Stranded (ss) carreaux8,9,10et ADN origami11,12,13. Ces motifs de l’ADN et les grilles sont assemblés à partir de ss-DNAs linéaire. Récemment, d’autres et nous avons rapporté l’utilisation de circulaires ss-oligonucléotides comme échafaudages pour construire des motifs, nanotubes 1D et 2D grilles14,15,16,17. En insérant un Holliday junction (HJ)18,19,20,21 au centre de c64nt, une paire de deux carreaux DAO couplés peut être formé17. Ce nouveau motif Badc et ses dérivés sont stables et suffisamment rigide pour assembler 2D ADN grilles jusqu'à 3 × 5 µm2. Dans cet article, nous utilisons un terme de « dalle circulaire », qui est définie comme une molécule stable de complexes ADN construite avec un échafaudage circulaire et autres agrafes linéaires des ss-oligonucléotides, et un nouveau mandat de « carreau linéaire », qui est construit à partir d’un ensemble complet de linéaire SS-oligonucléotides.

Ce protocole montre comment construire cinq sortes de nanostructures d’ADN avec des petites molécules d’ADN circulaires comme les échafaudages : 1) infinie nanofils de c64nt et c84nt de 1D, 2D Badc-c64nt-O 2) infinie et Badc-c64nt-E (-O représente un nombre impair de 5 demi-tours et-e représente un nombre pair de 4 demi-tours) grilles, 3) infinies 2D Badc-c84nt-O et Badc-c84nt-E grilles, 4) finis 2D 5 × 6 Badc-c64nt-O et les rectangles de Badc-c74 & 84nt-O 5 × 6, 5) infinie 1D acDAO-c64nt-E nanorings et nanospirals (Veuillez vous reporter à Figure 3-5 pour les schémas et images des cinq sortes de nanostructures ADN ci-dessus). Les nanofils de 1D c64nt et c84nt sont assemblés à partir de chaque échafaudage c64nt et c84nt associé respectivement avec deux agrafes linéaires. Chaque tuile circulaire de Badc-c64nt, acDAO-c64nt, Badc-c74nt ou c84nt-Badc est recuit de son échafaudage correspondant de c64nt, c74nt ou c84nt avec quatre agrafes linéaires respectivement. Les treillis 2D infinies sont assemblés à partir du même type de deux tuiles circulaires avec différentes séquences. Les deux grilles rectangle 2D finis sont assemblés de deux ensembles de tuiles sous circulaires 32 respectivement. Pour économiser de l’argent, c84nt, c74nt et c64nt seulement un séquencée est utilisé comme l’échafaud respectif tandis que différents porte-à-faux servent de recuire les 32 Badc-c64nt Badc-c74nt 12 et 20 Badc-c84nt circulaire sous tuiles respectivement dans la première étape de recuit sous tuile, puis mélanger 32 tuiles sous circulaires correspondantes et appliquer le deuxième treillis recuit étape visant à regrouper le finis 5 × 6 Badc-c64nt-O et 5 × 6 grilles Badc-c74 & 84nt-O, respectivement. Certainement, séquencés différemment des échafaudages circulaires peuvent être adoptées pour assembler une variété de nanostructures de taille finie, mais il vous en coûtera plus d’argent et labeurs. L’infini 1D acDAO-c64nt-E nanorings et nanospirals sont recuits de celui-séquencé asymétrique acDAO-c64nt tuiles avec des connexions linéaires d’un nombre pair de 4 demi-tours. Il existe deux approches pour assembler des grilles 2D infinies de tuiles circulaires de Badc-c64nt et Badc-c84nt, qui se distinguent par les distances mezhizraztsovye d’un nombre pair de 4 et un nombre impair de 5 demi-tours respectivement. Le premier exige que tous les carreaux doivent être alignés de manière identique ; cette dernière nécessite l’alternance des visages de deux tuiles voisines le long des axes hélicoïdes. Si la tuile est rigide et plane, comme Badc-c64nt, les deux approches générera nanorubans planaire ; Si la tuile est courbée vers une seule direction, tels que Badc-c84nt, la mezhizraztsovye connexion d’un nombre pair de 4 demi tours vont générer des nanotubes, tandis que la connexion mezhizraztsovye d’un nombre impair de 5 demi tours produira planaire nanorubans due à l’élimination des influencé par courbure de croissance par l’autre alignement des tuiles. Le succès de l’Assemblée des nanostructures d’ADN 1D et 2D de tuiles circulaires indique plusieurs avantages de cette nouvelle approche : forcée de stabilité et de rigidité des tuiles circulaires sur les carrelages linéaires, chiral carreaux pour l’assemblage des nanostructures asymétrique tels que nanorings et nanorubans, nouvelles visions sur la compréhension de la mécanique de l’ADN et les structures moléculaires, les etc..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. préparation d’ADN circulaire

  1. Utilisez tous les ADN linéaire fourni par les sociétés commerciales directement, sans davantage de purification.
  2. Centrifuger les échantillons d’ADN à 5 000 × g pendant 5 min recueillir toutes les pastilles d’ADN au fond des tubes. Ajouter un volume suffisant de tampon TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) pour dissoudre l’ADN.
  3. Mesurer la concentration de « a » ng/µL de chaque solution de ss-ADN à l’aide d’un spectromètre UV micro à 260 nm. Convertir les « a » ng/µL en « b » µM suivant b = a × 103 / (chapelet de poids moléculaire de l’ADN). Ajuster la quantité de solution de TE faire une solution stock de 10 µM ADN.
  4. T4 DNA ligase permet de relier les extrémités 3' et 5' des 5'-phosphorylés linéaires gabarits d’ADN ( Figure 1) de c64nt, de c74nt et de c84nt fournie par des entreprises commerciales directement.
  5. Mélanger le brin d’ADN linéaire 5'-phosphorylés (3,5 µM) et son brin d’ADN correspondant attelle (4,5 µM) dans 80 µL de tampon de TE dans un tube à essai 200 µL de la PCR,15. Incuber le tube dans une bouteille thermo ouvert rempli d’eau 95 ° C. Refroidir l’eau chaude à température ambiante (25 ° C) pendant environ 2-3 heures sous l’atmosphère de laboratoire.
  6. Ajouter 10 µL de tampon de x T4 10 (660 mM Tris-HCl, 66 mM MgCl2, 100 mM DTT, ATP de 1 mM) et 10 µL de T4 ligase (300 U/µL) au mélange pour un volume final de 100 µL. incuber le mélange dans un thermocycleur pendant 16 heures à 16 ° C.
    Remarque : Ces concentrations d’ADN et le volume de la réaction de ~ 100 µL sont optimisées pour l’efficacité de la ligature haute et le rendement élevé de cyclisation de bon oligo-monomère. Exécuter deux ou plusieurs tubes de réactions de ligature en même temps selon le protocole expérimental. Une procédure alternative d’incubation pour l’étape de remplacement ligature 1.6 est de 4 heures à 25 ° C.
  7. Après l’incubation, inactiver la ligase T4 dans l’eau 95 ° C pendant 5 minminutes. Transférer le tube dans un bain d’eau glacée, puis incuber pendant 5 minutes pour refroidir.
  8. Ajouter 10 µL de 10 x exonucléase j’ai de la mémoire tampon et 10 µL de l’exonucléase j’ai (5 U/µL) au mélange trempé et incuber les tubes à 37 ° C au bain-marie pendant 30 min à digérer l’ADN linéaires restants de manière sélective et laisser les φh1 ADN intact.
  9. Préparer une dénaturation gel PAGE de 10 %.
    1. Porter des lunettes et des gants en caoutchouc lors de la préparation du gel de PAGE sous la hotte. Ajouter 6,67 mL de solution d’acrylamide/bisacrylamide 30 % (p/v) (19:1), 2 mL de 10 x TAE· Tampon de mg (40 mM Tris, 40 mM HAc, 1 mM EDTA, pH 8,0, 12,5 mM Mg(Ac)2), 8,4 g d’urée (7 M) et de l’eau déionisée pour un volume final de 20 mL dans un tube à centrifuger 40 mL.
      Attention : La solution d’acrylamide/bisacrylamide solution (19:1) 30 % (p/v) est toxique.
    2. Ajouter 20 µL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) et 100 µL de persulfate d’ammonium (APS, 10 % p/v) à 40 mL de tube avant transfert la solution pour le système d’électrophorèse de gel immédiatement. Insérer un 1,5 mm d’épaisseur et un peigne de 10 puits. Attendre au moins 20 min jusqu'à ce que la solution de gel est solidifiée.
    3. Définir une tension constante de 80 V pour un gel de 85 × 80 × 1,5 mm3 (largeur × hauteur × épaisseur). Ajouter 1 x TAE· Tampon de mg pour le système d’électrophorèse et prerun le gel pendant 20 min à 10 V/cm.
  10. Mettre le tube à essai PCR étape 1.8 à 95 ° C d’eau pendant 5 min inactiver exonucléase j’ai. Transférer le tube dans un bain d’eau glacée, puis incuber pendant 5 min.
  11. Ajouter 20 µL du formamide dans le tube pour un volume final de 140 µL et mélanger la solution. Distribuer la solution à 7-9 PAGE dénaturation gel puits pied d’égalité avec les 16-20 µL de chaque gel bien. Mélanger 2 µL de colorant (bleu de bromophénol 0.05 %, 0,05 % de xylène cyanol FF, 60 % de glycérol, 10 mM Tris-HCl, 60 mM EDTA, pH 7,6) avec 8 µL de l’ADN linéaire correspondante de précurseur de chargement (10 µM) et injecter le mélange à un puits distinct pour référence.
    Remarque : L’ajout de formamide est d’augmenter la densité de la solution de chargement pour couler vers le bas du gel PAGE bien et aussi pour dissocier certaines double brin résidus ADN.
  12. Exécutez le gel pendant environ 2 h à 10 V/cm et arrêter l’exécution lorsque le xylène cyanol FF est à la position 2/3 de la plaque de verre à le œil nu.
  13. Porter des gants en caoutchouc et des lunettes pour protéger les peaux et les yeux. Prendre le gel hors de la plaque de verre. Placer le gel sur une plaque fluorescente de TLC (chromatographie sur couche mince). Couper les bandes de gel cible par une lame de rasoir sous le nom exactement comme occultée par irradiation aux rayons UV (Figure 2).
    Attention : La lumière UV est nocive pour les yeux et les peaux.
    Remarque : Sous irradiation UV à 254 nm, ADN absorbera la lumière et jeté une ombre sur la plaque de TLC. L’ADN circulaire a couru un peu plus lentement que son ADN linéaire correspondante de précurseur. Certains DNAs linéaire non digérés et indésirables ADN circulaire en petites quantités qui entourent la bande ombrée cible pollueront l’ADN circulaire, si elles sont collectées.
  14. Transférer les bandes de gel dans un tube de microtubes de 2,0 mL. Sécher à l’air ou un coup sec les bandes de gel et puis écrasez les gels en pâte par une spatule ou une baguette de verre plat. Veillez à ce que le gel a été complètement écrasé en une pâte, qui est essentielle pour le rendement élevé d’ADN circulaire. Ajouter deux fois de l’eau désionisée gel dans le tube et agiter le tube à température ambiante pendant la nuit.
  15. Filtrer le mélange pour récupérer le surnageant dans un tube de microtubes de 2,0 mL. Récupérer tout ADN résiduel en rinçant à faible volume d’eau déminéralisée et filtre pour combiner les surnageants.
  16. Extrait de l’éluant à volume égal de n-butanol. Répétez cette procédure jusqu'à ce que le volume aqueux est réduit à environ 200 µL.
  17. Ajouter 500 µL d’éthanol absolu (−20 ° C) et 20 µL de 3 M Acona (pH 5.1) au mélange pour la précipitation de l’ADN. Ranger le tube à −20 ° C pendant 30 min.
  18. Centrifuger le tube à 12 000 x g pendant 10 min à 4 ° C, éliminer le surnageant. Le précipité restant étant l’ADN est environ 100 µL dans le tube.
  19. Ajouter 600 µL d’éthanol 75 % (−20 ° C) dans le tube et stockez-le à −20 ° C pendant 30 min. Puis centrifuger à 12 000 × g pendant 10 min à 4 ° C, éliminer le surnageant. Le précipité restant étant l’ADN est environ 100 µL de solution dans le tube à nouveau. Répétez l’opération deux fois.
  20. Après la centrifugation dernier, jeter le surnageant autant que possible. Sécher les restes avec une pompe à vide.
  21. Stocker l’ADN circulaire purifiée dans le tube à −20 ° C.
  22. Remettre en suspension l’ADN circulaire dans la mémoire tampon de TE faire une 10 µM circulaire ADN solution selon l’étape 1.3 lorsque nécessaire.

2. recuit de Solutions d’assemblage

  1. Préparer chaque tuile ou nanostructure solution d’assemblage de c64bp, c84bp, HJ-c64nt, AC-c64nt, HJ-c84nt, Tremblay-c84nt, Badc-c64nt, acDAO-c64nt, Badc-c84nt, c64nt, c84nt et acDAO-c64nt-E avec un ensemble conçu d’ADN linéaire et circulaire pour un pot de recuit.
    1. Pour chaque solution d’assemblage, mélanger 2 µL de 10 x TAE· Tampon de mg, de 1 µL de chaque solution mère de l’ADN d’un ensemble de brins linéaires et circulaires dans des rapports molaires égales et tampon TE supplémentaire dans un tube à essai PCR 200 µL à une concentration finale de chaque brin à 0,5 µM et un volume final de 20 µL. recuire la solution d’assemblage dans un bouteille thermo de 95 ° C à 25 ° C sur une période de 48 h.
  2. Préparer chaque solution d’assemblage de 2D treillis infinies de Badc-c64nt-E, Badc-c64nt-O, Badc-c84nt-E et Badc-c84nt-O avec un ensemble conçu d’ADN linéaire et circulaire de recuit en deux étapes.
    1. Préparer chaque solution d’assemblage sous tuile précurseur en mélangeant 2 µL de 10 x TAE· Tampon de mg, 1 µL de chaque solution mère de l’ADN d’un ensemble de brins linéaires et circulaires dans des rapports molaires égales et tampon TE supplémentaire dans un tube à essai PCR 200 µL à une concentration finale de 0,5 µM pour chaque brin et un volume final de 20 µL. Dans la première étape de recuit sous tuile, recuire chaque solution sous tuile de précurseur dans un thermocycleur PCR à l’aide d’une méthode de refroidissement rapide-linéaire de 95 ° C à 25 ° C sur une période de 2,5 h.
    2. Préparer chaque solution d’assemblage des grilles infinies quatre ci-dessus en mélangeant 10 µL de chacune des deux solutions sous tuile correspondant à une concentration finale de 0,25 µM pour chaque volet. Dans le réseau de deuxième étape de recuit, recuit le mélange 20 µL dans un thermocycleur PCR à l’aide d’une méthode de refroidissement lente de rester à 50 ° C pendant 2 h et refroidissement à un taux de 0,1 ° C par 5 minutes à 20 ° C, environ 24 heures au total.
      Remarque : Les deux expériences parallèles peuvent être exécutés simultanément ou ultérieurement dans la deuxième étape de recuit pour chaque réseau infini 2D.
  3. Préparer des solutions d’assemblage de deux ensembles finis rectangle de 5 × 6 Badc-c64nt-O et 5 × 6 Badc-c74 & c84nt-O de recuit en deux étapes.
    1. Préparer chaque solution d’assemblage sous tuile précurseur en mélangeant 1 µL de 10 x TAE· Tampon de mg, 0,5 µL de chaque solution mère de l’ADN d’un ensemble de brins linéaires et circulaires dans des rapports molaires égales et tampon TE supplémentaire dans un tube à essai PCR 200 µL à une concentration finale de 0,5 µM pour chaque brin et un volume final de 10 µL. Dans la première étape de recuit, recuit chaque solution sous tuile de précurseur dans un thermocycleur PCR à l’aide d’une méthode de refroidissement rapide-linéaire de 95 ° C à 25 ° C sur une période de 2,5 h.
    2. Préparer chaque solution d’assemblage treillis finis rectangle en mélangeant 32 x (2 µL de chaque solution sous tuile) ensemble dans un tube à essai PCR 200 µL à une concentration finale de ~ 15 nM pour chaque sous tuile et un volume final de 64 µL. Dans la deuxième étape de recuit, recuit le mélange 64 µL dans un thermocycleur PCR à l’aide d’une méthode de refroidissement lente de rester à 50 ° C pendant 2 heures et refroidir à raison de 0,1 ° C / 5 min à 20 ° C, environ 24 heures au total.
      NOTE : Cinq expériences parallèles peuvent être exécutés simultanément ou ultérieurement dans la deuxième étape de recuit pour chaque assembly rectangle finie.

3. native PAGE analyse

  1. Préparer un natif de 10 % PAGE suivante étape 1.9 à l’exception de la composante de l’urée.
  2. Pour les échantillons de contrôle de c64bp et c84bp, ajouter 2 µL de chaque solution d’assemblage et de 1 µL de colorant à 3 µL de tampon TE de chargement comme témoins séparément. Pour chacun des autres assemblys répertoriés à la Figure 3, ajouter 1 µL de chaque solution d’assemblage et de 1 µL de colorant à 4 µL de tampon TE de chargement.
  3. Chacune des solutions ci-dessus à un gel injecter bien. Ajouter 5 µL de marqueur d’ADN (25-500 bp) à un puits distinct pour référence.
  4. Exécutez le gel pendant environ 4 heures à 10 V/cm dans un bain d’eau glacée. Le xylène cyanol FF va manquer de la plaque de verre.
  5. Porter des gants en caoutchouc et des lunettes pour protéger les peaux et les yeux. Prendre le gel hors de la plaque de verre et plongez-le dans 100 mL d’eau désionisée à 10 µL d’une tache de gel d’acide nucléique pendant 30 min.
    Attention : La solution de tache de gel d’acide nucléique est toxique.
  6. Observer le gel sous une UV système d’imagerie et de prendre une photo du gel coloré (Figure 3).

4. la purification des réseaux finis

  1. Préparer un gel d’agarose à 2 % natifs pour la purification de l’électrophorèse des réseaux finis.
    1. Mélanger 1 g d’agarose en poudre, 5 mL de 10 x TBE· Tampon de mg (89 mM Tris, 89 mM 2 mM EDTA, l’acide borique, pH 8,0, 12,5 mM Mg(Ac)2), 2 µL d’acide nucléique gel teinté et 47,5 mL d’eau désionisée dans un flacon 250 mL en triangle. Faire bouillir le mélange jusqu'à ce que les bulles deviennent petites et denses. Ajouter l’eau chaude dans la bouteille d’un volume total de 50 mL et une concentration d’agarose à 2 %.
    2. Portez des gants épais. Verser la solution de gel dans une boîte en plastique gel de 7 x 10 x 1 cm3 (largeur × longueur × épaisseur). Insérer un peigne de gel épais et 12 puits de 1,5 mm. Attendez que le gel se refroidir à température ambiante. Si nécessaire, placer le gel dans un réfrigérateur à 4 ° C.
      Attention : Soyez conscient de brûlures car la solution est très chaude.
    3. Ajouter 0,5 x TBE· Tampon de mg dans le système d’électrophorèse. Prerun le gel à 5 V/cm pendant 20 min dans un bain d’eau glacée à une tension constante de 50 volts.
    4. Injecter 20 µL de la solution de treillis finis bien préparée à l’étape 2.3 dans chaque gel d’agarose et ajouter 5 µL d’un marqueur d’ADN (100-3 000 bp) à un autre bien. Exécutez le gel pendant 2 h à 5 V/cm dans un bain d’eau glacée.
    5. Porter des gants en caoutchouc et des lunettes pour protéger les peaux et les yeux. Coupe la cible gel bandes avec une position similaire à la marque bp 1 000 sous la lumière UV et tranche en belles pièces et placer les gels écrasées dans un filtre de colonne8.
    6. Centrifuger la colonne à 2 000 x g pendant 5 min à 4 ° C. Extrait de la solution de l’échantillon par le biais de la colonne. Recueillir la solution d’imagerie de l’AFM.
  2. Purifier les réseaux finis par précipitation de PEG.
    1. Mélanger 50 µL de la solution de treillis finis préparée à l’étape 2.3 avec un volume égal de 15 % PEG8000 (p/v) de la mémoire tampon (20 mM Mg(Ac)2, 5 mM Tris, EDTA 1 mM et 505 mM NaCl)22. Centrifuger la solution à 18 000 × g à 4 ° C pendant 30 min.
    2. Retirez le surnageant et ajouter 100 µL de tampon de PEG. Répétez la centrifugation.
    3. Après avoir retiré le liquide surnageant, dissoudre le culot dans 1 x TAE· Tampon de mg pour l’imagerie de l’AFM.
      Remarque : La Purification est nécessaire pour les treillis finis de 5 × 6 Badc-c64nt-O et 5 × 6 Badc-c74 & c84nt-O pour l’imagerie de l’AFM et autres applications. Si le rendement est trop faible, augmenter la vitesse de centrifugation. Si le produit n’est pas assez pur, répétez l’étape 4.2.2.

5. AFM imagerie

  1. Pour c64nt des nanofils, nanofils c84nt, acDAO-c64nt-E, infinies treillis 2D de cDAO-c64nt-E(O) et cDAO-c84nt-E(O), déposent 2 μL d’échantillon recuit sur une surface fraîchement clivé mica. Laisser pendant 2 min pour l’adsorption des grilles de l’ADN à la surface de mica. Laver la surface avec 100 µL d’eau déminéralisée et sécher à l’air comprimé.
  2. Obtenir des images AFM d’infini grilles d’ADN dans l’air par balayage de la surface de mica avec des sondes AFM triangulaires sous écoutes mode. Définissez les paramètres suivants pour la numérisation : scan taille de 0,5 ~ 5 µm, résolution de 512 lignes de scan et scan taux de 3,5 Hz (Figure 4).
  3. Pour les réseaux ADN finis de 5 × 6 Badc-c64nt-O et 5 × 6 Badc-c74 & c84nt-O, dépôt 80 µL de 1 x TAE· Tampon de mg sur une surface fraîchement clivé mica. Puis ajouter 5 µL des échantillons finis dans la mémoire tampon. Laisser pendant 2 min pour l’adsorption des grilles de l’ADN à la surface de mica. Ajouter un autre 50 µL de 1 x TAE· Tampon de mg sur la sonde de l’AFM.
  4. Obtenir des images AFM de réseaux finis d’ADN dans le liquide en balayant la surface de mica avec des sondes AFM triangulaires sous écoutes mode. Définissez les paramètres suivants pour la numérisation : scan taille de 0,5 à 1 µm, résolution de 256 lignes de scan et scan de fréquence de 1,5 Hz (Figure 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

L’ADN circulaire se déplace légèrement plus lent que son ADN linéaire de précurseur en dénaturant PAGE (Figure 2) parce que le pore à l’intérieur de l’ADN circulaire est pénétré et retardé par gel fibres23,24,25. L’efficacité de réaction de ligature correcte de cyclisation de l’oligo-monomère dépend de la séquence de substrat et concentration, température, temps, etc.. Comme la concentration d’un précurseur de l’ADN linéaire est assez élevé à environ 3,5 µM, les produits de cyclisation de c64nt (ou c84nt) et la référence de précurseur dans le présent protocole peut être occulté directement sous forme de bandes dans la plaque TLC sous une lumière UV sans mourir. Si les bandes d’ADN circulaire sont vagues ou invisible, indiquant une défaillance de la réaction de ligature ou un rendement beaucoup produit faible. Parfois, il y a deux bandes au-dessus de la bande linéaire précurseur, se référant à un anneau supplémentaire oligo-dimère sauf pour la bague de bon oligo-monomère. Il suffit de laisser les bandes supérieures seul et recueillir les inférieures. Les produits purifiés d’ADN circulaires peuvent être vu sous forme de poudre blanche dans le tube après séchage sous vide. À l’exception de la PAGE de dénaturation, la pureté de l’ADN peut également être mesurée par spectromètre UV. Le pic d’absorption de l’ADN est à 260 nm. Deux critères standards pour la pureté de l’ADN sont le ratio d’absorption de 280 nm/260 nm à 1,8 et celle de 280 nm/230 nm, généralement de l’ordre de 2,0 à 2,2. Si les deux ratios ci-dessus s’écartent des valeurs standard, les restes doivent être extraites à nouveau par les étapes suivantes 1.18-1.20. Les rendements de c64nt et c84nt pour la cyclisation de bon oligo-monomère sont mesurés à l’ordre de 30 à 60 % selon le présent protocole.

Analyse de PAGE native fournit beaucoup d’informations sur la stabilité du motif, de pureté, de rigidité, de mode d’assemblage de monomère ou polymère, etc. (Figure 3). Les familles de l’Assemblée c64nt de c64bp, HJ-c64nt, AC-c64nt, Badc-c64nt et acDAO-c64nt n’ont qu’une bande claire et propre pour chaque assembly, ce qui représente ce sont des motifs monomères stable. Alors que les familles de l’Assemblée c84nt de tuiles HJ-c84nt Tremblay-c84nt et Badc-c84nt ont frottis autour de leurs principaux groupes, indiquant des sous-produits mineures sauf pour les motifs monomères de cible. Quel que soit les mineurs sous-produits associés incorrect, excellents treillis (E) de Badc-c84nt-O avec des rendements élevés peuvent être assemblés. Pour obtenir une image claire et propre de l’électrophorèse, le volume de chargement doit être pas plus de 10 µL et la quantité d’ADN devrait être 0,01 ~ 0,02 µg/mL.

Le succès des expériences est enfin évalué en 1D et 2D ADN nanostructures imagé par AFM (Figure 4 et Figure 5). Chaque assembly possède ses propres caractéristiques morphologiques à l’échelle du micromètre tels que les nanotubes, nanospirals, nanorubans, nanofils, etc.. En outre, les textures détaillées des assemblys ADN dans l’échelle du nanomètre en corrélation avec leur taille de tuile circulaire théorique et des modes d’organisation très bien respectivement sont la clé pour la vérification d’assemblage efficace et correcte. Par conséquent, panoramiques et à haute résolution des images AFM en échelles micrométrique et nanométrique doivent être obtenues. Choix des méthodes de l’AFM et des sondes sont cruciales pour la haute qualité d’image AFM. La force de scan devrait être ajustée aussi petits que 50 pN26. Si la force de scan est trop grande, il endommagerait les patrons de nanostructure ADN. La propreté environnementale est un autre paramètre clé pour obtenir une image haute résolution de AFM propre et belle dans le liquide. Tous les tampons doivent être filtrés par le filtre de 0,22 µm ; le support de la sonde et la pince à épiler doit être lavé par le détergent et rincés à l’eau désionisée. Si l’environnement est pollué par les débris particulaires, l’extrémité de la sonde serait endommagée ou s’accrochait de particules dans la mémoire tampon, ce qui affecte la qualité des images de l’AFM.

