Stabil DNA motiver og 1D 2D nanostrukturer konstruert fra små sirkulære DNA molekyler

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne artikkelen presenterer en detaljert protokoll for T4 ligatur og denaturing siden rensing av små sirkulære DNA molekyler, annealing og Opprinnelig side analyse av sirkulære fliser, montering og AFM avbilding av 1D- og 2D DNA nanostrukturer, samt agarose gel gelelektroforese og sentrifugering rensing av begrenset DNA nanostrukturer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Guo, X., Wang, X. M., Xiao, S. J. Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules. J. Vis. Exp. (146), e58744, doi:10.3791/58744 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Denne artikkelen presenterer en detaljert protokoll for syntese av små sirkulære DNA molekyler, annealing sirkulær DNA motiver, og byggingen av 1D- og 2D DNA nanostrukturer. Tiårene tilskrives den raske utviklingen av DNA nanoteknologi bruk av lineære DNAs som kildemateriale. For eksempel er arket til DAO (dobbel crossover, antiparallel, merkelig halv-svinger) kjent som en byggeblokk for bygging av 2D DNA lattices; kjernen strukturen i DAO er laget av to lineære single-strandet (ss) oligonucleotides, som to tau gjør en høyre granny knute. Her, en ny type DNA fliser kalt cDAO (kombinert DAO) er bygget med en liten sirkulær ss-DNA av c64nt eller c84nt (sirkulær 64 eller 84 nukleotider) som den stillas stranden og flere lineær ss-DNAs som stifter tråder. Perfekt 1D- og 2D nanostrukturer er satt sammen av cDAO fliser: uendelig nanowires, nanospirals, nanorør, nanoribbons; og endelig nano-rektangler. Detaljert protokoller er beskrevet: 1) forberedelse T4 ligase og rensing av denaturing siden (polyakrylamid gel geleelektroforese) i små sirkulære oligonucleotides, 2) annealing stabil sirkulær fliser, etterfulgt av innfødte side analyse, 3) montering uendelig 1D nanowires, nanorings, etterfulgt nanospirals, uendelig 2D lattices nanorør og nanoribbons og endelig 2D nano-rektangler, av AFM (Atomic Force mikroskopi) bildebehandling. Metoden er enkel, robust og rimelig for de fleste laboratorier.

Introduction

DNA molekyler har blitt brukt til å bygge mange typer nanostrukturer tiårene. Typisk motiver inkluderer DAE (double crossover, antiparallel, med halv-svinger) og DAO fliser1,2,3stjerners fliser4,5,6,7, single strandet (ss) fliser8,9,10og DNA origami11,12,13. Disse DNA motiver og lattices er samlet fra lineær ss-DNAs. Andre og vi har nylig rapportert bruk av sirkulære ss-oligonucleotides som stillaser bygge motiver og 1D nanorør 2D lattices14,15,16,17. Setter inn en Holliday krysset (HJ)18,19,20,21 i midten av c64nt, kan et par to kombinert DAO fliser være formet17. Denne nye cDAO motiv og dets derivater er stabile og stive nok å montere 2D DNA lattices opptil 3 × 5 µm2. I dette papiret bruker vi av "sirkulær flis", som er definert som en stabil komplekse DNA-molekyl konstruert med en sirkulær stillaset og andre lineær stifter av ss-oligonucleotides, og et annet begrep av "lineær flis", som er bygd fra et komplett sett med lineær SS-oligonucleotides.

Denne protokollen demonstrerer hvordan å lage fem typer DNA nanostrukturer med små sirkulære DNA molekyler som stillaser: 1) uendelig 1 D c64nt og c84nt nanowires, 2) uendelig 2D cDAO-c64nt-O og cDAO-c64nt-E (-O representerer et ulikt antall 5 halv-svinger og -E representerer en partall av 4 halv-svinger) lattices, 3) uendelig 2D cDAO-c84nt-O og cDAO-c84nt-E lattices, 4) endelig 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O og 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O rektangler, 5) uendelig 1 D acDAO-c64nt-E nanorings og nanospirals (se Figur 3-5 for skjematiske tegninger og bilder av over fem typer DNA nanostrukturer). 1D c64nt og c84nt nanowires er samlet fra hver c64nt og c84nt stillas forbundet med to lineær stifter henholdsvis. Hver runde flis av cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c74nt eller cDAO-c84nt er herdet fra sine tilsvarende stillaset c64nt, c74nt eller c84nt med fire lineær stifter henholdsvis. De uendelige 2D lattices er satt sammen av den samme typen sirkulær brikker med forskjellige sekvenser. To begrenset 2D rektangel lattices er satt sammen fra to sett med 32 sirkulær sub fliser henholdsvis. For å spare penger, brukes bare en-sekvensielt c64nt, c74nt og c84nt som respektive stillaset mens forskjellige overheng brukes å anneal den 32 cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt og 20 cDAO-c84nt runde sub fliser henholdsvis i første sub flis annealing trinn, deretter Bland tilsvarende 32 sirkulær sub fliser sammen og bruke andre gitteret annealing trinn å montere endelig 5 × 6 cDAO-c64nt-O og 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O lattices, henholdsvis. Definitivt, forskjellig sekvensielt sirkulær stillaser kan bli vedtatt å sette sammen en rekke endelig størrelse nanostrukturer, men det vil koste mer penger og arbeid. Den uendelige 1D acDAO-c64nt-E nanorings og nanospirals er herdet fra ett-sekvensert asymmetrisk acDAO-c64nt fliser med lineær tilkoblinger av et likt antall 4 halv-svinger. Det er to måter å montere uendelig 2D lattices fra sirkulær fliser cDAO-c64nt og cDAO-c84nt, som er preget av et likt antall 4 og et ulikt antall 5 halv-svinger intertile avstanden henholdsvis. Tidligere krever alle brikkene for å bli justert likt; sistnevnte krever veksling av ansiktene til to nabokommunene flisene langs spiralformede aksene. Hvis ruten er stive og plan, som cDAO-c64nt, genererer begge tilnærminger planar nanoribbons; Hvis ruten er buet mot én retning, for eksempel cDAO-c84nt, intertile forbindelsen til et likt antall 4 halv svinger genererer nanorør, mens intertile tilkobling av et odde antall 5 halv svinger vil produsere planar nanoribbons på grunn av eliminering av kurvatur-partisk vekst av alternative justering buet fliser. Vellykket montering av 1D- og 2D DNA nanostrukturer fra sirkulær fliser angir flere fordeler av denne nye tilnærmingen: håndheves stabilitet og stivhet av sirkulære fliser over lineær fliser, chiral fliser for montering av asymmetrisk nanostrukturer som nanorings og nanoribbons, nye visjoner på forståelse DNA mekanikk og molekylære strukturer, etc.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. utarbeidelse av sirkulære DNAs

  1. Bruke alle lineær DNAs fra kommersielle selskaper direkte uten ytterligere rensing.
  2. Sentrifuge DNA-prøver på 5000 × g i 5 min å samle alle DNA pellets nederst i rørene. Legge til en riktig mengde TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0) å oppløse DNA.
  3. Måle konsentrasjonen av "a" ng/µL for hver ss-DNA løsning bruker en mikro UV spectrometer på 260 nm. Konvertere "a" ng/µL til "b" µM etter b = × 103 / (molekylvekt av DNA strand). Justere TE løsning for å gjøre en 10 µM DNA lagerløsning.
  4. Bruk T4 DNA ligase for å koble ender 3 og 5' 5'-fosforylert lineær DNA maler ( figur 1) c64nt, c74nt og c84nt gitt fra kommersielle selskaper direkte.
  5. Bland 5'-fosforylert lineær DNA stranden (3,5 µM) og den tilsvarende skinne DNA strand (4,5 µM) i 80 µL TE buffer i en 200 µL PCR reagensglasset15. Inkuber røret i en åpen thermo flaske fylt med 95 ° C vann. Avkjøl varmtvann til romtemperatur (25 ° C) i ca 2-3 timer under lab atmosfæren.
  6. Legge til 10 µL av 10 x T4 buffer (660 mM Tris-HCl, 66 mM MgCl2, 100 mM DTT, 1 mM ATP) og 10 µL av T4 ligase (300 U/µL) til blandingen til et siste volum av 100 µL. ruge blandingen i en thermocycler 16 timer på 16 ° C.
    Merk: Ovennevnte DNA konsentrasjoner og reaksjon mengden ~ 100 µL er optimalisert for høy ligation effektiviteten og høye avkastningen av riktig oligo-monomer cyclization. Kjøre to eller flere rør av hemorroider reaksjoner på samme tid i henhold til eksperimentell design. En alternativ inkubasjon prosedyre for hemorroider erstatter trinn 1.6 er 4 timer på 25 ° C.
  7. Etter inkubasjon, Deaktiver T4 ligase i 95 ° C vann for 5 minminutes. Deretter overføre røret til en isen vannbad og ruge i 5 minutter avkjølt.
  8. Legge til 10 µL av 10 x Exonuclease jeg buffer og 10 µL av Exonuclease jeg (5 U/µL) til Let blanding og Inkuber røret på 37 ° C i et vannbad i 30 minutter til selektivt fordøye de gjenværende lineær DNAs og la de circularized DNAs intakt.
  9. Forberede 10% denaturing siden gel.
    1. Bruk gummihansker og vernebriller ved utarbeidelsen siden gel i avtrekksvifte. Legge til 6,67 mL av 30% (w/v) akrylamid/bisacrylamide løsning (19:1), 2 mL 10 x TAE· Mg buffer (40 mM Tris, 40 mM HAc, 1 mM EDTA, pH 8.0, 12.5 mM Mg(Ac)2), 8.4 g urea (7 M) og deionisert vann til et endelig antall 20 mL i et 40 mL sentrifuge rør.
      Forsiktig: 30% (w/v) akrylamid/bisacrylamide løsning (19:1) løsningen er giftig.
    2. Legg til 20 µL av tetramethylethylenediamine (TEMED) og 100 µL av ammonium persulfate (APS, 10% w/v) til 40 mL tube før gel løsningen geleelektroforese systemet umiddelbart. Sette inn en 1.5 mm tykk og 10-og kam. Vent minst 20 min til gel løsningen er styrket.
    3. Angi en konstant spenning på 80 V for en gel 85 × 80 × 1,5 mm3 (bredde × høyde × tykkelse). Legge til 1 x TAE· Mg buffer til geleelektroforese systemet og prerun gel for 20 min på 10 V/cm.
  10. Sette reagensglasset PCR fra trinn 1.8 i 95 ° C vann for 5 min å deaktivere Exonuclease jeg. Deretter overføre røret til en isen vannbad og ruge for en annen 5 min.
  11. Legg 20 µL av formamide i røret til et endelig antall 140 µL og bland løsningen. Distribuer løsningen på 7-9 denaturing siden gel brønner like med 16-20 µL for hver gel godt. Bland 2 µL av lasting fargestoff (0,05% bromophenol blå, 0,05% xylen cyanol FF, 60% glyserol, 10 mM Tris-HCl, 60 mM EDTA, pH 7.6) med 8 µL av tilsvarende forløper lineær DNA (10 µM) og injisere blandingen til et separat godt for referanse.
    NOTE Addisjonen av formamide er å øke tetthet lasting løsningen synker til bunnen av siden gel godt og også for å fjerne noen dobbel strandet DNA rester.
  12. Kjøre gel for ca 2t 10 V/cm og stoppe når xylen cyanol FF er ved 2/3 glassplate med det blotte øye.
  13. Bruk gummihansker og vernebriller å beskytte hud og øyne. Ta gel av glassplaten. Plass gel på en fluorescerende TLC (tynt lag kromatografi) plate. Avskåret målet gel band av et barberblad idet akkurat som skyggelagt av UV bestråling (figur 2).
    Forsiktig: UV-lyset er skadelig for øynene og skinn.
    Merk: Under UV irradiation 254 nm, DNA vil absorbere lys og kastet en skygge på TLC platen. Sirkulær DNA løp litt tregere enn den tilsvarende forløper lineær DNA. Noen ufordøyd lineær DNAs og uønsket sirkulær DNAs i små mengder som omgir skyggelagt target bandet vil forurense sirkulær DNA hvis de er samlet.
  14. Overføre gel bandene til en 2.0 mL microcentrifuge tube. Lufttørke eller blåse tørr gel band og deretter MOS geléer til et lim av en slikkepott eller flat glass stang. Kontroller at gel er helt knust i en lim, som er avgjørende for høykapasitets sirkulær DNA. Legg to ganger av gel volum vaskebuffer vann inn i røret og riste røret ved romtemperatur over natten.
  15. Filtrere blandingen til å samle supernatants i et 2.0 mL microcentrifuge rør. Gjenopprette eventuelle gjenværende DNA skylling med små volum deionisert vann og filteret igjen å kombinere supernatants.
  16. Pakk ut eluent med like volum av n-butanol. Gjenta dette til vandig volumet er redusert til ca 200 µL.
  17. Legge til 500 µL av absolutt etanol (−20 ° C) og 20 µL av 3 M NaOAc (pH 5.1) til blandingen for DNA nedbør. Lagre røret på −20 ° C i 30 min.
  18. Sentrifuge røret på 12.000 × g i 10 min på 4 ° C, forkaste nedbryting. Den gjenværende DNA utløse er ca 100 µL i røret.
  19. Legg til 600 µL av 75% etanol (−20 ° C) til røret og lagre den på −20 ° C i 30 min. Deretter sentrifuge 12.000 × g for 10 min ved 4 ° C, forkaste nedbryting. Den gjenværende DNA utløse er ca 100 µL løsning i røret igjen. Gjenta prosedyren to ganger.
  20. Etter den siste sentrifugering, forkaste nedbryting som mulig. Tørr restene med et vakuum konsentrator.
  21. Lagre renset sirkulær DNA i røret på −20 ° C.
  22. Resuspend rundskriv DNA i TE buffer for å lage en 10 µM sirkulær DNA lager løsning etter trinn 1.3 ved behov.

2. annealing montering løsninger

  1. Forberede hver brikke eller nanostructural montering løsning av c64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, HJ-c84nt, tHJ-c84nt, cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c84nt, c64nt, c84nt og acDAO-c64nt-E med en designet lineære og sirkulære DNAs one-pot avspenning.
    1. For hver montering løsning, bland 2 µL av 10 x TAE· Mg buffer, 1 µL av hver DNA lager løsning av lineære og sirkulære tråder i lik molar forholdstall, og ytterligere TE buffer i et 200 µL PCR reagensrør til en siste konsentrasjon av hver strand på 0,5 µM og et endelig antall 20 µL. Anneal montering løsningen i en Thermo flaske fra 95 ° C til 25 ° C over 48 timer.
  2. Forberede hver montering løsning av 2D uendelig lattices cDAO-c64nt-E, cDAO-c64nt-O, cDAO-c84nt-E og cDAO-c84nt-O med en designet lineære og sirkulære DNAs totrinns avspenning.
    1. Forberede hver forløper sub flis montering løsning ved å blande 2 µL av 10 x TAE· Mg buffer, 1 µL av hver DNA lager løsning av lineære og sirkulære tråder i lik molar forholdstall, og ytterligere TE buffer i et 200 µL PCR reagensrør en siste konsentrasjon på 0,5 µM for hver strand og et endelig antall 20 µL. Anneal hver forløper sub flis løsning i et PCR-thermocycler med en fast-lineær kjøling metode fra 95 ° C til 25 ° C over 2,5 t i første sub flis annealing trinn.
    2. Forberede hver montering løsning av de ovennevnte fire uendelig lattices ved å blande 10 µL av hver av de to sub flis løsningene sammen til en siste konsentrasjon av 0,25 µM for hver strand. I andre gitteret annealing trinn, anneal 20 µL blandingen i en PCR thermocycler bruke en langsom avkjøling bor på 50 ° C for 2t og nedkjøling med en hastighet på 0,1 ° C per 5 minutter til 20 ° C, ca 24 timer totalt.
      Merk: To parallelle eksperimenter kan kjøres samtidig eller senere i andre annealing trinn for hver 2D uendelig gitter.
  3. Forberede montering løsninger av to begrenset rektangel samlinger av 5 × 6 cDAO-c64nt-O og 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O totrinns avspenning.
    1. Forberede hver forløper sub flis montering løsning ved å blande 1 µL av 10 x TAE· Mg buffer, 0,5 µL av hver DNA lager løsning av lineære og sirkulære tråder i lik molar forholdstall, og ytterligere TE buffer i et 200 µL PCR reagensrør en siste konsentrasjon på 0,5 µM for hver strand og en endelig mengde 10 µL. Anneal hver forløper sub flis løsning i et PCR-thermocycler med en fast-lineær kjøling metode fra 95 ° C til 25 ° C over 2,5 t i første annealing trinn.
    2. Forberede hver begrenset rektangel gitter montering løsning ved å blande 32 x (2 µL av hver sub flis løsning) sammen i en 200 µL PCR reagensglasset til en siste konsentrasjon av ~ 15 nM for hvert sub panel og et endelig antall 64 µL. I andre annealing trinn anneal 64 µL blandingen i en PCR thermocycler bruke en langsom avkjøling bor på 50 ° C for 2t og nedkjøling med en hastighet på 0,1 ° C per 5 min til 20 ° C, ca 24 timer totalt.
      Merk: Fem parallelle eksperimenter kan kjøres samtidig eller senere i andre annealing trinn for hver begrenset rektangel montering.

3. Opprinnelig side analyse

  1. Forberede 10% Opprinnelig side under trinn 1,9 unntatt komponenten urea.
  2. For kontroll prøver av c64bp og c84bp, legge 2 µL av hver samling løsning og 1 µL av lasting fargestoff til 3 µL TE bufferen som kontroller separat. For hver av andre samlinger i Figur 3, Legg 1 µL av hver samling løsning og 1 µL av lasting fargestoff til 4 µL TE bufferen.
  3. Sette inn hvert av løsningene ovenfor til en gel godt. Legge til 5 µL av DNA merketråden (25-500 bp) til et separat godt for referanse.
  4. Kjør gel i ca 4 timer på 10 V/cm i et isvann bad. Xylen cyanol FF vil gå tom glassplaten.
  5. Bruk gummihansker og vernebriller å beskytte hud og øyne. Ta gel av glassplaten og Dynk kjeden i 100 mL deionisert vann med 10 µL av en nukleinsyre gel flekk i 30 min.
    Forsiktig: Nukleinsyre gel flekken løsningen er giftig.
  6. Observere gel under et UV tenkelig system og ta et bilde av farget gel (Figur 3).

4. rensing av begrenset Lattices

  1. Forberede en innfødt 2% agarose gel geleelektroforese rensing av begrenset lattices.
    1. Bland 1 g agarose pulver, 5 mL 10 x TBE· Mg buffer (89 mM Tris, 89 mM borsyre, 2 mM EDTA, pH 8.0, 12.5 mM Mg(Ac)2), 2 µL av nukleinsyre gel flekken og 47,5 mL deionisert vann i en 250 mL trekant flaske. Kok blandingen til boblene bli liten og tett. Legge til varmt vann i flasken i et totalt volum på 50 mL og en konsentrasjon av 2% agarose.
    2. Bruk tykk hansken. Hell gel løsningen i en plast gel boks med 7 x 10 x 1 cm3 (bredde × lengde × tykkelse). Sett inn en 1,5 mm tykk og 12-vel gel kam. Vent gel å avkjøles til romtemperatur. Eventuelt sette gel i 4 ° C kjøleskap.
      Forsiktig: Vær oppmerksom på skålding fordi løsningen er veldig varmt.
    3. Legge til 0,5 x TBE· Mg buffer i geleelektroforese systemet. Prerun gel på 5 V/cm for 20 min i et isvann bad med en konstant spenning på 50 V.
    4. Injisere 20 µL av begrenset gitter løsningen forberedt i trinn 2.3 i hver agarose gel godt og legge 5 µL av merketråd DNA (100-3000 bp) til en egen godt. Kjøre gel 2 h på 5 V/cm i et isvann bad.
    5. Bruk gummihansker og vernebriller å beskytte hud og øyne. Kutt målet gel band med en posisjon tilsvarende 1000 bp markøren under UV-lys og skjær dem i fine stykker og plassere de knuste gels i filteret kolonnen8.
    6. Sentrifuge kolonnen 2000 x g i 5 min på 4 ° C. Pakk den prøve løsningen gjennom kolonnen. Samle løsningen for AFM bildebehandling.
  2. Rense endelig lattices av PEG nedbør.
    1. Mix 50 µL av begrenset gitter løsningen i trinn 2.3 med en like volum på 15% PEG8000 (w/v) buffer (20 mM Mg(Ac)2, 5 mM Tris, 1 mM EDTA og 505 mM NaCl)22. Sentrifuge løsningen 18.000 × g på 4 ° C i 30 min.
    2. Fjern nedbryting og legge 100 µL PEG bufferen. Gjenta sentrifugering.
    3. Etter fjerner nedbryting, oppløse pellet i 1 x TAE· Mg buffer for AFM bildebehandling.
      Merk: Rensing er nødvendig for de endelige lattices 5 × 6 cDAO-c64nt-O og 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O AFM bildebehandling og andre programmer. Hvis avkastningen er for lav, øke sentrifugering hastigheten. Hvis produktet ikke er rent nok, Gjenta trinn 4.2.2.

5. AFM Imaging

  1. For c64nt nanowire, c84nt nanowire, acDAO-c64nt-E innskudd uendelig 2D lattices cDAO-c64nt-E(O) og cDAO-c84nt-E(O), 2 μL glødet eksempel på en fersk kløyvde glimmer overflate. La i 2 minutter for adsorpsjon av DNA lattices til glimmer overflaten. Vask overflaten med 100 µL deionisert vann to ganger og tørk den av komprimert luft.
  2. Få AFM bilder av uendelig DNA lattices i luften ved skanning glimmer overflaten med trekantet AFM sonder under trykke modus. Angi følgende parametere for skanning: skanne størrelsen på 0,5 ~ 5 µm, skanneoppløsningen 512 linjer, og Skann rate på 3,5 Hz (Figur 4).
  3. For endelig DNA lattices 5 × 6 cDAO-c64nt-O og 5 × 6 cDAO-c74 & c84nt-O, innskudd 80 µL av 1 x TAE· Mg buffer på en fersk kløyvde glimmer overflate. Deretter Legg 5 µL av begrenset prøver i bufferen. La i 2 minutter for adsorpsjon av DNA lattices til glimmer overflaten. Legge til en annen 50 µL av 1 x TAE· Mg buffer på AFM sonden.
  4. Få AFM bilder av begrenset DNA lattices i væske av skanning glimmer overflaten med trekantet AFM sonder under trykke modus. Angi følgende parametere for skanning: skanne størrelsen på 0,5-1 µm, skanneoppløsningen 256 linjer, og Skann sats på 1,5 Hz (figur 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sirkulær DNA flytter litt tregere enn sin forløper lineær DNA i denaturing siden (figur 2) fordi pore inne sirkulær DNA er gjennomsyret og tilbakestående gel fiber23,24,25. Riktig ligation reaksjon effektiviteten for oligo-monomer cyclization avhenger av underlaget sekvens og konsentrasjon, reaksjon temperatur, tid, etc. Som konsentrasjonen av en forløper lineær DNA er høyt nok på rundt 3,5 µM, cyclization produkter av c64nt (eller c84nt) og forløper referansen i denne protokollen kan være direkte skygget som band i TLC platen under UV-lys uten. Hvis sirkulær DNA er vage eller usynlig, som indikerer en feil av hemorroider eller en mye lav produkt avkastning. Noen ganger er det to band over lineær forløper bandet, refererer en ekstra oligo-dimer ring unntatt riktig oligo-monomer ringen. Bare la de høyere bandene alene og samle de lavere. Renset sirkulær DNA produktene kan sees som hvitt pulver i røret etter vakuumtørking. Bortsett fra siden denaturing kan DNA renheten også måles ved UV spectrometer. Absorpsjon toppen av DNA er 260 nm. To standardkriteriene for DNA renhet er absorpsjon forholdet mellom 280 nm/260 nm på 1,8 og for 280 nm/230 nm vanligvis i størrelsesorden 2.0-2.2. Hvis de over to prosenter avviker fra standard verdiene, bør restene pakkes igjen ved følgende trinn 1.18-1,20. Avkastningen av c64nt og c84nt for riktig oligo-monomer cyclization måles i størrelsesorden 30-60% i henhold til denne protokollen.

Opprinnelig side analyse gir mye informasjon om motivene stabilitet, renhet, stivhet, montering modus monomer eller polymer, etc (Figur 3). C64nt montering familiene til c64bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, cDAO-c64nt og acDAO-c64nt har bare én krystallklare band for hver montering, som representerer de er stabile monomer motiver. Mens c84nt montering familiene av HJ-c84nt, tHJ-c84nt og cDAO-c84nt fliser har flekker rundt deres viktigste band, som viser mindre biprodukter bortsett fra målet monomer motiver. Uansett mindre biprodukter av feil, kan utmerket cDAO-c84nt-O (E) lattices med høy avkastning monteres. For å få en klar og ren geleelektroforese bilde, lasting volumet bør være mer enn 10 µL og mengde DNA 0,01 ~ 0,02 µg/mL.

Suksessen til eksperimenter er endelig evaluert av 1D- og 2D DNA nanostrukturer fotografert av AFM (Figur 4 og figur 5). Hver samlingen har sin egen morfologiske funksjoner i mikrometer omfanget som nanowires, nanorør, nanospirals, nanoribbons, etc. Videre detaljerte teksturer av DNA samlingene i nanometer skalaen korrelert til deres teoretiske sirkulær flisstørrelser og organisasjon godt er henholdsvis nøkkelen for bekreftelse av vellykket og riktig. Derfor må både panoramautsikt og høy oppløsning AFM bilder i mikrometer og nanometer skalaer hentes. Valg av AFM metoder og sonder er avgjørende for høykvalitets AFM bilder. Skanning styrken skal justeres så lite som 50 pN26. Hvis skanning er for stor, vil det skade DNA nanostructural mønstre. Miljømessige renslighet er en annen viktig parameter å få en ren og vakker AFM oppløsning i væske. Alle buffere må filtreres av 0.22 µm filter; sonde holderen og pinsett må være vasket av vaskemiddel og skylles av deionisert vann. Hvis miljøet er forurenset av partikler rusk, ville probespissen være skadet eller klamret av partikler i buffer, noe som påvirker kvaliteten på AFM bilder.

Figure 1
Figur 1 . Syntese av sirkulære DNA. Flyt diagrammet representerer hvordan en lenge 5'-fosforylert lineær oligonucleotide i blått utvikler seg til en sirkulær DNA-molekyl. To kort rød tråder representerer skinne oligonucleotides. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Denaturing siden fotografi av DNA cyclization produkter under UV-lys uten. En forløper lineær 64nt DNA band er i langt til venstre kjørefelt og dets cyclization sirkulære 64nt (c64nt) DNA vises som 9 band på samme nivå i andre 9 baner. 9 bånd c64nt vil bli kuttet for abstracting sirkulær DNAs. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Opprinnelige siden fotografier etter døende og skjematisk dobbel-spiralformede modeller av sirkulære fliser. Begge polymerer c64nt nanowire og c84nt nanowire representeres av enkleste folding enhet celler, som de to justert prikker over og under hver enhet-cellen angir uendelig justering av enhet celler loddrett opp og ned, med lik avstand mellom duplexes til skjemaet nanowires. Monomer sirkulær fliser av c64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, HJ-c84nt og tHJ-c84nt i har A) ingen utstående overheng ut av deres ringer, mens cDAO-c64nt, acDAO-c64nt og cDAO-c84nt i B) har både Butt-slutt 10 bp overheng henholdsvis. For sekvenser, se tabell av DNA-sekvenser. Dette tallet er endret fra en tidligere publiserte figur17Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. AFM bilder av vanlig 1D- og 2D uendelig DNA samlinger skannet i luft. A) c64nt nanowire, B) uendelig acDAO-c64nt-E, C) uendelig cDAO-c64nt-E, D) uendelig cDAO-c64nt-O, E) uendelig cDAO-c84nt-E og F) uendelig cDAO-c84nt-O er herdet av klissete slutt samhold. Alle tekstur detaljer i bildene AFM er i tråd med flisstørrelser og organisasjon moduser godt. For sekvenser, se tabell av DNA-sekvenser. Dette tallet er endret fra en tidligere publiserte figur17Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . AFM bilder av begrenset rektangel samlinger skannet i væske. Endelig rektangel montering av A) 5 × 6 cDAO-c64nt-O består av 32 cDAO-c64nt sub fliser, og B) 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O er sammensatt av 12 cDAO-c74nt og 20 cDAO-c84nt sub fliser. For sekvenser, se tabell av DNA-sekvenser. Dette tallet er endret fra en tidligere publiserte figur17Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For DNA-sekvenser. Klikk her for å laste ned denne filen. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollene presentert i denne artikkelen fokuserer på syntesen av små sirkulære DNA molekyler og montering av DNA nanostrukturer. De fleste av tilfeldig sekvensielt DNA design kan brukes i denne protokollen. Renheten av sirkulære DNAs er avgjørende for suksess for DNA samlinger. Produksjon avkastningen av cyclization kan forbedres ved å redusere konsentrasjonen av 5'-fosforylert lineær DNA; men øker dette arbeidsmengden for å produsere den samme mengden sirkulær DNAs. Lengden på pinnen DNA tilnærmingene påvirker også riktig ligation reaksjonen, den er optimalisert for å være rundt 20 nukleotider lenge for både c64nt og c84nt.

En passende konsentrasjon av magnesium kasjoner (f.eks., 12.5 mM) i løsningen under og etter montering er svært viktig for dannelsen og vedlikeholdet av DNA nanostrukturer. Dermed en magnesium kasjon konsentrasjon av 12.5 mM er alltid holdes under prosessene av avspenning, Opprinnelig side, agarose gel geleelektroforese og PEG buffer sentrifugering renselser, AFM bildebehandling, etc.

For endelig rektangel samlinger av 5 × 6 cDAO-c64nt-O og 5 × 6 cDAO-c74 & 84nt-O, agarose gel rensing ikke påvirker tekstur detaljer, mens PEG buffer sentrifugering rensing skader tekstur detaljer om DNA nanostrukturer i den AFM oppløsning.

Benytt deg av stabilitet og stivhet av sirkulære fliser, det er mye enklere å produsere godt organisert og store enkelt krystallinsk 2D lattices sirkulær moduler enn lineær fliser og scaffolded origami9,11, selv om ekstra arbeid er nødvendig for å syntetisere og rense den sirkulære DNA molekyler. Med bare en sirkulær DNA som samme kjernen struktur, kan mange sirkulære moduler genereres med forskjellige overheng; endelig nanostrukturer kan bygges med bestemte klissete slutt cohesions av overheng; denne strategien reduserer arbeidsmengde og kostnaden for endelig nanostrukturer. En betydelig fordel av sirkulære DNA nanostrukturer er oppløsningen for sekundære og tertiære strukturer av DNA molekyler og deres viktige elementer som Holliday veikryss tekstur detaljer om enkelt krystallinsk lattices. 1D, 2D og 3D nanostrukturer bygget fra sirkulær moduler og potensielle programmer i biologi, medisin og nano-engineering vil bli et nytt familiemedlem DNA nanoteknologi i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.

Acknowledgments

Vi er takknemlige for økonomisk støtte fra NSFC (tilskudd nr. 91753134 og 21571100), og staten nøkkel laboratorium av Bioelectronics av Sørøst universitetet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T4 ligase TaKaRa 2011A
T4 buffer TaKaRa 2011A
TE buffer Sangon B548106
Thermo bottle Thermos SK-3000
Thermo cycler Bio Gener GE4852T
Exonuclease I TaKaRa 2650A
Exonuclease I buffer TaKaRa 2650A
30% (w/v) Acryl/Bis solution (19:1) Sangon B546016
TAE premix podwer Sangon B540023
Mg(Ac)2·4H2O Nanjing Chemical Reagent C0190550223
Urea Sangon A510907
TEMED BBI A100761
Ammonium Persulfate Nanjing Chemical Reagent 13041920295
Power supply Beijing Liuyi DYY-8C
Water bath Sumsung DK-S12
Formamide BBI A100314
DNA Marker (25~500 bp) Sangon B600303
DNA Marker (100~3000 bp) Sangon B500347
Loading buffer Sangon B548313
PAGE electrophoresis systerm Beijing Liuyi 24DN
Filter ASD 5010-2225 0.22 µM
UV imaging System Tanon 2500R
n-butanol Sangon A501800
Absolute Ethanol SCR 10009257
NaOAc Nanjing Chemical Reagent 12032610459
Centrifuge eppendorf Centrifuge 5424R
Vacuum concentrator CHRIST RVC 2-18
Ultraviolet spectrum Allsheng Nano-100
nucleic acid stain Biotium 16G1010 GelRed
Agarose Biowest G-10
Agarose electrophoresis systerm Beijing Liuyi DYCP-31CN
Heating Plate Jiangsu Jintan DB-1
TBE premix podwer  Sangon B540024
filter column Bio-Rad 7326165 Freeze 'N Squeeze column
AFM Bruker Dimension FastScan
PEG8000 BBI A100159
Mica Ted Pella BP50
triangular AFM probe in air Bruker FastScan-C
triangular AFM probe in fulid Bruker ScanAsyst-fluid+
DNA strands Sangon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsu-Ju, F., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32, (13), 3211-3220 (1993).
  2. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394, (6693), 539-544 (1998).
  3. Liu, F., Sha, R., Seeman, N. C. Modifying the surface features of two-dimensional DNA crystals. Journal of the American Chemical Society. 121, (5), 917-922 (1999).
  4. Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301, (5641), 1882-1884 (2003).
  5. Liu, D., Wang, M., Deng, Z., Walulu, R., Mao, C. Tensegrity: Construction of rigid DNA triangles with flexible four-arm DNA junctions. Journal of the American Chemical Society. 126, (8), 2324-2325 (2004).
  6. Tian, C., Li, X., Liu, Z., Jiang, W., Wang, G., Mao, C. Directed self-assembly of DNA tiles into complex nanocages. Angewandte Chemie: International Edition. 53, (31), 8041-8044 (2014).
  7. Wang, P., et al. Retrosynthetic analysis-guided breaking tile symmetry for the assembly of complex DNA nanostructures. Journal of the American Chemical Society. 138, (41), 13579-13585 (2016).
  8. Ke, Y., Ong, L. L., Shih, W. M., Yin, P. Three-dimensional structures self-assembled from DNA bricks. Science. 338, (6111), 1177-1183 (2012).
  9. Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485, (7400), 623-626 (2012).
  10. Ke, Y., et al. DNA brick crystals with prescribed depths. Nature Chemistry. 6, (11), 994-1002 (2014).
  11. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, (7082), 297-302 (2006).
  12. Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459, (7245), 414-418 (2009).
  13. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325, (5941), 725-730 (2009).
  14. Ackermann, D., Schmidt, T. L., Hannam, J. S., Purohit, C. S., Heckel, A., Famulok, M. A double-stranded DNA rotaxane. Nature Nanotechnology. 5, (6), 436-442 (2010).
  15. Zheng, H., Xiao, M., Yan, Q., Ma, Y., Xiao, S. J. Small circular DNA molecules act as rigid motifs to build DNA nanotubes. Journal of the American Chemical Society. 136, (29), 10194-10197 (2014).
  16. Wang, M., Huang, H., Zhang, Z., Xiao, S. J. 2D DNA lattices constructed from two-tile DAE-O systems possessing circular central strands. Nanoscale. 8, (45), 18870-18875 (2016).
  17. Guo, X., Wang, X. M., Wei, S., Xiao, S. J. Construction of a holliday junction in small circular DNA molecules for stable motifs and two-dimensional lattices. ChemBioChem. 19, (13), 1379-1385 (2018).
  18. Holliday, R. A mechanism for gene conversion in fungi. Genet. Res. 5, (2), 282-304 (1964).
  19. Duckett, D. R., et al. The structure of the Holliday junction. Structure and Methods, Human Genome Initiative and DNA Recombination. 1, (1), 157-181 (1990).
  20. Ariyoshi, M., Vassylyev, D. G., Iwasaki, H., Nakamura, H., Shinagawa, H., Morikawa, K. Atomic structure of the RuvC resolvase: A holliday junction-specific endonuclease from E. coli. Cell. 78, (6), 1063-1072 (1994).
  21. Eichman, B. F., Vargason, J. M., Mooers, B. H., Ho, P. S. The Holliday junction in an inverted repeat DNA sequence: sequence effects on the structure of four-way junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, (8), 3971-3976 (2000).
  22. Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie: International Edition. 53, (47), 12735-12740 (2014).
  23. de Gennes, P. G. Reptation of a polymer chain in the presence of fixed obstacles. The Journal of Chemical Physics. 55, (2), 572-579 (1971).
  24. Slater, G. W., Noolandi, J. New biased reptation model for charged polymers. Physical Review Letters. 55, (15), 1579 (1985).
  25. Lilley, D. M. J. Analysis of branched nucleic acid structure using comparative gel electrophoresis. Quarterly Reviews of Biophysics. 41, (1), 1-39 (2008).
  26. Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve-based AFM. Nature Protocols. 9, (5), 1113-1130 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics