Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Высокая пропускная способность в Vitro оценки задержки вспять агентов на ВИЧ транскрипции и сращивания
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Высокая пропускная способность протокол для функциональной оценки ВИЧ эффективного возобновления и распродажа скрытой proviruses описано и применяется тестирование воздействия мероприятий по ВИЧ транскрипции и сплайсинга. Представитель результаты эффекта задержки вспять агентов по инициативе LTR транскрипции и сплайсинга предоставляются.
Transcript
Общая цель этой процедуры заключается в оценке in vitro, влияния реверсивных агентов задержки на обработку ВИЧ-мРНК. Протокол обеспечивает простой эффективный и надежный метод оценки, одновременное влияние ЛРА на транскрипцию ВИЧ и сращивание. Этот метод дал представление о способности ЛРВ вызывать реактивацию вируса и расчистку скрытого резервуара.
После культивирования клеток поместите 20 000 из них в 100 микролитров среды DMEM, дополненных 10%FBS, и без антибиотиков в колодцах 96-хорошо плоской нижней пластины в течение 24 часов. На следующий день разбавить двойной цвет репортер построить. Tat и Rev ДНК в 50 микролитров сыворотки свободной среды, и смешать осторожно.
Аккуратно смешайте липидный реагент, а затем разбавьте 0,65 микролитров его на реакцию в 50 микролитров сыворотки свободной среды. Смешайте осторожно и инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут. Смешайте разбавленный липидный реагент с разбавленной ДНК и аккуратно перемешайте.
Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем, обойтись 100 микролитров этого липидного реагента ДНК комплекс падение мудрым, на вершине клеток в каждой хорошо. Рок пластины мягко вперед и назад, чтобы смешать.
И инкубировать пластину во влажном инкубаторе, при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислым газом в течение пяти часов. После этого, transfect дополнительные скважины с 100 нанограммов CMV приводом EGFP и DsRed экспресс ДНК плазмид для компенсационных целей. Для начала разбавляют каждую задержку реверсивным агентом в соответствующее рабочее состояние со средой роста.
Используя многоканарновую головку трубы, тщательно аспирировать трансфектную среду и заменить ее 100 микролитров среды, содержащих соответствующий реверсивный агент задержки. Инкубация во влажном инкубаторе при 37%celsius с 5%carbon dioxide в течение 48 часов. Чтобы начать окрашивание клеток, используйте многоканарную головку трубы, чтобы добавить 100 микролитров PBS к каждой хорошо.
Аккуратно труба голову вверх и вниз примерно в пять раз. Хотя убедившись, чтобы избежать вспенивания, чтобы отделить клетки в средствах массовой информации. Затем перенесите клетки в колодцы 96-ну V-нижней пластины.
Центрифуга при 500-времени гравитации и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Аспирировать среды и PBS, не касаясь клеток. Вымойте клетки по крайней мере один раз с 200 микролитров белка и сыворотки свободной PBS.
Центрифуга при 500-времени гравитации и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Наклоните пластину, чтобы отбросить супернатант и удалить буфер мытья, не касаясь клеток. После этого разбавить фиксированный краситель жизнеспособности в белке и сыворотке свободной PBS в соотношении от 1 до 1000, чтобы подготовить рабочий раствор.
Добавить 50 микролитров разбавленного красителя к каждой хорошо, и труба голову вверх и вниз, чтобы смешать. Инкубировать при четырех градусах по Цельсию. В то время как защищены от света с помощью фольги в течение 10 до 15 минут.
Затем мыть клетки один или два раза с 150 микролитров мыть буфера. После этого центрифугу в 500 раз больше гравитации и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут, и отбросим супернатант. Чтобы исправить клетки, добавьте 100 микролитров свежеприготовленного 1%формальдегида и вымойте буфер.
И инкубировать при четырех градусах по Цельсию в то время как защищены от света в течение 10 до 15 минут. После этого, мыть клетки один или два раза с 100 микролитров мыть буфера. Центрифуга при 500-времени гравитации и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Отбросьте супернатант и повторно посовелите клеточные гранулы в 70 микролитров буфера стирки. После проверки цитометра настройки производительности и чувствительности путем запуска калибровки бисера, настроить вперед и сбоку рассеяния напряжения с неопледеленным образцом, так что основная популяция находится на экране и четко различимы. Выполните ручную или автоматическую компенсацию с помощью одного окрашенных образцов, обеспечивая минимальное перелив положительной популяции EGFP в детектор DsRed и наоборот.
Используя флуоресценцию минус один элемент управления, создайте участки и установите ворота. Далее отрегулируйте напряжение вперед и бокового рассеяния с неопляленной выборкой, так что основная популяция находится на экране и четко различима. Приобретайте и записывая не менее 10 000 жизнеспособных событий ячейки на выборку.
После этого используйте программное обеспечение для анализа цитометрий данных потока для анализа данных, изложенных в текстовом протоколе. Репрезентативные результаты экспрессии ВИЧ-1, непликированных и сращивания продуктов, после лечения ингибитором бромодомаина J-1, показывают, что как положительный, так и Tat, значительно увеличивают процент клеток, выражаюющих EGFP. Что свидетельствует о неразлиценные стенограммы.
Также наблюдается значительное увеличение доли клеток, выражаюющих DsRed. И увеличить долю сращивания продукта до тех же уровней, как Тат. Это подтверждает способность J'1 положительно включить транскрипцию ВИЧ и сращивание.
Тем не менее, лечение с помощью стереоизомера контроля J'1 отрицательный, отменяет положительное влияние J-1 на транскрипцию ВИЧ и сращивания. После освоения, этот метод может быть осуществлен с использованием наркотиков индивидуально или в комбинации. Тестирование на их способность эффективно синхронизировать.
Что приведет к снижению дозы препарата и токсичности. После каждого развития, этот метод проложил путь для тестирования эффективных комбинаций наркотиков в первичных моделях задержки в образцах ex vivo пациента.
Tags
ВИЧ-инфекции выпуск 143 иммунологии высокая пропускная способность флуоресцентные репортер транскрипции сращивания EGFP-DsRedRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