Figure 1
Figure 1 . Synthèse de l’ADN circulaire. Le diagramme de flux représente l’évolution d’un oligonucléotide linéaire longue 5'-phosphorylés en bleu pour une molécule d’ADN circulaire. Les deux courts brins rouges représentent les oligonucléotides d’attelle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 . Photographie PAGE dénaturation des produits de cyclisation d’ADN sous ultraviolets sans mourir. Une bande d’ADN linéaire 64nt précurseur est dans la voie d’extrême gauche et ses produits de cyclisation de la circulaire 64nt (c64nt) ADN apparaissent sous forme de 9 bandes à l’horizontale de même niveau dans d’autres 9 voies. Les 9 bandes de c64nt seront coupées pour faire abstraction de l’ADN circulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
La figure 3. Photographies PAGE natif après des modèles double hélice mourants et schématiques de tuiles circulaires. Les deux polymères de nanofils de c64nt et c84nt des nanofils sont représentés par leurs cellules unitaires pliant plus simples, dans lequel les deux alignement points ci-dessus et ci-dessous chaque maille indiquent l’alignement infini des cellules unitaires verticalement jusqu'à et vers le bas, avec des distances égales entre duplex à nanofils de forme. Carreaux circulaire de monomère de c64bp, c84bp, HJ-c64nt, AC-c64nt, HJ-c84nt et Tremblay-c84nt en A) n’ont aucun porte-à-faux saillie hors de leurs anneaux, tandis que Badc-c64nt, acDAO-c64nt et Badc-c84nt dans B) ont deux émoussé-terminée 10 bp surplombs respectivement. Pour les séquences, veuillez consulter le tableau des séquences d’ADN. Ce chiffre a été modifié par un publiées antérieurement figure17S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
La figure 4. Images AFM d’assemblys ADN infinies typiques 1D et 2D scannés dans l’air. C64nt nanofil A), B) infinie acDAO-c64nt-E, C) infinie Badc-c64nt-E, D) infinie Badc-c64nt-O, E) infinie Badc-c84nt-E et F) infinie Badc-c84nt-O sont recuits de cohésion collant fin. Tous les détails de la texture dans ces images AFM concordent avec les tailles de tuile et les modes d’organisation très bien. Pour les séquences, veuillez consulter le tableau des séquences d’ADN. Ce chiffre a été modifié par un publiées antérieurement figure17S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 . Images AFM d’ensembles finis rectangle numérisées dans fluide. L’Assemblée finie rectangle A) 5 × 6 Badc-c64nt-O est composé de 32 Badc-c64nt sous tuiles et B) 5 × 6 Badc-c74 & 84nt-O se compose de 12 Badc-c74nt et 20 Badc-c84nt sous tuiles. Pour les séquences, veuillez consulter le tableau des séquences d’ADN. Ce chiffre a été modifié par un publiées antérieurement figure17S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Table de séquences d’ADN. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Les protocoles présentés en ce bref article sur la synthèse de petites molécules d’ADN circulaires et l’Assemblée des nanostructures de l’ADN. La plupart des modèles d’ADN séquencée au hasard peut être utilisée dans le présent protocole. La pureté de l’ADN circulaire est critique pour le succès des assemblées de l’ADN. Le rendement de production de cyclisation peut être amélioré en réduisant la concentration de l’ADN linéaire 5'-phosphorylés ; Toutefois, cela augmentera la charge de travail pour produire les mêmes quantités d’ADN circulaire. La longueur des brins d’ADN attelle affecte également la réaction de ligature correcte, il est optimisé pour être environ 20 nucléotides longs pour c64nt et c84nt.

Une concentration appropriée de cations magnésium (e.g., 12,5 mM) dans la solution pendant et après l’Assemblée est très importante pour la formation et le maintien des nanostructures de l’ADN. Ainsi, une concentration de cations magnésium de 12,5 mM est toujours conservée au cours du processus de recuit, natif de PAGE, sur gel d’agarose et PEG tampon des purifications de centrifugation, imagerie de l’AFM, etc.

Pour les ensembles finis rectangle de 5 × 6 Badc-c64nt-O et 5 × 6 Badc-c74 & 84nt-O, la purification de gel d’agarose n’affecte pas les détails de la texture, tandis que la purification de centrifugation de tampon PEG nuit les détails de la texture des nanostructures d’ADN dans la images de haute résolution AFM.

Bénéficier de la stabilité et la rigidité des tuiles circulaires, il est plus facile de produire bien organisée et grilles de 2D cristallin unique de grande taille de circulaire de modules de tuiles linéaires et origami structure9,11, bien que travail supplémentaire est nécessaire pour synthétiser et purifier les molécules d’ADN circulaires. Avec seulement un ADN circulaire comme la même structure de base, nombreux modules circulaires peuvent être générés avec des surplombs différents ; par le biais de cohésion fin collant spécifique des surplombs nanostructures finie peut être construit ; cette stratégie permet de réduire la charge de travail et le coût des nanostructures finie. Un avantage significatif de nanostructures d’ADN circulaire est la résolution de structures secondaires et tertiaires des molécules d’ADN et leurs éléments clés tels que la jonction de Holliday partir des détails de texture de trellis cristallins unique. Le 1D, nanostructures 2D et 3D, construit à partir de modules circulaires et leurs applications potentielles en nano-ingénierie, biologie et médecine deviendra un nouveau membre de la famille de la nanotechnologie de l’ADN à l’avenir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants pour le soutien financier de la FNSC (subventions no 91753134 et 21571100) et le laboratoire de clé en état de bioélectronique Southeast University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T4 ligase TaKaRa 2011A
T4 buffer TaKaRa 2011A
TE buffer Sangon B548106
Thermo bottle Thermos SK-3000
Thermo cycler Bio Gener GE4852T
Exonuclease I TaKaRa 2650A
Exonuclease I buffer TaKaRa 2650A
30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) Sangon B546016
TAE premix podwer Sangon B540023
Mg(Ac)2·4H2O Nanjing Chemical Reagent C0190550223
Urea Sangon A510907
TEMED BBI A100761
Ammonium Persulfate Nanjing Chemical Reagent 13041920295
Power supply Beijing Liuyi DYY-8C
Water bath Sumsung DK-S12
Formamide BBI A100314
DNA Marker (25~500 bp) Sangon B600303
DNA Marker (100~3000 bp) Sangon B500347
Loading buffer Sangon B548313
PAGE electrophoresis systerm Beijing Liuyi 24DN
Filter ASD 5010-2225 0.22 µM
UV imaging System Tanon 2500R
n-butanol Sangon A501800
Absolute Ethanol SCR 10009257
NaOAc Nanjing Chemical Reagent 12032610459
Centrifuge eppendorf Centrifuge 5424R
Vacuum concentrator CHRIST RVC 2-18
Ultraviolet spectrum Allsheng Nano-100
nucleic acid stain Biotium 16G1010 GelRed
Agarose Biowest G-10
Agarose electrophoresis systerm Beijing Liuyi DYCP-31CN
Heating Plate Jiangsu Jintan DB-1
TBE premix podwer  Sangon B540024
filter column Bio-Rad 7326165 Freeze 'N Squeeze column
AFM Bruker Dimension FastScan
PEG8000 BBI A100159
Mica Ted Pella BP50
triangular AFM probe in air Bruker FastScan-C
triangular AFM probe in fulid Bruker ScanAsyst-fluid+
DNA strands Sangon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsu-Ju, F., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32, (13), 3211-3220 (1993).
  2. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394, (6693), 539-544 (1998).
  3. Liu, F., Sha, R., Seeman, N. C. Modifying the surface features of two-dimensional DNA crystals. Journal of the American Chemical Society. 121, (5), 917-922 (1999).
  4. Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301, (5641), 1882-1884 (2003).
  5. Liu, D., Wang, M., Deng, Z., Walulu, R., Mao, C. Tensegrity: Construction of rigid DNA triangles with flexible four-arm DNA junctions. Journal of the American Chemical Society. 126, (8), 2324-2325 (2004).
  6. Tian, C., Li, X., Liu, Z., Jiang, W., Wang, G., Mao, C. Directed self-assembly of DNA tiles into complex nanocages. Angewandte Chemie: International Edition. 53, (31), 8041-8044 (2014).
  7. Wang, P., et al. Retrosynthetic analysis-guided breaking tile symmetry for the assembly of complex DNA nanostructures. Journal of the American Chemical Society. 138, (41), 13579-13585 (2016).
  8. Ke, Y., Ong, L. L., Shih, W. M., Yin, P. Three-dimensional structures self-assembled from DNA bricks. Science. 338, (6111), 1177-1183 (2012).
  9. Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485, (7400), 623-626 (2012).
  10. Ke, Y., et al. DNA brick crystals with prescribed depths. Nature Chemistry. 6, (11), 994-1002 (2014).
  11. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, (7082), 297-302 (2006).
  12. Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459, (7245), 414-418 (2009).
  13. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325, (5941), 725-730 (2009).
  14. Ackermann, D., Schmidt, T. L., Hannam, J. S., Purohit, C. S., Heckel, A., Famulok, M. A double-stranded DNA rotaxane. Nature Nanotechnology. 5, (6), 436-442 (2010).
  15. Zheng, H., Xiao, M., Yan, Q., Ma, Y., Xiao, S. J. Small circular DNA molecules act as rigid motifs to build DNA nanotubes. Journal of the American Chemical Society. 136, (29), 10194-10197 (2014).
  16. Wang, M., Huang, H., Zhang, Z., Xiao, S. J. 2D DNA lattices constructed from two-tile DAE-O systems possessing circular central strands. Nanoscale. 8, (45), 18870-18875 (2016).
  17. Guo, X., Wang, X. M., Wei, S., Xiao, S. J. Construction of a holliday junction in small circular DNA molecules for stable motifs and two-dimensional lattices. ChemBioChem. 19, (13), 1379-1385 (2018).
  18. Holliday, R. A mechanism for gene conversion in fungi. Genet. Res. 5, (2), 282-304 (1964).
  19. Duckett, D. R., et al. The structure of the Holliday junction. Structure and Methods, Human Genome Initiative and DNA Recombination. 1, (1), 157-181 (1990).
  20. Ariyoshi, M., Vassylyev, D. G., Iwasaki, H., Nakamura, H., Shinagawa, H., Morikawa, K. Atomic structure of the RuvC resolvase: A holliday junction-specific endonuclease from E. coli. Cell. 78, (6), 1063-1072 (1994).
  21. Eichman, B. F., Vargason, J. M., Mooers, B. H., Ho, P. S. The Holliday junction in an inverted repeat DNA sequence: sequence effects on the structure of four-way junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (8), 3971-3976 (2000).
  22. Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie: International Edition. 53, (47), 12735-12740 (2014).
  23. de Gennes, P. G. Reptation of a polymer chain in the presence of fixed obstacles. The Journal of Chemical Physics. 55, (2), 572-579 (1971).
  24. Slater, G. W., Noolandi, J. New biased reptation model for charged polymers. Physical Review Letters. 55, (15), 1579 (1985).
  25. Lilley, D. M. J. Analysis of branched nucleic acid structure using comparative gel electrophoresis. Quarterly Reviews of Biophysics. 41, (1), 1-39 (2008).
  26. Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve-based AFM. Nature Protocols. 9, (5), 1113-1130 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics