Author Produced

Användning av rekombinanta fusionsproteinerna i en fluorescerande proteas Assay plattform och deras i-gel utvinningsarbete

* These authors contributed equally
Biochemistry
JoVE Journal
Biochemistry
AccessviaTrial
 

Summary

Här presenterar vi de detaljerade anvisningar av en nyligen utvecklad proteas assay plattform använder N-terminala hexahistidine/maltos-bindande protein och fluorescerande protein-smält rekombinant substrat kopplad till ytan av nickel-nitrilotriacetic sura magnetiska agaros pärlor. Efterföljande i-gel analys av assay proverna åtskilda av sodium dodecyl sulfate-polyakrylamid gelelektrofores presenteras också.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Bozóki, B., Mótyán, J. A., Miczi, M., Gazda, L. D., Tőzsér, J. Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation. J. Vis. Exp. (143), e58824, doi:10.3791/58824 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Proteaser är intensivt studerade enzymer på grund av deras viktiga roller i flera biologiska spridningsvägar av levande organismer och i patogenesen; Därför är de viktiga målmolekyler. Vi har utvecklat en magnetisk-agaros-pärla-baserade test plattform för utredning av proteolytiska verksamhet, som bygger på användning av rekombinanta fusion protein substrat. För att demonstrera användningen av detta test system, presenteras ett protokoll på exemplet med humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) proteashämmare. Introducerade assay plattformen kan utnyttjas effektivt i biokemisk karakterisering av proteaser, inklusive enzym Aktivitetsmätningar i mutagenes, kinetic, hämning eller specificitet studier, och det kan vara lämplig för hög genomströmning substratet screening eller kan anpassas till andra proteolytiska enzymer.

I detta test system, de tillämpa substratesna innehåller N-terminala hexahistidine (hans6) och maltos-bindande protein (MBP) Taggar, klyvning platser för tobak etch virus (TEV) och HIV-1 proteaser och en C-terminala fluorescerande protein. Substratesna kan vara effektivt produceras i Escherichia coli -celler och renat enkelt med nickel (Ni) - kelat - belagda pärlor. Under analysen leder proteolytisk klyvning av pärla-knutna substrat till utsläpp av fluorescerande klyvning fragment, som kan mätas med fluorimetry. Klyvning reaktioner kan dessutom analyseras av sodium dodecyl sulfate-polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE). Ett protokoll för den i-gel utvinningsarbete assay komponenter beskrivs också, som delvis återställande av fluorescerande proteiner gör deras påvisande baserat på molekylvikt och fluorescens.

Introduction

Proteolytiska enzymer tillhör de mest intensivt undersökta enzym grupperna på grund av sin betydelse i metaboliska vägar och i industriella applikationer, liksom. Deras nyckelroll för virussjukdomar, reglering av blodets levringsförmåga, cancer och hjärt- och neurodegenerativa sjukdomar gör proteaser framträdande mål inom läkemedelsutveckling. Därför detaljerad karakterisering av substrat specificitet och hämmare profilering av proteashämmare (PR) av intresse är avgörande och utförs företrädesvis av snabba, kostnadseffektiva och robust biokemiska analyser1,2, 3.

Numera de allra flesta av in vitro-proteas analyser tillämpas inom läkemedelsutveckling för sammansatta profilering är homogen, fluorescerande peptid-baserad, och high-throughput screening (HTS)-kompatibla plattformar4. Dessutom märkt peptider är inte bara lämplig för bibliotek screening, men de erbjuder också bra verktyg för bestämning av enzymet kinetiska parametrar på de valda substratesna. I andra fall, om märkning av substratet inte är möjligt, kan separation-baserade analyser ge en möjlig lösning för att bedöma proteolytiska reaktioner3kinetiska egenskaper.

Allmänhet, in vitro-proteas analyser baseras på användningen av två typer av substrat: kort peptider eller hela proteiner. I de fall, där klyvning av kort peptid sekvenser återspeglar egenskaperna klyvning tillräckligt, de följande standardmetoder är tillämpliga: (i) att undersöka standard protein substrat såsom oxiderat insulin B-kedjan, (ii) testning kommersiellt tillgängligt substrat för andra proteaser, (iii) screening syntetiska och fluorescently märkt peptid-bibliotek som skapats av kombinatorisk kemi, eller (iv) med hjälp av genetiska metoder, exempelvis biologiska Visa teknik5, 6. Förutom konventionella klassificering, andra roman plattformar finns också för generering av substrat (t.ex. bildandet av proteom-derived peptid bibliotek7 eller särskilda subtyper av genetiska metoder, som den rekombinanta fusionen protein-baserade substrat8,9,10,11,12).

Alla ovannämnda substrat typer och analyser har sina egna fördelar och begränsningar, och utvecklingen av assay format att kombinera och/eller förbättra fördelarna med de kända plattformarna är fortfarande i efterfrågan. Här beskriver vi ett protokoll för en separation-baserade fluorescerande proteas analys, som använder rekombinant substrat. Dessa fusionsproteinerna består av hans6 och MBP Taggar smält till en kontroll klyvning platsen för TEV PR, som följs av substrat sekvens av intresse som är direkt ansluten till en C-terminala fluorescerande protein (FP) (figur 1A). Kloning av en DNA-sekvens som kodar för en klyvning platsen av intresse i 'kloning kassetten' kan utföras av en enda ligering reaktion till uttryck plasmiden, som har varit linearized tidigare av begränsning endonucleases.

Figure 1
Figur 1: Princip fluorescerande proteas analysens. (A) schematisk representation av en fluorescerande substrat och dess klyvning av humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1) proteas visas. Pilen visar klyvning position inom matrix/kapsid klyvning webbplats sekvensen i HIV-1 proteas (VSQNY * PIVQ). (B) fluorescerande substrat kan användas för att analysera enzymreaktioner av Ni-NTA magnetiska-pärla-baserade analysen och polyakrylamid gelelektrofores, samt, som visas i diagrammet arbetsflöde. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Även om proteolytiska analyser använder liknande rekombinant protein substrat som innehåller en affinitet-tagg, en proteolytisk klyvning webbplats och en fluorescerande protein-har redan beskrivits8,9,10, systemet presenteras här avser att integrera och förbättra fördelarna med dessa metoder. En viktig skillnad är att de fusion protein substratesna i denna analys plattform är utrustade med MBP att förbättra protein löslighet13 och innehåller en kontroll klyvning webbplats för TEV PRs. Dessutom innehåller substratesna ny generation fluorescerande proteiner, som är mycket stabil och har en monomer form att förhindra substrat aggregering. Förutom tidigare publicerade tillämpningen av mTurquoise2 - och mApple-smält former14visar här också vi resultaten ges genom användning av ett rekombinant substrat som innehåller en monomer enhanced gul fluorescerande protein (mEYFP) fluorescerande tagg. Härmed vi demonstrera systemet förenlighet med andra fluorescerande proteiner och representerar vissa allmänna typer av resultat som kan förvärvas av proteashämmare analysen.

Rekombinant fusionsproteinerna uttrycks i E. coli BL21(DE3) celler och används som underlag för analysen i ett nickel-nitrilotriacetic syra (Ni-NTA)-belagda magnetiska-agaros-pärla-anslutna form. C-terminal sönderdelningsprodukterna är befriade från pärla ytan i supernatanten vid klyvning av proteasen sevärdheter. Efter avskiljandet av supernatanten (som innehåller enzymet och sönderdelningsprodukterna) från de magnetiska pärlorna, kan fluorescensen mätas för att bestämma egenskaperna klyvning av enzymet. I motsats till de tidigare beskrivna metoderna, kvantifieras i systemet presenteras här, mängden substrat och C-terminal klyvningsprodukter unikt utifrån en detaljerad substrat kalibreringen. Assay systemet kan stödjas av en SDS-PAGE analys av assay proverna; en efterföljande fluorescerande i-gel visualisering kan tillämpas omedelbart efter elektrofores eller efter den i-gel utvinningsarbete nondenatured och denaturerat fluorescerande komponenter, respektive14.

Flexibiliteten och struktur av 'kloning kassetten' tillåta en tids - och kostnadseffektiva isättning av en mängd olika sekvenser i konstruktionen och främjar därmed, generering av substrat bibliotek. Eftersom alla analysstegen är automation - och HTS-kompatibla, kan systemet vara särskilt attraktiv för, till exempel proteas specificitet mätningar och mutagenes studier, eller det kan också utnyttjas effektivt för industriella proteas hämmare screening och/eller utveckling av antivirala läkemedel, liksom.

Enzymet kinetiska parametrar (kkatt, Km) kan bestämmas av den utvecklade Separationsbaserade analysen; Därför kan det vara lämpligt att utföra enskilda enzym kinetiska mätningar, såsom tid-kursen, substrat-beroende och hämning studierna. Detta bevisar att de rekombinanta fusion protein substratesna ger bra alternativ för de ofta utnyttjad syntetiska oligopeptide substratesna, och på grund av deras höga likhet de polyprotein substratesna, de representerar den naturligt förekommande enzym-substrat interaktioner mer exakt.

Protocol

1. generation av plasmidsna substrat-kodning uttryck

  1. Linjär pDest, hans6- MBP-FP uttryck plasmiden av PacI och NheI begränsning endonucleases. För generationen av pDest, hans6- MBP-FP, se Bozóki et al.14.
    1. Lägg till 1,500-2,000 µg pDest, hans6- MBP-FP uttryck plasmid, 2 µL varje PacI och NheI begränsning endonucleases, 10 µL 10 x buffert (se Tabell för material), och nuclease-fritt vatten (NFW) till 100 µL i en mikrocentrifug rör.
    2. Inkubera reaktionsblandningen vid 37 ° C i 1 h.
  2. Tillsätt 20 µL av 6 x DNA lila lastning dye till reaktionsblandningen och separera sönderdelningsprodukterna genom elektrofores, använda 1% agarosgel. Applicera 1 kB DNA stege som standard.
  3. Skölj gelen för 15 min i 20 mL TAE buffert (40 mM Tris, 20 mM ättiksyra, 1 mM EDTA, pH 8,5) innehållande 20 µL SYBR green lösning och punktskatt bandet av den linearized plasmiden ur det agarosgel, använda ett vasst verktyg.
    Obs: Medan lysande gelen genom en mörk-läsning blå transilluminator (DRBT), linearized pDest, hans6- MBP-FP plasmiden visas som en diskret och ljusa band vid ca 7-8 kB.
  4. Rena linearized uttryck plasmiden från gel segmentet med hjälp av en gel utvinning kit enligt tillverkarens anvisningar.
  5. Infoga sekvensen substrat i linearized pDest, hans6- MBP-FP uttryck Plasmiden.
    1. Glödga framåt (FWD) och omvänd (REV) E. coli kodon-optimerade oligonukleotiden primers kodning för substrat sekvensen av intresse.
      Obs: Glödgad primers kommer att åtföljas av sammanhängande ändarna motsvarar PacI och NheI begränsning Amiiiiin klyvning platser (figur 2).
      1. Blanda 150 ng av linearized uttryck plasmid med 200 ng FWD och 200 ng av REV oligonukleotiden primrar i en 0,2 mL polymeras-kedjereaktion (PCR) röret och justera volymen till 17 µL genom att lägga till NFW.
      2. Inkubera blandningen vid 65 ° C i 2 min och sedan vid 4 ° C i minst 2 min.
    2. Utföra införandet av glödgad primers in i den linearized plasmiden med ligering.
      1. Tillsätt 2 µL T4 ligase buffert (10 x) och 1 µL T4 ligase blandningen som innehåller den linearized plasmiden och glödgad primers.
      2. Inkubera ligering blandningen vid 16 ° C i 16 h.

Figure 2
Figur 2 : Oligonukleotiden primers som kodar för en proteolytisk klyvning webbplats sekvens. Framåt och bakåt primers koda VSQNY * PIVQ klyvning webbplats sekvens av HIV-1 PR. Efter glödgning kompletterande oligonukleotiden primers, innehåller kort dubbelsträngat DNA klibbig ändar, motsvaras av PacI och NheI begränsning endonucleases. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

  1. Omvandla 100 µL av BL21(DE3) behöriga celler av 5 µL av ligering blandning och sprida celler lysogeny buljong (LB) agarplattor som innehåller ampicillin.
    Obs: De fluorescerande proteinerna blir i samma öppna läsning ram med N-terminala fusion Taggar endast efter en framgångsrik ligering. Några dagar efter omvandling, kommer att kolonierna (innehållande uttryck plasmiden kodning för webbplatsen infogade klyvning av intresse) Visa synlig fluorescens med eller ens utan att använda en DRBT.
  2. Förbereda glycerol lager från de avbildade kolonierna.
    1. Tvätta en diskret koloni i en 50 mL centrifugrör innehållande 5 µL LB medium innehållande ampicillin (med en slutlig koncentration på 100 µg/mL).
    2. Inkubera vid 37 ° C i 8 h det samtidigt kontinuerligt skakar på 220 rpm; sedan skörda cellerna genom centrifugering vid 1 000 x g under 5 minuter i rumstemperatur.
    3. Försiktigt avbryta cellerna i 1 mL 80% glycerol lösning (utspädd med destillerat vatten) och tillsätt 500 µL 10 mM MgCl2 lösning i suspensionen.
    4. Överför till en frysning rör och lagra bestånd vid-70 ° C.
  3. Kontrollera sekvensen av genererade plasmiden med DNA-sekvensering.
    1. Tillsätt 10 µL av glycerol beståndet (bereddes i steg 1,7) till 5 mL LB medium innehållande 100 µg/mL ampicillin i ett 50 mL centrifugrör.
    2. Inkubera suspensionen vid 37 ° C i 16 h medan kontinuerligt skakar på 220 rpm; sedan skörda cellerna genom centrifugering vid 2000 x g i 10 minuter vid 4 ° C.
    3. Isolatet uttryck plasmiden från cellpelleten av en plasmid miniprep kit (se Tabell för material) enligt tillverkarens anvisningar, och använda renad plasmiden för DNA-sekvensering.
      Obs: för sekvensering, 5'-GATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAG-3' (framåt) och 5'-GCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGC-3' (bakåt) oligonukleotid primers kan användas.

2. redovisning av de fluorescerande substratesna

  1. Förbereda den förrätt kulturen.
    1. Tillsätt 10 µL av glycerol beståndet (bereddes i steg 1,7) till 5 mL LB medium innehållande 100 µg/mL ampicillin i ett 50 mL centrifugrör.
    2. Inkubera suspensionen vid 37 ° C i 15 h medan kontinuerligt skakar vid 220 rpm.
  2. Överföra den bakteriella kulturen (5 mL) till 50 mL färsk LB medium innehållande 100 µg/mL ampicillin i en steril 500 mL-Erlenmeyerkolv.
  3. Växa cellerna vid 37 ° C till en absorbans 0,6-0,8 på en 600 nm våglängd, medan kontinuerligt skakar vid 220 rpm.
    Obs: Om en tetracyklin behandling ska tillämpas vid steg 2.5, det rekommenderas inte att odla cellerna till en absorbans mer än 0,6 på 600 nm.
  4. Lägga till isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) 1 mM slutliga koncentration att inducera proteinuttryck.
  5. Om en tetracyklin behandling inte tillämpas, inkubera kulturen för 3 h vid 37 ° C under kontinuerligt omskakning vid 220 rpm och fortsätta protokollet med steg 2,6. Om en tetracyklin behandling appliceras, fortsätta protokollet med steg 2.5.1-2.5.3.
    Obs: Vissa FPs som produceras av E. coli celler kan ha längre mognad (se föregående arbete)16,17; i dessa fall kan protein översättning eventuellt arresteras av tetracyklin behandling, för att öka fluorescerande avkastningen av substratlösningen.
    1. Inkubera cellsuspensionen för 2 h vid 37 ° C under kontinuerligt omskakning vid 220 rpm; Lägg sedan till en tetracyklin lösning (med en slutlig koncentration på 200 µg/mL).
    2. Inkubera cellkulturen enligt mognad tid av fluorescerande protein val vid 37 ° C, medan kontinuerligt skakar vid 220 rpm.
  6. 2 x 25 ml av kulturen att rengöra 50 mL centrifugrör och skörda cellerna genom centrifugering vid 4000 x g i 15 minuter vid 4 ° C.
  7. Avlägsna supernatanten och lagra bakteriecell pellets vid-70 ° C i minst 1 h.
    Observera: Celler som innehåller de uttryckta fluorescerande substratesna Visa synlig fluorescens med eller ens utan att använda en DRBT.

3. cell störningar

  1. Placera den frysta cellpelleten på is och låt den Tina i 15 min.
  2. Tillsätt 2 mL lyseringsbuffert (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 0,05% Tween-20, pH 8) till pelleten och stänga av cellerna.
  3. Tillsätt 10 µL av nylagade phenylmethanesulfonyl-fluor (PMSF) proteas hämmare lösning (8,7 mg/mL, löst i etanol) till upphängningen.
  4. Tillsätt 2 mg lysozym och 20 enheter av DNAS till upphängningen och avbryta det.
  5. Inkubera suspensionen på is för 15 min och vortex det ibland.
  6. Överföra 2 x 1 mL av suspensionen till 1,5 mL mikrocentrifugrör och Sonikera upphängningarna för 3 min, i omgångar av 10 s av ultraljudsbehandling och 5 s av vila.
  7. Centrifugera rören vid 10 000 x g i 20 min i rumstemperatur; ta sedan bort fluorescerande supernatanten (avmarkerad bakteriell cell lysate) noggrant från varje rör och överföra det till nya mikrocentrifugrör.
    Obs: Rensas lysates innehållande fluorescerande substratet Visa synlig fluorescens med eller ens utan att använda en DRBT och kan lagras vid 4 ° C i upp till 2 veckor. INTE frys den. Rensas lysates kan utnyttjas direkt för provberedning i proteas-analysen (se avsnitt 4.1) eller också kan användas för rening av substrat (se steg 4.5.1).

4. Ni-NTA magnetiska-pärla-baserade proteas assay

Obs: På grund av flexibiliteten i assay plattformen, det kan optimeras till många olika typer av studier. Av denna anledning och på grund av skillnaden i andelen verksamhet val-enzymer, vissa assay parametrar (där den betecknas) kan inte beskrivas uttryckligen men behöver optimeras individuella mål och experimentell design. Som en vägledning betecknas parametrar av vissa typer av studier på de särskilda stegen.

  1. Provberedning
    1. Generation av substrat-anslutna magnetiska pärlor
      1. Placera ett stängt 2 mL låg-protein-bindning (se Tabell för material) mikrocentrifug rör som innehåller nya eller återvunna (se avsnitt 4.7) Ni-NTA magnetiska agaros pärlor i en magnetiska partikel koncentrator (MPC).
        Obs: Tillämpad pärla suspensionens beloppet fastställas baserat på experimentell design. Vi använde 1 mL magnetiska pärla lösning (5%, v/v) på varje experiment.
      2. Pärlor kan fastna på väggen eller i locket av mikrocentrifug röret; därför vända MPC uppochner i varje riktning för att se till att alla pärlorna samlas.
      3. Avlägsna supernatanten och kassera den.
      4. Tvätta pärlorna av lyseringsbuffert.
        1. Tillsätt 1,8 mL lyseringsbuffert till pärlorna och avlägsna stängda röret från MPC.
        2. Avbryta pärlorna i röret genom skakning eller vrida rören uppochner tills provet är helt homogen.
        3. Placera röret tillbaka till MPC och vända den upp och ner att samla pärlor.
        4. Öppna tuben och Kassera supernatanten.
      5. Tillsätt 1,0-1,8 mL den rensade lysate (bereddes i steg 3,7) till pärlorna och ta bort röret från MPC.
      6. Vrid det stängda röret uppochner tills pärlorna är helt homogena och sakta rotera röret genom en rotator i rumstemperatur i 30 min.
      7. Placera den i MPC och ta bort den rensade cellen lysate från pärlor och locket.
        Obs: Den rensade cellen lysate kan kasseras eller sparas för vidare bruk (se anteckningen efter steg 3,7).
      8. Tillsätt 1% Tween-20 (pH 7) till substrat-anslutna magnetiska pärlor (SAMBs).
        Observera: SAMBs Visa synlig fluorescens med eller ens utan att använda en DRBT.
    2. Tvättning av SAMBs
      1. Placera röret med SAMB suspensionen i MPC och kasta bort supernatanten.
      2. Tvätta SAMBs 3 x med varje buffert: i) 1,8 mL 1% Tween-20 (pH 7); (II) 1,8 mL tvätt buffert (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 5 mM Imidazol, 0,05% Tween-20, pH 7); (III) 1,8 mL klyvning buffert (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 0,05% Tween-20, pH 7).
        Obs: Om förfarandet som tvätt, se steg 4.1.1.4. Klyvning bufferten kan ändras enligt de experimentella behov, men det är rekommenderat att kontrollera manualen av Ni-NTA magnetiska pärlor är kompatibla.
    3. Beredning av SAMB stamlösning
      1. Lägga till en klyvning buffert de tvättade SAMBs att skapa en SAMB stamlösning.
        Obs: Efter tillägg av bufferten, inte skaka eller vända tuben upp och ner. Volymen av klyvning bufferten beror på den enskilda experimentell designen och måste beräknas baserat på antalet magnetiska pärlor (se steg 4.1.1.1) och på volymerna som ska användas i steg 4.1.4.2. För 2 mL rör, tillämpad volymen är upp till 1 900 µL (se tabell 1). Rekommenderade magnetiska pärla tätheten SAMB stamlösning är 2-10% (v/v).
        Studera typ Volymen av klyvning buffert (µL)
        S-beroende mätningar (Fig 4) 1600
        Tidsförlopp mätningar (Fig 5A) 1600
        Hämning studie (Fig 5B) 1900
        pH beroende studie (Fig 6) 1400

        Tabell 1: Volymen av klyvning bufferten används för att förbereda SAMB stamlösning i olika typer av mätningar.
      2. Ta bort stängda röret från MPC. Använda SAMB stamlösning direkt eller förvara den vid 4 ° C i upp till 24 h.
    4. Generation av assay proverna med SAMB stamlösning
      Obs: Detaljerna i denna del av analysen är starkt beroende av den enskilda experimentell designen (prov typer visas i tabell 2).
      Provtyp Anteckningar
      Reaktion prov (R) -används för att bedöma klyvning boenden
      -innehåller både enzymet och substratet i klyvning buffert
      Substratet blindprov (B) -används för att bedöma spontana substrat dissociation (se steg 4.6.2)
      -innehåller endast substratet i klyvning buffert
      Substratet kontrollprov (C) -för detemining substrat koncentrationen (se steg 4.6.3)
      -innehåller endast substratet i eluering buffert

      Tabell 2: Provtyper Ni-NTA magnetiska-pärla-baserade proteas analysens.
      1. Förbered 2 mL låg-protein-bindning mikrocentrifugrör för assay prover.
        Obs: Andra låg protein bindande plast varor kan också användas. Använda runda - eller platt-botten rör för att säkerställa fri rörlighet för SAMBs. Se det rekommendera antalet rör i tabell 3.
        Studera typ R B C
        S-beroende mätningar (Fig 4) 5 5 2
        Tidsförlopp mätningar (Fig 5A) 6 6 2
        Hämning studie (Fig 5B) 7 7 1
        pH beroende studie (Fig 6) 5 5 1

        Tabell 3: Antal krävs 2 mL mikrocentrifugrör för varje Provtyp i påvisade studierna.
      2. Avbryta SAMB stamlösning till homogenitet och överföra mängden substrat som ska analyseras i reaktionerna omedelbart in provet injektionsflaskorna. Den rekommenderade volymen är 25-300 µL, men det ska ställas in enligt den enskilda experimentell designen (tabell 4).
        Obs: Kontrollera om alla SAMBs har mätts i botten av rören. SAMBs kan hålla sig till väggen i röret, som kan snedvrida resultaten assay. Om olika volymer skall mätas sekventiellt, starta alikvotering med högsta volym och försöka minimera ändringen av pipetter eller pipettspetsar.
        Studera typ R B C
        S-beroende mätningar (Fig 4) 25 – 50 – 100 – 150 – 250 25 – 50 – 100 – 150 – 250 25
        Tidsförlopp mätningar (Fig 5A) 25 25 25
        Hämning studie (Fig 5B) 120 120 120
        pH beroende studie (Fig 6) 100 100 100

        Tabell 4: Volymen av lösning som SAMB mätt i provet injektionsflaskorna av varje Provtyp i påvisade studierna.
      3. Placera provet rören med aliquoted SAMB suspension i MPC och något flytta MPC och tillbaka.
      4. Försiktigt bort supernatanten från SAMBs och kassera den.
      5. Ta bort rören från MPC och Lägg till den beräknade volymen reaktion buffert (klyvning eller eluering buffert [100 mM EDTA, 0,05% Tween-20, pH 7]) noggrant SAMBs.
        Obs: Beräkna buffert volymen enligt individuella experimentell design (tabell 5). För 2 mL rör är den rekommenderade sista volymen av reaktionsblandningen (volymen av reaktion bufferten ska läggas i det här steget + volym av lösningen som ska läggas till i steg 4.2.3) 50-150 µL. se till att alla SAMBs tvättas i extra buffert. Eluering buffert används i stället för klyvning buffert i fall av substrat kontrollprover (C). En studie av hämning rekommenderas hämmaren val att läggas på detta steg.
        Studera typ Volymen av reaktion bufferten (µL)
        S-beroende mätningar (Fig 4) 68 µL klyvning buffert
        Tidsförlopp mätningar (Fig 5A) 68 µL klyvning buffert
        Hämning studie (Fig 5B) 67,3 µL klyvning buffert + 0.7 µL hämmare lagerför lösning *
        pH beroende studie (Fig 6) 69,5 µL klyvning buffert **

        Tabell 5: volymen av reaktion buffert i påvisade studierna. * Amprenavir löstes i dimetyl-sulfoxid; amprenavir stamlösningar (alltifrån 1 nM till 1 µM koncentrationer) tillämpades för hämmande studie (se figur 5B). ** PH i tillämpad klyvning bufferten varierade från pH 6,0-8.5.
      6. Stäng locken av rören. Proverna är nu redo för analysen.
        Obs: Proverna kan lagras vid 4 ° C i upp till 24 h, men lagring är endast tillämplig om SAMB stamlösningen används omedelbart efter beredning (se steg 4.1.3.2).
  2. Initiering av de proteolytiska reaktionerna
    1. Bered den proteolytiska enzym efter experimentella behov.
      Obs: Det rekommenderas att använda en klyvning buffert att upplösa eller späd enzymet. Protokoll för rening av HIV-1-14 och TEV PRs18 har publicerats tidigare.
    2. Ange thermoshaker agitation rate (600 rpm) och inkubation temperatur (tabell 6).
      Studera typ Inkubation temperatur (° C)
      S-beroende mätningar (Fig 4) 37
      Tidsförlopp mätningar (Fig 5A) 37
      Hämning studie (Fig 5B) 37
      pH beroende studie (Fig 6) 30

      Tabell 6: inkubation temperaturer tillämpas i annan studie typer. För HIV-1 PR rekommenderas 37 ° C, medan 30 ° C rekommenderas för TEV PR.
    3. Lägga till enzymet lösningen reaktion proverna för att initiera proteolytiska reaktioner.
      Obs: När det gäller substrat tomt (B) och C prover, lägga till klyvning buffert (enzym buffert) och eluering buffert, respektive. Volymen skall beräknas enligt de individuella experimentella behov (tabell 7). För 2 mL rör är den rekommenderade sista volymen av reaktionsblandningen (volymen av reaktion bufferten lade till i steg 4.1.4.5 + volym av lösningen som ska läggas till i det här steget) 50-150 µL.
      Studera typ Volymen av enzymet lösning/enzym buffert/eluering bufferten (µL)
      S-beroende mätningar (Fig 4) 2
      Tidsförlopp mätningar (Fig 5A) 2
      Hämning studie (Fig 5B) 2
      pH beroende studie (Fig 6) 0,5

      Tabell 7: Volymen av enzymet lösning/enzym buffert/eluering bufferten lagts under initieringen av de assay provexemplar av påvisade studierna.
    4. Rör upp pärlorna försiktigt genom att försiktigt flytta rören och placera rören omedelbart i den redan skakar thermoshaker.
      Obs: Manuell provet avslutas (se avsnitt 4.3) tar mer tid än inledande; Därför rekommenderas en registrerade försening på minst 2 min mellan reaktionerna initieringar.
    5. Inkubera proverna enligt experimentell design (tabell 8).
      Studera typ Inkubation gånger (min)
      S-beroende mätningar (Fig 4A) 7
      S-beroende mätningar (figur 4B) 120
      Tidsförlopp mätningar (Fig 5A) 0 – 2,5 – 5 – 10 – 15 – 20
      Hämning studie (Fig 5B) 10
      pH beroende studie (Fig 6) 60

      Tabell 8: Inkubationstider tillämpas på assay proverna i de olika mätningarna.
  3. Terminaration av de proteolytiska reaktionerna
    1. Ta provet ur shakern, 30 s före slutet av inkubation, och snurra den omgående.
    2. Placera röret på MPC, låt den stå för 15 s, och något flytta MPC och tillbaka.
    3. Öppna locket och överför supernatanten försiktigt till en tallrik eller en ny tub.
      Obs: Rör inte koncentrerad pärlorna med spetsen på pipetten. Insamlade supernatanten av C prover och R prover med en hög grad av klyvning kan visa synlig fluorescens med eller ens utan användningen av ett DRBT.
  4. Fluorescerande upptäckt
    1. Överföra 2 x 30 µL av separerade prov supernatanterna till en svart halv-området mikroplattan.
    2. Mäta den fluorescens med lämpliga excitation och utsläpp filter.
      Obs: Mät den grundläggande fluorescensen av klyvning buffert och eluering buffert, liksom. Filter kombinationer behöver väljas utifrån de uppmätta fluorescerande proteinet (tabell 9).
      Fluorescerande protein Magnetiseringen filter (nm) Utsläpp filter (nm)
      mTurqiouse2 355/40 460/25
      mEYFP 544/15 590/10
      mApple 544/15 590/10

      Tabell 9: Excitation och utsläpp filter används för att upptäcka olika fluorescerande proteiner.
  5. Kalibrering
    Obs: För att generera kalibreringskurvor i steg 4.6.1, fluorescens intensitetsvärden av klyvning - eller eluering-buffert-löst renat substrat vid olika koncentrationer behöver mätas.
    1. Rena de fluorescerande substratesna.
      Obs: För rening, SAMBs av substrat tomt (B) proverna efter proteas analysen kan samlas eller en ny SAMB suspension kan också förberedas (se avsnitt 4.1.1 och 4.1.2).
      1. Placera ett rör med SAMBs upphängd i 1 mL klyvning buffert (2% - 10%, v/v) till MPC och samla in de magnetiska pärlorna genom att vrida MPC uppochner i varje riktning.
      2. Öppna tuben och ta bort klyvning bufferten, både från röret och locket.
      3. Ta bort röret från MPC och tillsätt 400-600 µL eluering buffert i SAMBs.
      4. Rotera långsamt stängda röret med en rotator i rumstemperatur i 5 min.
      5. Placera röret på MPC och samla pärlor genom att vrida MPC uppochner.
      6. Ta bort supernatanten innehållande renat intakt fluorescerande substratet (eluatet) och överföra den till en ny låg-protein-bindning mikrocentrifug rör.
        Obs: Eluatet visar tydligt synlig fluorescens med eller ens utan att använda en DRBT.
    2. Utföra parallella buffert exchange med hjälp av två 0,5 mL 10K ultrafiltrering enheter.
      1. Mät halva volymen av det beredda eluatet (200-300 µL) i varje ultrafiltrering enhet.
      2. Efter varje centrifugering steg späd koncentrerad eluatet i först och de andra ultrafiltrering enheterna eluering buffert och klyvning buffert, respektive.
      3. Efter återställningen, justera koncentrerad proverna löst i olika buffertar till samma volym, mellan 120-200 µL.
        Obs: Nu proteinhalten i klyvning buffert-löst substratet är identisk med eluering buffert-löst substratet; Därför är det inte nödvändigt att bestämma proteinhalten av den sistnämnda vid steg 4.5.3, om den metod som används för att mäta proteinkoncentration stör med EDTA.
    3. Bestämma proteinhalten i substratesna löses antingen i eluering eller klyvning buffert genom att mäta absorbansen vid 280 nm.
      Obs: Andra metoder (t.ex. Bradford eller bicinchoninic syra (BCA) analyser) kan också användas att mäta proteinkoncentration, men eventuell inblandning med EDTA (närvarande i eluering bufferten) eller absorbansen av fluorescerande underlaget behöver vara anses vara. Inledande proteinhalten substratlösningen ska tillämpas i steg 4.5.4 rekommenderas att vara mellan 0,4-2,0 mg/mL för att generera en kalibrering kurvan i ett relevant område. Se tabell 10 för utplåningkoefficienter.
      Substrat Molekylvikt
      (Da)
      Extinktionskoefficient
      (M-1 cm-1vid 280 nm mätt i vatten)
      Hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 72101.7 96845
      Hans6- MBP-KARVL * AEAM-mTurquoise2 72042.7 95355
      Hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP 72367.1 94325
      Hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mApple 72145.9 105200

      Tabell 10: molekylvikter och utrotning koefficienterna för de olika rekombinanta fluorescerande fusion protein substratesna.
    4. Förbereda en tvåfaldiga seriella utspädning i minst åtta steg, både från den eluering - och klyvning-buffert-löst substrat lösningarna, med eluering eller klyvning buffert för utspädning, respektive.
    5. Överföra 30 µL av varje utspädning pekar till en svart halv-området mikroplattan.
    6. Mäta fluorescensen med en fluorimeter, med inställningen tillämpas i steg 4.4.2.
      Obs: Mät den grundläggande fluorescensen både klyvning och eluering bufferten.
  6. Utvärdering av analysen
    1. Rita kalibreringskurvorna.
      1. Beräkna koncentrationen (i mM) av renat substrat lösningar (används i steg 4.5.4), baserat på den proteinhalt som anges i steg 4.5.3.
      2. Korrigera relativa fluorescens intensitetsvärdena (RFU) seriell utspädning punkter genom den tillämpad förtunningsbuffert (klyvning bufferten eller eluering bufferten) grundläggande RFU värderingar.
      3. Rita de korrigerade RFU-värdena mot molära koncentrationen av de klyvning - eller eluering-buffert-löst renat substratesna och utföra en linjär regression (force skärningspunkt till noll).
        Obs: En hög R2 -värde (˃0.97) indikerar en bra linjär korrelation mellan fluorescensen och koncentrationen av fluorescerande protein. I det här fallet kan lutningen av regressionslinjen användas för att bedöma koncentrationen av assay komponenterna i intervallet undersökta i steg 4.6.2 och 4.6.3. Experimentella fel och data poängsystem kan påverka tillförlitligheten i kalibrering; en grafisk utvärdering kan således utföras med hjälp av zooma in grafer (som visas i figur 3), för att kontrollera huruvida R2 och lutning värdena påverkas av data.
    2. Beräkna mängden C-terminala fluorescerande klyvning produkt i proverna som reaktion.
      1. Korrigera RFU värdena av varje R-prov med RFU värden av det motsvarande B-provet.
      2. Beräkna klyvning produkt koncentrationen (i mM) i proverna som reaktion genom att dividera den korrigerade RFU värden av lutningen på klyvning-buffert-baserade kalibreringen kurvan (se steg 4.6.1.3).
    3. Beräkna koncentrationen av tillämpad substrat i proverna som reaktion.
      1. Korrigera RFU värdena av C provet med värdet RFU grundläggande eluering bufferten.
      2. Beräkna koncentrationen av eluerade substratet (i mM) i supernatanterna C provet genom att dividera sin korrigerade RFU värden av lutningen på eluering-buffert-baserade kalibreringen kurvan (se steg 4.6.1.3).
      3. Att bestämma substrat koncentration (i mM) SAMB stamlösningen används för att skapa assay proverna i steg 4.1.4.2, baserat på följande ekvation:
        Equation 1
        Här är cSAMB molära koncentrationen av SAMB stamlösning beredd på avsnitt 4.1.3; cC är molära koncentrationen av eluerade substratet i C provet beräknas vid steg 4.6.3.3; Vr är volymen av reaktionsblandningen skapade genom tillsats av reaktion bufferten i steg 4.1.4.5 och enzym bufferten i steg 4.2.3.; och VSAMB är volymen av SAMB stamlösning i C provet (steg 4.1.4.2).
      4. Beräkna den molära koncentrationen av substratesna i varje R prov baserat på molära koncentrationen av SAMB stamlösning (i mM) enligt volymen (i µL) mätt i varje prov reaktionsröret vid steg 4.1.4.2.
    4. Utföra databehandling.
      Obs: Dataanalys beror på syftet med experimentet. Videon visar ett exempel för databehandling en substrat-beroende kinetiska studier på HIV-1 PR med hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrat. De inledande hastighet värdena beräknas utifrån antalet C-terminal klyvning fragment och plottas mot tillämpad substrat koncentrationen. Kinetiska parametrar bestäms av en icke-linjär regressionsanalys Michaelis-Menten.
  7. Återvinning av magnetiska pärlor
    Obs: Efter att ha utfört en analys, magnetiska agaros pärlorna kan samlas och återvinnas.
    1. Samla använda magnetiska pärlor med MPC och kasta bort supernatanten.
      1. Tvätta pärlorna med 1,8 mL följande buffertar, i angiven ordning: regenerering buffert A (0,05% Tween-20, 0,5 M NaOH), regenerering buffert B (0,05% Tween-20), regenerering buffert C (0,05% Tween-20, 100 mM EDTA, pH 8), regenerering buffert B, regenerering buffert D ( 0,05% Tween-20, 100 mM NiSO4, pH 8), regenerering buffert B och regenerering buffert E (0,5% Tween-20, 30% etanol, pH 7).
        Obs: Om förfarandet som tvätt, se steg 4.1.1.4.
    2. Lagra återvunnet pärlorna i regenerering buffert E vid 4 ° C.

5. analys

  1. Provberedning
    Obs: Efter utför Ni-NTA magnetiska-pärla-baserade analysen, assay supernatanterna kan analyseras av. I det här fallet, hoppa över steg 5.1.1 och 5.1.2. Det är dock också möjligt att analysera den rena fluorescerande substrat lösningen eller sin klyvning fragment efter in-lösning rötning med proteasen sevärdheter. I det här fallet Fortsätt protokollet med steg 5.1.1.
    1. Bered substratlösningen enligt steg 4.5.1 renat fluorescerande.
    2. Utföra i-lösning matsmältningen.
      1. Utbyta eluering buffert med klyvning buffert i 0,5 mL 10K ultrafiltrering enheten och alikvot proverna att brytas ned i 1,5 mL mikrocentrifugrör.
        Obs: för sidan analys, vi aliquoted 68 µL av varje substrat, men antalet provrör och volymen av substratlösningen ska aliquoted kan optimeras enligt individuella experimentell design.
      2. Lägga till enzymet lösningen i proverna.
        Obs: För sidan analys, vi tillämpas 2 µL av HIV-1 PR, beredda som beskrivs av Bozóki et al.14, men volymen kan optimeras enligt individuella experimentell design. Det rekommenderas att använda klyvning buffert att upplösa eller späd enzymet.
      3. Inkubera proverna enligt experimentell design.
        Obs: För sida analysen, inkuberas vi reaktionsblandningen under 45 minuter vid 37 ° C, men inkubationstiden och temperaturen måste ställas in enligt experimentell design.
      4. Avsluta reaktionen genom att utföra steg 5.1.3.
    3. Förbereda provet för sidan.
      Obs: De fluorescerande-substrat-innehållande proverna kan beredas för sidan genom en nondenaturing eller en denatureringen metod. För användning av nondenaturing eller denatureringen villkor, Följ steg 5.1.3.1 eller 5.1.3.2, respektive.
      1. Förbereda ett nondenatured prov: Blanda 30 µL av provet med 6 µL av 6 x nondenaturing prov-lastning buffert (300 mM Tris, 20% glycerol, 0,05% bromofenolblått, pH 6,8).
      2. Förbereda en denaturerade provet: Blanda 30 µL av provet med 6 µL av 6 x denatureringen prov-lastning buffert (300 mM Tris, 20% glycerol, 0,05% bromofenolblått, 12% SDS, 100 mM β-merkaptoetanol, pH 6,8), och värma proverna vid 95 ° C i 10 min.
  2. SDS-PAGE analys
    Obs: Om bara nondenatured (beredd i steg 5.1.3.1) prover ska analyseras, en infödd sida kan också utföras frivilligt. I det här fallet, hoppa över avsnitt 5.3.
    1. Förbereda en SDS-Polyakrylamidgelen (användning 14 separera och 4% stapling gel) och fyll tanken med elektrofores buffert (2,5 mM Tris, 19,2 mM glycin, 0,01% SDS).
    2. Lägg proverna (bereddes i steg 5.1.3.1 eller 5.1.3.2) till brunnarna i en polyakrylamidgel och utför elektrofores vid 120 V spänning.
    3. Ta bort gel kassetten från modulen körs och placera gelen i en tvätt tank.
      Obs: Nondenatured prover är redan synliga i gel, även med blotta ögat eller med en DRBT.
  3. I-gel utvinningsarbete och upptäckt av fluorescerande proteiner
    Obs: För att upptäcka de fluorescerande proteinerna i denaturerat prover (bereddes i steg 5.1.3.2) på DRBT, SDS måste tvättas från gelen, att delvis renature proteinerna.
    1. Tillsätt ~ 100 mL destillerat vatten till gelen och skölj gelen minst 30 min.
      Obs: För att förbättra SDS avlägsnande, ersätta vattnet varje 10 min, eller skölj upp till 60 min.
    2. Visualisera de fluorescerande proteinerna med hjälp av en DRBT eller genom UV-avbildning.
  4. Konventionella Coomassie färgning av gel
    1. Fläcken gelen med Coomassie Brilliant blått färgämne att visualisera nonfluorescent proteiner.

Representative Results

Figur 1A visar den schematiskt strukturen av en representativ fluorescerande rekombinant protein substrat som kan bearbetas av HIV-1 PR på dess specifika klyvning webbplats sekvens. Figur 1B representerar substrat produktion och deras möjliga tillämpningar i proteas-analyser, inklusive Ni-NTA magnetiska-pärla-baserade assay eller sida.

För att få tillförlitliga data genom fluorimetry, krävs en kalibrering, för att fastställa kvantiteterna fluorescerande substrat och klyvningsprodukter. För detta, fluorescens intensitetsvärden för de olika substratesna i de olika buffer villkor behöver mätas och behöver vara korrelerade med deras koncentrationer i analyseras koncentrationer (figur 3). Kalibreringskurvornas lutning värden kan tillämpas för att avgöra mängden substrat och klyvningsprodukter i assay proven. Backarna kalibreringskurvornas är oberoende av klyvning webbplats sekvenser infogas i substratesna (tabell 11) och potentiellt kan användas för en rad substrat smält till samma typ av fluorescerande protein. Zooma in grafer visas för alla Linjära regressioner, att förstora lägre koncentration spänner också (figur 3). Det är viktigt att notera att kalibreringen behöver utföras noggrant eftersom en korrekt fördelning av datapunkter krävs för en pålitlig kalibrering. Av denna anledning används tvåfaldiga seriella utspädning för att bereda proverna för kalibrering, eftersom R2 värdet anger en god korrelation mellan koncentrationen av fluorescerande protein och fluorescens endast om tillräckligt antal datapunkter har använts för att täcka det hela koncentrationsintervallet. Dessutom kan experimentella fel starkt påverka precisionen i kalibrering; Således, en grafisk utvärdering av raderna regression kan behövas också.

En mängd enzymatisk mätningar kan utföras av proteashämmare analysen, inklusive en granskning av effekten av substrat koncentrationen på reaktion hastighet (figur 4A). Av icke-linjär regression, kan data användas för att bestämma enzym kinetiska parametrar (t.ex. vmax och Km). En otillräcklig pärla suspension och spridning och en felaktig reaktion uppsägning kan orsaka suboptimala resultat (figur 4B), som inte är lämpliga för beräkning av pålitligt enzym kinetiska värden.

Ett beroende av produkt bildandet i tid kan bestämmas genom analysen (figur 5A) (t.ex. under optimering av parametrarna klyvning reaktion). Enzymaktivitet i närvaro av en hämmare kan också undersökas (figur 5B) för bestämning av aktiva enzym koncentration och hämmande konstant. Använder samma metod, kan andra hämmares effekter också kontrolleras med analysen.

Proteas analysen är användbar när du undersöker effekterna av pH på enzymaktivitet, liksom. Figur 6A representerar beroendet av enzymaktivitet på pH vid exemplet av TEV PR, som har en bred optimala pH-intervall (pH 6-9). Om pH beroendet av enzymaktivitet studeras (eller enzymer med en sura pH optimal behöver mätas), är det nödvändigt att överväga att affinitet bindningen av rekombinant substrat till pärlorna kan vara begränsad på något surt pH. En förhöjd dissociation av substratesna från pärlorna (figur 6B) kan orsaka en snedvridning av analysens resultat. För att överväga spontana substrat dissociationen från pärlor, behöver de värden som uppmätts för reaktion prover korrigeras med dem i B prover.

Figur 7 visar att de nondenatured fluorescerande proteinerna kan göras åtskillnad mellan i gel baserat på deras färger, med blå ljus genomlysning (figur 7A). Om bestämning av molekylvikt av substrat/klyvning fragment är nödvändigt, kan denaturering villkor också användas för provberedning, eftersom fluorescerande proteiner kan vara delvis renatured i gel, och kan upptäckas av UV belysning (Figur 7B) eller genom Coomassie färgning (figur 7 c). Om R proverna analyseras, är endast C-terminal sönderdelningsprodukterna synlig (figur 7 c), medan N-terminala klyvning fragment och de uncleaved substratesna sitta kvar till pärlorna. Ibland, proteiner kan denatureras delvis trots användande nondenaturing förhållanden (figur 7 c), och medan de nondenatured proteinerna är mer riklig, denaturerad former är också påvisas i provet. Detta fenomen påverkar inte detektion av proteolytisk klyvning men måste beaktas när det gäller kvantitativa densitometry nondenatured prover.

Trots den detaljerade beskrivningen visas endast för en 2 mL-tube-baserad analys, kan analysen anpassas för ett 96 brunnar plattan-baserade system (figur 8), som har redan testats framgångsrikt i vårt laboratorium (visas inte). 96-väl plattan-anpassade formatet är helt kompatibel med de fluorimetriskt och elektroforetiska analyser, liksom, och de erhållna uppgifterna kan också utvärderas baserat på de metoder som beskrivs i detta dokument.

Figure 3
Figur 3 : Kalibreringskurvor. Representativa substrat kalibreringskurvorna demonstreras med exemplet av två rekombinant substrat smält till olika C-terminala fluorescerande Taggar: (A och B) hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 (C och D ) Hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP. Zooma in siffror visas också att representera en linjär regressionslinje för datapunkterna i den 0-0,005 mM substrat koncentrationsintervall. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 4
Figur 4 : Bestämning av enzymet kinetiska parametrar. Substrat-beroende kinetiska mätningar utfördes av HIV-1 PR (på aktiv koncentration på 41,2 nM). De inledande hastighet värdena var plottas mot substrat koncentrationen och Michaelis-Menten icke-linjär regressionsanalys utfördes. Felstaplar representera SD (n = 2). (A) A representativa optimalt resultat visas med exemplet av hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mApple fusion protein substrat. (B) en representativa suboptimala resultat visas också för hans6- MBP-KARVL * AEAM-mTurquoise2 substrat, där inställningen av ordentlig substrat koncentrationer var problematiskt på grund av en otillräcklig homogenisering SAMB stamlösning , medan relativt höga fel orsakades av felaktig reaktion uppsägning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Tid-kurs och hämmande studie. (A) Hans 6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP rekombinant fusion protein substrat (med en slutlig koncentration på 0.00326 mM) var klyvs av HIV-1 PR (på aktiv koncentration på 41,2 nM), och frisläppandet av fluorescerande PIVQ-mEYFP proteolytiska fragment mättes till utföra en tid-kursen analys. Mätningarna utfördes vid fem olika tidpunkter. Felstaplar representera SD (n = 2). (B), hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP användes som substrat (vid 0,0015 mM) för att bestämma vilken amprenavir hämmande effekt på aktiviteten av HIV-1 PR (vid en total koncentration på 163,8 nM). Av Rita data, den halv maximal hämmande koncentrationen (IC50) kunde bedömas och aktiva enzym koncentration (aktiv koncentration på 41,2 nM) av tillämpad HIV-1 PR kan också beräknas baserat på hämning kurvan. Felstaplar representera SD (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Studera beroendet av enzymaktivitet och spontana substrat dissociation på pH. (A) den hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrat (i 0.033 mM) användes för att mäta enzymaktiviteten av TEV PR (med en slutlig total koncentration på 91.42 nM) i klyvning buffert anges till en olika pH, mellan utbudet av 6,5-8,5. Felstaplar representera SD (n = 2). Plottade data har gått tidigare publicerade14. (B) baserat på de relativa fluorescerande intensitetsvärdena av substrat tom proverna, spontana dissociationen av hans6- MBP-VSQNY * PIVQ-mTurquoise2 substrat (0.033 mM) från de magnetiska pärlorna studerades med hjälp av klyvning buffert med olika pH, mellan 6.0-8,5. Plottade data har gått tidigare publicerade14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Påvisande av proteiner i gelen genom olika metoder. (A) Uncleaved och HIV-1 PR-rötas fusion protein substrat efter nondenaturing provberedning var visualiserat av blå ljus genomlysning efter SDS-PAGE. Klyvning reaktionen utfördes av i-lösning matsmältning. (B) omedelbart efter sidan, endast nondenatured proteiner kunde detekteras i gel av UV belysning, medan efter avlägsnande av SDS, de tidigare denaturerat fluorescerande proteinerna blev delvis renatured och detekterbar. Proverna var beredda från supernatanterna Ni-NTA magnetiska-pärla-baserade analysens. (C) Coomassie färgning kan också användas för protein detektering, efter den i-gel utvinningsarbete. SDS-gåvan i gel-maj orsaka den partiell denaturering av proteinet infödda, men i native prover, de nondenatured formerna är rikligare. Proverna var beredda från supernatanterna Ni-NTA magnetiska-pärla-baserade analysens. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 8
Figur 8 : 96-well plate-baserade anpassning av assay plattformen. (A) analysen kan utföras inte bara i 2 mL rör men i brunnarna av en plattan med 96 brunnar, samt. Här visar vi schematiska för tillämpningen av analysen att studera ett fiktivt proteas specificitet med hjälp av en serie av fluorescerande substrat, som kan innehålla vildtyp (wt) eller muterade (mut-1 till mut-4) klyvning webbplats sekvenser. För hantering av de magnetiska pärlorna, är en 96-väl kompatibel magnetiska partikel koncentrator (MPC) att användas i experiment. Alla de angivna volymerna är relaterade till en enda brunn. För att jämföra klyvning effektiviteten i de olika substratesna, kan substrat konvertering bedömas utifrån andelen substrat-blank-korrigerade RFU värden av reaktion proverna, med tanke på substrat-blank-korrigerade RFU värdena av de relaterade substratet kontrollprover som 100. (B) efter fluorimetry, separerade supernatanterna analysens prover kan också analyseras genom sida och de fluorescerande protein-komponenterna kan analyseras direkt eller efter i-gel utvinningsarbete vid nondenaturing och denatureringen prov förberedelse, respektive. De tre olika assay provtyper illustreras också i varje figur: C = substrat kontroll, B = substrat tomt och R = reaktion. Substratet kontrollprover i eluering buffert, medan substratet tomt och reaktion proverna är klyvning buffert. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Buffert Fluorescerande protein CV % pister (%)
Eluering mTurquoise2 6,04
Klyvning 9.11
Eluering mApple 10,92
Klyvning 12,68

Tabell 11: koefficient av variansen (CV %)-värden av backarna i substrat kalibreringskurvorna. För att testa om fluorescensen av de rekombinanta protein substratesna är beroende av webbplatsen infogade klyvning, utfördes kalibreringar av serien av mApple - och mTurquoise2-smält substrat (sex varianter för varje, innehållande olika klyvning webbplats sekvenser av HIV-1 proteas), både i eluering och klyvning buffertar. Vi fann att CV % värden i backarna under 15% i alla fall, vilket innebär att en enda underlag kalibrering kan utnyttjas för utvärdering av de olika mått som utförs av substrat varianter innehållande samma fluorescerande tagg.

Discussion

På grund av de intensiva industri- och akademiska utredningarna av proteolytiska enzymer och ständig efterfrågan på snabba och prisvärda HTS-kompatibel proteas assay plattformar med detta, har vi utvecklat ett magnetisk-pärla-baserade fluorescerande proteas assay. Analysen är baserad på användning av rekombinanta fusionsproteinerna som kan vara nya alternativ till de allmänt utnyttjad syntetisk peptid substratesna.

I formatet utvecklade analysen, är de fusion protein substratesna orörlig till ytbehandlar av Ni-kelat-coated magnetiska agaros pärlor. Substratet bilagan tillhandahålls av den N-terminalen hans6 affinitet tag av proteinet fusion, som smälts samman direkt på en MBP-tagg för att underlätta vikningen och förbättra vattenlösligheten av substrat13. MBP följs av klyvning platser av TEV PR och ett proteas sevärdheter. Den förstnämnda kan tjäna som en kontroll klyvning plats i analysen, medan den senare kan bearbetas av proteashämmaren för utredas. Webbplatsen för klyvning är utbytbara; en kort dsDNA sekvensen kodar för webbplatsen klyvning av intresse kan infogas i den flexibla 'kloning kassetten' av uttrycket plasmiden av ligering. Rekombinant fusionsproteinerna innehåller en mycket stabil, monomer fluorescerande protein tagg på C-terminalen, som möjliggör endpoint detektion av enzym-befriade, fluorescerande C-terminal sönderdelningsprodukterna släppt på proteolytisk klyvning ( Figur 1A). De renade fluorescerande intakt substrat löst i olika buffertar används också för kalibrering för att bedöma molara koncentrationerna av substrat och klyvningsprodukter. Dessutom, efter fluorimetry, kan assay komponenterna analyseras av SDS-PAGE, liksom. Både enhetliga (nondenatured) och denaturerat fluorescerande proteiner kan visualiseras i gel, omedelbart efter elektrofores eller efterföljande i-gel utvinningsarbete, respektive. Denna ytterligare förfarande-i kombination med en konventionell Coomassie Brilliant Blue färgning-kan användas effektivt för verifiering av assay resultaten (figur 1B).

Analysförfarandet består av enkla, lätt-att-utföra steg i en låg volym-format som kan vara fullt anpassade till en hög genomströmning automatisk miljö. Dock anses självständigt utföra analysen antingen manuellt eller med ett automationssystem, följande delar av analysen vara avgörande och behöver särskild uppmärksamhet medan du utför proceduren. (i) homogenitet av magnetiska pärla lösningen. En homogen magnetiska pärla lösning måste användas under hela analysen, både i rening och tvätt steg. Särskilt, beror tillförlitligheten av proteashämmare analyser starkt på korrekt alikvotering substrat-anslutna magnetiska pärla (SAMB) lager lösningarna. För att öka effektiviteten av indragning och spridning, är det rekommenderat att ställa pärla koncentrationen mellan 2% och 10% (v/v). Under provberedning, användning av buffertar kompletteras med Nonjonaktivt rengöringsmedel (t.ex. Triton x-100 eller Tween 20) upp till 2% kan också minska efterlevnaden av magnetiska pärlor plastytor. Efterlevnaden av pärlor till väggarna i ampuller prov kan undvikas om pärla upphängningarna tillämpas noggrant på bottnarna i injektionsflaskorna i stället för på väggarna i provrör. Homogenitet av magnetiska pärlor under den enzymatiska reaktionen är också kritiska och kan säkerställas genom kontinuerligt skakar proverna vid 600 rpm under inkubation. Pärlor är ordentligt dispergerade i rundade eller flatbottnade plast varor, medan användningen av V-botten injektionsflaskor inte rekommenderas. Ett suboptimala resultat som orsakats av felaktig pärla homogenisering är representerade i figur 4B. (II) upphörande av reaktion prover.  En annan fördel med metoden är att den enzymatiska reaktionen kan sägas utan användning av denaturering värmebehandling eller någon potentiellt interfererande kemiska agenser15. Uppsägning kan utföras helt enkelt genom att separera de magnetiska pärlorna från reaktionsblandningen, använda en konventionell magnetiska partikel koncentrator. Medan den borttagna reaktion-bufferten innehåller aktiva enzymet och genererade C-terminala fluorescerande sönderdelningsprodukterna, kvar på uncleaved substrat till pärlorna. Tack vare förekomsten av aktiva enzymet i reaktion bufferten behöver avskiljandetillvägagångssättet utföras noggrant för tillförlitlig slutpunktsidentifiering. Innan placera provet injektionsflaskorna i anrikningsverket, rekommenderas det att tillämpa en kort spin centrifugering. Efter att placera rören i anrikningsverket, tillhandahålla minst 15 s för pärlorna ska samlas in. Liten rörelse av separatorn och tillbaka kan underlätta insamling av pärlorna. Överväg att uppsägning under en manuellt utförd separation, oftast tar längre tid än inledandet av reaktionerna. Därför rekommenderas en cirka 2 min registrerade fördröjning mellan initiationerna om samma inkubationstiden måste tillämpas på alla prover.

Principen beskrivs proteolytiska analysens är relativt enkel; men garanteras mångsidigheten hos systemet av flexibelt och stabilt substrat struktur. Enskilda optimering av analysen kan begränsas endast av affinitet pärlorna förenlighet med de tillämpade villkor, reagenser och tillsatser. I samförstånd med tillverkarens protokollet fann vi också att affinitet bindningen av substrat till Ni-NTA pärla ytbehandlar väsentligen försvagar vid pH ≤ 6,515. Därför rekommenderas att tillämpa substrat tom prover parallellt med reaktion proverna, och frekvensen av spontana substrat dissociation måste beaktas vid utvärderingen av resultaten.

I de fall, där magnetiska-pärla-baserade analyser inte kan utföras på grund av användning av pärla-inkompatibla komponenter eller lågt pH, kan i-lösning rötning av de renade rekombinant substratesna tillämpas också. I dessa fall reaktion blandningarna kan analyseras genom elektrofores, och proteinerna kan visualiseras i gel baserat på protokollet beskrivs. För att undersöka proteolytiska aktivitet, kanske också alternativa verktyg för fluorimetry i i-lösning matsmältningen och i-gel påvisande av proteiner. En nyhet i systemet utformat substrat är tillämpningen av en i-gel utvinningsarbete steg efter denaturering SDS-PAGE. Medan infödda (nondenatured) fluorescerande proteiner behåller sin fluorescens under elektrofores, avskaffas egenskapen fluorescerande vid denaturering (figur 7B). Dock kan fluorescensen av denaturerad proteiner återvinnas delvis genom avlägsnandet av SDS från gelen. Således gör en separation av reaktion komponenter med denatureringen villkor inte bara den fluorescens-baserade men molekylär-vikt-baserade identifiering möjligt. En annan fördel med fluorescerande i-gel upptäckt jämfört med analysen av en Coomassie-färgade gel är att de (native eller renatured) fluorescerande proteinerna lätt kan identifieras i gel baserat på deras fluorescens (se figur 7). Detta kan vara viktigt om klyvning reaktioner utförs på prover som innehåller nonfluorescent föroreningar eller proteiner som mycket liknar molekylvikt av varandra.

Proteas analyser använder Likaså utformade substrat har redan tidigare publicerade8,9,10, och även om webbplatsen klyvning av intresse i de fall var också ligger mellan en affinitet-tagg och en fluorescerande protein, assay systemet presenteras här upprepar inte endast de beskrivna idéerna men kombinerar olika fördelarna med tidigare plattformar och också kompletterar dem med ytterligare förbättringar: i) utnyttjandet av en MBP fusion partner, ii) de förekomsten av en TEV PR kontroll klyvning webbplats, iii) användningen av nyutvecklade monomer FPs, och iv) tillämpningen av en unik substrat kalibreringen. Analysen själv var särskilt utformad för att vara användbar för enzym specificitet och kinetiska studier i en säker, tids - och kostnadseffektiva sätt, utan behov av dyra instrumentering. Metoden syftar till att vara en lämplig och prisvärd verktyg för både industriell och akademisk forskning. På grund av flexibiliteten i 'kloning kassett' av uttrycket plasmiden, kan systemet vara lämpliga för snabb och billig generering av rekombinant substrat bibliotek. Häri beskrivna analysen är ett möjligt verktyg för genomförandet av substrat specificitet, enzym mutagenes, och hämning studier och även ge ett alternativt verktyg för att utföra enzymkinetik. Assay plattformen (från bakteriell cell störningar vid fastställandet av de kinetiska parametrarna) kan anpassas till en HTS - och automation-baserad miljö och, eventuellt, kan tillämpas i industriella proteas hämmare screening eller antivirala läkemedel utveckling. Anpassning av analysen för konkurrenskraftiga proteolys är dessutom även i framtiden omfattningen av vårt laboratorium. I en sådan konkurrenskraftiga analys, två olika substrat-varje innehållande en olika klyvning webbplats smält till en olika C-terminala fluorescerande tagg-är avsedda att användas samtidigt i samma klyvning reaktion för att undersöka preferensen av den studerade enzymet för givet mål sekvenser. Dessutom är användningen av en 96-well plate-anpassade assay form (figur 8) också att vara optimerad för mutation screening med hjälp av en rad substrat med modifierade klyvning webbplats sekvenser vid cysteinproteaser.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete var stöds delvis av projektet ”PHARMPROT teaming” GINOP-2.3.2-15-2016-00044 och dessutom finansieras av högre utbildning institutionella Excellence programmet av ministeriet för mänskliga kapacitet i Ungern, inom ramen för den Bioteknik tematiska program av den Debrecens universitet. Författarna är tacksamma för medlemmarna i laboratorium av retrovirala biokemi för deras vetenskapliga hjälp under assay utvecklingen och även för deras tålamod under inspelningen analysen (särskilt till Norbert Kassay, Krisztina Joóné Matúz och Vanda Toldi, som dyker upp i bakgrunden i videon). Författarna vill även säga speciellt tack vare Gedeon Richter Plc., särskilt till Dr Zoltán Urbányi för att tillåta Beáta Bozókis arbete i Institutionen för biokemi och molekylärbiologi som gästforskare. Författarna vill också utöka sin tacksamhet till György Zsadányi, Balázs Tőgyi, Balázs Pöstényi och Zoltán Király från Multimedia och E-learning Technical Center av den Debrecens universitet för den professionella hjälpen som ljud och video produktion.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10K Amicon tubes Merck-Millipore UFC501096
2-Mercaptoethanol (β-ME) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  M6250
40% Acrylamide/Bis solution 37.5:1 Bio-Rad 1610148
Acetic acid  Merck 100063
Agarose SERVA 11404.04
Alpha Imager HP gel documentation system ProteinSimple
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  A3678
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  A9518
Beckman Coulter Allegra X-22 centrifuge Beckman Coulter 392185
Black half-area plates Greiner bio-One 675086
Bromophenol blue Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  B0126
CutSmart buffer (10x) New England Biolabs B7204S For plasmid linearization (step 1.1.1)
Dark Reader transilluminator Clare Chemical Research DR-45M
DNase I  New England Biolabs M0303L
Dynamag-2 magnetic particle concentrator Thermo Fischer Scientific 12321D
Escherichia coli BL21(DE3) competent cells  Thermo Fischer Scientific (Invitrogen) C600003
Ethanol Merc-Millipore 100983
Ethylenediaminetetraacetic acid  (EDTA) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  798681
Gel Loading Dye, Purple (6X) New England Biolabs B7024S
Glycerol Merck 356350
Glycine Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  G7126
High-Speed Plasmid Mini Kit GeneAid PD300
Imidazole Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  56750
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Thermo Fischer Scientific (Invitrogen) AM9464
Jouan CR 412 centrifuge Jouan CR412
Labinco LD-76 Rotator  Labinco 7600
Luria-Bertani (LB) broth Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  L3022
Lysozyme  Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  L6876
Magnesium chloride Scharlau MA0036
MERCK eurolab ultrasonic bath MERCK USR54H
Millifuge Eppendorf spin centrifuge Millipore CT10
Mini-PROTEAN 3 Electrophoresis Cell Bio-Rad
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  T9281
NanoDrop 2000 Thermo Fischer Scientific
NheI-HF restriction endonuclease New England Biolabs R3131L
Nickel(II) sulfate (NiSO4) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  656895
Ni-NTA magnetic agarose beads  Qiagen 36113
Orbital shaker Biosan OS-20
PacI restriction endonuclease New England Biolabs R0547L
PageBlue Protein Staining Solution  Thermo Fischer Scientific 24620
Phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  P7626
Protein Lobind Micro-centrifuge tubes  Eppendorf 22431102
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28704
Snijders Press-to-Mix shaker  Gemini 34524
Sodium-acetate trihydrate Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  S7670
Sodium-chloride Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  S9888
Sodium-hydroxide  Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  S5881
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain Thermo Fischer Scientific S7563
T4 DNA ligase Promega M180A
Thermo shaker Biosan TS-100 with SC-24 accessory block
Tris Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  T1503
Tween 20 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)  P2287
WALLAC VICTOR2 1420 multilabel counter Wallac Oy, Turku, Finland

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meldal, M. Smart Combinatorial Assays for the Determination of Protease Activity and Inhibition. Molecular Informatics. 24, (10), 1141-1148 (2005).
  2. Rao, M. B., Tanksale, A. M., Ghatge, M. S., Deshpande, V. V. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62, (3), 597-635 (1998).
  3. Zhang, G. Protease assays. The Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda, MD. (2012).
  4. Woelcke, J., Hassiepen, U. Fluorescence-based biochemical assay formats. A Practical Guide to Assay Development and High-Throughput Screening in Drug Discovery. Chen, T. CRC Press. Boca Raton, FL. (2010).
  5. Richardson, P. L. The determination and use of optimized protease substrates in drug discovery and development. Current Pharmaceutical Design. 8, (28), 2559-2581 (2002).
  6. Diamond, S. L. Methods for mapping protease specificity. Current Opinion in Chemical Biology. 11, (1), 46-51 (2007).
  7. Schilling, O., Overall, C. M. Proteome-derived, database-searchable peptide libraries for identifying protease cleavage sites. Nature Biotechnology. 26, (6), 685-694 (2008).
  8. Askin, S. P., Morin, I., Schaeffer, P. M. Development of a protease activity assay using heat-sensitive Tus-GFP fusion protein substrates. Analytical Biochemistry. 415, (2), 126-133 (2011).
  9. Chaparro-Riggers, J. F., Breves, R., Michels, A., Maurer, K. H., Bornscheuer, U. A GFP based assay for the determination of hydrolytic activity and substrate specificity of subtilisins under washing conditions. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 35, 74-77 (2005).
  10. Patel, D., Frelinger, J., Goudsmit, J., Kim, B. In vitro assay for site-specific proteases using bead-attached GFP substrate. Biotechniques. 31, (5), 1194-1198 (2001).
  11. Branchini, B. R., et al. Sequential bioluminescence resonance energy transfer-fluorescence resonance energy transfer-based ratiometric protease assays with fusion proteins of firefly luciferase and red fluorescent protein. Analytical Biochemistry. 414, (2), 239-245 (2011).
  12. Zhou, C., Yan, Y., Fang, J., Cheng, B., Fan, J. A new fusion protein platform for quantitatively measuring activity of multiple proteases. Microbial Cell Factories. 13, (1), 44 (2014).
  13. Fox, J. D., Waugh, D. S. Maltose-binding protein as a solubility enhancer. Methods in Molecular Biology. 205, 99-117 (2003).
  14. Bozóki, B., et al. A recombinant fusion protein-based, fluorescent protease assay for high throughput-compatible substrate screening. Analytical Biochemistry. 540-541, 52-63 (2018).
  15. Mótyán, J. A., Miczi, M., Bozóki, B., Tözsér, J. Data supporting Ni-NTA magnetic bead-based fluorescent protease assay using recombinant fusion protein substrates. Data in Brief. 18, 203-208 (2018).
  16. Balleza, E., Kim, J. M., Cluzel, P. Systematic characterization of maturation time of fluorescent proteins in living cells. Nature Methods. 15, 47-51 (2018).
  17. Hebisch, E., Knebel, J., Landsberg, J., Frey, E., Leisner, M. High variation of fluorescence protein maturation times in closely related Escherichia coli strains. PLoS One. 8, e75991 (2013).
  18. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering, Design and Selection. 14, 993-1000 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics