Anwendungen der räumlich-zeitliche Zuordnung und Partikel-Analyse-Techniken zu quantifizieren, intrazellulären Ca2 + Signalisierung In Situ

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Genetisch codierte Ca2 + Indikatoren (GECIs) haben sich radikal verändert wie in-situ Ca2 + Bildgebung durchgeführt wird. Um die Wiederherstellung von Daten aus solchen Aufnahmen zu maximieren, ist die entsprechende Analysen von Ca2 + Signale erforderlich. Die Protokolle in diesem Papier erleichtern die Quantifizierung von Ca2 + Signale an Ort und Stelle mit räumlich-zeitliche Zuordnung und partikelbasierten Analyse aufgezeichnet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Drumm, B. T., Hennig, G. W., Baker, S. A., Sanders, K. M. Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ. J. Vis. Exp. (143), e58989, doi:10.3791/58989 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ca2 + Bildgebung von isolierten Zellen oder bestimmte Arten von Zellen im intakten Gewebe oft offenbart komplexe Muster von Ca2 + -Signalisierung. Diese Tätigkeit erfordert eine sorgfältige und eingehende Analysen und Quantifizierung, so viele Informationen über die zugrunde liegenden Ereignisse wie möglich zu erfassen. Räumliche, zeitliche und Intensität Parameter untrennbar mit Ca2 + Signale wie Dauer, Ausbreitung, Geschwindigkeit, Frequenz und Amplitude können einige biologische Informationen zur intrazellulären Signalgebung erforderlich. Hochauflösende Ca2 + imaging in der Regel Ergebnisse bei der Akquisition von großen Dateien, die in Bezug auf die Bildinformationen in quantifizierbare Daten zu übersetzen, und dieser Prozess zeitaufwendig sind werden anfällig für menschliche Fehler und Vorurteile. Analyse von Ca2 + Signale von Zellen in-situ stützt sich in der Regel auf einfache Intensität Messungen aus willkürlich ausgewählten Regionen von Interesse (ROI) in ein Sichtfeld (FOV). Dieser Ansatz ignoriert viel wichtiger Signalisierung Informationen in das Blickfeld. Somit ist zur Wiederherstellung von Informationen aus solchen hochauflösende Aufnahmen mit Ca2 +Farbstoffe oder optogenetische Ca2 + erhalten Maximierung Bildgebung, angemessene räumliche und zeitliche Analyse der Ca2 + Signale erforderlich. Die Protokolle, die in diesem Dokument beschriebenen werden beschrieben, wie ein hohes Volumen an Daten von Ca2 + bildgebenden Aufnahmen ermöglichen umfassendere Analyse und Quantifizierung von Ca2 + Signale aufgezeichnet von Zellen mit einer Kombination aus abgerufen werden kann räumlich-zeitliche Karte (STM)-Basis und Partikel-basierte Analyse. Die Protokolle beschreiben auch wie verschiedene Muster von Ca2 + signalisieren beobachteten in andere Zelle, die Bevölkerung vor Ort angemessen analysiert werden können. Zur Veranschaulichung wird die Methode Ca2 + Signalisierung in eine spezialisierte Population von Zellen im Dünndarm, interstitiellen Zellen von Cajal (ICC), mit GECIs prüfen.

Introduction

Ca2 + ist eine allgegenwärtige intrazellulären Messenger steuert eine Vielzahl von zellulären Prozessen, z. B. Muskel Kontraktion1,2, Stoffwechsel3, Zelle Verbreitung3,4, 5, Stimulation der Freisetzung von Neurotransmittern im Nerv Klemmen6,7und Aktivierung der Transkription Faktoren im Zellkern. 7 intrazellulären Ca2 + Signale oft nehmen die Form von vorübergehenden Erhöhungen im cytosolischen Ca2 +, und diese können spontan oder ergeben sich aus Agonist Stimulation abhängig von der Zelle Typ8. Räumliche, zeitliche und Intensität Parameter untrennbar mit Ca2 + Signale wie Häufigkeit, Dauer, Ausbreitung, Geschwindigkeit und Amplitude können die biologische erforderlich für intrazelluläre Signalwege5, Informationen 7 , 9. zytoplasmatischen Ca2 + Signale können resultieren aus dem Zustrom von Ca2 + aus dem extrazellulären Raum oder über Ca2 + Release aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) über Ca2 + Release-Kanäle wie Ryanodin-Rezeptoren (RyRs) und Inositol-Tri-Phosphat-Rezeptoren (IP3Rs)10. RyRs und IP-3Rs können beide tragen zu der Generation von Ca2 + Signale und die konzertierte Öffnung dieser Kanäle, die in mit verschiedenen Ca2 + Zustrom Mechanismen Kombination kann dazu führen, dass eine Vielzahl von Ca2 + Signalisierung Muster Das sind geprägt durch die Zahlen und Wahrscheinlichkeit von Ca2 + Zustrom Kanälen, das Expressionsprofil von Ca2 + Release-Kanäle, die Nähe zwischen Ca2 + Zustrom und Release-Kanäle und Ausdruck und Verteilung von Ca2 Öffnen + Reuptake und Extrusion Proteine. Ca2 + Signale dauern Form von einheitlichen, langlebig, hohe Intensität globale Schwingungen, die für mehrere Sekunden oder sogar Minuten dauern propagieren intrazelluläre und interzelluläre Ca2 + Wellen, die intrazelluläre Strecken kreuzen kann mehr als 100 µm10,11,12,13,14,15,16oder mehr kurze, räumlich lokalisierte Ereignisse wie Ca2 + Funken und Ca2 + Züge, die auf Zehntausende Millisekunde Fristen auftreten und weniger als 5 µm17,18,19,20zu verbreiten.

Fluoreszenz-Mikroskopie hat am meisten benutzt, um Ca2 + Signalisierung in Zellen isoliert und kultiviert und in intakten Geweben zu überwachen. Traditionell, diese Experimente beteiligt die Verwendung von fluoreszierenden Ca2 + Indikatoren, ratiometrischen und nicht ratiometrischen Farbstoffe wie Fura2, Fluo3/4 oder Rhod2, unter anderem 21,22,23. Diese Indikatoren wurden entwickelt, um auf Zellmembranen durchlässig sein und dann in den Zellen durch die Spaltung der Estergruppe über endogene Esterasen eingeschlossen werden. Bindung von Ca2 + , die hohe Affinität Indikatoren verursachten Veränderungen in Fluoreszenz, wenn die Zellen und Gewebe von entsprechenden Wellenlängen des Lichts beleuchtet wurden. Die Verwendung der Zelle durchlässig Ca2 + Indikatoren verbessert stark unser Verständnis von Ca2 + Signalisierung in lebenden Zellen und räumliche Auflösung und Quantifizierung dieser Signale, die nicht möglich war, durch Prüfung Ca2 + Signale erlaubt durch andere Mittel, wie Elektrophysiologie. Traditionelle Ca2 + Indikatoren müssen jedoch einige Einschränkungen, z. B. Immunofluoreszenz, die über erweiterte Aufnahme Perioden24auftritt. Während neuere Ca2 + Indikator Farbstoffe wie z. B. Cal520/590 haben stark verbesserte Signal-Rausch-Verhältnis und die Fähigkeit, lokale Ca2 + Signale25zu erkennen, können Probleme mit Immunofluoreszenz immer noch ein Problem für einige Forscher bleiben. 26,27,28. Steilen Immunofluoreszenz schränkt auch die Vergrößerung, die Rate der Bildaufnahme, und Auflösung, die für Aufnahmen verwendet werden kann, da mehr objektive Leistung und höhere Raten von Bildaufnahme erfordern erhöhte Erregung Lichtintensität, die Immunofluoreszenz erhöht.

Diese Einschränkungen des traditionellen Ca2 + Indikatorfarbstoffen verstärkt werden, wenn Sie Ca2 + Signale an Ort und Stelle aufnehmen, zum Beispiel wenn Signale Aufnahme intrazellulären Ca2 + von intakten Gewebe. Aufgrund der oben genannten Probleme Visualisierung von Ca2 + Signale in Situ Zelle durchlässige Ca2 + Indikatoren zu verwenden wurde beschränkt auf low-Power-Vergrößerung und reduzierte Preise der Bilderfassung, Einschränkung der Fähigkeit der Ermittler zu erfassen und zeitlich oder räumlich eingeschränkt subzelluläre Ca2 + Signale zu quantifizieren. Daher ist es schwierig zu erfassen, zu analysieren und zu schätzen wissen die räumliche und zeitliche Komplexität der Ca2 + Signale, die in der Generation der gewünschten biologischen Reaktionen wichtig sein kann, wie oben beschrieben gewesen. Analyse von Ca2 + Signale von Zellen in-situ stützt sich in der Regel auf einfache Intensität Messungen aus ausgewählten Regionen von Interesse (ROI) in ein Sichtfeld (FOV). Die willkürliche Wahl der Anzahl, Größe und Position des ROIs, abhängig von der Laune des Forschers, kann die Ergebnisse stark beeinflussen. Neben inhärenten Bias mit ROI-Analyse, dieser Ansatz ignoriert ein Großteil der wichtigen Signalisierung Informationen in das Blickfeld, als dynamische Ca2 + -Ereignisse innerhalb einer willkürlich gewählten ROI für die Analyse ausgewählt sind. Analyse des ROIs versäumt darüber hinaus Auskunft über die räumlichen Eigenschaften der Ca2 + Signale beobachtet. Beispielsweise ist es nicht möglich um zu unterscheiden zwischen einem Anstieg Ca2 + infolge einer Vermehrung Ca2 + Welle und eine sehr lokalisierte Ca2 + release Event von Tabellen von Ca2 + Signale innerhalb eines ROI.

Das Aufkommen der genetisch codierten Ca2 + Indikatoren (GECIs) hat sich radikal verändert wie Ca2 + Bildgebung durchgeführt in Situ29,30,31,32,33 sein kann . Es gibt mehrere Vorteile bei der Verwendung von GECIs über Farbstoffe. Das wichtigste ist vielleicht, dass Ausdruck der GECI Zelle gezielt erfolgen kann, die reduziert unerwünschte Hintergrundgeräusche Kontamination von Zellen nicht von Interesse. Ein weiterer Vorteil von GECIs gegenüber traditionellen Ca2 + Indikatoren ist, dass Immunofluoreszenz reduziert (wie Fluoreszenz und consequentially Immunofluoreszenz tritt nur auf, wenn Zellen aktiv sind), im Vergleich zu Farbstoff beladen Exemplare, besonders bei hohen Vergrößerung und hohe Bild erfassen34. So kurze, lokalisierte subzellulären Ca2 + Signale in Situ imaging mit GECIs, wie z. B. die GCaMP Reihe von optogenetische Sensoren bietet Ermittler die Möglichkeit zur Aufzeichnung und untersuchen Ca2 + signalisieren in den Zellen innerhalb ihrer nativen Umgebungen, die zuvor nicht möglich gewesen. Um die Verwertung von Informationen aus solchen hochauflösende Aufnahmen zu maximieren, ist die entsprechende räumliche und zeitliche Analyse der Ca2 + Signale erforderlich. Es sei darauf hingewiesen, dass während GECIs einige klare Vorteile bieten können, haben neuere Studien gezeigt, dass Ca2 + Bildgebung von großen Populationen verschiedener neurochemischen Klassen von Neuronen, die gleichzeitig mit herkömmlichen erfolgreich durchgeführt werden kann Ca2 + Indikatoren, die in der tierischen35nicht genetisch codiert sind. Dieser Ansatz verwendet post-hoc-Immunohistochemistry, um mehrere verschiedene Klassen von Neuronen feuern mit hoher Frequenz in den synchronisierten Stössen zu offenbaren, und das Potenzial, das genetische Veränderungen für das Tier mit den physiologischen eingegriffen haben können vermieden Verhalten der Ermittler versucht,35,36zu verstehen.

Die Protokolle, die in diesem Dokument beschriebenen erleichtern vollständigere Analyse und Quantifizierung von Ca2 + -Signale aufgezeichnet von Zellen an Ort und Stelle mit einer Kombination aus raumzeitlichen Karte (STM)-Basis und Partikel-basierte Analyse. Die Protokolle beschreiben auch wie verschiedene Muster von Ca2 + signalisieren beobachteten in andere Zelle, die Bevölkerung vor Ort angemessen analysiert werden können. Zur Veranschaulichung wird die Methode Ca2 + Signalisierung in eine spezialisierte Population von Zellen im Dünndarm, interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) prüfen. ICC sind spezialisierte Zellen im Gastrointestinaltrakt (GI), die dynamische intrazellulären Ca2 + -Signalisierung, aufweisen wie visualisiert mit Mäusen, die mit dem Ausdruck GCaMPs37,38,39,40, 41,42. Ca2 + Transienten in ICC sind verbunden zu einer Aktivierung von Ca2 +-aktiviert Cl Kanäle (kodiert durch Ano1), die wichtig bei der Regulation der Erregbarkeit der intestinalen glatten Muskel Zellen (SMCs)43, 44,45. Somit ist die Studie von Ca2 + Signalisierung in ICC grundlegend für das Verständnis der intestinalen Motilität. Der murinen Dünndarm bietet ein hervorragendes Beispiel für diese Demonstration, da gibt es zwei Klassen von ICC, die anatomisch getrennt und unabhängig voneinander visualisiert werden: ich) ICC befinden sich im Bereich zwischen der Kreis- und längs glatten Muskulatur Schichten, rund um den Auerbach-Plexus (ICC-MY). Diese Zellen dienen als Schrittmacher Zellen und erzeugen die elektrische Aktivität bekannt als langsame Wellen46,47,48,49; (II) ICC befinden sich ebenfalls unter einem Plexus reich an den Klemmen des motorischen Neuronen (tiefe muskuläre Plexus, also ICC-DMP). Diese Zellen dienen als Vermittler von Antworten auf enterischen motor Neurotransmission37,39,40,50. ICC-MY ICC-DMP unterscheiden sich morphologisch und ihrer Ca2 + Signalisierung Verhaltensweisen unterscheiden sich radikal um ihre spezifischen Aufgaben zu erfüllen. ICC-mein Ganglion in Form und bilden ein Netzwerk von miteinander verbundenen Zellen über Gap Junctions51,52. Ca2 + -Signale in ICC-mein Manifest als kurze und räumlich lokalisierte Ca2 + Release Ereignisse, die an mehreren Standorten asynchron durch die ICC-mein Netzwerk als visualisierte innerhalb einer FOV (abgebildet mit einem 60 X Ziel)38. Diese asynchrone Signale zeitlich gliedern sich in Cluster 1 Sekunde, die, wenn zusammen tabelliert, belaufen sich auf einen Netto 1 s zellulären Anstieg Ca2 +. Diese Signale verbreiten von Zelle zu Zelle innerhalb des ICC-Netzwerks und deshalb organisieren Ca2 + -Signalisierung, aus subzellulären Websites in einem Gewebe Breite Ca2 + Welle erzeugt. Zeitliche clustering und Summierung von Ca2 + Signale ICC-mein Ca2 + transiente Cluster (CTCs)38bezeichnet worden. CTC auftreten rhythmisch (z. B. ganz ähnliche Laufzeiten und ähnliche Zeiträume zwischen CTCs) 30 Mal pro Minute in der Maus. Umgekehrt, ICC-DMP sind Spindel förmigen Zellen, teilweise mit sekundären Prozesse, die zwischen SMCs und Krampfadern Nerv Prozesse zu verteilen und nicht selbständig bilden ein Netzwerk51,52. ICC-DMP Form Lücke Kreuzungen mit SMCs, jedoch und Funktion innerhalb dieser größere Synzytien, bekannt als die SIP Synzytien53. Ca2 + Signale auftreten an mehreren Standorten entlang der Länge der Zellen, aber diese Transienten nicht mitgerissen oder zeitlich gruppiert, wie in ICC-MY37beobachtet. Ca2 + Signale in ICC-DMP auftreten in einer stochastischen Weise mit variabler Intensität, Dauer und räumlichen Eigenschaften. Die Protokolle unter, am Beispiel von Ca2 + Signalisierung in ICC-MY und ICC-DMP, Techniken zur Analyse komplexer Signalisierung in bestimmte Arten von Zellen an Ort und Stelle zu beschreiben. Wir nutzten das induzierbare Cre Lox-p-System GCaMP6f ausschließlich in ICC, auszudrücken, nach Aktivierung des Cre-Rekombinase (Cre) angetrieben durch ein ICC-spezifischen Promotor (Kit) induzieren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle verwendeten Tiere und die Protokolle, die in dieser Studie durchgeführt wurden in Übereinstimmung mit den nationalen Instituten der Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Alle Verfahren wurden vom institutionellen Animal Use and Care Committee an der University of Nevada, Reno genehmigt.

1. Generation der KitGCaMP6f Mäuse

  1. Ai95 Kreuz (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f Mäuse) und c-Kit+ / Cre-ERT2 (Kit-Cre Mäuse), ICC spezifische GCaMP6f mit dem Ausdruck ihrer Tiere (Kit-Cre-GCaMP6f Mäuse) zu generieren.
    Hinweis: GCaMP6f durch seine ausgewiesene Effizienz in der Berichterstattung lokalisiert verwendet wurde, signalisiert kurze intrazelluläre Ca2 + in-situ und in-vivo-54.
  2. Injizieren Sie Kit-Cre-GCaMP6f Mäuse mit Tamoxifen, im Alter von 6 – 8 Wochen induzieren Cre-Rekombinase Aktivierung und anschließende GCaMP6f Ausdruck in ICC (Abbildung 1).
    1. Zum Erstellen der Tamoxifen-Lösung lösen 80 mg Tamoxifen (siehe Tabelle der Materialien) in 800 μl Ethanol (siehe Tabelle der Materialien) in eine Küvette und Wirbel für 20 Minuten.
    2. Fügen Sie 3,2 mL Distelöl (generische) zum Erstellen von Lösungen von 20 mg/mL und dann für 30 Minuten vor der Injektion zu beschallen.
    3. Injizieren von Mäusen (intraperitoneale Injektion; IP) mit 0,1 mL Tamoxifen-Lösung (2 mg Tamoxifen) an drei aufeinander folgenden Tagen. GCaMP6f Ausdruck durch Genotypisierung bestätigen und Mäuse 10 Tage nach der ersten Injektion zu verwenden.
      1. Genotyp-Mäusen durch Zuschneiden ein kleines Stück des Ohres von jedem Tier. Verwenden Sie dann die HotSHOT Methode55 für genomische DNA-Isolierung durch Inkubation Ohr Clips bei 95 ° C für 60 min. in 75 mL der NaOH und dann von 75 mL Tris-Puffer neutralisieren. Verwenden Sie standard-PCR Genotyp jedes einzelnen Tieres, 2 mL der DNA in eine 20 mL-Reaktion mit GCaMP6f spezifische Primer56bestimmen. Führen Sie 10 mL PCR-Produkt auf einem 2 % Agarosegel, Wild-Typ zu bestimmen (297 bp) und Mutant (~ 450 bp) Bands.

2. Vorbereitung des Gewebes auf Ca2 + Imaging

  1. Betäuben Sie Mäuse durch Inhalation mit Isofluran (4 %, siehe Tabelle of Materials) in einem belüfteten Haube und dann Opfer durch zervikale Dislokation.
  2. Mit scharfen Schere öffnen der Bauch von Mäusen, entfernen den Dünndarm und in Krebs-Ringer-Bikarbonat-Lösung (KRB). Öffnen Sie den Dünndarm entlang der mesenterialen Grenze und spülen Sie Intraluminal Inhalte mit KRB Weg. Mit scharfen Dissektionen, die Schleimhaut und Sub-Schleimhaut Schichten entfernen.
    Hinweis: KRB-Lösung hat die folgende Zusammensetzung (in mM): NaCl 118,5, KCl 4.7, CaCl2 2,5, MgCl2 1.2, Nahco33 23,8, KH2PO4 1.2, Traubenzucker 11.0. Diese Lösung hat einen pH-Wert von 7,4 bei 37 ° C Wenn zum Gleichgewicht mit 95 % O2- 5 % CO2sprudelte.
  3. Mit Hilfe der kleinen Pins, pin der Dünndarm Gewebe auf der Basis einer 5 mL Volumen, 60 mm Durchmesser Sylgard-beschichtete Teller mit der kreisförmigen glatten Muskulatur Schicht nach oben. Durchspülen der Vorbereitung mit erwärmten KRB-Lösung bei 37 ° C für Gleichgewichtherstellung Zeit von 1 Stunde vor dem experimentieren.
  4. Nach dieser Periode Gleichgewichtherstellung führen Sie an Ort und Stelle Ca2 + Bildgebung von kleinen Darm ICC-MY und ICC-DMP mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie (die Bilder in diesem Protokoll wurden mit einem konfokalen Mikroskop, ausgestattet mit einer drehenden Scheibe erworben). Aufgrund der Vorteile des oben beschriebenen GECIs verwenden Zeitraffer Bilder mit hoher Auflösung (> 30 Frames pro Sekunde, FPS) kombiniert mit high-Power-Ziele (60 – 100 X) Filme von dynamischen Ca2 + Signale in ICC zu erwerben.
    Hinweis: Um Gewebe Bewegung zu verringern, gelten Nicardipin (0,1 – 1 μM) bei Aufnahmen wie zuvor37,38,39,40,41beschrieben.
  5. Unterscheiden ICC-MY und ICC-DMP in den Dünndarm mit unterschiedlichen anatomischen Lage, Morphologie und basalen Ca2 + Aktivitätsmuster.
    1. Suchen Sie ICC-mein auf der Ebene der Auerbach-Plexus, zwischen den runden und längs Glattmuskel Schichten des Dünndarms. Sie sind stellate geformt, bilden ein verbundenes Netzwerk (Abbildung 3A). CTC (oben beschrieben) breiten sich durch das Netzwerk der ICC-MY mit ein regelmäßiges Vorkommen von ~ 30 Zyklen pro Minute.
    2. Im Gegensatz dazu suchen Sie ICC-DMP in einer Ebene auf der Ebene der tiefen Muskulatur Plexus, zwischen der kreisförmigen glatten Muskelschicht und der submucosal Plexus. ICC-DMP bilden ein Netzwerk und sind Spindel förmigen Zellen (Abbildung 2A), die keine regelmäßigen verbreitende Veranstaltungen ausstellen und stattdessen Feuer stochastische, lokalisierte intrazelluläre Ca2 + Transienten.
  6. Unabhängig von der Software zur Datenerfassung genutzt speichern Sie Filme als ein Stapel von TIFF-Bildern.

3. Analyse der stochastischen Ca2 + Signale in ICC-DMP mit räumlich-zeitliche Zuordnung (STM)

  1. ICC-DMP mit räumlich-zeitliche Zuordnung mit einer Kombination von ImageJ Software (NIH, USA, kostenlos zum download auf http://imagej.nih.jov/ij) und Individualsoftware gemacht (Volumetrie, Version, G8d, GWH, funktionsfähig unter Mac OS, Grant Hennig grant.hennig@ Kontakt zu analysieren Med.uvm.edu in Bezug auf Anfragen für Volumetrie Zugang und Nutzung)
    Hinweis: Ein alternativer Ansatz, diese räumlich-zeitliche Karten mit ImageJ allein vollständig zu analysieren ist auch in späteren Abschnitten (ab Schritt 3,9) zur Verfügung gestellt.
  2. Öffnen Sie Volumetrie und verwenden Sie rechten Mausklicks, um Ordner mit Film-Dateien zu öffnen. Klicken Sie links auf die Movie-Datei analysiert werden, um sie in Volumetrie öffnen (muss im unkomprimierten TIFF-Format sein). Einmal geöffnet, wird der Film in eine blau umrandete Fenster (Film) enthalten, die eine große Fläche des rechten Bildschirms umfassen wird. Die linke Seite des Bildschirms wird der Plot-Fenster (obere 4/5ths) und Spuren (untere 1/5th) enthalten.
  3. Passen Sie die Dimensionen des Films indem Sie die Umschalttaste gedrückt halten und gleichzeitig Scrollen mit der mittleren Maustaste (MMB, verkleinert) oder scrollen Sie nach unten mit dem MMB (vergrößert). Initiieren oder Wiedergabe durch Drücken der Taste "A"; die Geschwindigkeit der Wiedergabe kann durch Drücken der Up und down Pfeiltasten eingestellt werden.
  4. Um ein STM mit Volumetrie erstellen, zeichnen Sie einen ROI über eine gesamte Zelle, indem Sie die Umschalttaste gedrückt halten, während Sie klicken und ziehen die linke Maustaste gedrückt. Stellen Sie die Ausrichtung des ROI durch Scrollen mit der MMB an den Ecken des ROI. Wenn der ROI ist im Ort über die Zelle analysiert werden (Abb. 2A), Verwendung Rechtsklicks in das Filmfenster Zugriff auf "ROI STMs – STMyAvg > xRow" und Links klicken, um ein STM die Zellaktivität in der Plot-Fenster erstellen (gibt es auch eine Option zur Auswahl "STMxAvg > yRo w ", welches ausgewählt ist wird abhängen, ob die Ausrichtung der Zelle mehr, mit dem x ausgerichtet ist oder y Achse, zum Beispiel die Zelle hervorgehoben Figur 2A orientiert sich mehr an der y-Achse").
  5. Klicken Sie links auf die STM in der Plot-Fenster und drücken Sie "P" zu subtrahieren durchschnittliche Hintergrundgeräusche und drücken Sie die Taste "H", um den Kontrast der STM erhöhen. Speichern Sie die STM durch Rechtsklick darauf "STM Last speichern - speichern STM als .tif" zugreifen und dann Linksklick um als TIFF speichern.
  6. Der Rest der ICC-DMP-Analyse erfolgt in ImageJ. ImageJ besteht aus zwei Hauptkomponenten, eine Symbolleiste mit einer festen Position auf der Oberseite des Monitors und eine mobile Benutzeroberfläche. Öffnen Sie mit ImageJ STM TIFF-Datei des ICC-DMP Ca2 + Aktivität (Datei-öffnen auf der Symbolleiste Bild J).
  7. Offenen erstellt die Volumetrie STM, die vertikal orientierten Zeit haben wird. ImageJ öffnet automatisch TIFF-Dateien als RGB oder 16-Bit-Bilder. Um die Bildqualität zu verbessern, klicken Sie links "Bild" in der Symbolleiste ImageJ. Blättern Sie auf die erste Option "geben Sie"um ein Dropdown-Menü mit verschiedenen Bildformaten anzuzeigen, führen Sie einen Bildlauf über 32-Bit", und klicken Sie links um zu ändern.
  8. Um die STM gegen die Zeit von links nach rechts lesbar zu machen, klicken Sie links auf die ImageJ-Symbolleiste auf den folgenden Pfad: "Bild-Transformation-Drehen 90 Grad Links". Es ist auch möglich, STMs von in-situ Ca2 + Aktivität mit ImageJ allein ohne Volumetrie und das Linescans unten zu erstellen.
    Hinweis: Nachdem die STMs erstellt wurden, werden sie auf die gleiche Weise analysiert, unabhängig davon, die welche Software verwendet wurde, um sie zu erzeugen. Um diese alternative Methode für die Erstellung von STMs in ImageJ überspringen, überspringen Sie Schritt 3.19.
  9. Um STMs mit ImageJ erstellen, öffnen Sie den Stapel von TIFF-Dateien, aus denen sich die Aufzeichnung der ICC-DMP Ca2 + Aktivität (File-Open auf der ImageJ-Symbolleiste). ImageJ öffnet automatisch TIFF-Dateien als RGB oder 16-Bit-Bilder. Um die Bildqualität zu verbessern, klicken Sie links "Bild" in der Symbolleiste ImageJ. Blättern Sie auf die erste Option "geben Sie"um ein Dropdown-Menü mit verschiedenen Bildformaten anzuzeigen, führen Sie einen Bildlauf über 32-Bit", und klicken Sie links um zu ändern.
  10. Hintergrundgeräusche (infolge von Auto-Fluoreszenz oder Kamera Rauschen) sollte jetzt aus dem Film abgezogen werden. Klicken Sie die "Rechteckige Auswahl" Funktion in der ImageJ-Schnittstelle und zeichnen Sie einen ROI (durch Linksklick und ziehen auf gewünschte Größe und Form) über die Hintergrundfluoreszenz des Films.
  11. Klicken Sie nach der Auswahl des ROI links auf "Analyze" in der Symbolleiste ImageJ, und klicken Sie dann links auf "Histogramm" aus dem angezeigten Dropdown-Menü. Ein Popup-Fenster erscheint dann Forschenden über Palette Pixelwerte berechnen; ImageJ hat die Werte des ROI vorgewählten also links klicken Sie "OK".
  12. Nach einem Klick auf "OK", erscheint ein neues Popup-Fenster mit einem Histogramm zeigt die Verteilung der Werte für das Pixelrauschen des Hintergrunds innerhalb des ROI. Beachten Sie den Mittelwert, nachfolgend das Histogramm und schließen Sie dann das Popup-Feld.
  13. Zurück zu den 32-Bit-Film klicken Sie und wählen Sie die gesamte FOV per Linksklick aus dem offenbarten Dropdown-Menü 'Bearbeiten' in der ImageJ-Werkzeugleiste auf "Auswahl" scrollen und Linksklick auf "Alle auswählen".
  14. Linksklick "Prozess" auf der Symbolleiste ImageJ, Blättern Sie zu "Math" und "Subtrahieren" offenbarten Dropdown-Menü die Linksklick.
  15. Ein Popup-Fenster erscheint, wo ein Wert abgezogen, die FOV eingefügt werden können. Geben Sie den Mittelwert aus dem Histogramm im Schritt oben 3.12 erworben, und klicken Sie auf "OK". ImageJ fragt dann alle Bilder im TIFF-Stapel zu verarbeiten (und nicht nur die einzelnen Frames des Films ist derzeit auf). Klicken Sie auf "Ja".
  16. Nach einem Klick auf "Ja", wird der Film schwarz. Um dies zu korrigieren, klicken Sie links "Bild" in der ImageJ-Symbolleiste und Scroll über "Anpassen". Klicken Sie links auf die offenbarten erste Option für "Helligkeit/Kontrast" (B & C). Dieses holt oben ein Pop-up-Box, wo verschiedene Aspekte der Helligkeit und Kontrast geändert werden können. Klicken Sie links auf "Auto" einmal um die Qualitätssteigerung im Film zu zeigen. Lassen Sie dieses B & C Pop-up-Fenster offen für eine spätere Verwendung.
  17. Zum Erstellen einer womit zuerst Rechtsklick auf der Linie-Auswahl-Werkzeug in der ImageJ-Schnittstelle, Optionen für verschiedene Linien zu offenbaren; Klicken Sie links auf "Segmentierte Linie", um es aus der Liste auswählen. Mit dem "Segmentierte Linie" Werkzeug ausgewählt klickt links Verwendung Single zum Zeichnen einer Linie entlang der Mitte ein individuelles ICC-DMP-Achse. Jedes einzelne Links-Klick wird die Linie an diesem bestimmten Punkt beheben und die Zeile kann dann frei verschoben werden weiter in jedem gewünschten Winkel. Nach Abschluss die Linie doppelte Links klicken Sie, um die Linie zu fixieren.
  18. Linke Maustaste "Bild" auf ImageJ-Symbolleiste und Scroll über "Stacks" und klicken Sie links auf die Option "Reslice". Es erscheint ein Popup-Feld; Klicken Sie links auf die Option "Drehen 90 Grad", dies wird die womit von links nach rechts zu orientieren, so dass es kalibriert und gegen die Zeit auf der x-Achse mit Platz auf der y-Achse gelesen werden kann. Klicken Sie auf "OK", um die STM erstellen.
  19. Die Intensität der STM wird mit hoher Intensität Ca2 + Signale unterschiedlicher weiß, aus weiß oder hellgrau, je nach Intensität dargestellt auf einem Graustufen erstellt werden. Normalerweise wird der Kontrast zwischen den erstellten womit müssen verbessert werden. Tun Sie dies, indem Sie auf "Auto" auf dem B & C Pop up-Fenster.
  20. Die Intensität der Fluoreszenz der womit wird auf die STM in willkürlichen Pixelwerte dargestellt. Um genau zu messen, die Amplitude der Ca müssen2 + Signale von STM, die Fluoreszenz-Werte aus dem STM (F) nun normalisiert werden. Zeichnen Sie mithilfe der Funktion "Rechteckige Auswahl" in der ImageJ-Schnittstelle einen ROI auf einer Fläche von STM, die meisten einheitlichen und zuletzt intensiven Bereich der Fluoreszenz (F0) anzeigt.
  21. Wiederholen Sie die Schritte in 3.11, 3.12, einen Mittelwert (F-0) zu erhalten der Intensität innerhalb der ausgewählten ROI und wählen Sie dann die gesamte STM durch Linksklick auf "Bearbeiten-Auswahl-Select All" aus der Symbolleiste ImageJ.
  22. Klicken Sie links "Prozess" auf ImageJ-Symbolleiste und wählen Sie "Math"; Klicken Sie links "Teilen" aus den offenbarten Optionen. Geben Sie im folgenden Popup-Feld den Mittelwert (F0) Schritt 3.21 entnommen. Auf die gesamte STM durch (F0) dividiert wird die STM schwarz; korrigieren Sie dies durch Klicken auf 'Auto' auf der B & C pop-up-Box. Jetzt ist die womit für Amplitude, mit der Intensität der Fluoreszenz ausgedrückt als F/F0kalibriert.
  23. Die STM wird derzeit die Anzahl der Bilder im TIFF-Stapel auf der x-Achse und die Anzahl der Pixel, die die Länge der Zelle auf der y-Achse angezeigt. Um zeitliche und räumliche Informationen aus Ca2 + Signale zu quantifizieren, Kalibrieren der STM für Raum und Zeit. Linke Maustaste "Bild" in der ImageJ-Symbolleiste und Links klicken Sie auf "Eigenschaften". Ein Popup-Fenster erscheint. Geben Sie in diesem Fenster die entsprechenden Werte um die STM vollständig zu kalibrieren.
  24. Geben Sie für "Pixelbreite" die Länge der Zeit, die es braucht, um ein einzelnes Bild in Sekunden zu erfassen. Zum Beispiel bei 5 FPS geben Sie einen Wert von 0,2, für 50 FPS geben Sie ein Wert von 0,02 für 33 FPS geben Sie einen Wert von 0,033 etc.. Geben Sie für "Pixelhöhe" wie viele Mikrometer jedes Pixel repräsentiert (wird auf das Ziel verwendet und für den Erwerb verwendeten Kamera ab). "Voxel Tiefe" wird am 1 beibehalten, bevor Sie auf "OK". Keine weiteren Parameter innerhalb des Fensters angepasst werden müssen.
    Hinweis: Nach einem Klick auf "OK", wird die STM für Amplitude, Raum und Zeit vollständig kalibriert werden. Amplitude auf die STM wird F/F0, Zeit auf der x-Achse wird in Sekunden ausgedrückt werden und Raum auf der y-Achse wird in μm (Abbildung 2 b) ausgedrückt ausgedrückt werden. Ca2 + -Ereignisse auf die STM können jetzt gemessen werden, die kalibrierte STM kann auch als TIFF Einzelbild zu analysieren, zu einem späteren Zeitpunkt gespeichert werden.
  25. ImageJ hat eine Reihe von farblich gekennzeichnet-Lookup-Tabelle (LUTs), die verwendet werden, um die STM Farbencode erbaute. Wenden Sie einer eingebauten LUT durch Linksklick auf die ImageJ-Symbolleiste auf dem Weg "Bild-Lookup-Tabellen an" und wählen Sie eine LUT anzuwenden. Maßgeschneiderte LUTs kann auch auf die STM durch Linksklick auf die ImageJ-Symbolleiste auf dem Weg "Datei-Import-LUT" und wählen Sie dann die LUT importieren importiert werden. Zum Beispiel hatte die STM in Abbildung 2 gezeigt die benutzerdefinierte LUT 'QUBPallete' (Queens University Belfast, UK) angewendet, um Code warmen Farben (rot, Orange) Bereichen intensiv Ca2 + Fluoreszenz und kalte Farben (schwarz, blau) als Bereiche von niedrigen Ca2 + Fluoreszenz.
  26. Um eine Amplitude Kalibrierung-Leiste, um das Spektrum der Amplituden, vertreten durch die verschiedenen Farben zeigen einzufügen, Blättern Sie zu "Extras" Linksklick "Analyze" von ImageJ-Symbolleiste und Menü "Kalibrierung Bar" offenbarte. Optionen werden angegeben für die Grösse, Zoom, Reichweite und Position auf die STM für die Kalibrierung Bar; passen Sie die Einstellungen wie gewünscht und klicken Sie auf "OK". Beachten Sie, dass wenn die Kalibrierung Bar eingefügt wird, ImageJ eine neue STM enthalten ist schafft, verlassen die Originalversion ohne Kalibrierung Bar intakt und getrennt.
    Hinweis: Wenn das "Overlay" Kästchen angekreuzt ist, wenn die Kalibrierung Bar einfügen, wird eine neue STM nicht generiert werden.
  27. Klicken Sie Analyse von Ca2 + Einzelveranstaltungen links zunächst auf den "Geraden" Selector auf ImageJ-Schnittstelle. Zunächst klicken Sie links auf die STM, ziehen Sie eine gerade horizontale Linie durch die Mitte einer Ca2 + Veranstaltung parallel zur x-Achse (gegen die Zeit). Füllen Sie die Linie durch Linksklick ein zweites Mal (Abb. 2D).
  28. Klicken Sie auf "Analysieren" auf der ImageJ-Symbolleiste und klicken Sie links auf "Plot-Profil". Eine neue Box erscheint mit dem Plot-Profil der Ca2 + Veranstaltung (Abb. 2E).
    Hinweis: Die Option "Liste" in diesem Feld generiert eine Liste von XY-Werte der generierten Handlung, die in ein Kalkulationsprogramm, Spuren zu erstellen, bei Bedarf kopiert werden kann.
  29. Um die Amplitude der Ca2 + Veranstaltung vertreten in der Plot-Profil zu messen, klicken Sie links auf den "Geraden" Selector auf ImageJ-Schnittstelle. Anschließend zeichnen Sie eine vertikale Linie zwischen der Grundlinie der Plot-Profil auf den Gipfel der Ca2 + Veranstaltung; die Länge der Linie (dargestellt auf der ImageJ-Schnittstelle) wird die Amplitude des Ereignisses ausgedrückt als ΔF/F0 (Abb. 2E) vertreten.
  30. Mit den erworbenen Amplitudenwert, die Dauer der Ca2 + Veranstaltung gemessen werden durch das Zeichnen einer geraden Linie über die gesamte Breite des Ereignisses zum Zeitpunkt 50 % maximale Amplitude (volle Dauer bei halben maximalen Amplitude, FDHM) oder die gesamte Dauer der Veranstaltung kann gemessen werden, falls gewünscht (Abbildung 2E).
    Hinweis: Experimentatoren müssen bestimmten Kriterien für Schwellwerte gültige Ca2 + Ereignisse in diesen Aufnahmen zu entwerfen. In unseren Experimenten wurden Ca2 + -Ereignisse gekennzeichnet als gültig für die Analyse sei seine Amplitude > 15 % der maximalen Amplitude Veranstaltung im Bereich der Aufnahme. Allerdings diese Schwellenwerte hängt von den spezifischen Geweben und Zellen unter studieren und sind nur willkürliche Richtlinien, die gezielte Optimierung für jede Art von Gewebe und Zellen benötigen.
  31. Durch Ziehen einer Linie entlang der Aufschlag oder Abschlag von der Ca2 + Grundstück Nebenwirkungsprofil, kann die Rate der steigenden oder fallenden entsprechend berechnet werden. Nachdem die Linie gezeichnet wird, kann der Mauscursor auf den Punkt verschoben werden, wo die Zeile beginnt und wo es endet. Wenn der Cursor über diese Punkte still steht, wird in der unteren linken Seite der ImageJ-Schnittstelle X, y-Koordinaten für diesen Standort angezeigt. Also, durch den Erwerb von X, y-Werte für die Zeile beginnt (x1, y-1) und endet (x2, y2), die bei steigenden oder fallenden (ΔF/s) kann berechnet werden, wie die Steigung der Linie, y2 - y1 / x2 - x1 (Abbildung 2F ).
  32. Um die Vermehrung oder räumliche Ausbreitung der eine Ca2 + -Ereignis zu berechnen, klicken Sie links auf den "Geraden" Selector auf ImageJ-Schnittstelle. Ziehen Sie eine gerade vertikale Linie entlang der Länge der Ca2 + Veranstaltung entlang der y-Achse. Die Länge der Linie (dargestellt auf der ImageJ-Schnittstelle) wird die räumliche Ausbreitung der Veranstaltung ausgedrückt als μm (Abbildung 2) vertreten.
  33. Bestimmen Sie die Geschwindigkeit eines verbreitende Ca2 + Events Zeichnen einer Linie entlang der verbreitende vor der Veranstaltung und die Berechnung der Steigung der geraden. Dies kann manuell erfolgen, in ähnlicher Weise beschrieben im Schritt 3,32, durch die Bestimmung x, y-Werte für die Zeile beginnt (x1, y-1) und endet (x2, y2); Diese Werte werden beim Bewegen Sie der Mauszeiger auf die STM liegt in der unteren linken Seite des ImageJ-Interface angezeigt.
  34. Bei der Abholung der gewünschten Parameter für Ca2 + Event Quantifizierung bündeln Sie diese Werte durchschnittlich um Mittelwerte für jeden Parameter pro Zelle zu erzeugen; Alternativ stellen Sie die Rohwerte in einem Histogramm Verteilung zeigen ihre Reichweite (Abb. 2 H).

(4) Quantifizierung von CTCs im ICC-mein mit Partikel basierte Analyse

  1. Bevor Sie Filme in Volumetrie mit PTCLs analysieren, müssen die räumliche und zeitliche Kalibrierung des Films in den Dateinamen eingefügt werden. Bearbeiten Sie alle Dateien zu analysierenden in Volumetrie im Titel enthalten die Anzahl der Sekunden, die jeden Frame entspricht und auch die Anzahl der Mikrometer, die jedes Pixel entspricht getrennt mit einem einzigen Strich mit den Werten, die in eckigen Klammern eingeschlossen. Zum Beispiel sollte ein Film auf 33 FPS mit einem Objektiv 60 X (512 x 512) erworben [0,22 – 0,033] haben in den Dateinamen eingefügt.
  2. Öffnen Sie Volumetrie und verwenden Sie rechten Mausklicks, um Ordner mit Film-Dateien zu öffnen. Klicken Sie links auf die Movie-Datei analysiert werden, um es in Volumetrie (Abb. 3A, muss im unkomprimierten TIFF-Format) zu öffnen.
  3. Um Ca2 + Signale aus die gesamte FOV genau zu berechnen, wird der Film zuerst durchlaufen, Differenzierung und Glättung an, um Hintergrund-Störungen (Kamera Lärm, Auto-Fluoreszenz etc.) entfernen und das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen. In das Filmfenster, Rechte Maustaste, um ein Menü und mit richtigen Klicks Access "STK Filter-differenzieren", rechts klicken und wieder geben Sie einen Wert zu differenzieren, drücken Sie die Eingabetaste, und klicken Sie links um zu gelten (für Filme auf 33 FPS Wert 2 erworben (∆t = ± 66-70 msec) funktioniert gut, der Wert wird als die Rate der Image Capture erhöht erhöht).
    Hinweis: Differenzierung in diesem Zusammenhang verringert sich die Intensität der Bereiche der Aufnahme (Pixel), die keine dynamische Aktivität zeigen, über die Anzahl der Frames angegeben. So, wenn ein Wert von "2" eingefügt wird, wird jedes Pixel in jedem Frame der Aufnahme analysiert und wenn innerhalb dieses Rahmens gibt es keine dynamische Änderung in Pixel Fluoreszenz 1 vor und 1 Frame nach, wird die Intensität innerhalb dieser Pixel aus der Aufzeichnung subtrahiert werden. Also, nicht dynamische Hintergrundgeräusche entfernt und Signal-Rausch wird erhöht.
  4. Glätten Sie die differenzierte Film durch Anwenden eines Gauß-Filters. Rechtsklick in das Filmfenster, um ein Menü aufzurufen und mit richtigen Klicks Access "STK Filter-Gauss KRNL" rechts klicken und wieder einfügen eines Wertes (verwenden Sie immer eine ungerade Zahl, für Filme mit 33 FPS erworben, ein Wert von 5 funktioniert gut, 1,5 x 1,5 µm StdDev 1.0) einen Wert eingeben, drücken Sie die Eingabetaste und Linksklick um (Abb. 3 b) anzuwenden.
  5. Erstellen von PTCLs durch die erste Auswahl einen Zeitraum des Films, der einen ruhenden Punkt (20 – 40 Frames) gefolgt von das Auftreten von einem CTC und auch 20 – 40 Frames nach dem CTC beinhaltet beginnen. Um dies zu tun, Blättern Sie durch den Film mithilfe der MMB Scrollen von links nach rechts auf den gelben Balken.
  6. Mit der Auswahl Rechtsklicks Verwendung in das Filmfenster zugreifen "STK-Ops – Rampe DS PTCLinfo" und klicken Sie links um zu gelten. Diese Funktion führt eine PTCL-Analyse-Routine, die schrittweise die Schwelle von höchster Intensität auf minimale Intensität Rampen. Dies wird grafisch in der Plot-Fenster als ein Grundstück von Lärm und auch im Fenster "Spuren" als drei farbige Spuren mit der grünen Spur zeigt die Anzahl der PTCLs, die rote Spur zeigt PTCL Durchschnittsgröße und die blaue Spur zeigt die absolute Intensität angezeigt Schwelle.
    Hinweis: Die Anzahl und durchschnittliche Größe des PTCLs an jeder Schwelle wird automatisch berechnet und dann eine halb-manuelle Schwelle angewendet, mit der Intensität an die bei denen die durchschnittliche Größe der PTCLs beginnt zu sinken, die auftritt an den Wendepunkt der roten Spur in Trace-Fenster (Abbildung 3D, z. B. durch große Anzahl von räumlich begrenzten Lärm PTCLs Reduzierung der durchschnittlichen Größe der PTCLs).
  7. Innerhalb der Plot-Fenster drücken Sie 'H', Histogramm-Saldo die Handlung gezeigt PTCL Lärm. Zyklus durch Farbschemata durch Drücken der Taste "[" bis der Hintergrund weiß mit farbigen Spuren an der Spitze ist.
  8. Drücken Sie "F", um ein Messinstrument und Linksklick auf dem Grundstück an der Kreuzung, wo die farbigen Flächen auf der rechten Seite zu verlagern. Dies wird eine einzelne vertikale Linie in der Scroll-Leiste des Fensters Spuren markieren.
  9. Scrollen Sie im Trace-Fenster MMB links nach rechts aus dem Wendepunkt der roten Spur die markierten weißen vertikale Linie in Schritt 4.10 erstellt und dafür sorgen, dass die blaue Spur ausgewählt ist, mit der rechten Maustaste darauf, die "yAVG", die in t angezeigt wird abgelesen er unteren linken Seite des Fensters Spuren. Deaktivieren Sie die Auswahl durch Drücken der MMB einmal in das Spuren-Fenster.
  10. In das Filmfenster, drücken Sie die Taste "C", um ein Farbrad aufzurufen, dann Presse würde "Schwellenwert anpassen. Gültige PTCLs werden nun angezeigt, wie in das Film-Fenster (Abbildung 3) und diejenigen, die sättigen rot weiß sein wird. Entfernen Sie die weißen Flächen durch Scrollen mit der linken Maustaste.
  11. Führen Sie einen Bildlauf nach oben oder unten mit MMB, passen den gelben numerischen Wert im Farbrad, passen diesen Wert auf den yAVG Wert aus Schritt 4.11 genommen. Dies wird alles in rot als eine aktive Ca2 + zuweisen transiente PTCL Zeitpunkt festgelegten Schwellenwert. Um dies als eine Koordinate auf der Grundlage Partikeldatei speichern, Rechtsklicks Nutzung zugänglich "STK 3D-Save PTCLS 0' und dann nach links klicken, um die Datei zu speichern.
  12. Volumetrie beenden und erneut zu öffnen. Öffnen Sie die PTCL Datei (.gpf) im Schritt 4.13 erstellt. In einer solchen Datei werden alle aktiven Ca2 + Transienten als eine einheitliche blaue PTCL (Abbildung 3E) gespeichert. Da jede PTCL eine einzelne Entität mit eigener ID, Fläche und Umfang Koordinaten, Zustandsflags (siehe unten) und Ergebnis-Arrays ist, ist die Analyse der räumlich-zeitlichen Eigenschaften der PTCLs, oder zwischen PTCLs gestrafft.
  13. Um PTCLs Analyse zu beginnen, entfernen Sie verbleibenden PTCL Lärm (kleine ungültige PTCLs erstellt, wenn die .gpf-Datei generiert wird) mithilfe des richtigen Klicks in das Filmfenster Zugriff auf ' PTCL STKOPS-Flag Ptcls > Min = 70' und klicken Sie links um zu gelten. Diese Aktion wird PTCLs größer als 6 µm2 flag (~ Durchmesser > 2μm) und Volumetrie ordnen sie "FLAG 1" Auswahl. Wenn dieser Vorgang abgeschlossen ist, erscheint PTCLs, die oberhalb dieser Schwelle (FLAG 1) sind als eine violette Farbe in das Filmfenster, während jeder PTCLs Schwelle ihre blauen Grundfarbe (Abbildung 3F bleiben).
  14. Mit richtigen Klicks in das Filmfenster Zugriff auf erstellen Wärme Karte Darstellungen von PTCL Aktivität "PTCL-STKops-StatMap-Flag ='. Mit der rechten Maustaste auf diesem letzten Weg, kann eine Flagge Zuordnung zu analysieren eingegeben werden. Also, wenn in dem Wunsche, die PTCLs, die FLAG1 zugewiesen zu quantifizieren, geben Sie einfach "1", drücken Sie die Eingabetaste und dann Linksklick um gelten. Dies erzeugt eine Heatmap zeigt den gesamten PTCLs für die gesamte Länge der Aufnahme, mit verschiedenen Farben repräsentieren auftreten (%) während der Aufnahme (Abbildung 3, warmen Farben zeigen vermehrte Auftreten an dieser Stelle).
  15. Speichern Sie Heatmaps durch rechten Mausklick auf "STM Last speichern - speichern STM als .tif" Zugang zu und dann Linksklick um als TIFF speichern.
  16. PTCL Aktivität mit richtigen Klicks in das Filmfenster Zugang zu quantifizieren "PTCL Maßnahme-PTCLStats STK =", mit der rechten Maustaste auf diesem letzten Weg, eine Flagge Zuordnung zu analysieren eingegeben werden. Also, wenn in dem Wunsche, die PTCLs, die FLAG1 zugewiesen zu quantifizieren, geben Sie einfach "1", drücken Sie die Eingabetaste und dann Linksklick um gelten. Dadurch wird eine Reihe von Spuren im Trace-Fenster erzeugt.
  17. Volumetrie werden standardmäßig die PTCL Spuren erzeugt im Schritt 4.17. übereinander überlagern. Trennen Sie diese mit rechts klickt im Trace-Fenster zugreifen "Align-separater Trace" und klicken Sie links um zu gelten. Hierdurch werden die vier unterschiedlichen PTCL Ablaufverfolgungen angezeigt, die die Zertifizierungsstelle zu quantifizieren,2 + PTCL Aktivität in den Film zeigt PTCL Bereich (grün), PTCL Graf (rot), PTCL Größe (Cyan) und PTCL Größe Standardabweichung (blau) gegen die Zeit (Abbildung 3 H) aufgetragen.
  18. Diese Spuren können als Textdatei gespeichert werden, die in einem Tabellenkalkulationsprogramm zur weiteren Analyse importiert werden können. Um Spuren zu sparen, halten Sie die Umschalttaste gedrückt und verwenden Rechtsklicks im Trace-Fenster "Assorted-Dump ROI als Text" Zugang zu Links klicken, um die Datei zu speichern. Diese Informationen sind dann gesammelt und in Histogramme oder anderen entsprechenden grafischen Darstellungen (Abbildung 3 H) dargestellt.
  19. Um das erste Vorkommen des PTCLs (d. h. Brand Websites anschauen) zu betrachten, sind diese ersten PTCLs eine andere Flagge Anweisung gegeben. Um besser isolieren feuern Websites auftreten innerhalb des Netzwerks, nur jene PTCLs, die keine Partikel in den vorherigen Frame aber Überschneidungen mit Teilchen in den nächsten 70 ms überschneidet gelten Seiten feuern.
  20. Um diese Schwelle zu beantragen, Gebrauch in das Filmfenster Zugriff auf Rechtsklicks "PTCL Verhalten-F1 InitSites > F = 3' und Links klicken. Dies wird weisen, Initiierung von PTCLs als "FLAG 3", und PTCLs, die diese Kriterien erfüllen erscheint nun als lindgrünen Farbe im Film (Abb. 4A).
  21. Volumetrie bietet auch die Möglichkeit, zu quantifizieren und die Anzahl der PTCL Brand Websites in einer bestimmten FOV sowie Plotten ihre Wahrscheinlichkeit von feuern während ein CTC Plotten. Um diese Parameter zu analysieren, Erstellen einer Heatmap PTCLs (Flagge 3) zu initiieren, wie in Schritt 4.16 (Abbildung 4 b) beschrieben.
  22. Klicken Sie links im Fenster "Plot" und dann drücken Sie "C", um ein Farbrad und Presse würden "Schwellenwert. Die Heatmap der Einleitung PTCLs wird dann wiederum grau und weiß. Entfernen Sie alle weiß durch Scrollen mit der linken Maustaste und die Schwelle der PTCLs in der Heatmap, dass nur gültige PTCLs in grau abgedeckt werden (stellen Sie Schwelle durch Scrollen nach oben und unten mit dem MMB).
  23. Verwendung Rechtsklicks über die Heatmap im Plot-Fenster zugreifen 'STM PTCLs findende PTCLs 70' und klicken Sie links um zu gelten. Diese weisen alle grauen PTCLs in der Karte, die größer sind als 70 Pixel2 in der Größe als eine separate farbcodiert Initiation PTCL oder PTCL feuern Website (Abbildung 4) zugewiesen werden.
  24. Plotten Sie die Aktivität eines jeden dieser Brand Websites gegen die Zeit durch einen Rechtsklick auf die Karte und den Zugriff auf 'STM PTCLs erstellen PTCL Rois' und Linksklick feuern PTCL anzuwenden. Dies erzeugt ein neues Bild in das Film-Fenster mit der separate farbige PTCL feuern Websites angezeigt mit einem ROI um sie herum.
  25. Verwendung Rechtsklicks in das Filmfenster Zugriff auf ' PTCL Maßnahme-PTCLpixROIBM > = 1' und klicken Sie links um zu gelten. Dies wird alle ROIs in das Filmfenster identifizieren, enthalten mindestens eine PTCL und wird alle Aktivitäten im Rahmen dieser ROIs im Fenster "Spuren" geplottet. Standardmäßig werden diese Spuren auf einander überlagert werden. Um sie zu trennen, Rechtsklicks Verwendung im Trace-Fenster zugreifen "Align-separater Trace" und klicken Sie links um zu gelten. Um Spuren zu sparen, halten Sie die Umschalttaste gedrückt und verwenden Rechtsklicks im Trace-Fenster "Assorted-Dump ROI als Text" Zugang zu Links klicken, um die Datei zu speichern.
  26. Die Aktivität des Ortes brennen kann auch als vorkommen Karte geplottet werden. Dazu Rechtsklicks Verwendung in das Filmfenster Zugriff auf ' PTCL Maßnahme-ROI Pianola = 10' und klicken Sie links um zu gelten. Dadurch wird ein Grundstück von allen Seiten schießen gegen die Zeit in der Plot-Fenster erzeugt. Jeder Brand-Website erscheint als separat farbige Einheit, jeder auf seine eigene "Lane" und diese Grundstücke entsprechen Ca2 + PTCLs Einleitung während CTCs (Abbildung 4E) speichern diese auftreten-Karten mit der rechten Maustaste auf Zugriff auf ' STM Ladung sichern - speichern STM als .tif "und dann Linksklick um als TIFF speichern.
  27. Um die Wahrscheinlichkeit der Zündung an jedem Standort Brand während einer CTC zu quantifizieren, Rechtsklicks Verwendung in das Filmfenster Zugriff auf ' PTCL Verhalten-Marke ist = 1' und klicken Sie links um zu gelten. Dies wird alle Frames in dem Film, die PTCLs über dem Schwellenwert enthalten identifizieren und diese werden in den unteren Bereich des Fensters Film als vertikalen blauen Linien markiert.
  28. CTC manifestieren sich als schnelle clustering von asynchronen feuern aus mehreren feuern Standorten innerhalb der FOV mit ~ 1 s Lücken zwischen einzelnen CTC-Zyklus. Diese Regelmäßigkeit und lange Lücke keine aktive PTCLs zwischen CTCs wird verwendet, um ein CTC für die Analyse weiter zu definieren.
  29. Verwendung Rechtsklicks in das Filmfenster Zugriff auf "Lücke PTCL Verhalten-Block ist < =", und verwenden Sie einen Rechtsklick auf den letzten Punkt, eine Zahl einzugeben. Mit diesem Befehl wird die aktive PTCL Rahmen identifiziert in Schritt 4,28 verblockbar gruppieren und Blöcke basieren auf die Anzahl der Frames, die aktive PTCLs zu trennen. Für Aufnahmen von 33 FPS beispielsweise funktioniert ein Wert von 10 gut. Wenn aktive PTCLS weniger als 10 Frames auseinander sind (330 ms) werden diese zu einem einzigen Block für die Analyse zusammengefasst (die Blöcke werden dann als rosa Rechtecke über die vertikalen blauen Linien an der Unterseite des Fensters Film mit jeder rosa Rechteck zeigt jetzt ein CTC angezeigt).
  30. Verwendung Rechtsklicks in das Filmfenster 'PTCL Maßnahme-PTCL Veranstaltung Prob' zugreifen. Dadurch wird eine Text-Datei generiert, die in eine Tabellenkalkulation importiert werden kann. Diese Textdatei liefert eine große Menge an Daten über die Art der die Einweihungsstätten, die von Treppe 4.16, 4.23 und ihren Beitrag zu CTC definiert wurden.
    Hinweis: Die Textdatei wird zeigen die Anzahl der Einweihungsstätten (bezeichnet als "Domänen"), die Größe des Standortes in Pixel und μm2, Wahrscheinlichkeit des Ortes Einleitung feuern entweder einmal oder mehrere Male während jeder CTC (angegeben als Prozentsatz), die durchschnittliche Dauer und Größe der PTCLs bei dieser Initiation-Website, die Anzahl der CTC-Zyklen (wie definiert in Schritt 4.23) und der Prozentsatz der Brand Websites, die bei jedem CTC-Zyklus ausgelöst. Diese Informationen gesammelt und in Histogramme oder anderen entsprechenden grafischen Darstellungen (Abb. 4F) dargestellt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mit Hilfe von Kit-Cre-GCaMP6F Mäusen (Abbildung 1), dynamische Ca2 + signalisieren, dass Verhaltensweisen von ICC im Magen-Darm-Trakt in-situ abgebildet werden können. Mit der konfokalen Mikroskopie können hochauflösende Bilder von bestimmten Populationen von ICC erworben werden, ohne Kontamination Signale von anderen Populationen der ICC innerhalb der gleichen Gewebe, sondern in anatomisch unterschiedliche Ebenen von Fokus (Abbildung 2A)37 , 39 , 40 , 41. es ist möglich, kurze Datensatz (< 100 ms), lokalisiert Ca2 + -Ereignisse, die nicht mit Membran durchlässig Ca2 + Indikatoren möglich waren. Räumlich-zeitliche Zuordnung mit Volumetrie oder ImageJ-Software kann verwendet werden, um STMs aller Ca2 + Ereignisse innerhalb der Zellen an Ort und Stelle zu erzeugen. Mit diesem Ansatz, Ca2 + -Ereignisse in eine gesamte FOV visualisiert werden und abgebildet (Abb. 2 bC), anstatt nur Aufzeichnung von einem einzigen ROI begrenzt. Diese Methoden können auf jede Zelle innerhalb einer gegebenen FOV ausgedehnt werden, damit repräsentative Datenerhebung aus allen Zellen und quantitative Informationen über relative Amplituden, vorübergehender Dauer, Rate der Aufstieg und Fall der Transienten, etc. (Abbildung 2E , F). STM-Analyse, im Gegensatz zu ROI-basierte Intensität Grundstücke, auch bieten die Möglichkeit zur Überwachung und Aufzeichnung räumlichen Eigenschaften von Ca2 + signalisieren, wie räumliche Ausbreitung und Ausbreitungsgeschwindigkeit, wie in Abbildung 2dargestellt. Diese Informationen kann gesammelt werden, um einen ziemlich umfassenden Überblick über Ca2 + Signalisierung Verhaltensweisen in Zellen in ihrer nativen Umgebungen (Abb. 2 H) bieten.

PTCL Analyse kann verwendet werden, um komplexere Ca2 + Signalisierung Verhaltensweisen, wie diejenigen, die innerhalb der vernetzten Mobilfunknetze zu quantifizieren. Ein Beispiel für diese Anwendung liefert die Analyse, auf ICC-MY (Abbildung 3A) durchgeführt. In der Regel in solchen komplexen Vorbereitungen können Hintergrundgeräusche und Signal-Rausch ein Problem sein. Jedoch können mit Volumetrie Software auf Filme von Ca2 + Aktivität differential und glätten Filter anwenden und dann die Anwendung Lärm Schwelle Protokolle Lärm (Abb. 3 b-D) Hintergrundgeräusche herausfiltern vom Komplex entfernt werden Aufnahmen von Dynamik. Mit PTCL Analyse wie in Abbildung 3E-G, quantitative Informationen über Ca2 + kann Signalisierung berechnet werden durch Messen der PTCL Bereich, PTCL Graf und PTCL Größe die räumliche Bereiche der Aktivierung von Ca2 + anzeigen Signale in einem FOV. Diese Daten können zusammengestellt, wie in Abbildung 3 H und gegebenenfalls statistisch analysiert werden. Abbildung 4 zeigt, wie PTCL Analyse in Tiefe Quantifizierung der subzellulären Ca2 + Signalisierung durch Prüfung der Lage und feuern Wahrscheinlichkeiten von Ca2 + Brand Websites ermöglicht. Durch Zuteilung von PTCLs in verschiedenen Flaggen, die aufgrund ihrer zeitlichen Eigenschaften, Einleitung PTCLs genau abgebildet werden wie in Abbildung 4-E und eine Fülle von harten Daten über die Zahl der Einweihungsstätten erworben (genannt " Domänen), die Größe des Standortes in Pixel und µm2, Wahrscheinlichkeit jeder Einleitung Seite feuern entweder einmal oder mehrere Male während jeder CTC (angegeben als Prozentsatz), die durchschnittliche Dauer und Größe der PTCLs in der Einleitung-Website auftreten die Anzahl der CTC Zyklen (als im Schritt 4.23 definiert) und die % von Brand-Websites, die bei jedem Zyklus CTC gefeuert. Diese Techniken ermöglichen ein hohes Maß an Data-Mining und Quantifizierung der in-situ Ca2 + Signale, die innerhalb einer intakten Mobilfunknetz, die nicht mit ROI-Analysen möglich sind.

Figure 1
Abbildung 1: Generation von Mäusen, KitGCaMP6f. Schematische Darstellung der Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f Mäuse) wurden gekreuzt mit c-Kit+ / Cre-ERT2 (Kit-Cre Mäuse), Kit-Cre-GCaMP6f Mäuse zu generieren. Diese Mäuse sind im Alter von 6-8 Wochen induzieren Cre-Rekombinase und anschließende GCaMP6f Ausdruck ausschließlich in ICC mit Tamoxifen injiziert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Analyse der stochastischen Ca2 + Signale in ICC-DMP mit räumlich-zeitliche Zuordnung (STM). (A) repräsentatives Bild von mehreren ICC DMP aus dem Dünndarm eine Kit-Cre-GCaMP6F Maus an Ort und Stelle. Ein grüne ROI zeigt die Größe und Ausrichtung des ROI, um einen einzigen ICC-DMP innerhalb der FOV erstelle ich ein STM in Volumetrie zeichnen. (B) STM Ca2 + -Aktivität in der ICC-DMP in zentrale A hervorgehoben, nachdem es für Amplitude, Raum und Zeit richtig kalibriert worden ist. (C) wurde die gleiche STM gezeigt im Bedienfeld "B" nach es farblich gekennzeichnet mit einer Lookup-Tabelle (QUBPallete). (D) erweiterte Bild der ICC-DMP Ca2 + Transienten angezeigt auf eine Farbe codiert STM, wo zum Zeichnen einer Linie durch eine Ca2 + -Ereignis in seiner (X) Zeitachse ein Plot-Profil ihrer Tätigkeit in ImageJ erstellen. (E) Grundstück Profil der Ca2 + Veranstaltung hervorgehoben in panel D, darauf hinweist, wo Linien gezeigt werden gezogen, genau messen die Amplitude und Dauer der Veranstaltung. (F) Grundstück Profil der Ca2 + Veranstaltung hervorgehoben in panel D, darauf hinweist, wo Linien gezeigt werden genau messen die Anstiegsgeschwindigkeit und Fallgeschwindigkeit des Ereignisses gezeichnet. (G) erweiterte Bild der ICC-DMP Ca2 + Transienten angezeigt auf eine Farbe codiert STM, wo zum Zeichnen einer Linie durch eine Ca2 + -Ereignis an seinen Platz (y) Achse ihrer räumlichen Ausbreitung genau zu messen. (H) Vertreter die Histogramme der gepoolten Daten aus ICC-DMP darstellen, wie die Amplitude, die Dauer und die räumliche Ausbreitung Werte nach den oben genannten Schritten gewonnenen grafisch angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Quantifizierung von CTCs im ICC-mein Umgang mit Partikel basierte Analyse. (A) repräsentatives Bild einer ICC-mein Netzwerk aus dem Dünndarm eine Kit-Cre-GCaMP6F Maus an Ort und Stelle. (B) Bild von der Aufnahme in zentrale A gezeigt nachdem es einen differenziellen Filter der Δt durchgemacht hat = ±66 – 70 ms und eine Gaußsche Filter von 1,5 x 1,5 µm, StdDev 1.0. (C) Bild aus dem Video in B Schnittstellenüberwachung Schwellenwert rot mit PTCLs abgeschlossen war. (D) Spuren von PTCL zählen und meine PTCL Größe in einem Schnittstellenüberwachung Protokoll zu beseitigen Lärm in dem Film gezeigt im Bedienfeld "B. PTCLs entstanden mit Hilfe eines Algorithmus Füllung, das die Struktur der alle angrenzenden Pixel gekennzeichnet, die Intensitäten über Schwellenwert, Ca 2 + waren vorübergehende PTCLs größer als Lärm PTCLs. Die Schwelle an die große Anzahl von kleinen mittelständischen Lärm PTCLs entstanden und fing an, die mittlere Größe der PTCLs reduzieren kann als einen gemeinsamen Schwellenwert für alle Aufnahmen verwendet werden. (E) repräsentatives Bild von der Koordinate-basierten Ca2 + PTCL Datei erstellt aus der thresholded Aufnahme in C. (F) repräsentatives Bild der PTCL Datei e entnommen, nach einer Screening-Kriterien von > 6 µm2 (Durchmesser ~ 2 µm oder kleiner) angewendet wurde; PTCLs über diese Grenze sind als lila Lichtteilchen (FLAG 1) gekennzeichnet und als gültige PTCLs. (G) Heatmap zeigt den gesamten PTCLs (FLAG 1) für die gesamte Aufzeichnung des Videos gezeigt im Bedienfeld "F, mit insgesamt PTCLs aufintegrierten mit Farben auftreten während der Aufnahme (warme Farben zeigen vermehrte Auftreten an dieser Stelle). (H) repräsentative Spuren von PTCL Bereich (blau) und PTCL zählen (rot), abgeleitet aus der PTCL-Datei erstellt, die im Bedienfeld "A-G. Die Spuren sind repräsentative Histogramme der gepoolten Daten aus mehreren Experimenten unten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Analyse von Ca2 + Websites im ICC-mein Umgang mit Feuern Partikel basierte Analyse. (A) repräsentatives Bild der PTCL Datei von Abbildung 3E entnommen, nachdem FLAG 1 PTCLS in FLAG 3, den Kennzeichnungsstatus für Ca2 + Brand Websites weiter verfeinert werden. Fahne 3 PTCLs als hellgrün angezeigt (nur jene PTCLs, die keine Partikel in den vorherigen Frame aber Überschneidungen mit Teilchen in den nächsten 70 ms überschneidet Brand Websites angesehen wurden). (B) Hitze diese Karte zeigt die totale PTCLs (Flagge 3) für die gesamte Aufzeichnung des Videos gezeigt im Bedienfeld "A," mit insgesamt PTCLs summiert mit Farben auftreten während der Aufnahme (warme Farben zeigen vermehrte Auftreten an dieser Stelle). (C) repräsentative Karte von Ca2 + feuern Seiten im Bedienfeld "zugeteilt B, mit jedem anderen feuern Standort identifizierende andersfarbig dargestellt. (D) repräsentative Spuren von PTCL Bereich (blau) und PTCL zählen (rot), abgeleitet aus der PTCL Datei erstellt in Abbildung 3A-G. (E) eine vorkommen Karte der Tätigkeit der einzelnen Brand Websites. Jeder Brand Site innerhalb der FOV wird als farbiger Block in eine eigene "Lane" gegen die Zeit angezeigt. (F) repräsentative Histogramme der gepoolten Daten aus mehreren Experimenten werden gezeigt, zur Veranschaulichung Werte akkumulieren für Ca2 + brennen Seite feuern Wahrscheinlichkeit / CTC und die Anzahl der Ca2 + Brand Websites in einem FOV. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ca2 + Bildgebung der bestimmte Arten von Zellen im intakten Gewebe oder in Netzwerken von Zellen oft offenbart komplexe Muster von Ca2 + Transienten. Diese Tätigkeit erfordert eine sorgfältige und eingehende Analysen und Quantifizierung, so viele Informationen über die zugrunde liegenden Ereignisse und Kinetik dieser Ereignisse wie möglich zu erfassen. STM und PTCL Analyse bieten die Möglichkeit, die Menge von quantitativen Daten ergab von Aufnahmen dieser Art zu maximieren.

Die schmale Spindel förmigen Morphologie der ICC-DMP machen sie gut geeignet für STM-Analyse von der oben beschriebenen STMs abgeleitet. Allerdings eignet sich diese Analyse nicht zu ICC-mein Ganglion geformt und sind verbunden in einem Netzwerk (Abbildung 3A). Darüber hinaus sind die Ca2 + Signalisierung Muster in ICC-MY komplexer, manifestiert als CTCs aus mehreren Standorten Ursprungs im ICC, mein Netzwerk zu verbreiten. So wurde um die Aktivität auftritt im gesamten ICC-mein Netzwerk innerhalb einer FOV zu quantifizieren, Partikelanalyse (PTCL) implementiert mit Individualsoftware gemacht (Volumetrie, Version, G8d, GWH, funktionsfähig unter Mac OS, Grant Hennig grant.hennig@med.uvm.edu Kontakt in Bezug auf Anfragen für Volumetrie Zugang und Nutzung).

STM-Analyse lässt alle Ca2 + Ereignisse innerhalb einzelner Zellen und alle Zellen in einem FOV kritisch in einem Spektrum von räumlichen und zeitlichen Parameter analysiert werden. Das Protokoll beschrieben zeigt wie diese Techniken auf ICC-DMP des Dünndarms Maus angewendet werden können. Durch Quantifizierung voll Ca2 + Signalisierung in ICC-DMP, wie dargestellt in Abbildung 2 b-G, Ca2 + signalisieren, dass Muster im Detail37charakterisiert wurden. Diese Analysen angewandt worden, um Aufnahmen wo ICC-DMP unterziehen Interventionen zu fein Quantifizierung der Auswirkungen der Sperrung oder Ca2 + Freisetzung / Ca2 + Zustrom / Neurotransmission Wege37,39 , 40 , 41. diese Techniken können auch leicht auf andere Präparate intaktem Gewebe. Zum Beispiel ist STM Analyse wie hier beschrieben verwendet worden, um neue mechanistische Wege in der Generation der intrazellulären Ca2 + Wellen aufgezeichnet in Harnröhre Glattmuskel in Situ57zu identifizieren.

Die Vorbereitung der STMs in Volumetrie erfordert einige Vorsicht, da die Funktion in Volumetrie, die die STM von gezeichneten ROI (Abbildung 2A) schafft einen durchschnittlichen Wert von Intensität ist. Die Amplitude der Ca2 + Signale könnten somit potenziell verdünnt werden, wenn der ROI breiter oder länger als die Ca2 + -Ereignis oder die Zelle von Interesse gezeichnet wird. Daher sollten Nutzer ROIs zu zeichnen, die sind so dicht wie möglich an die Ca2 + Signale oder bestimmte Zelle, die sie analysieren, um dieses Problem zu lindern Montage vorsichtig sein. Ebenso bedeutet die STMS mit einzelnen Pixels Linescans in ImageJ zu schaffen, dass genaue Kartierung von Ca2 + -Ereignisse die Nähe des Ca2 + -Signals auf die gezeichnete Linie unterliegt. Solche Bedenken sind gering in dünne Spindel förmigen Zellen wie ICC-DMP, aber andere Zelltypen mit einem Ganglion oder Runde Morphologie machen kann diese Art der Analyse unangemessen, alle Ca2 + Signale präzise abzubilden. Bei der Vorbereitung STMs für Analyse, unabhängig davon, ob sie in Volumetrie oder mit ImageJ Linescans gemacht wurden gibt es ein paar Bereiche hervorgehoben werden, für die Problembehandlung. Es ist wichtig, die Bildqualität auf 32-Bit zu ändern, bevor Durchführung Kalibrierung auf die STMs. Scheitern zu tun, oder damit, nach der Kalibrierung für F/F0 zum inkonsistenten Messungen über führen kann Experimente. Überprüfen Sie immer die Bildqualität der STM, die im oberen Bereich der weißen Rahmen der STM selbst beim Öffnen mit ImageJ angegeben ist. Ein weiteres potentielles Feld der Inkonsistenz ist den F-0 -Wert auswählen, wenn für die Amplitude kalibrieren. Es ist wichtig, dass für die Auswahl der Region für F0, daß es umfasst eine Fläche von der Zelle, die einheitlich ist und im Fokus. Aus diesem Grund Bereiche der Zelle, die eine instabile basale Fluoreszenz oder das ändern durch Bewegung oder andere Artefakte, sind nicht ideal und strenge Bewegung Stabilisierung Protokolle sollten in diesen Fällen eingesetzt werden.

Innerhalb von in-situ oder kultivierten Zubereitungen miteinander verbunden mit Mobilfunknetzen, wie ICC-mein in den kleinen Darm, PTCL Analyse bietet eine optimierte Technik, um komplexe, subzelluläre Ca2 + Ereignisse, die in das Netzwerk zu quantifizieren. Darüber hinaus erlaubt es auch alle Ca2 + -Ereignisse im Netzwerk innerhalb einer gegebenen FOV analysiert werden, anstatt mit willkürlichen ROIs, die nur Auskunft über Häufigkeit und Intensität innerhalb des ROI. Ein Vorteil der hier beschriebenen PTCL Analyse ist, dass durch die Anwendung differential und Gaußsche glätten Filter, Aufnahmen, eine große Menge an Lärm aus Filmen entfernt werden kann, die kontaminierenden Licht aus den Zellen nicht von Interesse oder wegen nicht dynamische enthalten können helle Flecken oder Einschlüsse. Es ist wichtig zu beachten, dass die Höhe der Differenzierung angewendet um Aufnahmen weitgehend auf die Erfassungsrate verwendet durch den Experimentator abhängen wird. Unterscheidung von Filmen wie im Protokoll beschrieben bietet eine Möglichkeit, Anwenden eines Filters auf den Film, hochfrequentes Rauschen aus Aufnahmen zu entfernen. Differenzierung der Wert "2" anwenden, wenn Erwerb bei 33FPS funktioniert gut, um Hintergrundgeräusche zu entfernen, unter Beibehaltung der gutes Signal-Rausch (wenn der Wert zu niedrig ist, Lärm wird abgeholt, aber Signal-Rausch gefährdet wird, wenn der Wert zu hoch ist). Der Differenzierung Wert angewendet sollte erhöht werden, mit schneller Erfassungsraten, zum Beispiel bei 100 FPS, Differenzierung der Wert "7" gibt ungefähr das gleiche Signal Rauschabstand als Wert "2" eine 33FPS Aufnahme. Experimentatoren müssen diese Einstellungen optimieren entsprechend für ihre Vorbereitungen und Aufnahmebedingungen.

Die Schwellwerte Protokoll gemäß Abbildung 3D ermöglicht eine konsistente Schnittstellenüberwachung anzuwendende Verfahren, um verschiedene Aufnahmen auf unterschiedlichen Systemen mit unterschiedlichen Datenerfassungs-Software. Diese Flexibilität ermöglicht Daten von mehreren Forschern arbeiten auf verschiedenen Systemen, ihre Aufnahmen in der gleichen Datasets zu kompilieren. Durch Verwendung von Flagge in Volumetrie, ermöglicht PTCL Analyse der Visualisierung und Quantifizierung von einzelnen Ca2 + Brand Websites innerhalb eines Netzwerks im Detail. Informationen kann über die Anzahl der Einweihungsstätten, die Größe des Standortes in Pixel und µm2und die durchschnittliche Dauer der PTCLs Auftritt an diesem Standort gesammelt werden. Diese PTCL Analyse erlaubt die erste Charakterisierung der CTC-Aktivität im Dünndarm subzellulären Ebene, und mit den verschiedenen Flaggen in Volumetrie Software, PTCLs an den beiden Netzwerk und individuelle Brand Website Ebene wurden im intakten Gewebe quantifiziert Vorbereitungen von Kit-Cre-GCaMP3 Mäuse38. Aus diesen anfänglichen Beobachtungen dieser Analyse verwendet worden, weitere neuartige Ca2 + Zustrom Wege in GI wie Shop-betrieben-Ca2 +ICC-mein Studium-Eintrag42 und die Rolle der mitochondrialen Ca2 + Signalisierung auf GI Wettfahrten 41. viel wie STM Analyse oben beschrieben, kann PTCL Analyse leicht an verschiedene intakt Präparate in diesem Protokoll beschriebenen angepasst werden. Zum Beispiel eine kürzlich durchgeführte Studie PTCL Analyse verwendet, um neuartige rhythmische Ca2 + Ereignisse, die in der intakten Mobilfunknetze der Lamina Propria der Ratte Harnblase58,59 studieren und konnten somit leicht auf angewendet werden andere komplexe, intakten zellulären Systeme wie neuronale Systeme. Während dieses Papier auf Ca2 + imaging im intakten Gewebe mit GECIs konzentriert, können diese Analysetechniken auch auf isolierten Zellen und Gewebe, die mit traditionellen Ca2 + Indikatorfarbstoffen geladen ausgeführt werden. Die STM-basierte Analyse wurde verwendet, um erfolgreich zu quantifizieren, lokalisierte Ca2 + Signale und Ca2 + Wellen von Spindel geformte interstitiellen Zellen und glatten Muskelzellen aus einer Vielzahl von Vorbereitungen11,60 , 61 , 62 , 63. Darüber hinaus die PTCL Analyseroutinen hier beschriebenen auch angewandt worden, um an Ort und Stelle Netzwerk Vorbereitungen mit Cal 52058,59visualisiert. Allerdings behalten diese Studien auch die Nachteile einer solchen Farbstoff beladen Protokolle wie zweideutig Zelle Identifikation und Probleme mit Signal-Rausch.

Die dargestellten Beispiele zeigen, dass STM und PTCL Analyse sehr formbar Techniken, die verwendet werden können, um komplexe Ca2 + Signalisierung in einem breiten Spektrum von intaktem Gewebe Vorbereitungen zu quantifizieren. Die Ansätze bieten viele Vorteile gegenüber traditionellen ROI Intensität Parzellen, die routinemäßig verwendet wurden bisher und sollen Ermittler mit wertvoller quantitative Informationen über Ca2 + Signalisierung als bisher erreicht werden konnte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Finanzierung wurde durch die NIDDK über P01 DK41315 bereitgestellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ImageJ software NIH 1.5a ImageJ software
Volumetry GWH Volumetry 8Gd Custom made analysis software
Isoflurane Baxter, Deerfield, IL, USA NDC 10019-360-60
Tamoxifen Sigma T5648
GCaMP6F mice Jackson Laboratory Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice Gifted From Dr. Dieter Saur c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol Pharmco-Aaper SDA 2B-6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wellman, G. C., Nelson, M. T. Signaling between SR and plasmalemma in smooth muscle: Sparks and the activation of Ca2+-sensitive ion channels. Cell Calcium. 34, (3), 211-229 (2003).
  2. Mironneau, J., Arnaudeau, S., Macrez-Lepretre, N., Boittin, F. X. Ca2+sparks and Ca2+waves activate different Ca2+-dependent ion channels in single myocytes from rat portal vein. Cell Calcium. 20, (2), 153-160 (1996).
  3. Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1793, (6), 933-940 (2009).
  4. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. Calcium signalling. Current biology. 9, (5), R157-R159 (1999).
  5. Bootman, M. D., et al. Calcium signalling—an overview. Seminars in Cell & Developmental Biology. 12, (1), 3-10 (2001).
  6. Brain, K. L., Bennett, M. R. Calcium in sympathetic varicosities of mouse vas deferens during facilitation, augmentation and autoinhibition. The Journal of Physiology. 502, (3), 521-536 (1997).
  7. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1, (1), 11-21 (2000).
  8. Dupont, G., Goldbeter, A. Problems and paradigms: Oscillations and waves of cytosolic calcium: Insights from theoretical models. BioEssays. 14, (7), 485-493 (1992).
  9. Bootman, M. D., Berridge, M. J. The elemental principles of calcium signaling. Cell. 83, (5), 675-678 (1995).
  10. Berridge, M. J., Dupont, G. Spatial and temporal signalling by calcium. Current Opinion in Cell Biology. 6, (2), 267-274 (1994).
  11. Drumm, B. T., et al. The role of Ca 2+ influx in spontaneous Ca 2+ wave propagation in interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. The Journal of Physiology. 593, (15), 3333-3350 (2015).
  12. Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. Ca 2+ imaging of activity in ICC-MY during local mucosal reflexes and the colonic migrating motor complex in the murine large intestine. The Journal of Physiology. 588, (22), 4453-4474 (2010).
  13. Drumm, B. T., Sergeant, G. P., Hollywood, M. A., Thornbury, K. D., McHale, N. G., Harvey, B. J. The role of cAMP dependent protein kinase in modulating spontaneous intracellular Ca2+ waves in interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. Cell Calcium. 56, (3), 181-187 (2014).
  14. Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O’Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells. Journal of Biological Chemistry. 267, (25), 18118-18121 (1992).
  15. Straub, S. V., Giovannucci, D. R., Yule, D. I. Calcium wave propagation in pancreatic acinar cells: functional interaction of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors, ryanodine receptors, and mitochondria. The Journal of General Physiology. 116, (4), 547-560 (2000).
  16. Sneyd, J., Tsaneva-Atanasova, K., Bruce, J. I. E., Straub, S. V., Giovannucci, D. R., Yule, D. I. A model of calcium waves in pancreatic and parotid acinar cells. Biophysical Journal. 85, (3), 1392-1405 (2003).
  17. Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. Calcium sparks in smooth muscle. American Journal of Physiology. Cell. 278, (2), C235-C256 (2000).
  18. Nelson, M. T., et al. Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks. Science. 270, (5236), 633-637 (1995).
  19. Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks: Elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 262, (5134), 740-744 (1993).
  20. Parker, I., Choi, J., Yao, Y. Elementary events of InsP3-induced Ca2+ liberation in Xenopus oocytes: Hot spots, puffs and blips. Cell Calcium. 20, (2), 105-121 (1996).
  21. Diliberto, P. a, Wang, X. F., Herman, B. Confocal imaging of Ca2+ in cells. Methods in Cell Biology. 40, 243-262 (1994).
  22. Martínez-Zaguilán, R., Parnami, G., Lynch, R. M. Selection of fluorescent ion indicators for simultaneous measurements of pH and Ca2+. Cell Calcium. 19, (4), 337-349 (1996).
  23. Hayashi, H., Miyata, H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2. The Journal of Pharmacology & Toxicology Methods. 31, (1), 1-10 (1994).
  24. Thomas, D., Tovey, S. C., Collins, T. J., Bootman, M. D., Berridge, M. J., Lipp, P. A comparison of fluorescent Ca2+indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+signals. Cell Calcium. 28, (4), 213-223 (2000).
  25. Lock, J. T., Parker, I., Smith, I. F. A comparison of fluorescent Ca2+indicators for imaging local Ca2+signals in cultured cells. Cell Calcium. 58, (6), 638-648 (2015).
  26. Flagmeier, P., et al. Ultrasensitive Measurement of Ca 2+ Influx into Lipid Vesicles Induced by Protein Aggregates. Angewandte Chemie International Edition. 56, (27), 7750-7754 (2017).
  27. Tsutsumi, S., et al. Structure-Function Relationships between Aldolase C/Zebrin II Expression and Complex Spike Synchrony in the Cerebellum. Journal of Neuroscience. 35, (2), 843-852 (2015).
  28. Rietdorf, K., Chehab, T., Allman, S., Bootman, M. D. Novel improved Ca indicator dyes on the market - a comparative study of novel Ca indicators with Fluo-4. Calcium Signalling: The Next Generation. 590 (2014).
  29. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. Journal of Neuroscience. 32, (40), 13819-13840 (2012).
  30. Seidemann, E., et al. Calcium imaging with genetically encoded indicators in behaving primates. eLife. 5, (2016JULY), (2016).
  31. Su, S., et al. Genetically encoded calcium indicator illuminates calcium dynamics in primary cilia. Nature Methods. 10, (11), 1105-1109 (2013).
  32. Kaestner, L., et al. Genetically encoded Ca2+ indicators in cardiac myocytes. Circulation Research. 114, (10), 1623-1639 (2014).
  33. Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor design. Current Opinion in Chemical Biology. 27, 90-97 (2015).
  34. Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLoS ONE. 12, (2), 1-24 (2017).
  35. Spencer, N. J., et al. Identification of a rhythmic firing pattern in the enteric nervous system that generates rhythmic electrical activity in smooth muscle. The Journal of Neuroscience. 3489 (2018).
  36. Hibberd, T. J., et al. Synaptic Activation of Putative Sensory Neurons By Hexamethonium-Sensitive Nerve Pathways in Mouse Colon. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. (861), (2017).
  37. Baker, S. A., Drumm, B. T., Saur, D., Hennig, G. W., Ward, S. M., Sanders, K. M. Spontaneous Ca(2+) transients in interstitial cells of Cajal located within the deep muscular plexus of the murine small intestine. The Journal of Physiology. 594, (12), 3317-3338 (2016).
  38. Drumm, B. T., et al. Clustering of Ca2+ transients in interstitial cells of Cajal defines slow wave duration. The Journal of General Physiology. 149, (7), 703-725 (2017).
  39. Baker, S. A., Drumm, B. T., Cobine, C. A., Keef, K. D., Sanders, K. M. Inhibitory Neural Regulation of the Ca2+ Transients in Intramuscular Interstitial Cells of Cajal in the Small Intestine. Frontiers in Physiology. 9, (April), 1-24 (2018).
  40. Baker, S. A., et al. Excitatory Neuronal Responses of Ca 2+ Transients in Interstitial Cells of Cajal in the Small Intestine. eNeuro. 5, (2), (2018).
  41. Drumm, B. T., Sung, T. S., Zheng, H., Baker, S. A., Koh, S. D., Sanders, K. M. The effects of mitochondrial inhibitors on Ca2+signalling and electrical conductances required for pacemaking in interstitial cells of Cajal in the mouse small intestine. Cell Calcium. 72, 1-17 (2018).
  42. Zheng, H., Drumm, B. T., Earley, S., Sung, T. S., Koh, S. D., Sanders, K. M. SOCE mediated by STIM and Orai is essential for pacemaker activity in the interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. Science Signaling. 11, (June), (2018).
  43. Zhu, M. H., et al. A Ca(2+)-activated Cl(-) conductance in interstitial cells of Cajal linked to slow wave currents and pacemaker activity. The Journal of Physiology. 587, (20), 4905-4918 (2009).
  44. Zhu, M. H., Sung, T. S., O’Driscoll, K., Koh, S. D., Sanders, K. M. Intracellular Ca(2+) release from endoplasmic reticulum regulates slow wave currents and pacemaker activity of interstitial cells of Cajal. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 308, (8), C608-C620 (2015).
  45. Zhu, M. H., et al. Muscarinic activation of Ca2+-activated Cl- current in interstitial cells of Cajal. The Journal of Physiology. 589, (Pt 18), 4565-4582 (2011).
  46. Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine. The Journal of Physiology. 480, (Pt 1), 91-97 (1994).
  47. Huizinga, J. D., Thuneberg, L., Klüppel, M., Malysz, J., Mikkelsen, H. B., Bernstein, A. W/kit gene required for interstitial cells of cajal and for intestinal pacemaker activity. Nature. 373, (6512), 347-349 (1995).
  48. Ordog, T., Ward, S. M., Sanders, K. M. Interstitial cells of Cajal generate electricial slow waves in the murine stomach. The Journal of Physiology. 518, (1), 257-269 (1999).
  49. Sanders, K. M., Ward, S. M., Koh, S. D. Interstitial cells: regulators of smooth muscle function. Physiological Reviews. 94, (3), 859-907 (2014).
  50. Ward, S. M., McLaren, G. J., Sanders, K. M. Interstitial cells of Cajal in the deep muscular plexus mediate enteric motor neurotransmission in the mouse small intestine. The Journal of Physiology. 573, (1), 147-159 (2006).
  51. Komuro, T. Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. The Journal of Physiology. 576, (3), 653-658 (2006).
  52. Komuro, T. Comparative morphology of interstitial cells of Cajal: ultrastructural characterization. Microscopy Research and Technique. 47, (4), 267-285 (1999).
  53. Sanders, K. M., Ward, S. M., Koh, S. D. Interstitial Cells: Regulators of Smooth Muscle Function. Physiological Reviews. 94, (3), 859-907 (2014).
  54. Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+dynamics in the awake mouse brain. PLoS ONE. 12, (7), e0181113 (2017).
  55. Truett, G. E., Heeger, P., Mynatt, R., Truett, A. A., Walker, J. A., Warman, M. L. Preparation of PCR quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT). BioTechniques. 29, (52), 54 (2000).
  56. The Jackson Laboratory. Available from: https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:5:0::NO:5:P5_MASTER_PROTOCOL_ID,P5_JRS_CODE:27076,028865 (2017).
  57. Drumm, B. T., et al. Ca 2+ signalling in mouse urethral smooth muscle in situ role of Ca 2+ stores and Ca 2+ influx mechanisms. The Journal of Physiology. 596, (8), 1433-1466 (2018).
  58. Heppner, T. J., Hennig, G. W., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Rhythmic Calcium Events in the Lamina Propria Network of the Urinary Bladder of Rat Pups. Frontiers in Systems Neuroscience. 11, (December), 1-16 (2017).
  59. Heppner, T. J., Hennig, G. W., Nelson, M. T., May, V., Vizzard, M. A. PACAP38-Mediated Bladder Afferent Nerve Activity Hyperexcitability and Ca 2 + Activity in Urothelial Cells from Mice. Journal of Molecular Neuroscience. 1, (2018).
  60. Griffin, C. S., et al. Muscarinic Receptor Induced Contractions of the Detrusor are Mediated by Activation of TRPC4 Channels. Journal of Urology. 196, (6), 1796-1808 (2016).
  61. Sergeant, G. P., Craven, M., Hollywood, M. A., Mchale, N. G., Thornbury, K. D. Spontaneous Ca2+waves in rabbit corpus cavernosum: Modulation by nitric oxide and cGMP. Journal of Sexual Medicine. 6, (4), 958-966 (2009).
  62. Bradley, E., et al. Novel Excitatory Effects of Adenosine Triphosphate on Contractile and Pacemaker Activity in Rabbit Urethral Smooth Muscle. Journal of Urology. 183, (2), 801-811 (2010).
  63. Drumm, B. T., et al. The effect of high [K + ] o on spontaneous Ca 2+ waves in freshly isolated interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. Physiological Reports. 2, (1), e00203 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics