Applications de cartographie spatio-temporelle et Techniques d’analyse des particules pour quantifier la signalisation intracellulaire Ca2 + In Situ

Biology

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Summary

Ca2 + indicateurs génétiquement encodés (GECIs) ont radicalement changé comment in situ Ca2 + imagerie est réalisée. Pour optimiser la récupération de données de ces enregistrements, il faut une analyse appropriée des signaux de Ca2 + . Les protocoles dans le présent document facilitent la quantification de Ca2 + des signaux enregistrés sur place à l’aide de la cartographie spatio-temporelle et analyse axée sur les particules.

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Drumm, B. T., Hennig, G. W., Baker, S. A., Sanders, K. M. Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ. J. Vis. Exp. (143), e58989, doi:10.3791/58989 (2019).

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Abstract

Ca2 + imagerie de cellules isolées ou de types spécifiques de cellules dans les tissus intacts souvent révèle des motifs complexes de signalisation Ca2 + . Cette activité nécessite une analyse attentive et approfondie et quantification de capturer autant d’informations que possible sur les événements sous-jacents. Spatial, temporel et intensité paramètres intrinsèques aux signaux de Ca2 + comme fréquence, durée, propagation, vitesse et l’amplitude peuvent fournir certaines informations biologiques requises pour signalisation intracellulaire. Haute résolution Ca2 + imagerie typiquement résultats dans l’acquisition des fichiers de données volumineux qui prennent beaucoup de temps au processus en termes de traduire l’information d’imagerie en données quantifiables et ce processus peuvent être sensibles à la partialité et l’erreur humaine. Analyse des signaux de Ca2 + des cellules in situs s’appuie généralement sur les mesures d’intensité simple d’arbitrairement certaines régions d’intérêt (ROI) dans un champ de vision (FOV). Cette approche ignore une grande partie des signalisation des informations importantes contenues dans le champ de vision. Ainsi, afin de maximiser la récupération d’informations provenant de ces enregistrements haute résolution obtenue avec Ca2 +colorants ou optogenetic Ca2 + , d’imagerie, il conviendra d’analyse spatiale et temporelle des signaux2 + Ca est requis. Les protocoles décrits dans le présent document décrira comment un volume élevé de données peut provenir de Ca2 + imageries enregistrements pour faciliter l’analyse plus complète et la quantification des signaux2 + Ca enregistrés à partir de cellules en utilisant une combinaison de carte spatio-temporelle (STM)-fonction analyse et analyse axée sur les particules. Les protocoles décrivent également comment les différents modèles de Ca2 + signalisation observés dans différentes cellules in situ des populations peuvent être analysées de façon appropriée. À titre d’exemple, la méthode examinera Ca2 + signalisation dans une population spécialisée des cellules dans l’intestin, cellules interstitielles de Cajal (CIC), à l’aide de GECIs.

Introduction

Ca2 + est un messager intracellulaire ubiquitaire qui contrôle une large gamme de processus cellulaires, comme le muscle contraction1,2,3de métabolisme, cellule prolifération3,4, 5, stimulation de la libération des neurotransmetteurs au nerf bornes6,7et l’activation de la transcription factors dans le noyau. 7 Ca intracellulaire2 + signale souvent prendre la forme d’élévations transitoires cytosolique Ca2 +, et ceux-ci peuvent être spontanées ou résultent d’une stimulation agoniste selon le type de cellule8. Spatial, temporel et paramètres d’intensité intrinsèques de Ca2 + signaux tels que la fréquence, la durée, propagation, vitesse et amplitude peuvent fournir les informations biologiques nécessaires à la signalisation intracellulaire5, 7 , 9. cytoplasmique Ca2 + signaux peuvent résulter de l’influx de Ca2 + de l’espace extracellulaire ou par libération de Ca2 + du réticulum endoplasmique (re) par l’intermédiaire de canaux de Ca2 + libération tels que les récepteurs de la ryanodine (RyRs) et des récepteurs de l’inositol-triphosphate (IP3Rs)10. RyRs et IP3Rs peuvent tous deux contribuent à la génération de signaux de Ca2 + et l’ouverture concertée de ces canaux, ce qui combiné à divers mécanismes de Ca2 + afflux peut entraîner une myriade de Ca2 + modèles de signalisation qui sont façonnés par les nombres et ouvrir la probabilité des canaux Ca2 + afflux, le profil d’expression des canaux Ca2 + libération, la proximité entre l’influx de Ca2 + et des canaux de libération et expression, répartition du Ca2 + protéines recaptage et extrusion. Ca2 + signaux peuvent prendre la forme d’uniforme, longue durée, oscillations global de haute intensité qui peut durer pendant plusieurs secondes ou minutes même, multiplication intracellulaires et intercellulaires Ca2 + vagues pouvant traverser des distances intracellulaires plus de 100 µm10,11,12,13,14,15,16, ou des événements plus brèves, localisées dans l’espace comme Ca2 + sparks et Ca2 + bouffées qui se produisent sur des dizaines de milliseconde échelles de temps et la propagation de moins de 5 µm17,18,19,20.

Microscopie de fluorescence a été utilisée largement pour surveiller Ca2 + signalisation dans les cellules isolées et cultivées et dans les tissus intacts. Traditionnellement, ces expériences comportait l’utilisation de fluorescent Ca2 + indicateurs, ratiométrique et non-ratiométrique colorants tels que Fura2, Fluo3/4 ou Rhod2, entre autres, 21,22,23. Ces indicateurs ont été conçus pour être perméable aux membranes cellulaires et puis piégé dans les cellules par le clivage d’un groupe ester par des estérases endogènes. Fixation du Ca2 + pour les indicateurs de haute affinité cause des changements dans la fluorescence lorsque les cellules et les tissus ont été éclairés par des longueurs d’onde de lumière. L’utilisation de cellules perméables Ca2 + indicateurs grandement amélioré notre compréhension de Ca2 + signalisation dans les cellules vivantes et permis la résolution spatiale et la quantification de ces signaux qui n’a pas été possible en testant des signaux de Ca2 + par d’autres moyens, tels que de l’électrophysiologie. Cependant, Ca2 + indicateurs traditionnels présentent plusieurs limites, telles que le Photoblanchiment qui se produit au cours de l’enregistrement de longues périodes24. Tandis que l’indicateur2 + Ca nouveaux colorants tels que Cal520/590 ont grandement amélioré signal aux rapports de bruit et de la capacité à détecter des locaux Ca2 + signaux25, problèmes avec le Photoblanchiment peuvent rester encore un sujet de préoccupation pour certains chercheurs 2627,de,28. Photoblanchiment précipité limite également le grossissement, le taux d’acquisition d’image, et résolution qui peut être utilisée pour des enregistrements, comme le besoin d’augmenter la puissance objective et des taux plus élevés d’acquisition d’images a augmenté l’intensité lumineuse excitation qui augmente le Photoblanchiment.

Ces limitations de traditionnel Ca2 + indicateur colorants sont exacerbées lors de l’enregistrement des signaux2 + Ca in situ, par exemple lorsque enregistrement intracellulaire Ca2 + des signaux de tissus intacts. En raison des problèmes ci-dessus, visualisation de signaux2 + Ca in situ à l’aide de cellules perméables Ca2 + indicateurs a été limitée à un grossissement de faible puissance et réduit les taux de capture d’image, limitant la capacité des enquêteurs pour enregistrer et quantifier les signaux2 + Ca subcellulaires restreintes dans le temps ou dans l’espace. Ainsi, il a été difficile à capturer, analyser et apprécier la complexité spatiale et temporelle des signaux Ca2 + , ce qui peut être important dans la génération de réponses biologiques souhaités, comme indiqué ci-dessus. Analyse des signaux de Ca2 + des cellules in situs s’appuie généralement sur les mesures d’intensité simple de certaines régions d’intérêt (ROI) dans un champ de vision (FOV). Le choix arbitraire du nombre, taille et position des ROIs, dépendants de la fantaisie du chercheur, peut sérieusement biaiser les résultats obtenus. Ainsi que de la distorsion inhérente à l’analyse du retour sur investissement, cette approche ignore une grande partie des importantes informations contenues dans le champ de vision, comme Ca2 + événements dynamiques dans un arbitrairement choisi de signalisation ROI sont sélectionnés pour l’analyse. En outre, analyse des ROIs ne parvient pas à fournir des informations sur les caractéristiques spatiales des Ca2 + signaux observés. Par exemple, il ne serait pas possible d’établir une distinction entre une augmentation de Ca2 + résultant d’une multiplication Ca2 + wave et un très localisée Ca2 + sortie événement de totalisations des signaux de Ca2 + au sein d’un retour sur investissement.

L’avènement de codé génétiquement Ca2 + indicateurs (GECIs) a radicalement changé comment Ca2 + imagerie peut être effectué sur place29,30,31,32,33 . Il y a plusieurs avantages à utiliser GECIs sur teintures. Le plus important peut-être est que l’expression de GECI peut être effectuée d’une manière spécifique de cellule, ce qui réduit la contamination de fond indésirables des cellules pas d’intérêt. Un autre avantage de GECIs Ca2 + indicateurs traditionnels est que Photoblanchiment est réduit (comme la fluorescence et par conséquent le Photoblanchiment se produit uniquement quand les cellules sont actifs), par rapport aux échantillons chargés en colorant, particulièrement à haute grossissement et des taux élevés d’image capturent34. Ainsi, imagerie avec GECIs, tels que la série de GCaMP d’optogenetic capteurs, offre chercheurs la possibilité d’enregistrer brève, localisée subcellulaires Ca2 + signaux in situ et étudier Ca2 + signalisation dans les cellules au sein de leur environnements natifs qui n’ont pas été possibles auparavant. Pour maximiser la récupération d’informations provenant de ces enregistrements de haute résolution, analyse spatiale et temporelle appropriée des Ca2 + signaux est nécessaire. Il convient de noter que tandis que GECIs peut offrir que certains avantages évidents, des études récentes ont révélé que Ca2 + imagerie peut être effectuée avec succès de grandes populations de différentes classes neurochimiques des neurones simultanément à l’aide de classiques Ca2 + indicateurs qui ne sont pas codés génétiquement dans l' animal35. Cette approche immunohistochimie post-hoc permettant de révéler plusieurs différentes classes de neurones tir à haute fréquence en rafales synchronisés et évite la possibilité que des modifications génétiques de l’animal peuvent avoir nui à la physiologique comportement de l’enquêteur cherche à comprendre les35,36.

Les protocoles décrits dans le présent document facilitent l’analyse plus complète et quantification de Ca2 + des signaux enregistrés à partir de cellules in situs en utilisant une combinaison de carte spatio-temporelle (STM)-fonction analyse et analyse axée sur les particules. Les protocoles décrivent également comment les différents modèles de Ca2 + signalisation observés dans différentes cellules in situ des populations peuvent être analysées de façon appropriée. À titre d’exemple, la méthode examinera Ca2 + signalisation dans une population spécialisée des cellules dans l’intestin, cellules interstitielles de Cajal (CIC). ICC sont des cellules spécialisées dans le système gastro-intestinal (GI) qui présentent dynamique intracellulaire Ca2 + signalisation, tel qu’il est visualisé à l’aide de souris exprimant GCaMPs37,38,39,40, 41,42. Transitoires de ca2 + en ICC sont liés à l’activation de Ca2 +-activé Cl canaux (codées par Ano1) qui sont importants dans la régulation de l’excitabilité du muscle lisse intestinal cellules (CML)43, 44,45. Ainsi, l’étude de Ca2 + signalisation dans ICC est fondamentale pour comprendre la motilité intestinale. L’intestin grêle murine offre un excellent exemple pour cette démonstration, qu’il sont a deux classes de CPI qui sont anatomiquement séparés et peuvent être visualisées indépendamment : J’ai) ICC sont situés dans la zone située entre les muscles lisses circulaires et longitudinaux couches, entourant le plexus myentérique (ICC-MY). Ces cellules servent de cellules de stimulateur cardiaque et génèrent de l’activité électrique appelée ondes lentes46,47,48,49; II) ICC se trouvent également parmi un plexus riche dans les terminaisons des neurones moteurs (plexus musculaire profond, donc ICC-DMP). Ces cellules servent de médiateurs des réactions à la neurotransmission entérique moteur37,39,40,50. MY-ICC et ICC-DMP sont morphologiquement différentes, et leurs Ca2 + signalisation comportements diffèrent radicalement pour accomplir leurs tâches spécifiques. ICC-MY sont stellaire en forme et forment un réseau de cellules interconnectées via gap jonctions,51,52. Ca2 + des signaux dans le manifeste de l’ICC-MY brèves et localisées dans l’espace Ca2 + sortie des événements se produisant à plusieurs sites de façon asynchrone par le biais de l’ICC-mon réseau comme visualisées dans un champ de vision (photographié avec un objectif X 60)38. Ces signaux asynchrones est organisés dans le temps en 1 seconde de clusters qui, lorsque totalisées ensemble, s’élèvent à une net 1 s cellulaire augmentation de Ca2 +. Ces signaux propage de cellule-cellule au sein du réseau ICC et donc organise Ca2 + signalisation, générés à partir des sites subcellulaires, sous une tissu large Ca2 + vague. Temporelle de clustering et de sommation de Ca2 + signaux dans ICC-MY a appelé Ca2 + grappes transitoire (CTC)38. CTC se produire rythmiquement (durées par exemple assez semblables et des périodes similaires entre CTC) 30 périodes par minute chez la souris. À l’inverse, ICC-DMP sont les cellules fusiforme, certains avec des processus secondaires, qui distribuent entre les CML et les axones variqueux et ne sont pas indépendamment forment un réseau51,52. Toutefois, ICC-DMP forment les jonctions avec la CML et fonction au sein de ce grand syncytium, connu comme le SIP syncytium53. Signaux de ca2 + se produisent à plusieurs endroits le long de la longueur des cellules, mais ces transitoires ne sont pas entraînés ou groupées dans le temps, tel qu’observé dans ICC-MY37. Ca2 + signaux dans ICC-DMP se produisent de manière stochastique, avec des intensités variables, des durées et des caractéristiques spatiales. Les protocoles ci-dessous, en utilisant l’exemple de Ca2 + signalisation dans MY-ICC et ICC-DMP, décrivent des techniques pour analyser la signalisation complexes dans les types spécifiques de cellules in situs. Nous avons utilisé le système de p de Cre-Lox inductible pour exprimer GCaMP6f exclusivement à la CPI, après induisant l’activation de Cre-Recombinase (Cre), conduite par un promoteur spécifique de l’ICC (Kit).

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Protocol

Tous les animaux utilisés et les protocoles réalisées dans cette étude étaient conformes au Guide National des instituts de santé pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les procédures ont été approuvées par l’Institutional Animal Use et le Comité de protection de l’Université du Nevada, Reno.

1. génération de souris KitGCaMP6f

  1. Croix de Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f, souris) et c-Kit+ / Cre ERT2 (Kit-Cre souris) pour générer des animaux exprimant de la GCaMP6f spécifique de la ICC (Kit-Cre-GCaMP6f souris).
    Remarque : GCaMP6f a été utilisé en raison de son efficacité signalée dans les rapports localisée, bref Ca intracellulaire2 + signaux in situ et in vivo54.
  2. Injecter le Kit-Cre-GCaMP6f souris par le tamoxifène à l’âge de 6 à 8 semaines pour induire l’activation de la Cre Recombinase et ultérieures GCaMP6f expression dans ICC (Figure 1).
    1. Pour créer la solution de tamoxifène, dissoudre 80 mg de tamoxifène (voir Table des matières) dans 800 μL d’éthanol (voir Table des matières) dans une cuvette et vortexer pendant 20 minutes.
    2. Ajouter 3,2 mL d’huile de carthame (générique) pour créer des solutions de 20 mg/mL et ensuite laisser agir pendant 30 minutes avant l’injection.
    3. Injecter des souris (injection intrapéritonéale ; IP) avec 0,1 mL de solution de tamoxifène (2 mg de tamoxifène) pendant trois jours consécutifs. Confirmer l’expression GCaMP6f de génotypage et utilisez souris 10 jours après la première injection.
      1. Souris de génotype de couper un petit morceau d’oreille de chaque animal. Ensuite, utilisez la méthode de HotSHOT55 pour l’isolement de l’ADN génomique par incubation de clips d’oreilles à 95 ° C pendant 60 min à 75 mL de NaOH et puis neutraliser par 75 mL de tampon Tris. PCR standard permet de déterminer le génotype de chaque animal, 2 mL d’ADN dans une réaction de 20 mL avec des amorces spécifiques de GCaMP6f56. Exécutez 10 mL de produit PCR sur un gel d’agarose à 2 % pour déterminer le type sauvage (297 bp) et un mutant (~ 450 bp) bandes.

2. préparation des tissus pour l’imagerie de Ca2 +

  1. Anesthésier souris par inhalation à l’isoflurane (4 %, voir Table des matières) dans une hotte ventilée et sacrifice puis par dislocation cervicale.
  2. À l’aide de ciseaux pointus ouvert l’abdomen des souris, enlever l’intestin grêle et placer dans une solution bicarbonatée Krebs-Ringer (KRB). Ouvrez l’intestin grêle, le long de la frontière mésentérique et laver tout contenu intraluminal avec KRB. Utilisant les dissections pointues, enlever les couches de la muqueuse et la sous muqueuse.
    Remarque : KRB solution a la composition suivante (en mM) : 118,5 NaCl, KCl 4.7, CaCl2 2.5, MgCl2 1.2, NaHCO3 23,8, KH2PO4 1.2, dextrose 11.0. Cette solution a un pH de 7,4 à 37 ° C lorsque bouillonnait à l’équilibre avec 95 % O2- 5 % CO2.
  3. À l’aide de petites épingles, épingler les tissus de l’intestin grêle à la base d’un volume de 5 mL, plat de Sylgard revêtu de la diamètre de 60 mm avec la couche de muscles lisses circulaires vers le haut. Perfuse la préparation avec une solution KRB chauffée à 37 ° C pendant une période d’équilibration de 1hr avant l’expérimentation.
  4. Suite à cette période de l’équilibration, effectuer sur place Ca2 + imagerie des petits intestinale MY-ICC et ICC-DMP à l’aide de la microscopie confocale (les images du présent protocole ont été acquises avec un microscope confocal, équipé d’un tourne-disque). Grâce aux avantages de GECIs décrites ci-dessus, utiliser des images à haute résolution (> 30 images par seconde, FPS) combinés avec des objectifs de haute puissance (60 – 100 x) d’acquérir des films de Ca2 + signaux dynamiques en ICC.
    Remarque : Pour réduire le mouvement du tissu, appliquer la nicardipine (0,1 – 1 μM) pendant les enregistrements, comme décrit plus haut37,38,39,40,41.
  5. Distinguer les MY-ICC et ICC-DMP dans l’intestin grêle à l’aide de leurs différente localisation anatomique, de morphologie et de patterns Ca2 + activité basales.
    1. Localiser mon ICC au niveau du plexus myentérique, entre les couches musculaires lisses circulaires et longitudinaux de l’intestin grêle. Ils sont étoilées en forme, formant un réseau connecté (Figure 3 a). CTC (décrit ci-dessus) se propage à travers le réseau de ICC-MY avec un événement régulier de ~ 30 cycles / min.
    2. À l’inverse, localiser ICC-DMP dans un seul plan au niveau du plexus musculaire profond, entre la couche de muscles lisses circulaires et le plexus sous-muqueux. ICC-DMP ne forment pas un réseau et sont des cellules fusiforme (Figure 2 a) qui ne présentent aucune multiplication des événements réguliers et à la place le feustochastiques, localisées intracellulaires Ca 2 + transitoires.
  6. Quel que soit le logiciel d’acquisition utilisé, enregistrer des films comme une pile d’images TIFF.

3. l’analyse des signaux2 + Ca stochastique dans ICC-DMP à l’aide de la cartographie spatio-temporelle (STM)

  1. Analyser les ICC-DMP à l’aide de cartographie spatio-temporelle avec une combinaison de logiciels ImageJ (NIH, Etats-Unis, gratuit à télécharger sur http://imagej.nih.jov/ij) et le logiciel fait sur mesure (volumétrie, version G8d, GWH, utilisable sous Mac OS, communiquer avec Grant Hennig grant.hennig@ Med.uvm.edu en ce qui concerne les demandes d’accès de volumétrie et d’utilisation)
    Remarque : Une autre approche pour analyser pleinement ces cartes spatio-temporelle avec ImageJ seul est également fournie dans les sections suivantes (en commençant à l’étape 3.9).
  2. Ouvrez la volumétrie et utiliser les clics droit de la souris pour ouvrir les dossiers contenant des fichiers de film. Faites un clic gauche sur le fichier de film à analyser pour l’ouvrir dans la volumétrie (doit être au format TIFF non compressé). Une fois ouvert, le film sera publié dans une bordure bleue fenêtre (film) qui englobera une vaste zone de l’écran de droite. Le côté gauche de l’écran contient la fenêtre Plot (4/5ths supérieure) et la fenêtre de trace (moins 1/5ème).
  3. Ajuster les dimensions du film en tenant enfoncée la touche Maj et en même temps de défilement vers le haut avec le bouton central de la souris (MMB, réduit la taille) ou défilement vers le bas avec le module d’administration (augmente la taille). Lancer ou arrêter la lecture en appuyant sur « A » ; la vitesse de lecture réglable en haut et bas touches fléchées.
  4. Pour créer un STM à l’aide de volumétrie, tirer un retour sur investissement sur une cellule entière en maintenant enfoncée la touche Maj tout en faisant glisser le bouton de gauche de la souris. Ajustez l’orientation du ROI en faisant défiler avec module d’administration aux coins du ROI. Quand le ROI est en place sur la cellule à analyser utilisation (Figure 2 a), clic droit dans la fenêtre film pour accéder à "ROI STMs – STMyAvg > xRow' et faites un clic gauche pour créer un STM de l’activité des cellules dans la fenêtre de tracé (il y a aussi une option pour sélectionner ' STMxAvg > Bry w «, celui qui est sélectionné dépendra de savoir si l’orientation de la cellule est plus en adéquation avec le x ou l’axe y, par exemple, la cellule en surbrillance Figure 2 a est plus orienté sur l’axe des y »).
  5. Faites un clic gauche sur la STM dans la fenêtre de tracé, puis appuyez sur « P » pour soustraire le bruit de fond moyenne et appuyez sur « H » pour augmenter le contraste de la STM. Enregistrez la STM en cliquant dessus pour accéder à « STM charge enregistrer - enregistrer STM comme .tif » et puis faites un clic gauche pour enregistrer au format TIFF.
  6. Le reste de l’analyse de l’ICC-DMP s’effectuera en ImageJ. ImageJ est constitué de deux composantes principales, une barre d’outils avec une position fixe sur le dessus de l’écran et une interface utilisateur mobile. ImageJ, ouvrez le fichier TIFF STM d’ICC-DMP Ca2 + activité (fichier-ouvrir la barre d’outils Image J).
  7. Ouvrir la volumétrie créé STM, qui auront le temps orienté verticalement. ImageJ ouvre automatiquement les fichiers TIFF RVB ou les images 16 bits. Pour améliorer la qualité de l’image, clic gauche « Image » dans la barre d’outils ImageJ. Défiler sur la première option "Type « pour faire apparaître un menu déroulant des différents formats d’image, faites défiler sur 32 bits » et clic gauche pour changer.
  8. Pour rendre lisible contre la montre de gauche à droite, la STM, faites un clic gauche sur la barre d’outils de ImageJ sur le chemin suivant : « Image-transformation-Rotate 90 ° à gauche ». Il est également possible de créer des STM d’in situ Ca2 + activité en utilisant linescans avec ImageJ seul sans la volumétrie et c’est détaillée ci-dessous.
    Remarque : Une fois que la STM est créés, ils sont analysés de la même manière quel que soit le logiciel a été utilisé pour les générer. Pour ignorer cette méthode alternative pour la création de STMs en ImageJ, passez à l’étape 3.19.
  9. Pour créer STMs avec ImageJ, ouvrir la pile de fichiers TIFF qui composent l’enregistrement de l’activité de ICC-DMP Ca2 + (ouverture de fichier dans la barre d’outils ImageJ). ImageJ ouvre automatiquement les fichiers TIFF RVB ou les images 16 bits. Pour améliorer la qualité de l’image, clic gauche « Image » dans la barre d’outils ImageJ. Défiler sur la première option "Type « pour faire apparaître un menu déroulant des différents formats d’image, faites défiler sur 32 bits » et clic gauche pour changer.
  10. Bruit de fond (issu du bruit de fluorescence ou caméra auto) devrait maintenant être soustrait du film. Faites un clic gauche de la fonction « Sélection rectangulaire » dans l’interface d’ImageJ et dessiner un retour sur investissement (par clic gauche et en traînant à la forme et la taille souhaitée) au cours de la fluorescence de fond du film.
  11. Après avoir sélectionné le retour sur investissement, clic gauche sur « Analyze » dans la barre d’outils ImageJ et ensuite clic gauche « Histogramme » dans le menu déroulant qui en résulte. Une fenêtre pop-up apparaîtra alors curieux sur les valeurs de plage de pixels à calculer ; ImageJ a les valeurs de la ROI présélectionnés alors gauche, cliquez « OK ».
  12. Après avoir cliqué sur « OK », une nouvelle boîte de pop-up contenant un histogramme s’affiche montrant la distribution des valeurs pour le bruit de pixels de l’arrière-plan dans le retour sur investissement. Prendre note de la valeur moyenne indiquée sous l’histogramme, puis fermez la boîte de pop-up.
  13. Cliquez sur revenir à la film de 32 bits, puis sélectionnez le champ de vision complet de gauche en cliquant sur « Modifier » dans la barre d’outils ImageJ, défilement pour « Sélection » et faites un clic gauche sur « Sélectionner tout » dans le menu déroulant a révélé.
  14. Clic gauche « Processus » dans la barre d’outils ImageJ, mettez en surbrillance « Math » et clic gauche « Soustraire » dans le menu déroulant révélée.
  15. Une boîte contextuelle apparaîtra où une valeur à soustraire de la champ de vision peut être insérée. Entrez la valeur moyenne acquise de l’histogramme à l’étape 3.12 ci-dessus et cliquez sur « OK ». ImageJ demandera alors à traiter toutes les trames de la pile de TIFF (et pas seulement le cadre unique le film est actuellement sur). Cliquez sur « Oui ».
  16. Après avoir cliqué sur « Oui », le film devient noir. Pour corriger cela, clic gauche « Image » dans la barre d’outils ImageJ et descendez sur « Ajuster ». Faites un clic gauche sur la première option révélée pour « Luminosité/contraste » (B & C). Cela fera apparaître une boîte pop up où les divers aspects de la luminosité et le contraste peuvent être modifiées. Faites un clic gauche sur l’option « Auto » une fois pour révéler la qualité accrue dans le film. Laissez cette B & C pop boîte ouverte pour une utilisation future.
  17. Pour créer un IRLS, tout d’abord un clic droit sur l’outil de sélection de ligne dans l’interface d’ImageJ pour révéler les options pour différentes lignes ; Faites un clic gauche sur « Segmentée » pour le sélectionner dans la liste. Avec l’outil « Segmentée » sélectionné, usage unique gauche clique pour dessiner une ligne le long de l’axe milieu d’une ICC-DMP individuel. Chaque simple clic gauche fixera la ligne à ce moment précis et la ligne peut alors être librement déplacée plus loin à n’importe quel angle. Lorsque la ligne est complétée, double clic gauche pour fixer la ligne en place.
  18. Clic gauche « Image » sur la barre d’outils ImageJ et descendez sur « Piles » et faites un clic gauche sur l’option « Retrancher ». Une boîte contextuelle apparaîtra ; Faites un clic gauche sur l’option à « rotation 90 ° », cela va orienter les IRLS de gauche à droite afin qu’elle peut être calibré et lire contre la montre sur l’axe des x, avec un espace sur l’axe des ordonnées. Cliquez sur « OK » pour créer de la STM.
  19. L’intensité de la STM sera créée sur une échelle de gris avec forte intensité Ca2 + signaux montrés comme des degrés de blanc, large gris blanc ou clair selon leur intensité. Normalement, le contraste de l’IRLS créés devront être améliorés. Cela en cliquant sur « Auto » sur le pop B & C boîte.
  20. L’intensité de la fluorescence de l’IRLS est présentée sur la STM dans les valeurs de pixel arbitraire. Afin de mesurer avec précision l’amplitude de Ca2 + les signaux de la STM, les valeurs de la fluorescence de la STM (F) maintenant doivent être normalisées. En utilisant la fonction « Sélection rectangulaire » dans l’interface d’ImageJ, tirer un retour sur investissement sur une superficie de la STM qui affiche la zone moins intense et plus uniforme de la fluorescence (F0).
  21. Répétez les étapes prises 3.11, 3.12 pour obtenir une valeur moyenne (F0) de l’intensité dans le retour sur investissement sélectionné, puis sélectionnez la STM entier par clic gauche sur « Edit-sélection-Select All » dans la barre d’outils ImageJ.
  22. Clic gauche « Processus » sur la barre d’outils ImageJ et sélectionnez « Math » ; clic gauche « Diviser » parmi les options révélées. Dans la boîte de popup ultérieures, entrez la valeur moyenne (F0) obtenue à l’étape 3.21. Dès divisant la STM ensemble (F,0), la STM devient noire ; corriger cela en cliquant sur « Auto » sur la B & C pop-up boîte. Les IRLS est maintenant réglé pour amplitude, avec une intensité de fluorescence exprimée en F/F0.
  23. La STM affiche actuellement le nombre d’images dans la pile TIFF sur l’axe des abscisses et le nombre de pixels représentant la longueur de la cellule sur l’axe y. Afin de quantifier l’information spatiale et temporelle des signaux de Ca2 + , calibrer la STM pour l’espace et le temps. Clic gauche sur « Image » dans la barre d’outils ImageJ et à gauche, cliquez sur « Propriétés ». Une boîte contextuelle apparaîtra. Dans cette fenêtre, entrez les valeurs appropriées pour bien calibrer la STM.
  24. Pour « Largeur en pixels », entrez la durée de temps que nécessaire pour capturer une image unique en quelques secondes. Pour obtenir des exemples, à 5 images/s, entrez une valeur de 0,2, 50fps entrer une valeur de 0,02, pour 33 FPS Entrez une valeur de 0,033 etc. Pour « Hauteur en pixels », entrez microns combien chaque représente pixel (dépendra de l’objectif utilisé et la caméra utilisée pour l’acquisition). « Profondeur de Voxel » est maintenue à 1 avant de cliquer sur « OK ». Aucun autre paramètre ne devant être modifiées dans la fenêtre.
    Remarque : Après avoir cliqué sur « OK », la STM sera entièrement calibrée pour l’amplitude, l’espace et le temps. Amplitude sur la STM sera exprimé comme temps0, F/F sur l’axe des abscisses sera exprimé en secondes et espace sur l’axe y est exprimé en μm (Figure 2 b). Ca2 + événements sur la STM sont maintenant prêts à être mesurée, la STM calibrée peut également être enregistrée comme une seule image TIFF pour analyser à une date ultérieure.
  25. ImageJ a un certain nombre de construit dans la table de choix de couleur (lut) qui peut être utilisé pour le code couleur de la STM. Appliquez construit en LUT en cliquant à gauche sur la barre d’outils de ImageJ sur le chemin d’accès « Image-Lookup Tables » et choisir un LUT à appliquer. Fait sur commande LUTs peut également être importé à la STM en cliquant à gauche sur la barre d’outils de ImageJ sur le chemin d’accès « Fichier-importation-LUT » puis en sélectionnant la LUT à importer. Par exemple, la STM illustrée à la Figure 2 a eu le LUT personnalisé « QUBPallete » (Queens University Belfast, UK) appliqué à lui, aux couleurs chaudes de code (rouge, orange) comme zones de fluorescence de Ca2 + intense et des couleurs froides (bleu, noir) comme des zones de faible Ca2 + fluorescence.
  26. Pour insérer une barre de calibration d’amplitude pour indiquer la plage d’amplitudes représentée par les diverses couleurs, clic gauche « Analyze » de la barre d’outils ImageJ, mettez en surbrillance « Outils » et sélectionnez « Étalonnage Bar » dans le menu révélé. Options sont indiquées pour la taille, la zoom, la gamme et la position sur la STM pour la barre d’étalonnage ; régler ces paramètres comme vous le souhaitez, puis cliquez sur « OK ». Notez que lorsque la barre de calibration est insérée, ImageJ crée un nouveau STM contient, laissant la version originale sans la barre de calibration intact et distinct.
    Remarque : Si la case « Overlay » est cochée lors de l’insertion de la barre de calibration, un nouveau STM ne sera pas généré.
  27. Pour débuter l’analyse Ca2 + épreuves individuelles, cliquez sur le sélecteur de « Ligne droite » sur l’interface ImageJ. Par initialement clic gauche sur la STM, tracez une ligne horizontale droite à travers le centre d’un événement de Ca2 + parallèle à l’axe des abscisses (contre la montre). Complétez la ligne en cliquant à gauche une seconde fois (Figure 2D).
  28. Cliquez sur « Analyser » dans la barre d’outils ImageJ et faites un clic gauche sur « Tracer le profil ». Une nouvelle boîte s’affiche avec le profil de l’intrigue de la Ca2 + événement (Figure 2E).
    Remarque : L’option « List » dans cette boîte va générer une liste de valeurs XY de l’intrigue généré, ce qui peut être copié dans un tableur pour créer des traces si vous le souhaitez.
  29. Pour mesurer l’amplitude de la Ca2 + événement représenté dans le profil du terrain, cliquez sur le sélecteur « Ligne droite » sur l’interface ImageJ. Puis, tracez une ligne verticale de la ligne de base du profil de terrain à l’apogée de l’événement de Ca2 + ; la longueur de la ligne (affiché sur l’interface ImageJ) représentera l’amplitude de l’événement, exprimée en ΔF/F0 (Figure 2E).
  30. À l’aide de la valeur acquise d’amplitude, la durée d’une épreuve2 + Ca peut être mesurée en dessinant une ligne droite sur toute la largeur de l’événement au point de l’amplitude maximale de 50 % (toute la durée à demi amplitude maximale, FDHM) ou toute la durée de l’événement peut être mesurée si vous le souhaitez (Figure 2E).
    Remarque : Expérimentateurs devra concevoir un critère spécifique pour le seuillage Ca2 + événements valides dans ces enregistrements. Dans nos expériences, Ca2 + épreuves ont été désignées comme étant valide pour l’analyse, si son amplitude a été > 15 % de l’événement d’amplitude maximale dans la section de contrôle de l’enregistrement. Toutefois, ces seuils dépendra des tissus spécifiques et cellules sous étudient et sont seulement arbitraires directives nécessitant une optimisation spécifique pour chaque type de tissus et de cellules.
  31. En traçant une ligne le long de la branche ascendante ou battement vers le bas de Ca2 + événement intrigue profil, le taux de hausse ou la baisse peut être calculé en conséquence. Après que la ligne est tracée, le curseur de la souris peut être déplacé vers le point où la ligne commence et où elle se termine. Lorsque le curseur est à l’arrêt sur ces points, les coordonnées x, y pour cet endroit s’affichera dans le côté inférieur gauche de l’interface ImageJ. Ainsi, par l’acquisition de x, les valeurs de y pour où la ligne commence (x1, y1) et se termine (x2, y2), le taux de hausse ou baisse (ΔF/s) peut être calculé comme la pente de la ligne, y2 - y1 / x2 - x1 (Figure 2F ).
  32. Afin de calculer la multiplication ou la propagation spatiale d’un événement de Ca2 + , cliquez sur le sélecteur de « Ligne droite » sur l’interface ImageJ. Puis, tracer une ligne droite verticale sur toute la longueur de la Ca2 + manifestation le long de l’axe des ordonnées. La longueur de la ligne (affiché sur l’interface ImageJ) représentera la propagation spatiale de l’événement exprimé en μm (Figure 2).
  33. Déterminer la vitesse d’une multiplication Ca2 + événement en traçant une ligne le long du front de propagation de l’événement et en calculant la pente de la droite. Ceci peut être effectué manuellement de manière semblable, décrite à l’étape 3.32, en déterminant x, les valeurs de y pour où la ligne commence (x1, y1) et se termine (x2, y2) ; ces valeurs seront affichera dans le côté inférieur gauche de l’interface ImageJ lorsque le curseur de la souris se trouve sur la STM.
  34. Sur la collection des paramètres souhaités pour la quantification de Ca2 + événement, mettre en commun ces moyenne de valeurs afin de générer des valeurs moyennes pour chaque paramètre sur une base par cellule ; vous pouvez également placer toutes les valeurs brutes dans un histogramme de distribution pour montrer leur aire de répartition (Figure 2 H).

4. quantification des PTC dans ICC-ma Particle utilisant analyse fondée sur

  1. Avant d’analyser les films en volumétrie avec PTCLs, la calibration spatiale et temporelle du film devra être inséré dans le nom du fichier. Modifier tous les fichiers à analyser dans la volumétrie pour contenir dans le titre, le nombre de secondes que chaque image est égal à et aussi le nombre de microns chaque pixel égale à séparés par un trait unique, avec les valeurs entourées de crochets. Par exemple, un film acquis à 33 images par seconde avec un objectif de 60 x (512 x 512) devrait avoir [0,22 – 0,033] inséré dans son nom de fichier.
  2. Ouvrez la volumétrie et utiliser les clics droit de la souris pour ouvrir les dossiers contenant des fichiers de film. Faites un clic gauche sur le fichier de film à analyser pour l’ouvrir dans la volumétrie (Figure 3 a, doit être au format TIFF non compressé).
  3. Afin de calculer avec précision les signaux de Ca2 + de la FOV ensemble, le film fera l’objet d’abord différenciation et lissage pour supprimer les interférences de l’arrière-plan (bruit de l’appareil photo, auto fluorescence etc.) et d’augmenter le rapport signal sur bruit. Dans la fenêtre film, faites un clic droit pour faire apparaître un menu et à l’aide de clics droit accès "STK filtre-différencier », un clic droit à nouveau pour entrer une valeur pour différencier, appuyez sur entrée et faites un clic gauche pour appliquer (pour films acquis à 33 images par seconde, une valeur de 2 (∆t = ± 66-70 msec) fonctionne bien, la valeur augmente selon le taux d’augmentation de capture d’image).
    Remarque : Dans ce contexte, la différenciation permettra de réduire l’intensité des zones d’enregistrement (pixels) qui ne montrent aucune activité dynamique sur le nombre de frames spécifié. Ainsi, si une valeur de "2" est insérée, chaque pixel de chaque image de l’enregistrement est analysé, et s’il n’y a aucun changement dynamique dans le cadre de fluorescence 1 pixel avant et 1 cadre après dans ce cadre, l’intensité dans ces pixels sera soustrait l’enregistrement. Ainsi, bruit de fond non dynamiques est supprimé, et le signal à bruit est augmentée.
  4. Lisser le film différencié en appliquant un filtre Gaussien. Faites un clic droit dans la fenêtre film pour faire apparaître un menu et à l’aide de clics droit accès « STK filtre-Gauss KRNL », un clic droit à nouveau pour insérer une valeur (utilisez toujours un nombre impair, pour les films acquis à 33 images par seconde, une valeur de 5 fonctionne bien, 1,5 x 1,5 µm StdDev 1.0) une valeur d’entrée, appuyez sur entrée et faites un clic gauche pour appliquer (Figure 3 b).
  5. Commencez à créer des PTCLs d’abord sélectionner une période du film incluant une période de repos (20 à 40 cadres) suivie de l’apparition d’une CCT et aussi des cadres de 20 à 40 après la CCT. Pour ce faire, faites défiler le film en utilisant le module d’administration pour faire défiler de gauche à droite sur la barre jaune.
  6. Avec la sélection faite, utilisation clic droit dans la fenêtre film d’accès « Ops STK – rampe DS PTCLinfo » et faites un clic gauche pour appliquer. Cette fonction exécute une routine d’analyse PTCL qui rampes progressivement le seuil de l’intensité maximale à intensité minimale. Ceci sera affiché sous forme graphique dans la fenêtre de tracé comme un complot du bruit et également dans la fenêtre de trace comme trois traces colorées, avec la trace verte indiquant le nombre de PTCLs, la trace rouge montrant la taille moyenne de PTCL et la trace bleue indiquant l’intensité absolue seuil.
    Remarque : La numéro et moyenne de la taille de PTCLs à chaque seuil est calculée automatiquement et ensuite un seuil semi-manuel est appliqué à l’aide de l’intensité à laquelle à dont la taille moyenne des PTCLs commence à diminuer, ce qui se produit au point d’inflexion de la trace rouge dans la fenêtre de Trace (Figure 3D, c'est-à-dire due à un grand nombre de bruit dans l’espace limité PTCLs réduction de la taille moyenne de PTCLs).
  7. Dans la fenêtre de tracé, appuyez sur « H » à la solde de l’histogramme l’intrigue montré du bruit PTCL. Parcourir les jeux de couleurs en appuyant sur ' [' jusqu'à ce que le fond est de couleur blanche avec des traces de couleurs sur le dessus.
  8. Appuyez sur « F » à mettre en place un outil de mesure et faites un clic gauche sur le terrain à l’intersection où les parcelles colorées déplacement vers la droite. Cela marquera une seule ligne verticale dans la barre de défilement de la fenêtre de trace ci-dessous.
  9. Dans la fenêtre de Trace, mettez en surbrillance la gauche MMB droit depuis le point d’inflexion de la courbe rouge jusqu'à ce que la ligne verticale blanche marquée créé à l’étape 4.10 et en s’assurant que la trace bleue est sélectionnée par un clic droit dessus, lire le « yAVG » qui s’affichera dans t Il inférieure gauche de la fenêtre de trace. Désélectionnez la sélection en appuyant sur le module d’administration une fois à l’intérieur de la fenêtre de trace.
  10. Dans la fenêtre film, appuyez sur « C » pour faire apparaître une roue de couleurs, puis presse aurait "pour régler le seuil. PTCLs valides apparaît désormais comme le rouge dans la fenêtre film (Figure 3) et ceux qui saturent sera blanc. Supprimer les zones blanches en faisant défiler vers le haut avec le bouton gauche de la souris.
  11. Faites défiler vers le haut ou vers le bas avec le MMB pour ajuster la valeur numérique jaune dans la roue chromatique, ajuster cette valeur à la valeur d’yAVG prise à l’étape 4.11. Cela affectera tout en rouge comme un actif Ca2 + PTCL transitoire au point seuil déterminé. Clic pour enregistrer cela dans un fichier de coordonnées des particules basé, utilisation droit d’accès "STK 3D-Save PTCLS 0', puis à gauche, cliquez sur pour enregistrer le fichier.
  12. Quittez la volumétrie et rouvrir. Ouvrez le fichier PTCL (fichier .gpf), créé à l’étape 4.13. Dans ce type de fichier, tous les actifs transitoires2 + Ca sont enregistrées sous un uniforme PTCL bleu (Figure 3E). Comme chaque PTCL est une entité individuelle avec son propre ID, aire et périmètre coordonnées, drapeaux d’État (voir ci-dessous) et les tableaux de résultat, l’analyse des caractéristiques spatio-temporelles des PTCLs, ou entre PTCLs est simplifiée.
  13. Pour commencer l’analyse PTCLs, supprimer n’importe quel bruit PTCL restant (petites PTCLs non valides créés lorsque le fichier .gpf est généré) à l’aide de clics droit dans la fenêtre film pour accéder à « PTCL STKOPS-drapeau ptcls > Min = 70' et faites un clic gauche pour appliquer. Cette action signalera PTCLs supérieurs à 6 µm2 (~ diamètre > 2µ) et volumétrie eux assignera à la sélection « 1 drapeau'. Lorsque c’est terminé, PTCLs qui sont au-dessus de ce seuil (pavillon 1) apparaîtra comme une couleur pourpre clair dans la fenêtre film, alors que tout PTCLs seuil restera leur couleur bleu de base (Figure 3F).
  14. Créer des représentations de carte de chaleur d’activité PTCL à l’aide de clics droit dans la fenêtre film pour accéder à « PTCL STKops-StatMap Flag ='. Par un clic droit sur cette dernière voie, une affectation de drapeau à analyser peut être entrée. Ainsi, si vous vouloir quantifier les PTCLs assignés à Indicateur1, il suffit d’entrer "1", appuyez sur entrée et puis faites un clic gauche pour appliquer. Cela va générer une carte de chaleur montrant les PTCLs totales pour toute la durée de l’enregistrement, avec des couleurs différentes, qui représente l’occurrence (%) tout au long de l’enregistrement (Figure 3, couleurs chaudes indiquent une présence accrue à cet endroit).
  15. Enregistrer les cartes de chaleur en cliquant dessus pour accéder à « STM charge enregistrer - enregistrer STM comme .tif » et puis faites un clic gauche pour enregistrer au format TIFF.
  16. Quantifier à l’aide de clics droit dans la fenêtre film pour accéder à l’activité des PTCL ' PTCL mesure-PTCLStats STK =', faites un clic droit sur cette dernière voie, une affectation de drapeau d’analyser peut être entrée. Ainsi, si vous vouloir quantifier les PTCLs assignés à Indicateur1, il suffit d’entrer "1", appuyez sur entrée et puis faites un clic gauche pour appliquer. Cela va générer une série de traces dans la fenêtre de Trace.
  17. Volumétrie sera, par défaut, superposer les traces PTCL générés à l’étape 4.17 uns sur les autres. Séparez-les en utilisant le clic droit dans la fenêtre de Trace d’accès « Align-Remscheid Trace » et faites un clic gauche pour appliquer. Cela révélera les différentes traces PTCL quatre qui quantifient la Ca2 + activité PTCL dans le film montrant PTCL zone (vert), comte PTCL (rouge), taille PTCL (cyan) et PTCL taille écart (bleu) complotèrent contre la montre (Figure 3 H).
  18. Ces traces peuvent être enregistrées dans un fichier texte qui peut être importé dans un tableur pour une analyse ultérieure. Pour enregistrer les traces, maintenez la touche Maj et utilisez le clic droit dans la fenêtre de Trace d’accès « ROI assortis-Dump sous forme de texte » et faites un clic gauche pour enregistrer le fichier. Cette information est ensuite recueillie et illustrée en histogrammes ou autres représentations graphiques appropriées (Figure 3 H).
  19. Afin d’examiner la présence initiale de PTCLs (c.-à-d., se pencher sur les sites de tir), ces PTCLs initiales reçoivent une affectation de pavillon différent. Pour mieux isoler, sites de tir qui se produisent au sein du réseau, seulement ces PTCLs qui a fait se chevauchent pas avec toutes les particules dans l’image précédente mais le chevauchement avec des particules dans les prochains 70 ms sont considérés sites de tir.
  20. Pour appliquer ce seuil, les utiliser clic droit dans la fenêtre film pour accéder à « PTCL comportement-F1 InitSites > F = 3' et gauche, cliquez sur appliquer. Cela affectera initiant PTCLs comme « drapeau 3', et PTCLs qui répondent à ce critère apparaît désormais comme une couleur vert clair dans le film (Figure 4 a).
  21. Volumétrie offre également la capacité de quantifier et de tracer le nombre de sites de mise à feu de PTCL dans un champ de vision donnée mais aussi tracer leur probabilité de mise à feu au cours d’une CCT. Pour analyser ces paramètres, créer une carte thermique de lancer PTCLs (pavillon 3) comme indiqué au point 4.16 (Figure 4 b).
  22. Faites un clic gauche dans la fenêtre de tracé, puis appuyez sur « C » pour faire apparaître un cercle chromatique et la presse ne ' au seuil. La carte thermique de lancer PTCLs volonté puis tour gris et blanc. Supprimer tout blanc en faisant défiler vers le haut avec le bouton gauche de la souris et le seuil des PTCLs dans la carte thermique afin que seulement valides PTCLs sont couvertes en gris (ajuster le seuil en faisant défiler de haut en bas avec le module d’administration).
  23. Utilisation de clic droit sur la carte de chaleur dans la fenêtre de tracé d’accès « STM PTCLs-Find PTCLs 70' et faites un clic gauche pour appliquer. Cela affectera tous les PTCLs gris sur la carte qui sont supérieurs à 70 pixels2 taille devant être affectés comme une initiation de couleur distincte PTCL ou PTCL tir site (Figure 4).
  24. Tracer l’activité de chacun de ces sites de tir contre la montre par un clic droit sur la PTCL tir carte et pour accéder aux « Rois de la STM PTCLs-créer PTCL » et à gauche en cliquant sur appliquer. Cela va générer une nouvelle image dans la fenêtre film avec tous la PTCL couleur distincte tir des sites affichés avec un retour sur investissement autour d’eux.
  25. Utilisation de clic droit dans la fenêtre film pour accéder à « PTCL mesure-PTCLpixROIBM > = 1' et faites un clic gauche pour appliquer. Cela permettra d’identifier tous les ROIs de la fenêtre film qui contiennent au moins un PTCL et vont tracer l’ensemble de l’activité au sein de ces ROIs dans la fenêtre de trace. Par défaut, ces traces vont se superposer sur l’autre. Pour les séparer, utilisation clic droit dans la fenêtre de Trace d’accès « Align-Remscheid Trace » et faites un clic gauche pour appliquer. Pour enregistrer les traces, maintenez la touche Maj et utilisez le clic droit dans la fenêtre de Trace d’accès « ROI assortis-Dump sous forme de texte » et faites un clic gauche pour enregistrer le fichier.
  26. L’activité de chaque site de tir peut aussi être tracée comme une carte de présence. Pour ce faire, les utiliser clic droit dans la fenêtre film pour accéder à « PTCL mesure-ROI Pianola = 10' et faites un clic gauche pour appliquer. Cela va générer une parcelle de tous les sites de tir contre la montre dans la fenêtre de tracé. Chaque site de tir sera affichée comme une entité couleur séparément, chacun dans sa propre « voie » et ces emplacements correspondent à Ca2 + PTCLs initier au cours de la CTC (Figure 4E as EventArgs) enregistrer ces cartes d’accident par un clic droit dessus pour accéder à ' STM Charge enregistrer - enregistrer STM comme .tif ' et puis faites un clic gauche pour enregistrer au format TIFF.
  27. Afin de quantifier la probabilité de mise à feu à chaque emplacement de mise à feu au cours d’une CCT, les utiliser clic droit dans la fenêtre film pour accéder à « PTCL marque de comportement est = 1' et faites un clic gauche pour appliquer. Il identifiera toutes les images dans le film qui contiennent PTCLs seuil et ceux-ci seront marqués dans le bas de la fenêtre film comme des lignes bleues verticales.
  28. CTC se manifeste comme le regroupement rapide des tirs asynchrone de plusieurs sites de mise à feu dans le champ de vision avec des écarts de s ~ 1 entre chaque cycle de la CCT. Cette régularité et long intervalle d’aucune PTCLs actives entre CTC est utilisé pour définir plus précisément une CCT pour analyse.
  29. Utilisation de clic droit dans la fenêtre film pour accéder à ' écart PTCL comportement-bloc est < =' et utilisez un clic droit sur le point final d’entrer un numéro. Cette commande regroupera les cadres PTCL actives identifiées à l’étape 4,28 en blocs et blocs sont basés sur le nombre d’images qui séparent PTCLs actives. Pour les enregistrements de 33 FPS par exemple, une valeur de 10 fonctionne bien. Si PTCLS actives sont moins de 10 images dehors (330 ms) ils sont regroupés en un seul bloc pour analyse (les blocs sont ensuite indiquées comme rectangles roses au-dessus des lignes bleues verticales au bas de la fenêtre film, avec chaque rectangle rose maintenant indiquant une CCT).
  30. Utilisation de clic droit dans la fenêtre film d’accéder aux « PTCL mesure-PTCL événement Prob ». Cela va générer un fichier texte qui peut être importé dans un tableur. Ce fichier texte fournira une grande quantité de données sur la nature des sites de lancement qui ont été définis des escaliers 4.16 – 4,23 et leur contribution au DCC.
    Remarque : Le fichier texte indiquera le nombre de sites d’initiation (appelés « domaines »), la taille du site en pixels et μm2, probabilité de chaque site d’initiation de tir soit une fois ou plusieurs fois au cours de chaque CTC (donnée en pourcentage), la durée moyenne et la taille de PTCLs se produisant à ce site d’initiation, le nombre de cycles de CCT (tel que défini à l’étape de 4,23) et le pourcentage de sites de mise à feu qui ont tiré au cours de chaque cycle de la CCT. Ces informations sont recueillies et illustrées dans les histogrammes ou autres représentations graphiques appropriées (Figure 4F).

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Representative Results

À l’aide de Kit-Cre-GCaMP6F souris (Figure 1), dynamique Ca2 + signalisation comportements d’ICC dans le tractus gastro-intestinal peuvent être photographiées sur place. Avec la microscopie confocale, photos haute résolution de certaines populations de CPI peuvent être acquis sans contaminer les signaux des autres populations d’ICC dans le même tissu mais en avions anatomiquement distinctes de mise au point (Figure 2 a)37 , 39 , 40 , 41. il est possible d’enregistrer en bref (< 100 ms), localisée Ca2 + événements qui n’étaient pas possibles avec membrane perméable Ca2 + indicateurs. La cartographie spatio-temporelle avec volumétrie ou ImageJ logiciel peut servir à générer STMs de tous les événements2 + Ca dans les cellules in situs. En utilisant cette approche, Ca2 + evenements dans un champ de vision complet peuvent être visualisées et mappé (Figure 2 bC), plutôt que de simplement enregistrer l’activité limitée d’un seul ROI. Ces méthodes peuvent être appliqués à chaque cellule dans un champ de vision donnée, veiller à ce que collecte de données représentatives de toutes les cellules et fournissant des informations quantitatives sur les amplitudes relatives, des périodes transitoires, vitesse de montée et la chute des transitoires, etc. (Figure 2E , F). Analyse STM, au lieu de parcelles d’intensité axée sur le retour sur investissement, permettent également de surveiller et d’enregistrer caractéristiques spatiales de Ca2 + signalisation, tels que la propagation spatiale et de la vitesse de propagation, comme illustré à la Figure 2. Cette information peut être amassée pour fournir une vue assez complète de Ca2 + signalisation des comportements chez les cellules dans leur environnement natif (Figure 2 H).

PTCL analyse peut être utilisée pour quantifier plus complexes Ca2 + signalisation des comportements, tels que ceux survenant dans les réseaux cellulaires interconnectés. Un exemple de cette application est fourni par l’analyse menée sur ICC-MY (Figure 3 a). Généralement dans ces préparations complexes, bruit de fond et de signal-bruit peuvent être un problème. Cependant, à l’aide de logiciels de volumétrie d’appliquer des filtres de différentiels et lissage sur les films de Ca2 + activité et puis application de protocoles de seuil de bruit pour filtrer les bruits de fond de bruit (Figure 3 b-D) peuvent être enlevés du complexe enregistrements de l’activité dynamique. En utilisant l’analyse PTCL telles que celles indiquées dans la Figure 3E-G, des informations quantitatives sur Ca2 + signalisation peut être calculée en mesurant la zone PTCL, comte PTCL et taille PTCL qui indiquent les gammes spatiales de l’activation de Ca2 + signaux dans un champ de vision. Ces données peuvent être compilées comme illustré à la Figure 3 H et analysées statistiquement, le cas échéant. La figure 4 illustre comment PTCL analyse permet dans la quantification de la profondeur de subcellulaire Ca2 + signalisation en examinant l’emplacement et en tirant les probabilités de Ca2 + sites de tir. En allouant PTCLs dans différents drapeaux basés sur leurs caractéristiques temporelles, lancer PTCLs peut être correctement mappé comme illustré dans la Figure 4-E et une richesse des données acquises sur le nombre de sites d’initiation (dénommé " les domaines), la taille du site en pixels et µm2, la probabilité de chaque ouverture du site de tir soit une fois ou plusieurs fois au cours de chaque CTC (donnée en pourcentage), la durée moyenne et la taille des PTCLs qui se produisent sur le site de l’initiation, le nombre de CCT cycles (comme définie à l’étape 4,23) et le % des sites de mise à feu qui ont tiré au cours de chaque cycle de la CCT. Ces techniques permettent un niveau élevé d’exploration de données et de la quantification in situ Ca2 + signaux survenant dans un réseau cellulaire intact qui ne sont pas possibles avec les analyses axées sur le retour sur investissement.

Figure 1
Figure 1 : production de souris KitGCaMP6f. Diagramme schématique de la façon dont Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f souris) ont été croisées avec c-Kit+ / Cre ERT2 (Kit-Cre souris) pour générer des Kit-Cre-GCaMP6f souris. Ces souris sont injectés par le tamoxifène à l’âge de 6 à 8 semaines pour induire la Cre Recombinase et ultérieures GCaMP6f expression exclusivement à la CPI. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Signaux d’analyse stochastique Ca2 + dans ICC-DMP à l’aide de la cartographie spatio-temporelle (STM). (A) image représentative de plusieurs ICC-DMP de l’intestin grêle d’une souris de Kit-Cre-GCaMP6F in situe. Un retour sur investissement vert indique la taille et l’orientation du ROI dessiner autour d’un unique ICC-DMP dans le champ de vision pour créer un STM en volumétrie. (B), à la STM de Ca2 + activité en ICC-DMP a mis en évidence dans le groupe A, après qu’il a été correctement calibré pour l’amplitude, l’espace et le temps. (C) la STM même montrée dans le groupe B après qu’il a été codé avec une table de recherche (QUBPallete) en couleur. (D) Expanded image de transitoires de ICC-DMP Ca2 + affichée une couleur codé STM, indiquant où tracer une ligne à travers un événement de Ca2 + à travers son axe de temps (x) pour créer un profil de l’intrigue de son activité dans ImageJ. Terrain (E) profil de la Ca2 + événement mis en évidence dans la paroi D, indiquant où les lignes montrées être dessiné pour mesurer avec précision l’amplitude et la durée de l’événement. Terrain (F) le profil de la Ca2 + événement mis en évidence dans la paroi D, indiquant où les lignes montrées être dessiné pour mesurer avec précision la vitesse de montée et le taux de précipitation de l’événement. (G) Expanded image de transitoires de ICC-DMP Ca2 + affichée une couleur codé STM, indiquant où tracer une ligne à travers un événement de Ca2 + à travers son axe (y) de l’espace pour mesurer avec précision sa propagation spatiale. (H) histogrammes représentant des données regroupées des ICC-DMP illustrant comment afficher graphiquement l’amplitude, la durée et propagation spatiale valeurs acquises de suivre les étapes ci-dessus. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Quantification des PTC en utilisant ICC-mon analyse fondée sur la particule. (A) image représentative d’un réseau ICC-MY dans l’intestin grêle d’une souris de Kit-Cre-GCaMP6F in situe. (B) Image extraite de l’enregistrement sur la paroi A après qu’il a subi un filtre différentiel de Δt = ±66 – 70 ms et un filtre Gaussien de 1,5 x 1,5 µm, StdDev 1.0. (C) Image tirée de la vidéo en B après seuillage était complété par PTCLs seuil en rouge. (D) Traces de PTCL compte et moyenne taille PTCL dans un protocole de seuillage pour éliminer le bruit dans le film montré dans panneau B. PTCLs ont été créés en utilisant un algorithme de remplissage inondation qui ont marqué la structure de tous les pixels adjacents ayant une intensité supérieure à seuil, Ca 2 + PTCLs transitoires étaient plus grands que le bruit PTCLs. Le seuil au cours de laquelle un grand nombre de petites taille bruit PTCLs ont émergé et ont commencé à réduire la taille moyenne des PTCLs utilisable comme un seuil commun pour tous les enregistrements. Image représentant (E) de la coordonnée de Ca2 + PTCL fichier créé à partir de l’enregistrement Binariser en image représentative C. (F) issu du fichier PTCL de E après un critères de sélection de > 6 µm2 (diamètre ~ 2 µm ou plus petit) a été appliqué ; PTCLs ci-dessus, cette limite sont marqués (pavillon 1) comme particules de lumière pourpres et considéré comme valide carte de chaleur PTCLs. (G) montrant les PTCLs totales (pavillon 1) pour tout l’enregistrement de la vidéo montrée dans le groupe F, avec totales PTCLs récapitulées aux couleurs représentant présence tout au long de l’enregistrement (couleurs chaudes indiquent une présence accrue à cet endroit). (H) les traces représentatives de PTCL (bleu) et comte PTCL (rouge) dérivées du fichier PTCL créé dans panneau A-G. Histogrammes représentant des données regroupées de plusieurs expériences figurent ci-dessous les traces. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Analyse du Ca2 + tir sites dans l’utilisation de l’ICC-mon analyse fondée sur la particule. (A) image représentative prélevée dans le fichier PTCL de Figure 3E après que 1 drapeau PTCLS sont encore affinés dans le pavillon 3, l’état de l’indicateur de Ca2 + sites de tir. DRAPEAU 3 PTCLs sont affichés sous forme de vert lime (seuls ces PTCLs qui a fait se chevauchent pas avec toutes les particules dans l’image précédente mais le chevauchement avec des particules dans les prochains 70 ms ont été considérés comme des sites de mise à feu). (B) chaleur carte montrant les PTCLs totales (pavillon 3) pour tout l’enregistrement de la vidéo montrée dans le groupe A, avec totales PTCLs a résumé avec couleurs représentant la présence tout au long de l’enregistrement (couleurs chaudes indiquent une présence accrue à cet endroit). (C) carte représentative de Ca2 + tir sites sont indiqués dans le groupe que b, avec chaque site de tir différents attribué une couleur différente d’identification. (D) les traces représentatives de PTCL salon (bleue) et PTCL comptent (rouges) dérivées du fichier PTCL créé dans la Figure 3 a-G. (E) une carte de survenue de l’activité des sites de tirs individuels. Chaque site de tir dans le champ de vision est affiché comme un bloc coloré dans sa propre « voie » contre la montre. (F) des histogrammes représentant des données regroupées de plusieurs expériences sont présentés illustrant les valeurs s’accumulent pour Ca2 + probabilité de mise à feu site de tir / CTC et le nombre de Ca2 + tir sites dans un champ de vision. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Ca2 + imagerie des types spécifiques de cellules dans les tissus intacts ou au sein des réseaux de cellules souvent révèle des motifs complexes de transitoires de Ca2 + . Cette activité nécessite une analyse attentive et approfondie et quantification de capturer plus d’informations sur les événements sous-jacents et la cinétique de ces événements que possible. STM et analyse PTCL fournissent une occasion de maximiser la quantité de données quantitatives dans les enregistrements de ce type.

Les étroites et morphologie fusiforme du ICC-DMP rendent bien adapté à l’analyse STM dérivée de la STM décrites ci-dessus. Toutefois, cette analyse n’est pas bien adaptée à ICC-MY qui sont étoilées en forme et connecté à un réseau (Figure 3 a). En outre, les Ca2 + signalisation modèles dans ICC-MY sont plus complexes, se manifestant par la CTC de plusieurs sites d’origine tout au long de l’ICC-mon réseau de multiplication. Ainsi, afin de quantifier l’activité qui se produisent dans l’ensemble du réseau ICC-MY dans un champ de vision, analyse de particules (PTCL) a été implémentée à l’aide de logiciel fait sur mesure (volumétrie, version G8d, GWH, utilisable sous Mac OS, communiquer avec Grant Hennig grant.hennig@med.uvm.edu en ce qui concerne les demandes d’accès de volumétrie et d’utilisation).

Analyse de la STM permet tous les événements de Ca2 + au sein de cellules uniques et toutes les cellules dans un champ de vision à analyser critique dans un éventail de paramètres spatiaux et temporels. Le protocole décrit illustre comment ces techniques peuvent être appliquées pour ICC-DMP de l’intestin de souris. En quantifiant entièrement Ca2 + signalisation dans ICC-DMP, tel qu’illustré à la Figure 2 b-G, Ca2 + signalisation patrons ont été caractérisés en détail37. Ces analyses ont été appliqués aux enregistrements où ICC-DMP subissent des interventions de finement quantifier les effets de blocage ou de stimuler la libération de Ca2 + / influx de Ca2 + / neurotransmission voies37,39 , 40 , 41. ces techniques peuvent être facilement appliquées aux autres préparations de tissus intacts. Par exemple, analyse de la STM comme décrit ici a été utilisé pour identifier de nouvelles voies mécanistiques impliquées dans la génération des intracellulaire Ca2 + ondes enregistrées dans le muscle lisse urétral en situ57.

La préparation de STMs en volumétrie exige une certaine prudence, comme la fonction en volumétrie qui crée la STM depuis le retour sur investissement dessiné (Figure 2 a) est une valeur moyenne de l’intensité. Ainsi, l’amplitude des signaux2 + Ca pourrait potentiellement être dilué le retour sur investissement est attirée plus large ou plus longtemps que le Ca2 + événement ou cellules d’intérêt. Ainsi, les utilisateurs devraient prendre soin de tirer les ROIs qui sont comme correspondant étroitement que possible aux signaux de Ca2 + ou cellule particulière qu’ils analysent afin d’atténuer ce problème. De même, création de STM à l’aide de pixel unique linescans dans ImageJ signifie que cartographie de Ca2 + événements précis est soumise à la proximité du signal Ca2 + à la ligne tracée. Ces préoccupations sont mineures en mince cellules comme ICC-DMP fusiforme, cependant autre cellule types avec une morphologie plus étoilée ou ronde peut rendre ce type d’analyse inappropriées mapper tous les signaux de Ca2 + avec précision. Lors de la préparation des STM pour analyse, peu importe si elles ont été faites en volumétrie ou avec ImageJ linescans, il y a quelques zones d’être mis en évidence pour des fins de dépannage. Il est important de changer la qualité d’image 32 bits avant d’effectuer tout étalonnage sur le STMs. le défaut de le faire, ou faire après que étalonnage pour F/F0 peut conduire à des mesures incohérentes dans des expériences. Vérifiez toujours la qualité de l’image de la STM, qui est indiquée dans la partie supérieure de la bordure blanche de la STM lorsqu’elle a ouvert avec ImageJ. Une autre zone potentielle d’incompatibilité consiste à sélectionner la valeur de0 F lors de l’étalonnage d’amplitude. Il est vital que pour sélectionner la région pour F0, qu’il couvre une surface de la cellule qui est uniforme et bien centrées. Pour cette raison, les zones de la cellule qui ont une fluorescence basale instable ou qui modifient en raison de la circulation ou d’autres objets ne sont pas idéales et des protocoles rigoureux motion stabilisation doivent être employés dans ces cas.

Dans les préparations sur place ou de cultures contenant interconnectés réseaux cellulaires, tels que ICC-MY dans le petit intestin, analyse PTCL fournit une technique simplifiée afin de quantifier les complexes, subcellulaires Ca2 + événements survenant dans le réseau. En outre, il permet également de tous les événements de Ca2 + dans le réseau au sein d’un champ de vision donnée à analyser, plutôt que d’utilisant des ROIs arbitraires, qui seulement fournir des informations sur la fréquence et l’intensité dans le retour sur investissement. Un avantage de l’analyse PTCL décrite ici est que par l’application différentielle et aux enregistrements, les filtres de lissage gaussien une grande quantité de bruit peut être retirée de films pouvant contenir contaminantes de lumière des cellules pas d’intérêt ou en raison de la non dynamiques des points lumineux ou des inclusions. Il est important de noter que le montant de la différenciation appliquée aux enregistrements dépendra en grande partie le taux d’acquisition utilisé par l’expérimentateur. Différencier les films tel que décrit dans le protocole fournit un moyen d’appliquer un filtre au film pour supprimer le bruit haute fréquence d’enregistrements. Appliquer une valeur de différenciation de '2' lors de l’acquisition à 33FPS fonctionne bien pour éliminer le bruit de fond tout en conservant le bon signal à bruit (si la valeur est trop faible, bruit est ramassé mais signal-bruit sera compromis si la valeur est trop élevée). La valeur de différenciation appliquée doit être augmentée avec des taux d’acquisition plus rapides, par exemple à 100 FPS, une valeur de différenciation de '7' donne environ le même signal sur bruit comme une valeur de '2' pour un enregistrement 33FPS. Expérimentateurs devra optimiser ces paramètres en conséquence pour leurs préparations et leurs conditions d’enregistrement.

Le protocole de seuillage décrit à la Figure 3D permet une procédure cohérente seuillage à appliquer aux différents enregistrements réalisés sur différents systèmes avec logiciel d’acquisition différents. Cette flexibilité permet aux données provenant de plusieurs chercheurs travaillant sur différents systèmes de compiler leurs enregistrements dans les mêmes ensembles de données. En utilisant le système de drapeau en volumétrie, analyse PTCL permet la visualisation et la quantification des individuels Ca2 + tir sites au sein d’un réseau en détail. Informations peuvent être recueillies sur le nombre de sites d’initiation, la taille du site en pixels et µm2et la durée moyenne des PTCLs se produisant à cet endroit. Cette analyse PTCL a permis la première caractérisation de l’activité de la CCT dans l’intestin grêle au niveau infra-cellulaire, et, en utilisant les différents drapeaux dans le logiciel de volumétrie, PTCLs à la fois le réseau et la mise à feu individuel du site niveau ont été quantifiés dans le tissu intact préparations de Kit-Cre-GCaMP3 souris38. De ces observations initiales, cette analyse a été davantage utilisée pour étudier le roman Ca2 + afflux parcours en GI ICC-MY comme magasin-opéré-Ca2 +-entrée42 et le rôle des mitochondries Ca2 + signalisation sur GI pacemaker 41. bien comme l’analyse de la STM décrite ci-dessus, PTCL analyse peut être facilement adaptables aux différentes préparations intactes, autre que celle décrite dans le présent protocole. Par exemple, une étude récente analysèrent PTCL pour étudier le roman rythmique Ca2 + des événements qui se produisent dans les réseaux cellulaires intacts de la lamina propria de la rat vessie58,59 et pourrait donc être facilement appliquée à autres systèmes cellulaires intacts, complexes tels que les systèmes neuronaux. Si cet article se concentre sur Ca2 + l’imagerie des tissus intacts avec GECIs, ces techniques d’analyse peuvent également être exécutés sur des cellules isolées et tissus chargés avec traditionnel Ca2 + indicateur colorants. L’analyse de la STM basé a été utilisé pour quantifier correctement localisé Ca2 + signaux et ondes de Ca2 + de la broche en forme de cellules interstitielles et les cellules musculaires lisses provenant de diverses préparations11,60 , 61 , 62 , 63. en outre, les routines d’analyse PTCL décrites ici ont également été appliqués aux préparations de réseau in situ visualisées avec 520 Cal58,59. Toutefois, ces études conservent également les inconvénients de ce colorant protocoles tels que l’identification de la cellule ambigu et des problèmes de signal-bruit de chargement.

Les exemples illustrés ci-dessus montrent que les STM et PTCL analyse sont des techniques très malléables qui peuvent être utilisées pour quantifier complexe Ca2 + signalisation dans un large éventail de préparations de tissus intacts. Les approches offrent de nombreux avantages par rapport à ROI traditionnel basé parcelles d’intensité qui ont été systématiquement utilisées auparavant et devraient fournir aux enquêteurs des renseignements quantitatifs plus précieux sur Ca2 + signalisation qu’était possible auparavant.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Financé par le NIDDK, via DK41315 P01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ImageJ software NIH 1.5a ImageJ software
Volumetry GWH Volumetry 8Gd Custom made analysis software
Isoflurane Baxter, Deerfield, IL, USA NDC 10019-360-60
Tamoxifen Sigma T5648
GCaMP6F mice Jackson Laboratory Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice Gifted From Dr. Dieter Saur c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol Pharmco-Aaper SDA 2B-6

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