Alto Throughput em Vitro avaliação de latência invertendo agentes na transcrição de HIV e de emenda

Immunology and Infection

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Summary

Um protocolo de alto throughput para avaliação funcional de reativação eficiente de HIV e apuramento de provírus latentes é descrito e aplicado por testar o impacto das intervenções na transcrição de HIV e de emenda. Resultados representativos do efeito de latência invertendo agentes na transcrição orientado a LTR e emendando são fornecidos.

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Khoury, G., Purcell, D. F. High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing. J. Vis. Exp. (143), e58753, doi:10.3791/58753 (2019).

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Abstract

HIV permanece incurável devido à existência de um reservatório de células que abriga o formulário estável e latente do vírus, que permanece invisível para o sistema imunológico e destina-se não pela atual terapia anti-retroviral (carrinho). Transcrição e emendando foram mostrados para reforçar a latência do HIV-1 em células T CD4 + a descansar. Reversão de latência pelo uso de agentes de reversão de latência (órgãos) na abordagem de "choque e matar" tem sido estudado extensivamente na tentativa de purgar este reservatório, mas até agora não mostrou qualquer sucesso em ensaios clínicos, devido à falta de desenvolvimento de pequenas adequada moléculas que podem eficientemente a perturbar este reservatório. O protocolo apresentado aqui fornece um método para confiável e eficiente avaliação de agentes de reversão de latência (órgãos) na transcrição de HIV e de emenda. Esta abordagem baseia-se na utilização de um repórter de cor dupla LTR-driven que simultaneamente pode medir o efeito de um LRA na transcrição e emenda por citometria de fluxo. O protocolo descrito aqui é adequado para as células aderentes, bem como as células em suspensão. É útil para testar um grande número de drogas em um sistema de alta taxa de transferência. O método é tecnicamente simples de implementar e cost-effective. Além disso, o uso da citometria de fluxo permite a avaliação da viabilidade celular e, portanto, toxicidade de drogas ao mesmo tempo.

Introduction

Apesar da terapia de antiretroviral eficaz a longo prazo, HIV persiste em estado latente, como um provirus integrado em memória de células T CD4 +1. A estrutura da cromatina do HIV-1 5' promotor de repetição tempo terminal (LTR) e modificações epigenéticas como metilação de histonas e deacetilação de histona por DNA metiltransferases (DNMT) e histona deacetilases (HDAC) são mecanismos importantes, levando a repressão transcriptional e, assim, a latência de pós-integração2,3. Uma grande variedade de agentes de inversão de latência (órgãos) foi investigada por sua eficácia induzir a produção de vírus in vitro e in vivo de Latentemente infectadas descanso T CD4 + células4,5,6,7 ,8. Entre os órgãos testados, HDACi (inibidores HDAC) e aposta contem inibidores (BETis) induzem ocorre descondensação da cromatina e lançamento da transcrição positivo alongamento fator b (P-TEFb), respectivamente, levando a subsequente aliviar do transcriptional repressão em 5' LTR e ativação de HIV expressão9,10,11,12,13. No entanto, a magnitude da reativação alcançada por esses órgãos foi limitada apenas um aumento modesto na célula associada unspliced HIV mRNA (RNA nos), indicativo de transcrição viral, observou-se ex vivo14,15. Importante, estes órgãos também conseguiram induzir uma redução da frequência de células Latentemente infectadas.

Expressão de HIV pode ser ainda mais restrito por ineficiente emenda16 , bem como defeitos de exportação nuclear de multiplicar emendados HIV RNA (RNA MS)17. Assim, identificando novas classes de órgãos que são mais potentes e podem afetar aspectos distintos da vírus produção pós integração são necessários. Além disso, o desenvolvimento de novos ensaios que ajudam a definir os compostos ideais para eficientemente reverter a latência é necessário.

Aqui, é apresentado um protocolo, que utiliza uma abordagem de alto rendimento para avaliação funcional do impacto das intervenções na transcrição orientada por HIV LTR e emenda. Em breve, um novo dual LTR-driven cor repórter sistema pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (Figura 1) é usado para avaliar a reativação de HIV por citometria de fluxo. Este repórter fluorescente, a expressão do mRNA de HIV unspliced (4kb) leva à expressão da proteína verde fluorescente melhorada (EGFP), enquanto a expressão do mRNA emendados (2KB) levaria a expressão de proteínas fluorescentes de Discosoma SP. vermelho (DsRed). Brevemente, usamos uma proteína fluorescente de fusão Env-EGFP, gp140unc. EGFP, onde a sequência de codificação da EGFP foi colocada no quadro com um formulário truncado e un-entalhado do envelope (Env). As alterações foram introduzidas para ablate o local de clivagem, impedindo a dissociação do Env em gp120 e gp41-EGFP e truncar a proteína gp160 antes do domínio transmembrana criando um análogo solúvel de Env, que facilita o correto dobramento e expressão de EGFP. Sobre a expressão dentro de uma célula, Rev localiza-se no núcleo, onde ele Medeia a exportação nuclear citoplasmática de 4KB env mRNA através da interação com o elemento responsivo rev (RRE). Truncamento de Env não compromete a RRE, que se situa entre gp120 e gp41, A7 3' site da tala. Neste sistema, emendando a HIV-1 splice doador 4 (SD4) e splice aceitador 7 (AE7) resultados na produção de um 2KB mRNA codificação de uma proteína não-funcional de Rev truncada no aminoácido 38 fundido a DsRed proteína fluorescente, RevΔ38-DsRed. Brevemente, DsRed foi inserido o exon 2nd de Rev no aminoácido 38 por sobreposição extensão18. Para facilitar a exportação nuclear de unspliced mRNA, um vetor de expressão mamíferos codificação Rev (pCMV-RevNL4.3) foi co transfected com construção de repórter fluorescente (Figura 2). Essa construção único repórter descrita aqui é útil na avaliação da elevado-produção de HIV transcrição e emenda, sem a necessidade de usar vetores virais.

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Protocol

Nota: Processos de clonagem, transformação e sequenciamento são discutidas em outra parte18,19. Os protocolos aqui começam o transfeccao dos vetores de expressão de mamíferos (Figura 3).

1. transfecção de células HEK293T com cor dupla repórter construir

  1. Cultivar as células HEK293T no meio da águia modificados de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS), penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (100 μg/mL) em uma 5% CO2 incubadora a 37 ° C. Após o descongelamento, células de HEK293T passagem 2 - 3 vezes antes de usá-los em transfeccao de experiências. Isto dar-lhe-ia o tempo de células para se recuperar do processo de descongelamento.
    Atenção: Contaminação de micoplasma de culturas celulares continua a ser um problema sério. Boas práticas de laboratório e testes de rotina de culturas celulares são essenciais para diminuir o risco de contaminação de micoplasma e evitar a difusão de20.
  2. Dividir as células 1:2 um dia antes da semeadura e transferi-los para meio DMEM fresco. Cultivar as células para 24h numa incubadora 5% CO2 a 37 ° C.
  3. O dia antes de transfeccao, remover o meio do balão por aspiração e lavar as células com tampão fosfato salino (DPBS) solução de Dulbecco livre de cálcio (Ca2 +) e magnésio (Mg2 +) para remover traços de soro.
  4. Dispense a 5 mL da solução do trypsin-EDTA (0.05% - 10mm em PBS) para o recipiente de cultura e colocá-lo a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 para 2 a 5 min.
  5. Quando as células são desanexadas, adicione 5 mL de DMEM suplementado com 10% (v/v) FBS para inibir ainda mais a atividade de tripsina, que pode danificar as células.
  6. Resuspenda suavemente pipetando a suspensão de células acima e para baixo para separar as touceiras.
  7. Dilua as células 01:10 em mancha azul de trypan (0,4%).
  8. Conte as células vivas que não ocupam trypan azuis usando um microscópio (objetivo de x 10) e um haemocytometer.
  9. Calcular o número de células viáveis por mililitro, tomando a média da contagem de células e multiplicando-o por 10.000 e pelo factor de diluição (01:10) de azul de trypan mancha.
  10. Placa de 2 x 104 células em 100 μL de meio DMEM suplementado com 10% de FBS sem antibióticos em uma placa de 96 poços de fundo plano para 24h.
  11. Para cada poço, diluir 400 ng de pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng de pCMV-RevNL4.3 e 100 ng de pCMV-Tat101AD8-bandeira DNA em 50 µ l de meio livre de soro. Misture suavemente. Para experiências sem Tat, use uma correspondência vazia Tat pcDNA3.1 vector (-).
    Nota: O uso de DNA livre de endotoxina é altamente recomendado. Por isso, preparem-se livre de endotoxinas DNA usando um kit de purificação de ácidos nucleicos de midi ou maxiprep. Determine a pureza do DNA medindo-se a proporção de OD 260/280, que deve ser entre 1,7 e 1,9.
  12. Misturar o reagente de lipídios suavemente antes do uso e, em seguida, diluir 0.65 μL em 50 µ l de meio livre de soro. Misture delicadamente e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
  13. Combine o DNA diluído com o reagente diluído de lipídios.
  14. Misture delicadamente e incubar durante 20 min à temperatura ambiente. A solução pode parecer nublada.
    Nota: Prossiga para a etapa de 1,15. dentro de 30 min.
  15. Distribuir 100 μL por poço dos complexos reagente-DNA drop-wise em cima das células lipídicas.
  16. Misture delicadamente agite-a placa e para trás.
  17. Incubar a placa por 5h em uma incubadora umidificada 5% CO2 a 37 ° C.
    1. Cada mix de reação é suficiente para um único poço (96 poços) do transfection. Ajuste a quantidade e volume dos componentes de acordo com o número de drogas e combinação que seria testada e contas para variações de pipetagem. Todas as condições são geralmente testadas em triplica.
    2. Transfect poços adicionais com 100 ng do CMV-driven EGFP e DsRed-Express DNA do plasmídeo para fins de compensação.

2. tratamento de HEK293T transfectadas células com latência invertendo agentes

Nota: Antes de cada ensaio, determine o estado fisiológico de cada LRA medindo-se a viabilidade das células após a exposição a alta e baixa dose da droga com ensaio de proliferação de células.

  1. Diluir cada LRA para a concentração de trabalho adequado com meio de cultura (por exemplo,, 1 μM para JQ1(+)).
    Atenção: Reconstitua as liofilizado drogas com o solvente apropriado para uma concentração de 10 mM. Armazenar todas as ações de órgãos a-80 ° C em uma alíquota de uso único (5 μL cada) a fim de evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.
  2. Cuidadosamente Aspire transfeccao com um multicanal e coloque 100 μL contendo LRA apropriado (tabela 1). Adicione meio muito suavemente ao lado da parede do poço para evitar desanexando HEK293T células transfectadas, que são conhecidas para soltar facilmente da superfície da placa de cultura.
  3. Incubar a placa por 48h em uma incubadora umidificada 5% CO2 a 37 ° C.

3. coloração de células transfectadas com viabilidade fixável tintura para análise de citometria de fluxo

Atenção: Remoção de detritos e células mortas é essencial para eliminar falsos positivos e para obter resultados de alta qualidade.

  1. Separe as células na mídia usando 100 μL de tampão fosfato salino (PBS) por alvéolo e pipetando suavemente inconstante (~ 5 vezes) com um multicanal, evitando a formação de espuma dos meios de comunicação. Se necessário, retire as células da placa usando 35 µ l por poço da solução do trypsin-EDTA (0.05% - 10mm em PBS) e incubar 5 min a 37 ° C, antes de neutralizar com meio contendo soro.
  2. Transferi as células para uma placa de V-fundo de 96 poços.
  3. Girar as células durante 5 min à 500 x g a 4 ° C e, em seguida, Aspire cuidadosamente com a médio/PBS sem tocar as células.
  4. Lave as células pelo menos 1 vez com 200 µ l de PBS livre de proteína/soro.
  5. Centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 ° C, em seguida, descartar o sobrenadante inclinando a placa e removendo o tampão de lavagem sem tocar as células.
  6. Prepare uma solução de trabalho de viabilidade fixável corante diluindo o corante de viabilidade 1: 1000 em PBS livre de proteína/soro. Prepare-se 50 µ l da mancha diluída por bem.
    Nota: Viabilidade de corantes estão disponíveis em uma gama de cores adequadas para uso com laser azul, vermelho e violeta. Prepare uma solução stock de viabilidade fixável tintura resuspending um frasco de corante (componente A) liofilizado com 50 μL de DMSO anidro (componente B). Loja a-20 ° C em uma única utilização de alíquota (1 μL cada), protegido da luz.
  7. Adicionar 50 μL da tintura viabilidade diluídos a cada poço e misturar as células pipetando para cima e para baixo com um multicanal.
  8. Mancha para 10-15 min a 4 ° C, protegido da luz.
  9. Lavar 1 - 2 vezes com 150 µ l de tampão de lavagem (PBS com 1% bovina albumina de soro e 2 mM EDTA).
  10. Centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
  11. Fixe as células com 100 μL de formaldeído recentemente preparada de 1% em tampão de lavagem para 10-15 min a 4 ° C, no escuro.
    Atenção: O formaldeído é muito tóxico. Prepare a solução de formaldeído 1% em uma coifa para evitar a inalação usando luvas e óculos de segurança para proteção.
  12. Lave as células 1 - 2 vezes com 100 μL de tampão de lavagem.
  13. Centrifugar a 500 x g por 5 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante.
  14. Ressuspender as células em 70 μL de tampão de lavagem.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. Fixa as células poderiam ser armazenadas a 4 ° C, no escuro para análise no dia seguinte sobre o citômetro de fluxo.

4. EGFP e DsRed medições por citometria de fluxo e análise de dados

Nota: Analise a transcrição de HIV (% EGFP) e emenda (% DsRed) em um citômetro de fluxo. Filtre a amostra antes da corrida com um célula de 70 μm-filtro ou malha de nylon 100 μm para evitar entupir o bico.

  1. Iniciar o computador e o citômetro de pelo menos 10 min antes de usar para garantir lasers de aquecer.
  2. Antes da execução de amostras e a iniciar a aquisição de dados, encha o reservatório de bainha com solução salina 0,9% e certifique-se de que um tablet de hipoclorito de sódio é adicionado para o depósito de dejectos.
  3. Verifique a pilha de fluxo para as bolhas de ar.
  4. Verifique se que os detectores e filtros são apropriados para o experimento.
    Nota: Para EGFP, uso de laser azul (488 nm) e 530/30 bandpass, enquanto DsRed Express é otimamente detectado usando o laser amarelo (561 nm) e bandpass 610/20. Um laser azul (488 nm) e bandpass 610/20 também pode ser usados para detectar a expressão DsRed.
  5. Verificar o desempenho do citômetro e sensibilidade através de detectores de executando grânulos de calibração.
  6. Ajustar o avanço (FSC-A) e tensões de dispersão (SSC-A) de lado com inocente amostra para que a população principal é na tela e claramente discerníveis.
    Nota: FSC (luz difusa) é uma medida da luz difração em um ângulo de plana, o que depende do volume da célula (tamanho ou área de superfície de célula), enquanto o SSC (lado difusa luz) é uma medida da difração de luz em um ângulo reto, que é proporcional à granularidade de célula e complexidade interna.
  7. Realizar compensação manual ou automática usando as amostras single-manchado, garantindo mínimas repercussões da EGFP + população para o detector de DsRed e vice-versa.
    Atenção: Para fins de compensação, use uma amostra de células expressando cada um a proteína fluorescente de cor única, bem como as células individualmente coradas com o corante de viabilidade fixável. Não use contas de compensação FITC e PE para compensações de proteínas fluorescentes EGFP e DsRed devido a diferentes características espectrais. Controles de compensação devem ser brilhantes o suficiente para resolver a população positiva e negativa.
  8. Criar parcelas e definir as portas usando fluorescência menos um controles (FMO).
  9. Adquirir e registar um mínimo de 10.000 eventos de célula viável, por exemplo. Execute amostras em média ou baixa velocidade para evitar parelhas de passagem a interceptação do laser. Usar o pulso geometria gating tais como SSC-A contra SSC-H para eliminar parelhas. Verificar a estabilidade do run traçando tempo contra SSC-A para ver como até mesmo o fluxo é durante a execução.
  10. No final da corrida, limpar o fluidics de citometria de fluxo com agentes de limpeza concentradas, em seguida, água por 5 min cada.
  11. Desligamento do sistema, descarte de resíduos e re-encher o tanque de bainha, após a aquisição.
  12. Analise os dados usando um software de análise de dados de citometria de fluxo. Excluir os restos celulares e moita (parelhas), baseado na dispersão de frente e lateral e, em seguida, eliminar as células mortas, usando a mancha de tintura de viabilidade (negativo população = células vivas). Identificar as células expressando EGFP e DsRed (Figura 4), bem como a percentagem do produto emendado DsRed /(DsRed + EGFP) (Figura 5).
  13. Determine o efeito do LRA na transcrição de HIV e emendando comparando células não tratadas e as células expostas ao indivíduo ou uma combinação de órgãos (Figura 5).

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Representative Results

Resultados representativos são mostrados na Figura 5 para a expressão do HIV-1 unspliced (EGFP) e emendados produtos (DsRed) após o tratamento com inibidor de bromodomain JQ1. Ambos JQ1(+) e Tat aumentaram significativamente a percentagem de células expressando EGFP (2.18 e 4,13 FC sobre DMSO respectivamente; n = 3) indicativo de transcrições de unspliced. Além disso, o JQ1(+) aumentou significativamente a percentagem de células expressando DsRed (46,6 FC sobre DMSO) bem como a proporção de produto emendado (7,37 FC sobre DMSO) a um nível semelhante como Tat (59.6 e 5.83 FC em DMSO, respectivamente) confirmando a capacidade de JQ1(+) para ativar a transcrição de HIV e de emenda. Por outro lado, o tratamento com o controle de estereoisômero JQ1(-) abole JQ1(+) efeito na transcrição de HIV e confirmando o sucesso do protocolo de emenda.

Em uma recente publicação, mostramos por análise de RNA uma acumulação de HIV emendados transcrições JQ1(+) tratamento21a seguir. Na verdade, nossos dados revelaram consistentes mudanças nos níveis de unspliced e emendados transcrições que foram espelhados com a expressão da proteína EGFP e DsRed neste modelo, após o tratamento com JQ1(+). Estes resultados indicam que o EGFP e DsRed expressando células refletem a capacidade do inibidor bromodomain JQ1(+) para induzir a transcrição de HIV e de emenda.

Em resumo, nós validado o uso da pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed repórter em uma armação de alta produtividade para a avaliação do efeito de órgãos na transcrição de HIV-1 e emenda. Sub-ótimo quantidade de LRA ou toxicidade aumentada pode levar a resultados de scud. Otimizando a quantidade de droga usada, preservando a viabilidade celular pode melhorar a precisão dos resultados.

Figure 1
Figura 1: esquemático do modelo utilizado para determinar os efeitos da latência invertendo agentes na transcrição orientado a LTR e emendando. O exprime de construção LTR a que ou proteína unspliced envelope (Env) fundida melhorada proteína verde fluorescente (EGFP) ou emendados proteína Δ38rev com DsRed. Esta figura foi reimpresso de Khoury et al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: constrói o projeto. (A) pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed repórter emenda permite a expressão de envelope fundido a EGFP (gp140-EGFP) e proteína não-funcional de Rev truncado no aminoácido 38 fundido a DsRed proteína fluorescente (RevΔ38-DsRed). (B) pCMV-RevNL4.3 permite a expressão da proteína de Rev. (C) pCMV-Tat101AD8-bandeira permite a expressão da proteína de Tat101(AD8) com um C-terminal bandeira-tag. O plasmídeo de expressão é construído usando sobreposições PCR e restrição digest. Todos os mapas de vetor foram criados usando o software SnapGene , versão 4.1.9. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: ensaio de design para a rápida avaliação de latência do HIV invertendo agentes. O método atual para a avaliação do efeito de órgãos na transcrição de HIV-1 e emenda inclui i) semeadura de células HEK293T um dia antes da ii) transfecção com vetores de expressões, seguidos de um tratamento de LRA iii). IV) as células são analisadas pelo fluxo cytometry 48h pós-tratamento. Usando este protocolo, 32 (em triplicado) para 96 condições poderia ser testado por placa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: exemplo representativo de instalação da placa e controles necessários. Colunas de 1 a 3 correspondem aos controles de negativo (-) com nenhuma droga e solvente única (DMSO 1:5000), bem como controles positivo (+), tais como Tat (100 ng), PMA/PHA = phorbol myristate acetato/fitoemaglutina (10 nM PMA, PHA de 10 μg/mL), JQ1 (+ /-) (1 μM), VOR = (vorinostat 0,5 μM) e PAN = panobinostat (30 nM). Órgãos desconhecidos são testados em triplicado sobre uma escala das concentrações (15.625 a 1000 nM). Para fins de compensação, células expressando cada um da único-cor proteína fluorescente (EGFP + e DsRed +) bem como de células coradas com o corante de viabilidade e imaculadas células estão incluídas em cada execução. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figure 4
Figura 4: estratégia utilizada na análise de citometria de fluxo de Gating. O primeiro passo na estratégia associada baseia-se a dispersão para a frente e lateral, que permite a distinção das células de interesse baseada nas propriedades de tamanho e granulosidade dessas células. É recomendável que este canal ser tão generoso como possível incluir todos os eventos, enquanto a remoção de restos celulares e células mortas, que se encontram no canto inferior esquerdo da trama densidade. Então remova o dataset usando a geometria de pulso associada, SSC-A contra SSC-H e ainda mais estreita sobre as células vivas, usando a tintura de viabilidade parelhas. Finalmente, um canal de despejo (violeta) e EGFP ou DsRed são usados para definir a células de interesse. O uso da fluorescência menos um (FMO) controles são fundamentais na definição da população de interesse e das questões das repercussões do outro fluorocromo no canal de interesse. Após a aquisição, os dados são analisados usando software de análise de dados de citometria de fluxo. Esta figura foi reimpresso em forma adaptada Khoury et al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: resultados representativos do efeito de inibidores de bromodomain na transcrição de HIV e emendando. (A) exemplos de dois parâmetros dual cor de fluorescência EGFP contra DsRed densidade parcelas de células untransfected (-Tat), células transfectadas com 100 ng de pCMV-Tat101AD8-bandeira (+ Tat) e células tratadocom com DMSO, JQ1 (+) ou JQ1 (-). (B), a média percentual (%) de células expressando EGFP, DsRed ou produto emendado (DsRed / DsRed + EGFP) de 3 experimentos independentes é mostrado. Comparações de cada condição de DMSO foram feitas utilizando o teste ANOVA de 2 vias. Apenas estatisticamente significativas comparações são mostradas. p < 0,05; p < 0,01; p < 0,001. As linhas pretas representam o mean±SEM. DMSO (1:5000), JQ1 (+) e JQ1(-) (1 μM). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Dada a dificuldade em medir a reativação do vírus ex vivo, uma vasta gama de em vitro modelos foram desenvolvidos ao longo do tempo, a fim de estudar a latência de HIV incluindo Latentemente infectadas T cell-linhas (J-Lats, ACH2, U1), modelos primários de infecção latente de descansar ( O ' Doherty, Lewin, Greene e Spina modelos) ou pré-activated células T CD4 + (Santos, Marini, Planelles Siliciano, Karn modelos) com a única rodada ou replicação competente repórter vírus22. Para modelar as condições fisiológicas de latência do HIV em células T CD4 + a descansar, sistemas dual fluorescente repórter seguiu-se como a repórter Patricia (vermelho-verde-HIV) desenvolvido pelo grupo de Ivan Sadowski com um marcador de Gag-eGFP LTR-driven e um mCherry controlado por CMV em lugar de Nef23. Um semelhante vírus de repórter de cor dupla, Duo-Fluo, foi desenvolvido pelo laboratório de E. Verdin com uma expressão de EGFP LTR-driven e um marcador fluorescente mCherry, impulsionado por um promotor de EF1α24. Neste sistema, o EGFP foi inserido na extremidade 3' do pró-vírus no lugar de Nef. A exclusão no envelope em ambos os sistemas impede várias rodadas de infecções. Além disso, a combinação das duas proteínas fluorescentes permite a detecção de forma produtiva (eGFP + mCherry +) e Latentemente (eGFP - mCherry +) infectado as células. No entanto, várias deficiências dos vírus cor dupla repórter foram perceptíveis em células T CD4 +, como a infecção direta de células Latentemente infectadas é largamente dependente do estado de ativação celular de células T23,24. Na verdade, baixíssima taxa de infecção foi observada usando estes vírus dois repórter no repouso de células T CD4 +: 0,1% de Patricia23 e 0,2% para DuoFluo25. Além disso, como o CMV promotor foi mostrado para ser expressa em níveis mais baixos em células não está ativado26,,27,28, um CMV inativo ou promotor EF1α levaria a subestimação dos Latentemente infectados populações.

Temos gerado e caracteriza-se um novo vetor de repórter de HIV para estudar a criação de latência e reativação de vírus em um ensaio de alto rendimento. Várias vantagens ao nosso método de seleção incluem i) relação custo-eficácia com a capacidade de avaliar a transcrição e, simultaneamente, empalme ii) a capacidade de testar um grande número de drogas ou combinações em uma única experiência, iii) rápida avaliação do efeito de órgãos por citometria de fluxo (30-45 min Leia tempo típico para 96 placa bem independente do número de parâmetros fluorescentes), iv) alta gama dinâmica, v) apropriado para transfeccao alto throughput e citometria de fluxo, usando os braços do robô e plataforma HTS, automatizados cura vi) rápida de dados usando um modelo de espaço de trabalho de citometria de fluxo, vii) ideal para suspensão e células aderentes, viii) a simplicidade do modelo e adaptabilidade para medições de leitor da luminescência e placa (dual luciferase de vaga-lume e Renilla) e ix) escalabilidade (formatos de patê de 96 e 384 poços).

A propensão de uma ira ou uma combinação de órgãos para ativar a transcrição orientada por HIV LTR e emenda, portanto, expressão de proteínas fluorescentes EGFP e DsRed poderia ser analisada por citometria de fluxo, usando o nosso repórter de emenda de HIV. No entanto, antes de testar a sinergia do romance regional, é altamente recomendável para determinar as condições fisiológicas de cada LRA medindo-se a viabilidade das células após a exposição a uma gama de concentrações da droga única. Portanto, incluindo um marcador de células vivas e mortas é essencial para eliminar falsos positivos e para obter resultados de alta qualidade. Outro aspecto importante da análise de citometria de fluxo é os controles de compensação ou FMO. É altamente recomendável usar isoladamente manchadas amostras garantindo mínimas repercussões da EGFP + população na DsRed e vice-versa. Além disso, é essencial para a conta para autofluorescência das células, incluindo células imaculadas. Finalmente, um controle regular do citômetro desempenho e sensibilidade através dos detectores é fundamental principalmente quando medir amostras para um estudo abrangendo um longo período de tempo.

Embora não discutido na seção de protocolo, existem várias limitações do nosso sistema de repórter a emenda. Para uma discussão mais detalhada, por favor consulte nossa publicação anterior (Khoury et al., 2018). Exportação do parcialmente ou unspliced variantes do mRNA do HIV é facilitada pela proteína viral Rev e sua associação com elemento responsivo Rev (RRE) nestas espécies do mRNA29,30,31,32. A superexpressão de Rev em nosso sistema permitido-nos evitar o grande bloco de retenção nuclear de multiplicar emendados e mRNAs unspliced observada em Latentemente infectadas de células T17 e foco na compreensão de como os órgãos induzem a transcrição e a emenda assim, reativação do vírus. Além disso, dado que o nosso sistema exige o transfeccao de 3 plasmídeos, escolhemos HEK293T células porque a eficiência elevada do transfection dessas células. Devido a diferente disponibilidade espacial e temporal dos fatores celulares em células T em comparação com uma linhagem de células de câncer, é importante validar os resultados do repórter emenda adquirida em HEK293T células em linhas de células T e as células primárias, que pode fornecer grande desafios técnicos, devido à sua limitada transfectability. Portanto, o uso de reagentes de entrega alternativos DNA para transfeccao como DMRIE-C, que foi mostrado para ser particularmente eficaz para a transfecção de células de suspensão (por exemplo, Jurkat), ou nucleofection métodos como Amaxa nucleofector ou Neon sistema de transfeccao que têm sido provada a fim de facilitar a entrega eficiente e confiável de único ou múltiplos plasmídeos de difícil-para-transfect células incluindo primárias células T CD4 +. Como alternativa, seria interessante testar este sistema de repórter no contexto dos vírus completos em um modelo de célula primária de latência usando os métodos acima mencionados do transfection. Na verdade, as diferenças na disponibilidade de transcrição de anfitrião, alongamento e emendando fatores em uma célula de T rCD4 + podem afetar a capacidade de um LRA para reativar o pró-vírus latente. Finalmente, nosso modelo não aborda se o LRA pode afetar a transcrição e emenda de células de espectador, e se pode induzir vírus competente de replicação. No entanto, nós suspeitaria que medindo o aumento da célula associada HIV U.S. e MS RNA, isso levaria à produção de vírus competente de replicação no sobrenadante da cultura. Isso pode ser confirmado através da realização do padrão-ouro vírus quantitativa consequência do ensaio (QVOA)33.

Devido à natureza complexa da latência e para garantir a reativação do vírus eficiente, uma estratégia multifacetada combinatória pode ser necessário34. Precisa de tratamento potencial para estimular múltiplas vias incluindo a transcrição e a emenda, que foi mostrado anteriormente para desempenhar um papel essencial no estabelecimento de latência16,35,36, 37. orientado a LTR nosso repórter emenda permitiria uma seleção de alta taxa de transferência de drogas que pode direcionar otimamente tanto passos, transcrição e emendando, aumentando a chance de encontrar moléculas que podem synergize eficientemente, que levaria a uma menor níveis de dose e, portanto, a toxicidade de cada droga.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela concessão do projeto APP1129320 e programa grant APP1052979 do NHMRC da Austrália. Agradecemos o Dr. Adam Wheatley, Dr. Marina Alexander, Dr. Jenny L. Anderson e Michelle Y. Lee para fornecer construções essenciais e conselhos para a conclusão deste trabalho. Agradecemos também a equipe DMI fluxo instalações para seus conselhos e ajuda na manutenção do citômetro de fluxo utilizado neste estudo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) ATCC CRL-3216 Replicates vectors carrying the SV40 region of replication.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) Gibco 10569-010 + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate
Fetal Bovine serum Gibco 10099-141 Origin Australia
Penicillin-Streptomycin Sigma P4458
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Gibco 14190-136
Trypan blue Stain, 0.4% Gibco 15250
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019 Lipid transfection reagent
Opti-MEM I (1x) reduced serum medium Gibco 31985-070 Serum free medium
NucleoBond Xtra Maxi Marcherey-Nagel 740414.50
pEGFP-N1 plasmid Clontech (TaKaRa) 6085-1 Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter.
pDsRed-Express-N1 Clontech (TaKaRa) 632429 Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter.
pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed Addgene 115775
pCMV-RevNL4.3 Addgene 115776
pCMV-Tat101AD8-Flag Addgene 115777
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Millipore 67-68-5
JQ1(+) Cayman Chemical 11187 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
JQ1(-) Cayman Chemical 11232 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
Phorbol Myristate Acetate (PMA) Sigma-Aldrich 16561-29-8 Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM
Phytohaemagglutinin (PHA) Remel HA15/R30852701 Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL
Vorinostat (VOR) Cayman Chemical 10009929 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM
Panobinostat (PAN) TRC P180500 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Promega 63581
Venor GeM Classic Minerva Biolabs 11-1100 Mycoplasma Detection Kit, PCR-based
Name Company Catalog Number Comments
Flow cytometry reagents
LSR Fortessa BD Biosciences Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow)
LSR II BD Biosciences Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet)
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Life Technologies L34976 Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit.
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
EDTA 0.5M pH8 Gibco 15575-038
Formaldehyde Solution 37/10 (37%) Chem-Supply FA010
BD FACS Diva CS&T Research Beads BD Biosciences 655050 Calibration beads
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) BD Biosciences 559123 3.0 - 3.4 mm
Sheath solution Chem-Supply SA046 90 g NaCl in 10 L water
HAZ-Tabs Guest Medical H8801 Chlorine release tablets for disinfection
Decon 90 Decon Laboratories Limited N/A Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%.
Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) Labco SODHYPO-5L Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%.
7x MPBio IM76670 Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%.
Name Company Catalog Number Comments
Materials
Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) Corning 430641U
Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) Costar 3599
Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) Costar 3896
Centrifuge tubes (10 mL) SARSTEDT 62.9924.284 100x16 mm
Centrifuge tubes (50 mL) CellStar 227261 30x115 mm
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) Corning Axygen MCT-150-C
Serological Pipette (25 mL), sterile Corning CLS4489-200EA
Serological Pipette (10 mL), sterile Corning CLS4488-200EA
Serological Pipette (5 mL), sterile Corning CLS4487-200EA
Reagent reservoirs (50 mL), sterile Corning CLS4470-200EA
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap Corning 352235 12 x 75 mm style, 70 mm
Nylon Mesh SEFAR 03-100/32 100 mm
Titertube Micro test tubes, bulk BIO-RAD 2239391 microfacs tubes
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap Corning 352008 12x75 mm style
Snap Caps for 12x75 mm Test Tubes Corning 352032
Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) ProSciTech SVZ4NIOU 3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2
Coverslips (Menzel-Gläser) Grale Scientific HCS2026 20 x 26 mm
Microscope Nikon TMS 310528
Centrifuge 5810R refrigerated Eppendorf 5811000487 with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech N/A Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm.
Name Company Catalog Number Comments
Softwares
FACS Diva BD Biosciences Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1
FlowJo FlowJo FlowJo 10.4.2 Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481
Omega BMG Labtech FLUOstar multi-user reader control, version 5.11
Omega - Data Analysis BMG Labtech MARS FLUOstar data analysis, version 3.20R2
Microsoft Excel Microsoft Excel:mac 2011 version 14.0.0
Prism GraphPad Prism 7 version 7.0c

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References

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