Spatio-लौकिक मानचित्रण और कण विश्लेषण तकनीक के अनुप्रयोगों Intracellular Ca के लिए2 + सीटू में संकेतन

Biology

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Summary

आनुवंशिक रूप से एंकोडेड ca2 + संकेतक (GECIs) मौलिक कैसे सीटू Ca2 + इमेजिंग किया जाता है में बदल गया है । इस तरह की रिकॉर्डिंग से डेटा वसूली को अधिकतम करने के लिए, Ca के उपयुक्त विश्लेषण2 + संकेतों की आवश्यकता है । इस पेपर में प्रोटोकॉल spatiotemporal मानचित्रण और कण आधारित विश्लेषण का उपयोग कर सीटू में दर्ज सीए2 + संकेतों के ठहराव की सुविधा ।

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Drumm, B. T., Hennig, G. W., Baker, S. A., Sanders, K. M. Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ. J. Vis. Exp. (143), e58989, doi:10.3791/58989 (2019).

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Abstract

ca2 + पृथक कोशिकाओं या बरकरार ऊतकों के भीतर कोशिकाओं के विशिष्ट प्रकार के इमेजिंग अक्सर सीए2 + संकेत के जटिल पैटर्न से पता चलता है । इस गतिविधि में सावधानी और गहराई से विश्लेषण और संभव के रूप में अंतर्निहित घटनाओं के बारे में अधिक जानकारी के रूप में कैप्चर करने के लिए ठहराव की आवश्यकता है । स्थानिक, लौकिक और तीव्रता पैरामीटर सीए के लिए आंतरिक2 + आवृत्ति, अवधि, प्रसार, वेग और आयाम के रूप में संकेत कुछ जैविक intracellular संकेत के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान कर सकते हैं । उच्च-रिज़ॉल्यूशन Ca2 + इमेजिंग आमतौर पर quantifiable डेटा में इमेजिंग जानकारी का अनुवाद करने के मामले में प्रक्रिया करने के लिए समय लेने वाले बड़े डेटा फ़ाइलों के अधिग्रहण में परिणाम, और इस प्रक्रिया को मानव त्रुटि और पूर्वाग्रह के लिए अतिसंवेदनशील हो सकते हैं । 2 सीए का विश्लेषण+ सीटू में कोशिकाओं से संकेत आम तौर पर (FOV) देखने के एक क्षेत्र के भीतर ब्याज की मनमाने ढंग से चयनित क्षेत्रों (रॉय) से सरल तीव्रता माप पर निर्भर करता है. इस दृष्टिकोण बहुत महत्वपूर्ण संकेतन FOV में निहित जानकारी की अनदेखी । इस प्रकार, ca 2 + रंजक या optogenetic ca2 + इमेजिंग, उचित स्थानिक और अस्थाई विश्लेषणके साथ प्राप्त की ऐसी उच्च संकल्प रिकॉर्डिंग से जानकारी की वसूली को अधिकतम करने के लिए 2 + संकेतों की आवश्यकता है । इस पत्र में उल्लिखित प्रोटोकॉल का वर्णन करेगा कि कैसे डेटा की एक उच्च मात्रा ca से प्राप्त किया जा सकता2 + इमेजिंग रिकॉर्डिंग और अधिक पूर्ण विश्लेषण की सुविधा के लिए और ca के ठहराव2 + संकेतों का एक संयोजन का उपयोग कर कोशिकाओं से रिकॉर्ड की गई spatiotemporal मानचित्र (STM)-आधारित विश्लेषण और कण आधारित विश्लेषण । प्रोटोकॉल भी वर्णन कैसे विभिंन पैटर्न Ca के2 + संकेत सीटू में अलग सेल की आबादी में मनाया उचित विश्लेषण किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, विधि 2 सीए की जांच करेगा+ छोटी आंत में कोशिकाओं की एक विशेष जनसंख्या में संकेतन, Cajal के मध्यवर्ती कोशिकाओं (आईसीसी), GECIs का उपयोग कर.

Introduction

Ca2 + एक सर्वव्यापी intracellular दूत जो सेलुलर प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला जैसे मांसपेशियों संकुचन1,2, चयापचय3, सेल प्रसार3,4, नियंत्रण है 5, तंत्रिका टर्मिनलों6,7, और नाभिक में प्रतिलेखन कारकों के सक्रियकरण पर न्यूरोट्रांसमीटर रिहाई की उत्तेजना । 7 Intracellular ca2 + संकेतों अक्सर cytosolic Ca2 +में क्षणिक उंनयन के रूप ले, और इन सहज हो सकता है या एगोनिस्ट उत्तेजना से उत्पंन सेल प्रकार8के आधार पर । स्थानिक, लौकिक और तीव्रता पैरामीटर सीए 2 के लिए आंतरिक+ आवृत्ति, अवधि, प्रसार, वेग के रूप में संकेत है, और आयाम जैविक intracellular संकेत5के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान कर सकते हैं, 7 , 9. Cytoplasmic ca 2+ सिग्नल ca के आमद से परिणाम कर सकते हैं2 + extracellular अंतरिक्ष से या ca के माध्यम से 2 + रिलीज endoplasmic जालिका (एर) से ca के माध्यम से2 + रिलीज चैनलों ऐसे ryanodine रिसेप्टर्स के रूप में (RyRs) और inositol-त्रिकोणीय फॉस्फेट रिसेप्टर्स (आईपी3रुपये)10. RyRs और आईपी3रुपये दोनों सीए की पीढ़ी के लिए योगदान कर सकते हैं2 + संकेतों और इन चैनलों, जो विभिन्न सीए2 + आमद तंत्र के साथ संयुक्त के साथ संयोजित एक सीए के असंख्य में परिणाम कर सकते हैं2 + संकेत पैटर्न जो संख्या और ca2 + आमद चैनल की ओपन प्रायिकता के आकार के होते हैं, ca 2 + रिलीज़ चैनलों की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल, ca2 + आमद और रिलीज़ चैनलों के बीच निकटता, और अभिव्यक्ति और ca 2 के वितरण + reuptake और बाहर निकालना प्रोटीन । ca2 + संकेतों वर्दी, लंबे समय तक चलने, उच्च तीव्रता वैश्विक दोलनों कि कई सेकंड या यहां तक कि मिनट के लिए पिछले हो सकता है के रूप ले सकते हैं, intracellular और सेलुलर सीए2 + तरंगों है कि intracellular दूरी पार कर सकते है प्रचार अधिक १०० µm10,11,12,13,14,15,16, या अधिक संक्षिप्त, विशेष रूप से स्थानीयकृत इवेंट जैसे Ca2 + स्पार्क्स और2 Ca + puffs कि मिलीसेकंड timescales के दसियों पर होते है और कम 5 µm17,18,19,20से फैल ।

फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है Ca2 + अलग और प्रसंस्कृत कोशिकाओं में संकेत और बरकरार ऊतकों में निगरानी । परंपरागत रूप से, इन प्रयोगों फ्लोरोसेंट सीए 2 का उपयोग शामिल+ संकेतक, ratiometric और गैर ratiometric रंजक जैसे Fura2, Fluo3/4 या Rhod2, दूसरों के बीच में 21,22,23. ये संकेतक कोशिका झिल्ली को पारगंय और फिर अंतर्जात esterases के माध्यम से एक एस्टर समूह की दरार द्वारा कोशिकाओं में फंस बनने के लिए डिजाइन किए गए थे । 2 Ca के बंधन+ उच्च संबध संकेतक के लिए प्रतिदीप्ति में परिवर्तन के कारण जब कोशिकाओं और ऊतकों प्रकाश की उचित तरंग दैर्ध्य द्वारा प्रबुद्ध थे । सेल पारगंय ca के उपयोग2 + संकेतक बहुत सीए की हमारी समझ को बढ़ाया2 + जीवित कोशिकाओं में संकेत और स्थानिक संकल्प और इन संकेतों है कि Ca2 + सिग्नल परख द्वारा संभव नहीं था की अनुमति दी ठहराव अंय साधनों के माध्यम से, जैसे इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी । हालांकि, पारंपरिक Ca2 + संकेतक है कई सीमाएं, जैसे विस्तारित रिकॉर्डिंग अवधियों पर24photobleaching होती है । जबकि नए ca2 + सूचक Cal520/590 के रूप में रंजक बहुत शोर अनुपात करने के लिए संकेत में सुधार हुआ है और स्थानीय Ca का पता लगाने की क्षमता2 + सिग्नल25, photobleaching के साथ मुद्दों अभी भी कुछ जांचकर्ताओं के लिए एक चिंता का विषय रह सकते हैं २६,२७,२८. तेज़ photobleaching भी बढ़ाई, छवि अधिग्रहण की दर को प्रतिबंधित करता है, और संकल्प है कि रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, के रूप में वृद्धि की उद्देश्य शक्ति और छवि अधिग्रहण की उच्च दर वृद्धि हुई उत्तेजना प्रकाश तीव्रता की आवश्यकता है कि बढ़ता photobleaching ।

intracellular ca2 + संकेतों बरकरार ऊतकों से रिकॉर्डिंग जब उदाहरण के लिए, सीटू में सीए2 + संकेतों रिकॉर्डिंग जब पारंपरिक ca2 + संकेतक रंजक की इन सीमाओं को ख़राब कर रहे हैं । इसके बाद के संस्करण की समस्याओं के लिए, ca के दृश्य2 + सीटू में संकेतों सेल पारगंय सीए का उपयोग कर2 + संकेतक कम बिजली आवर्धन और छवि पर कब्जा की कम दरों तक सीमित किया गया है, जांचकर्ताओं की क्षमता को रिकॉर्ड करने के लिए विवश और अस्थायी या स्थानिक रूप से प्रतिबंधित उपसेलुलर सीए2 + संकेतों को बढ़ाता है । इस प्रकार, यह गया है मुश्किल पर कब्जा करने के लिए, विश्लेषण, और सीए 2 के स्थानिक और लौकिक जटिलता+ संकेतों की सराहना करते हैं, जो वांछित जैविक प्रतिक्रियाओं की पीढ़ी में महत्वपूर्ण हो सकता है, के रूप में ऊपर उल्लिखित । 2 सीए का विश्लेषण+ सीटू में कोशिकाओं से संकेत आम तौर पर (FOV) देखने के एक क्षेत्र के भीतर ब्याज के चयनित क्षेत्रों (रॉय) से सरल तीव्रता माप पर निर्भर करता है. संख्या, आकार और ROIs की स्थिति की मनमानी पसंद, शोधकर्ता की सनक पर निर्भर है, गंभीर रूप से प्राप्त परिणामों पूर्वाग्रह कर सकते हैं । के रूप में अच्छी तरह के रूप में रॉय विश्लेषण के साथ निहित पूर्वाग्रह, इस दृष्टिकोण महत्वपूर्ण संकेतन FOV में निहित जानकारी के बहुत उपेक्षा, गतिशील Ca के रूप में2 + एक मनमाने ढंग से चुना रॉय के भीतर घटनाओं विश्लेषण के लिए चुना जाता है । इसके अलावा, ROIs के विश्लेषण के लिए Ca के स्थानिक विशेषताओं के बारे में जानकारी प्रदान करने में विफल रहता है2 + मनाया संकेतों । उदाहरण के लिए, यह हो सकता है नहीं संभव हो ca 2 + में एक वृद्धि के बीच अंतर करने के लिए + परिणामस्वरूप एक प्रोपेगेटिंग ca2 + लहर और एक अत्यधिक स्थानीयकृत ca 2 + रिलीज़ इवेंट से tabulations ca2 + एक ROI के भीतर संकेतों ।

आनुवंशिक रूप से एनकोडेड ca केआगमन 2 + संकेतक (GECIs) मौलिक बदल गया है कैसे ca2 + इमेजिंग सीटू मेंकिया जा सकता है29,30,31,३२,३३ . रंगों से अधिक GECIs का उपयोग करने के लिए कई फायदे हैं । सबसे महत्वपूर्ण शायद यह है कि GECI की अभिव्यक्ति एक सेल विशिष्ट तरीके से किया जा सकता है, जो नहीं ब्याज की कोशिकाओं से अवांछित पृष्ठभूमि संदूषण कम कर देता है । पारंपरिक Ca 2 पर GECIs का एक और लाभ+ संकेतक यह है कि photobleaching कम है (के रूप में प्रतिदीप्ति और परिणामी photobleaching केवल तब होती है जब कोशिकाओं को सक्रिय कर रहे हैं), के रूप में डाई से भरा नमूनों की तुलना में, विशेष रूप से उच्च पर आवर्धन और छवि की ऊंची दरों पर कब्जा३४। इस प्रकार, GECIs के साथ इमेजिंग, ऐसे optogenetic सेंसर की GCaMP श्रृंखला के रूप में, मुलाजिम के लिए संक्षिप्त रिकॉर्ड करने की क्षमता, स्थानीय उप सेलुलर सीए2 + सीटू में सिग्नल और जांच ca2 + कोशिकाओं में अपने भीतर संकेतन मूल वातावरण है कि पहले से संभव नहीं किया गया है । इस तरह के उच्च संकल्प रिकॉर्डिंग से जानकारी की वसूली को अधिकतम करने के लिए, उपयुक्त स्थानिक और अस्थायी विश्लेषण के Ca2 + संकेतों की आवश्यकता है. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि जबकि GECIs कुछ स्पष्ट लाभ की पेशकश कर सकते हैं, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि सीए2 + इमेजिंग सफलतापूर्वक एक साथ पारंपरिक का उपयोग कर ंयूरॉंस के विभिंन neurochemical वर्गों की बड़ी आबादी से प्रदर्शन किया जा सकता है Ca2 + संकेतक कि आनुवंशिक रूप से पशु३५में एनकोडेड नहीं हैं । इस दृष्टिकोण के बाद हॉक immunohistochemistry सिंक्रनाइज़ फटने में उच्च आवृत्ति पर फायरिंग न्यूरॉन्स के कई विभिन्न वर्गों प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया, और संभावित है कि पशु के लिए आनुवंशिक संशोधनों शारीरिक के साथ हस्तक्षेप किया है हो सकता से परहेज व्यवहार जांचकर्ता३५,३६समझ चाहता है ।

इस पत्र में उल्लिखित प्रोटोकॉल और अधिक पूर्ण विश्लेषण और सीए के ठहराव2 + spatiotemporal मानचित्र (STM) आधारित विश्लेषण और कण आधारित विश्लेषण का एक संयोजन का उपयोग कर सीटू में कक्षों से रिकॉर्ड किए गए संकेतों की सुविधा । प्रोटोकॉल भी वर्णन कैसे विभिंन पैटर्न Ca के2 + संकेत सीटू में अलग सेल की आबादी में मनाया उचित विश्लेषण किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, विधि छोटी आंत में कोशिकाओं की एक विशेष जनसंख्या में सीए2 + संकेत की जांच करेगा, Cajal (आईसीसी) के मध्यवर्ती कोशिकाओं. आईसीसी GCaMPs३७,३८,३९,४०व्यक्त चूहों का उपयोग visualized के रूप में, गतिशील intracellular सीए2 + संकेतन प्रदर्शन, जठरांत्र (सैनिक) पथ में विशिष्ट कोशिकाओं रहे हैं ४१,४२. 2 सीए + आईसीसी में यात्रियों के सक्रियण से जुड़े रहे हैं ca2 +-सक्रिय Cl- चैनल ( Ano1द्वारा इनकोडिंग) कि आंतों चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं (SMCs)४३की उत्तेजितता को विनियमित करने में महत्वपूर्ण हैं, ४४,४५. इस प्रकार, Ca के अध्ययन2 + आईसीसी में संकेतन आंत्र गतिशीलता को समझने के लिए मौलिक है. murine छोटी आंत इस प्रदर्शन के लिए एक उत्कृष्ट उदाहरण प्रदान करता है, के रूप में वहां आईसीसी के दो वर्गों है कि anatomically अलग कर रहे है और स्वतंत्र रूप से visualized किया जा सकता है: i) आईसीसी परिपत्र और अनुदैर्ध्य के बीच क्षेत्र में स्थित है चिकनी मांसपेशी परतें, myenteric जाल आसपास (आईसीसी-मेरा) । इन कोशिकाओं पेसमेकर कोशिकाओं के रूप में सेवा और विद्युत धीमी लहरों४६,४७,४८,४९के रूप में जाना जाता गतिविधि उत्पंन; ii) आईसीसी भी मोटर न्यूरॉन्स के टर्मिनलों में अमीर जाल के बीच स्थित हैं (गहरी पेशी जाल, इस प्रकार आईसीसी-DMP). इन कोशिकाओं को प्रवेश मोटर neurotransmission३७,३९,४०,५०के लिए प्रतिक्रियाओं के मध्यस्थों के रूप में सेवा करते हैं । आईसीसी-मेरी और आईसीसी-DMP आकृति विज्ञान अलग हैं, और उनके Ca2 + संकेत व्यवहार मौलिक उनके विशिष्ट कार्यों को पूरा करने के लिए अलग हैं । आईसीसी-मेरे आकार में तारामय है और गैप जंक्शनों५१,५२के माध्यम से परस्पर कोशिकाओं के एक नेटवर्क के रूप में । 2 ca + सिग्नल आईसीसी में-मेरे मैनिफ़ेस्ट संक्षिप्त और स्थानिकी स्थानीयकृत Ca2 + रिलीज़ के रूप में एक से अधिक साइटों में एसिंक्रोनस रूप से आईसीसी के माध्यम से-मेरे नेटवर्क एक FOV के भीतर visualized के रूप में (एक 60X उद्देश्य के साथ imaged)३८. इन अतुल्यकालिक संकेतों अस्थाई 1 दूसरा क्लस्टर में आयोजित कर रहे है कि, जब एक साथ सारणीबद्ध, एक शुद्ध 1 एस सेलुलर वृद्धि में राशि Ca2 +। इन संकेतों को सेल के लिए आईसीसी नेटवर्क के भीतर सेल प्रचार और इसलिए सीए2 + सिग्नलिंग, उप से उत्पंन सेलुलर साइटों, एक ऊतक वाइड Ca2 + वेव में । अस्थाई क्लस्टरिंग और सीए 2 के योग+ आईसीसी में संकेत-मेरे ca2 + क्षणिक क्लस्टर (CTCs)३८का कार्यकाल दिया गया है । CTCs हो rhythmically (उदाहरण के लिए काफी इसी तरह की अवधि और CTCs के बीच समान अवधि) माउस में प्रति मिनट 30 बार । इसके विपरीत, आईसीसी-DMP धुरी आकार कोशिकाओं रहे हैं, माध्यमिक प्रक्रियाओं के साथ कुछ, कि SMCs और वैरिकाज़ तंत्रिका प्रक्रियाओं के बीच वितरित और स्वतंत्र रूप से एक नेटवर्क५१,५२फार्म नहीं है । आईसीसी-DMP फार्म SMCs के साथ अंतर जंक्शनों, तथापि, और इस ग्रेटर syncytium के भीतर समारोह, घूंट syncytium५३के रूप में जाना जाता है । 2 सीए + संकेतों कोशिकाओं की लंबाई के साथ कई साइटों पर होते हैं, लेकिन इन यात्रियों entrained या अस्थायी संकुल नहीं कर रहे हैं, के रूप में आईसीसी में मनाया-मेरे३७. Ca2 + आईसीसी में संकेत-DMP चर तीव्रता, अवधि और स्थानिक विशेषताओं के साथ, एक stochastic तरीके से होते हैं । नीचे दिए गए प्रोटोकॉल, 2 Ca के उदाहरण का उपयोग कर+ आईसीसी में संकेतन-मेरे और आईसीसी-DMP, तकनीक का वर्णन करने के लिए सीटू में कोशिकाओं के विशिष्ट प्रकार में संकेत जटिल विश्लेषण । हम inducible Cre-लोक्स पी प्रणाली का उपयोग आईसीसी में विशेष रूप से GCaMP6f व्यक्त करने के लिए, Cre-Recombinase (Cre) एक आईसीसी विशिष्ट प्रमोटर (किट) से प्रेरित के सक्रियकरण उत्प्रेरण के बाद ।

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Protocol

सभी जानवरों का इस्तेमाल किया और इस अध्ययन में किए गए प्रोटोकॉल की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के साथ अनुसार थे । सभी प्रक्रियाओं को नेवादा, रेनो विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु उपयोग और देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. KitGCaMP6f चूहों की पीढ़ी

  1. क्रॉस Ai95 (RCL-GCaMP6f)-डी (GCaMP6f चूहों) और सी-किट+/Cre-ERT2 (किट-Cre चूहों) को आईसीसी विशिष्ट GCaMP6f व्यक्त पशु (किट-Cre-GCaMP6f चूहों) उत्पन्न करने के लिए.
    नोट: GCaMP6f रिपोर्टिंग स्थानीयकृत में अपनी रिपोर्ट की क्षमता के कारण प्रयोग किया जाता था, संक्षिप्त intracellular सीए2 + संकेत सीटू में और vivo५४में.
  2. सुई किट-Cre-GCaMP6f चूहों tamoxifen के साथ 6 की उम्र में-8 सप्ताह Cre Recombinase सक्रियण और आईसीसी में बाद में GCaMP6f अभिव्यक्ति प्रेरित करने के लिए (चित्रा 1).
    1. tamoxifen समाधान बनाने के लिए, tamoxifen के ८० मिलीग्राम भंग ( सामग्री की तालिकादेखें) इथेनॉल के ८०० μL में ( सामग्री की तालिकादेखें) एक cuvette और भंवर में 20 मिनट के लिए.
    2. कुसुम का तेल (जेनेरिक) के ३.२ मिलीलीटर जोड़ें 20 मिलीग्राम/एमएल और फिर इंजेक्शन के लिए 30 मिनट पहले sonicate के समाधान बनाने के लिए ।
    3. चूहों इंजेक्षन (intraperitoneal इंजेक्शन; आईपी) के साथ tamoxifen समाधान के ०.१ मिलीलीटर (2 मिलीग्राम tamoxifen) लगातार तीन दिनों के लिए । genotyping द्वारा GCaMP6f अभिव्यक्ति की पुष्टि करें और पहले इंजेक्शन के 10 दिनों के बाद चूहों का उपयोग.
      1. प्रत्येक जानवर से कान का एक छोटा सा टुकड़ा कतरन द्वारा चूहों जीनोटाइप । फिर, NaOH के 75 मिलीलीटर में ६० मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर कान क्लिप मशीन द्वारा जीनोमिक डीएनए अलगाव के लिए हॉटशॉट विधि५५ का उपयोग करें और फिर Tris बफर के ७५ मिलीलीटर द्वारा बेअसर । प्रत्येक पशु, GCaMP6f विशिष्ट प्राइमरों५६के साथ एक 20 मिलीलीटर की प्रतिक्रिया में डीएनए के 2 मिलीलीटर के जीनोटाइप निर्धारित करने के लिए मानक पीसीआर का प्रयोग करें । जंगली प्रकार (२९७ बीपी) और उत्परिवर्ती (~ ४५० बीपी) बैंड का निर्धारण करने के लिए एक 2% agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद के 10 मिलीलीटर भागो ।

2.2 सीए के लिए ऊतकों की तैयारी+ इमेजिंग

  1. isoflurane के साथ साँस लेना द्वारा चूहों Anaesthetize (4%, सामग्री की तालिकादेखें) एक हवादार हुड में और फिर ग्रीवा विस्थापन द्वारा बलिदान.
  2. तेज कैंची का प्रयोग करने से चूहों का पेट खुला, छोटी आंत और जगह को Krebs-रिंगर बिकारबोनिट सॉल्यूशन (केआरबी) में हटा दें । mesenteric सीमा के साथ छोटी आंत खोलें और केआरबी के साथ किसी भी intraluminal सामग्री दूर धोने । तीव्र विच्छेदन का प्रयोग, म्यूकोसा और उप म्यूकोसा परतों को हटा दें ।
    नोट: केआरबी समाधान (मिमी में) निम्नलिखित संरचना है: NaCl ११८.५, KCl ४.७, CaCl2 २.५, MgCl2 १.२, NaHCO3 २३.८, KH2पीओ4 १.२, डेक्सट्रोज ११.०. यह समाधान ३७ डिग्री सेल्सियस पर ७.४ का पीएच है जब ९५% ओ2-5% सह2के साथ संतुलन के लिए bubbled ।
  3. छोटे पिंस का उपयोग करना, एक 5 मिलीलीटर मात्रा के आधार पर छोटी आंत के ऊतकों पिन, ६० mm व्यास Sylgard-लेपित डिश ऊपर का सामना कर रहे परिपत्र चिकनी मांसपेशी परत के साथ । प्रयोग से पहले 1 hr की equilibration अवधि के लिए ३७ ° c पर उष्ण केआरबी समाधान के साथ तैयारी Perfuse ।
  4. इस equilibration अवधि के बाद, सीटू Ca में प्रदर्शन2 + छोटे आंत्र आईसीसी की इमेजिंग-मेरे और आईसीसी-DMP का उपयोग करते हुए फोकल माइक्रोस्कोपी (इस प्रोटोकॉल में छवियों को एक कताई-डिस्क के साथ सज्जित एक फोकल माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहीत किया गया था). कारण ऊपर वर्णित GECIs के लाभों के लिए, उच्च संकल्प समय चूक छवियों (> 30 फ्रेम प्रति सेकंड, एफपीएस) उच्च शक्ति उद्देश्यों के साथ संयुक्त (60-100x) गतिशील सीए 2 की फिल्में प्राप्त करने के लिए का उपयोग करें+ आईसीसी में संकेतों ।
    नोट: ऊतक आंदोलन को कम करने के लिए, पहले३७,३८,३९,४०,४१वर्णित के रूप में रिकॉर्डिंग के दौरान nicardipine (0.1-1 माइक्रोन) लागू करें ।
  5. अपनी अलग संरचनात्मक स्थान, आकृति विज्ञान और बेसल सीए2 + गतिविधि पैटर्न का उपयोग छोटी आंत में आईसीसी-मेरी और आईसीसी-DMP भेद.
    1. पता लगाएँ आईसीसी-मेरी छोटी आंत के परिपत्र और अनुदैर्ध्य चिकनी मांसपेशी परतों के बीच, myenteric जाल के स्तर पर. वे तारामय आकार के हैं, एक जुड़ा नेटवर्क बनाने (3 ए आंकड़ा) । CTCs (ऊपर वर्णित) आईसीसी के नेटवर्क के माध्यम से प्रचार-मेरी एक नियमित घटना के साथ ~ प्रति मिनट 30 चक्रों ।
    2. इसके विपरीत, गहरी पेशी जाल के स्तर पर एक एकल विमान में आईसीसी-DMP का पता लगाने, परिपत्र चिकनी मांसपेशी परत और सबम्यूकोसल जाल के बीच में. आईसीसी-DMP एक नेटवर्क के रूप में नहीं है और धुरी के आकार की कोशिकाओं (चित्रा 2a) है कि कोई नियमित रूप से प्रचार की घटनाओं प्रदर्शन और बजाय आग stochastic, स्थानीयकृत intracellular Ca2 + यात्रियों ।
  6. अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग के बावजूद, एक झगड़ा छवियों के ढेर के रूप में फिल्मों को बचाने के ।

3. Stochastic सीए 2 का विश्लेषण+ आईसीसी में संकेत-DMP Spatio का उपयोग-लौकिक मानचित्रण (STM)

  1. आईसीसी का विश्लेषण-DMP का उपयोग spatio-ImageJ सॉफ्टवेयर का एक संयोजन के साथ लौकिक मानचित्रण (NIH, संयुक्त राज्य अमेरिका, http://imagej.nih.jov/ij में मुफ्त डाउनलोड करने के लिए) और कस्टम मेड सॉफ्टवेयर (Volumetry, संस्करण G8d, GWH, मैक ओएस पर प्रचलित, संपर्क अनुदान Hennig अनुदान । Hennig @ Volumetry पहुंच और उपयोग के लिए पूछताछ के बारे में med.uvm.edu)
    नोट: एक वैकल्पिक दृष्टिकोण पूरी तरह से इन spatio का विश्लेषण करने के लिए अकेले ImageJ के साथ लौकिक नक्शे भी बाद में वर्गों में प्रदान की जाती है (३.९ कदम पर शुरुआत) ।
  2. Volumetry खोलें और चलचित्र फ़ाइलों वाले फ़ोल्डरों को खोलने के लिए सही माउस क्लिक का उपयोग करें । मूवी फ़ाइल पर वाम क्लिक करने के लिए यह Volumetry में खोलने के लिए विश्लेषण किया जा (uncompressed TIFF प्रारूप में होना चाहिए) । एक बार खोला, फिल्म एक नीली सीमा वाली खिड़की (फिल्म खिड़की) है कि दाहिने हाथ स्क्रीन के एक बड़े क्षेत्र शामिल होगा भीतर समाहित हो जाएगा । स्क्रीन के बाएं हाथ की ओर भूखंड खिड़की (ऊपरी 4/5ths) और निशान विंडो (कम 1/5वें) शामिल होंगे ।
  3. SHIFT दबाए रखकर और साथ ही मध्य माउस बटन (MMB, आकार कम कर देता है) के साथ स्क्रॉल या MMB (बढ़ाता है आकार) के साथ नीचे स्क्रॉल करके चलचित्र के आयामों को समायोजित करें । प्रारंभ या ' A ' दबाकर प्लेबैक रोकें; प्लेबैक की गति ऊपर और नीचे तीर कुंजियों का उपयोग करके समायोजित किया जा सकता है ।
  4. Volumetry का उपयोग करके कोई STM बनाने के लिए, बाएँ माउस बटन पर क्लिक करके और खींचते समय SHIFT दबाकर संपूर्ण कक्ष पर ROI आरेखित करें. रॉय के कोनों पर MMB के साथ स्क्रॉल करके roi के उन्मुखीकरण को समायोजित करें. जब रॉय सेल पर जगह में है (चित्रा 2a) का विश्लेषण किया जाना है, ' रॉय STMs – STMyAvg > xRow ' तक पहुँचने के लिए चलचित्र विंडो में सही क्लिक का उपयोग करें और बाएँ क्लिक करें प्लॉट विंडो में सेल गतिविधि का एक STM बनाने के लिए (वहाँ भी एक विकल्प का चयन करने के लिए है ' STMxAvg > यरो w ', जो एक चयनित है यह इस पर निर्भर करेगा कि कक्ष का ओरिएंटेशन x या y अक्ष के साथ अधिक संरेखित है या नहीं, उदाहरण के लिए कक्ष हाइलाइट किया गया चित्र 2a y अक्ष पर अधिक केंद्रित है ') ।
  5. प्लॉट विंडो में STM पर बाएं क्लिक करें और ' P ' को औसत पृष्ठभूमि शोर घटाना और STM के कंट्रास्ट को बढ़ाने के लिए ' H ' दबाएं । ' STM लोड सहेजें-सहेजें STM के रूप में. tif ' का उपयोग करने के लिए दाईं ओर क्लिक करके STM सहेजें और फिर एक TIFF के रूप में सहेजने के लिए क्लिक छोड़ दिया है ।
  6. आईसीसी-DMP के विश्लेषण के शेष ImageJ में किए जाएंगे । ImageJ दो मुख्य घटकों, मॉनिटर के शीर्ष पर एक निश्चित स्थान और एक मोबाइल उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस के साथ एक उपकरण पट्टी के होते हैं । ImageJ का उपयोग कर, STM TIFF फ़ाइल की ICC-DMP Ca2 + गतिविधि (फ़ाइल-खोलें छवि J उपकरण पट्टी पर) खोलें ।
  7. Volumetry STM बनाया है, जो समय खड़ी केंद्रित होगा खोलो । ImageJ स्वचालित रूप से या तो आरजीबी या 16 बिट छवियों के रूप में TIFF फ़ाइलों को खोल देगा । छवि गुणवत्ता में सुधार करने के लिए, बाएँ क्लिक करें ' छवि ' ImageJ टूलबार में. पहले विकल्प ' प्रकार ' पर स्क्रॉल करने के लिए विभिन्न छवि प्रारूपों के मेनू नीचे एक ड्रॉप प्रकट, ' ३२-bit ' पर स्क्रॉल, और बदलने के लिए क्लिक करें छोड़ दिया है.
  8. STM को बाएँ से दाएँ समय के विरुद्ध पठनीय बनाने के लिए, बाएँ पर ImageJ टूलबार पर निम्न पथ पर क्लिक करें: ' छवि-रूपांतर-घुमाएँ ९० डिग्री बाएँ '. यह भी STMs में सीटू Ca2 + Volumetry के बिना अकेले ImageJ के साथ linescans का उपयोग कर गतिविधि बनाने के लिए संभव है और यह नीचे विस्तृत है ।
    नोट: एक बार STMs बनाए जाते हैं, वे उसी तरह का विश्लेषण कर रहे हैं, चाहे जो सॉफ्टवेयर के लिए उंहें उत्पंन किया गया था । ImageJ में STMs बनाने के लिए इस वैकल्पिक पद्धति को छोड़ने के लिए, चरण ३.१९ पर जाएं ।
  9. ImageJ के साथ STMs बनाने के लिए, ICC-DMP Ca2 + गतिविधि (फ़ाइल-खोलें ImageJ उपकरण पट्टी पर) की रिकॉर्डिंग बनाने वाले TIFF फ़ाइलों का स्टैक खोलें । ImageJ स्वचालित रूप से या तो आरजीबी या 16 बिट छवियों के रूप में TIFF फ़ाइलों को खोल देगा । छवि गुणवत्ता में सुधार करने के लिए, बाएँ क्लिक करें ' छवि ' ImageJ टूलबार में. पहले विकल्प ' प्रकार ' पर स्क्रॉल करने के लिए विभिन्न छवि प्रारूपों के मेनू नीचे एक ड्रॉप प्रकट, ' ३२-bit ' पर स्क्रॉल, और बदलने के लिए क्लिक करें छोड़ दिया है.
  10. पृष्ठभूमि शोर (ऑटो प्रतिदीप्ति या कैमरा शोर से उत्पंन) अब फिल्म से घटाया जाना चाहिए । वाम ImageJ अंतरफलक में ' आयताकार चयन ' समारोह पर क्लिक करें और एक रॉय आकर्षित (क्लिक करके छोड़ दिया और इच्छित आकार और आकार के लिए खींचकर) फिल्म की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति पर ।
  11. रॉय का चयन करने के बाद, ' पर विश्लेषण ' ImageJ टूलबार में छोड़ दिया है, और फिर क्लिक करें ' के परिणामस्वरूप ड्रॉपडाउन मेनू से ' हिस्टोग्राम ' छोड़ दिया है । एक पॉप-अप बॉक्स फिर गणना करने के लिए पिक्सेल श्रेणी मानों के बारे में पूछताछ दिखाई देगा; ImageJ रॉय चुना तो छोड़ दिया है पर क्लिक करें ' ठीक ' का मूल्य है ।
  12. ' ठीक ' क्लिक करने के बाद, हिस्टोग्राम युक्त एक नया पॉप-अप बॉक्स, ROI के भीतर पृष्ठभूमि के पिक्सेल शोर के लिए मानों का वितरण दिखाई देगा. हिस्टोग्राम के नीचे सूचीबद्ध माध्य मान का ध्यान रखें और फिर पॉप-अप बॉक्स बंद करें.
  13. ३२-bit फिल्म के लिए वापस क्लिक करें और ImageJ टूलबार पर ' संपादित करें ' पर क्लिक करके छोड़ दिया द्वारा पूरे FOV चयन करें, ' चयन ' के लिए स्क्रॉल, और ' पर सभी का चयन करें ' से पता चला ड्रॉपडाउन मेनू पर क्लिक छोड़ दिया ।
  14. वाम क्लिक करें ' प्रक्रिया ' ImageJ टूलबार पर, ' मठ ' के लिए स्क्रॉल और पता चला ड्रॉपडाउन मेनू से ' घटाना ' पर क्लिक करें छोड़ दिया है ।
  15. एक पॉपअप बॉक्स दिखाई देगा जहां FOV से घटाया जाने वाला मान संमिलित किया जा सकता है । उपरोक्त चरण ३.१२ में हिस्टोग्राम से प्राप्त मतलब मान दर्ज करें और ' ठीक ' पर क्लिक करे. ImageJ तो TIFF स्टैक में सभी फ़्रेम को संसाधित करने के लिए कहेगा (और न केवल एकल फ़्रेम चलचित्र वर्तमान में है) । ' हां ' पर क्लिक करें ।
  16. ' हां ' क्लिक करने के बाद फिल्म ब्लैक हो जाएगी । इसे सही करने के लिए, बाएँ क्लिक करें ' छवि ' में ImageJ टूलबार और स्क्रॉल पर ' समायोजित '. ' चमक/कंट्रास्ट ' (B & C) के लिए पता चला पहला विकल्प पर वाम क्लिक करें । यह एक पॉप अप बॉक्स लाएगा, जहां चमक और कंट्रास्ट के विभिंन पहलुओं को संशोधित किया जा सकता है । फिल्म में बढ़ी हुई गुणवत्ता का खुलासा करने के लिए एक बार ' ऑटो ' ऑप्शन पर लेफ्ट क्लिक करें । भविष्य के उपयोग के लिए इस बी & सी पॉप अप बॉक्स खुला छोड़ दें ।
  17. एक linescan बनाने के लिए, ImageJ अंतरफलक में लाइन चयन उपकरण पर पहले ठीक क्लिक करें अलग लाइनों के लिए विकल्प प्रकट करने के लिए; सूची से चुनने के लिए ' सेगमेंट्ड लाइन ' पर लेफ्ट क्लिक करें । चयनित ' लाइन ' उपकरण के साथ, एकल वाम क्लिकों का उपयोग करने के लिए एक व्यक्तिगत आईसीसी-DMP के मध्य अक्ष के साथ एक लाइन आकर्षित । प्रत्येक एक छोड़ दिया क्लिक करें कि विशेष बिंदु पर लाइन ठीक हो जाएगा और लाइन तो स्वतंत्र रूप से किसी भी वांछित कोण पर आगे ले जाया जा सकता है । लाइन के पूरा होने पर, जगह में लाइन को ठीक करने के लिए डबल लेफ्ट क्लिक करें ।
  18. बाएं क्लिक करें ' छवि ' पर ImageJ टूलबार और ' पर ढेर ' स्क्रॉल और ' reslice ' विकल्प पर क्लिक करें छोड़ दिया है । एक पॉपअप बॉक्स दिखाई देगा; ' ९० डिग्री रोटेट ' करने के विकल्प पर लेफ्ट क्लिक करें, इससे linescan को बाएं से दाएं मालूम जाएगा ताकि वह एक्स-एक्सिस पर समय के खिलाफ तुले और पढ़ सकें, वाई-एक्सिस पर स्पेस के साथ । STM बनाने के लिए ' ठीक ' क्लिक करें ।
  19. STM की तीव्रता उच्च तीव्रता Ca के साथ एक greyscale पर बनाया जाएगा2 + सफेद, बंद सफेद या प्रकाश ग्रे उनकी तीव्रता पर निर्भर करता है की डिग्री बदलती के रूप में दिखाया गया संकेत. आम तौर पर, निर्मित linescan के विपरीत सुधार करने की आवश्यकता होगी । बी & सी पॉप अप बॉक्स पर ' ऑटो ' पर क्लिक करके ऐसा करें.
  20. linescan के प्रतिदीप्ति की तीव्रता को STM पर मनमाने ढंग से पिक्सेल मूल्यों पर प्रस्तुत किया जाता है । सही STM से2 + संकेतों Ca के आयाम को मापने के लिए, STM (एफ) के प्रतिदीप्ति मूल्यों अब सामान्यीकृत किया जाना चाहिए. ImageJ इंटरफ़ेस में ' आयताकार चयन ' समारोह का उपयोग करना, STM के एक क्षेत्र पर एक रॉय आकर्षित कि प्रतिदीप्ति (एफ0) के सबसे समान और कम तीव्र क्षेत्र प्रदर्शित करता है ।
  21. चयनित ROI के भीतर तीव्रता का एक अर्थ मान (F0) प्राप्त करने के लिए 3.11-3.12 में उठाए गए चरणों को दोहराएँ और फिर ' संपादन-चयन-ImageJ टूलबार से ' सभी का चयन करें पर क्लिक करके पूरे STM का चयन करें.
  22. वाम क्लिक करें ' प्रक्रिया ' ImageJ टूलबार पर और ' मठ ' के लिए स्क्रॉल; वाम क्लिक करें पता चला विकल्पों में से ' डिवाइड ' । क्रमिक पॉपअप बॉक्स में, चरण ३.२१ से प्राप्त माध्य मान (F0) दर्ज करें । पर पूरे STM विभाजन (एफ0) STM काला हो जाएगा; बी & सी पॉप अप बॉक्स पर ' ऑटो ' पर क्लिक करके इसे सही. linescan अब आयाम के लिए तुले है, एफ के रूप में व्यक्त की प्रतिदीप्ति की तीव्रता केसाथ/
  23. STM वर्तमान में x-अक्ष पर TIFF स्टैक में फ़्रेंस की संख्या और y-अक्ष पर कक्ष की लंबाई का प्रतिनिधित्व करने वाले पिक्सेल की संख्या प्रदर्शित करेगा । आदेश में सीए2 + संकेतों से लौकिक और स्थानिक जानकारी यों तो, अंतरिक्ष और समय के लिए STM जांचना । बाएं क्लिक करें ' छवि ' में ImageJ टूलबार और बाएं क्लिक करें ' गुण ' । एक पॉपअप बॉक्स दिखाई देगा । इस विंडो के भीतर, STM को पूरी तरह जांचने के लिए उचित मान दर्ज करें ।
  24. ' पिक्सेल चौड़ाई ' के लिए, सेकंड में किसी एकल फ़्रेम को कैप्चर करने में लगने वाले समय की लंबाई दर्ज करें. उदाहरण के लिए, 5 एफपीएस में, ०.२ के एक मूल्य दर्ज करें, ५० एफपीएस के लिए ०.०२ के एक मूल्य दर्ज करें, ३३ एफपीएस के लिए ०.०३३ आदि के एक मूल्य दर्ज करें ' पिक्सेल ऊँचाई ' के लिए, प्रत्येक पिक्सेल का प्रतिनिधित्व करने वाले कितने माइक्रोन दर्ज करें (प्राप्ति के लिए उपयोग किए गए उद्देश्य और कैमरे पर निर्भर करेगा). ' ओके ' पर क्लिक करने से पहले ' Voxel गहराई ' 1 पर छोड़ दी जाती है । कोई अंय मापदंडों खिड़की के भीतर समायोजित करने की आवश्यकता है ।
    नोट: ' ओके ' क्लिक करने के बाद, STM पूरी तरह से आयाम, अंतरिक्ष और समय के लिए तुले होंगे । STM पर आयाम f/f 0 के रूप में व्यक्त किया जाएगा, x-अक्ष पर समय सेकंड और अंतरिक्ष में y-अक्ष पर व्यक्त किया जाएगा माइक्रोन में व्यक्त किया जाएगा (चित्रा 2 बी) । Ca2 + STM पर इवेंट अब मापा जा करने के लिए तैयार हैं, नपे STM भी एक TIFF छवि के रूप में एक बाद की तारीख में विश्लेषण करने के लिए सहेजा जा सकता है ।
  25. ImageJ रंग कोडित लुकअप तालिका (लुट्यो) रंग कोड STM करने के लिए उपयोग किया जा सकता है में निर्मित की एक संख्या है । लागू एक LUT में छोड़ दिया ' पथ छवि पर ImageJ टूलबार पर क्लिक करके बनाया-लुकअप टेबल ' और एक LUT का चयन करने के लिए लागू होते हैं । कस्टम मेड लुट्यो भी STM के लिए ' पथ फ़ाइल आयात-LUT ' पर ImageJ टूलबार पर क्लिक करके छोड़ दिया और फिर आयात करने के लिए LUT का चयन कर सकते है आयात किया जा सकता है । उदाहरण के लिए चित्र 2c में दिखाया STM कस्टम LUT ' QUBPallete ' (क्वींस विश्वविद्यालय बेलफास्ट, ब्रिटेन) पड़ा है यह करने के लिए लागू, गर्म रंग कोड के लिए (लाल, नारंगी) तीव्र ca के क्षेत्रों के रूप में2 + प्रतिदीप्ति और ठंडा रंग (काला, नीला) कम ca के क्षेत्रों के रूप में2 + प्रतिदीप्ति ।
  26. विभिन्न रंगों द्वारा प्रतिनिधित्व आयाम की सीमा को इंगित करने के लिए एक आयाम अंशांकन पट्टी डालने के लिए, बाएँ ImageJ टूलबार से ' विश्लेषण ' पर क्लिक करें, ' उपकरण ' के लिए स्क्रॉल, और पता चला मेनू से ' अंशांकन पट्टी ' चुनें. विकल्प आकार, ज़ूम, रेंज और अंशांकन पट्टी के लिए STM पर स्थिति के लिए दिए गए हैं; वांछित के रूप में इन सेटिंग्स को समायोजित करें और ' ठीक ' क्लिक । अंशांकन पट्टी सम्मिलित किया जाता है, जब ImageJ एक नया STM बनाता है, तो मूल संस्करण अंशांकन पट्टी के बिना बरकरार और अलग छोड़ रहा है कि ध्यान दें ।
    नोट: यदि अंशांकन पट्टी को सम्मिलित करते समय ' ओवरले ' बॉक्स टिक जाता है, तो एक नया STM जेनरेट नहीं किया जाएगा.
  27. व्यक्तिगत Ca2 + घटनाओं का विश्लेषण शुरू करने के लिए, ImageJ अंतरफलक पर ' सीधी रेखा ' चयनकर्ता पर क्लिक करें छोड़ दिया है । शुरू में STM पर क्लिक करके छोड़ दिया, एक Ca के केंद्र के माध्यम से एक सीधी क्षैतिज रेखा आकर्षित2 + x-अक्ष (समय के खिलाफ) घटना के समानांतर । एक दूसरी बार (चित्रा 2d) क्लिक करके रेखा को पूरा छोड़ दिया है ।
  28. क्लिक करें ' विश्लेषण ' पर ImageJ टूलबार और बाएं क्लिक करें ' भूखंड प्रोफाइल ' पर । Ca2 + ईवेंट (आरेख 2E) के प्लॉट प्रोफ़ाइल के साथ एक नया बॉक्स दिखाई देगा ।
    नोट: इस बॉक्स के भीतर ' सूची ' विकल्प उत्पंन भूखंड के XY मूल्यों की एक सूची है, जो एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम में प्रतिलिपि बनाया जा सकता है अगर इतनी वांछित निशान पैदा करेगा ।
  29. भूखंड प्रोफ़ाइल में प्रतिनिधित्व Ca2 + घटना के आयाम को मापने के लिए, ImageJ अंतरफलक पर ' सीधी रेखा ' चयनकर्ता पर क्लिक करें छोड़ दिया है । फिर, प्लॉट प्रोफ़ाइल की आधार रेखा से एक अनुलंब रेखा को Ca2 + ईवेंट के शिखर पर आरेखित करें; लाइन की लंबाई (ImageJ अंतरफलक पर दिखाया गया है) ΔF/एफ0 (चित्रा 2E) के रूप में व्यक्त की घटना के आयाम का प्रतिनिधित्व करेंगे ।
  30. अधिग्रहीत आयाम मान का उपयोग करना, Ca2 + घटना की अवधि ५०% अधिकतम आयाम (पूर्ण अवधि आधा अधिकतम आयाम, FDHM) या घटना की पूरी अवधि के बिंदु पर घटना की चौड़ाई भर में एक सीधी रेखा ड्राइंग द्वारा मापा जा सकता है अगर वांछित (चित्रा 2E) मापा जा सकता है ।
    नोट: प्रयोगकर्ता को इन रिकॉर्डिंग में मान्य Ca2 + ईवेंट्स को थ्रेशोल्ड करने के लिए विशिष्ट मापदंड डिज़ाइन करने की आवश्यकता होगी. हमारे प्रयोगों में, Ca2 + घटनाओं विश्लेषण के लिए मान्य किया जा रहा है के रूप में नामित किया गया था, तो उसके आयाम रिकॉर्डिंग के नियंत्रण खंड में अधिकतम आयाम घटना के 15% > था. हालांकि, इन थ्रेसहोल्ड अध्ययन के तहत विशिष्ट ऊतकों और कोशिकाओं पर निर्भर करेगा और केवल मनमाने ढंग से दिशानिर्देश है कि ऊतक और कोशिका के हर प्रकार के लिए विशिष्ट अनुकूलन की आवश्यकता होती है ।
  31. स्ट्रोक या downstroke Ca2 + घटना भूखंड प्रोफ़ाइल के साथ एक लाइन ड्राइंग द्वारा, वृद्धि या गिरावट की दर तदनुसार गणना की जा सकती है । रेखा के आरेखित होने के बाद, माउस कर्सर को उस बिंदु पर ले जाया जा सकता है जहां रेखा शुरू होती है और कहां समाप्त होती है । जब इन बिंदुओं पर कर्सर स्थिर है, x, y इस स्थान के लिए निर्देशांक ImageJ इंटरफ़ेस के निचले बाईं ओर में प्रदर्शित किया जाएगा । इस प्रकार, एक्स प्राप्त करके, जहां लाइन शुरू होता है के लिए y मान (x1, y1) और समाप्त होता है (x2, y2), वृद्धि या गिरावट (ΔF/s) की दर रेखा की ढलान के रूप में गणना की जा सकती, y2 -y1 /x2 -x1 (चित्रा 2F ).
  32. आदेश में प्रचार या एक Ca2 + घटना के स्थानिक प्रसार की गणना करने के लिए, ImageJ अंतरफलक पर ' सीधी रेखा ' चयनकर्ता पर क्लिक करें छोड़ दिया है । फिर, y-अक्ष के साथ Ca2 + ईवेंट की लंबाई के साथ एक सीधी अनुलंब रेखा आरेखित करें । लाइन की लंबाई (ImageJ अंतरफलक पर दिखाया गया है) माइक्रोन (चित्रा 2g) के रूप में व्यक्त घटना के स्थानिक प्रसार का प्रतिनिधित्व करेंगे ।
  33. इस घटना के प्रचार के मोर्चे के साथ एक पंक्ति ड्राइंग और लाइन की ढलान की गणना द्वारा एक प्रचार Ca2 + घटना के वेग का निर्धारण । यह मैन्युअल रूप से चरण ३.३२ में वर्णित समान तरीके से किया जा सकता है, जहाँ लाइन शुरू होता है के लिए x, y मान निर्धारित करके (x1, y1) और समाप्त होता है (x2, y2); माउस कर्सर STM पर स्थित है, जब ये मान ImageJ इंटरफ़ेस के निचले बाईं ओर में प्रदर्शित किया जाएगा ।
  34. के संग्रह पर Ca के लिए इच्छित पैरामीटर2 + ईवेंट ठहराव, पूल ये मान औसत प्रति कक्ष के आधार पर प्रत्येक पैरामीटर के लिए माध्य मान जनरेट करने के लिए; वैकल्पिक रूप से, किसी वितरण हिस्टोग्राम में सभी अपुष्ट मानों को उनकी श्रेणी (आरेख 2H) दिखाने के लिए रखें ।

4. आईसीसी में CTCs का ठहराव-मेरा प्रयोग कण आधारित विश्लेषण

  1. PTCLs के साथ Volumetry में फिल्मों का विश्लेषण करने से पहले, फिल्म के स्थानिक और लौकिक अंशांकन फ़ाइल नाम में डाला जा करने की आवश्यकता होगी । सभी फ़ाइलों को संपादित करने के लिए Volumetry में विश्लेषण किया जा करने के लिए शीर्षक के भीतर सेकंड की संख्या है कि प्रत्येक फ्रेम के बराबर और भी माइक्रोन की संख्या है कि प्रत्येक पिक्सेल एक एकल डैश द्वारा अलग बराबरी, वर्ग कोष्ठक में रह गए मूल्यों के साथ । उदाहरण के लिए, एक 60x उद्देश्य (५१२ x ५१२) के साथ ३३ FPS पर अधिग्रहीत फिल्म [0.22-0.033] इसके फ़ाइल नाम में डाला होना चाहिए ।
  2. Volumetry खोलें और चलचित्र फ़ाइलों वाले फ़ोल्डरों को खोलने के लिए सही माउस क्लिक का उपयोग करें । मूवी फ़ाइल पर वाम क्लिक करने के लिए यह Volumetry में खोलने के लिए विश्लेषण किया जा (आंकड़ा 3ए, uncompressed TIFF प्रारूप में होना चाहिए) ।
  3. सही पूरे FOV से सीए2 + संकेतों की गणना करने के लिए, फिल्म पहली बार भेदभाव और पृष्ठभूमि हस्तक्षेप (कैमरा शोर, ऑटो प्रतिदीप्ति आदि) को दूर करने के लिए और शोर अनुपात करने के लिए संकेत को बढ़ाने के लिए चिकनी से गुजरना होगा । फिल्म खिड़की में, ठीक क्लिक करें एक मेनू लाने के लिए और सही क्लिकों का उपयोग ' STK फिल्टर-अंतर ', सही फिर से क्लिक करने के लिए एक मान अंतर करने के लिए इनपुट, प्रेस दर्ज करें, और क्लिक करने के लिए (३३ FPS पर अधिग्रहीत फिल्मों के लिए लागू करने के लिए छोड़ दिया 2 (∆ टी = ± 66-70 msec) का मूल्य अच्छी तरह से काम करता है छवि कैप्चर बढ़ाता है की दर के रूप में मान बढ़ जाती है) ।
    नोट: इस संदर्भ में भिंनता रिकॉर्डिंग (पिक्सेल) के क्षेत्रों की तीव्रता को कम करेगा जो निर्दिष्ट फ़्रेंस की संख्या पर कोई डायनेमिक गतिविधि नहीं दिखाती । इस प्रकार, यदि ' 2 ' का मान डाला जाता है, तो रिकॉर्डिंग के प्रत्येक फ्रेम में प्रत्येक पिक्सेल का विश्लेषण किया जाता है और यदि उस फ़्रेम के भीतर पिक्सेल प्रतिदीप्ति 1 फ़्रेम से पहले और 1 फ़्रेम के बाद कोई डायनेमिक परिवर्तन नहीं होता है, तो उन पिक्सेल के भीतर की तीव्रता रिकॉर्डिंग से घटाई जाएगी । इस प्रकार, गैर गतिशील पृष्ठभूमि शोर हटा दिया जाता है और शोर करने के लिए संकेत बढ़ जाती है.
  4. एक गाऊसी फ़िल्टर लागू करके विभेदित फिल्म चिकना । फिल्म विंडो में दायां क्लिक करें एक मेनू लाने के लिए और सही क्लिकों का उपयोग ' STK फ़िल्टर-गॉस ' KRNL, ठीक क्लिक करें फिर से एक मूल्य डालने के लिए (हमेशा एक विषम संख्या का उपयोग करें, ३३ FPS पर प्राप्त फिल्मों के लिए, 5 के एक मूल्य अच्छी तरह से काम करता है, १.५ x १.५ µm , मानक विचलन १.०) इनपुट एक मान, प्रेस दर्ज करें, और बाएं क्लिक करें (चित्र बी) लागू करने के लिए ।
  5. पहली फिल्म है कि एक quiescent अवधि (20-40 तख्ते) एक सीटीसी की घटना के बाद और भी 20-40 फ्रेम के बाद सीटीसी शामिल की अवधि का चयन करके PTCLs बनाने के लिए शुरू करो । ऐसा करने के लिए, बाएं से दाएं स्क्रॉल करने के लिए MMB का उपयोग कर चलचित्र द्वारा पीली पट्टी पर स्क्रॉल करें ।
  6. चयन के साथ बनाया, फिल्म खिड़की में सही क्लिकों का उपयोग करने के लिए ' STK ऑप्स-रैंप डी एस PTCLinfo ' और क्लिक करें छोड़ दिया लागू होते हैं । यह फ़ंक्शन एक PTCL विश्लेषण रूटिन चलाता है जो उत्तरोत्तर अधिकतम तीव्रता से थ्रेशोल्ड को न्यूनतम तीव्रता तक रैम्प करता है. इस साजिश खिड़की में रेखांकन भी शोर की साजिश के रूप में प्रदर्शित किया जाएगा और निशान विंडो में तीन रंग का निशान के रूप में, हरी ट्रेस PTCLs की संख्या दिखा रहा है, लाल ट्रेस औसत PTCL आकार दिखा रहा है, और नीले रंग का पता लगाने निरपेक्ष तीव्रता दिखा थ्रेशोल्ड.
    नोट: प्रत्येक थ्रेशोल्ड पर PTCLs का संख्या और औसत आकार स्वचालित रूप से परिकलित किया जाता है और फिर अर्द्ध-पुस्तिका थ्रेशोल्ड उस तीव्रता का उपयोग करके लागू किया जाता है जिस पर PTCLs का औसत आकार ड्रॉप होना शुरू होता है, जो कि लाल ट्रेस के मोड़ बिंदु पर होता है ट्रेस विंडो (चित्रा 3d, यानी स्थानिक सीमित शोर की बड़ी संख्या के कारण PTCLs के औसत आकार को कम करने PTCLs).
  7. प्लॉट विंडो के भीतर, हिस्टोग्राम को PTCL शोर के दिखाए गए प्लॉट को संतुलित करने के लिए ' H ' दबाएँ. का उपयोग करके रंग योजनाओं के माध्यम से चक्र ' [' जब तक पृष्ठभूमि शीर्ष पर रंग का निशान के साथ सफेद रंग का है ।
  8. प्रेस ' एफ ' को मापने के उपकरण लाने के लिए और चौराहे पर भूखंड पर क्लिक करें छोड़ दिया, जहां रंग का भूखंडों दाहिने हाथ की ओर शिफ्ट । यह नीचे ट्रैस विंडो की स्क्रॉल पट्टी में किसी एकल अनुलंब रेखा को चिह्नित करेगा ।
  9. ट्रेस विंडो में, MMB बाएं से दाएं स्क्रॉल करने के लिए मोड़ बिंदु लाल ट्रेस के चिह्नित सफेद अनुलंब रेखा चरण ४.१० में बनाई गई और सुनिश्चित करें कि नीले ट्रेस चयनित है सही से उस पर क्लिक करके, ' yAVG ' जो टी में प्रदर्शित किया जाएगा बंद पढ़ें वह निचले निशान खिड़की के बाएं हाथ की ओर । MMB को एक बार ट्रैस विंडो के अंदर दबाकर चयन अचयनित करें ।
  10. फिल्म खिड़की के भीतर, एक रंग पहिया लाने के लिए ' सी ' प्रेस, तो दहलीज समायोजित करने के लिए ' सोंच ' दबाएँ. वैध PTCLs अब फिल्म खिड़की (चित्रा 3सी) में लाल के रूप में दिखाया जाएगा और उन है कि संतृप्त सफेद हो जाएगा । बाएँ माउस बटन के साथ स्क्रॉल करके सफेद क्षेत्रों को निकालें ।
  11. रंग व्हील में पीले संख्यात्मक मान को समायोजित करने के लिए MMB के साथ ऊपर या नीचे स्क्रॉल करें, चरण ४.११ से लिया गया yAVG मान के लिए इस मान को समायोजित करें । यह निर्धारित सीमा बिंदु पर एक सक्रिय Ca2 + क्षणिक PTCL के रूप में लाल रंग में सब कुछ प्रदान करेगा । यह एक निर्देशांक आधारित कण फ़ाइल के रूप में सहेजने के लिए, ' STK 3d-सहेजें PTCLS 0 ' तक पहुँचने के लिए सही क्लिक का उपयोग करें और तब फ़ाइल सहेजने के लिए बाएँ क्लिक करें ।
  12. Volumetry से बाहर निकलें और पुनः खोलें । चरण ४.१३ में बनाई गई PTCL फ़ाइल (. gpf फ़ाइल) को खोलें । इस फ़ाइल प्रकार में, सभी सक्रिय Ca2 + यात्रियों एक समान नीला PTCL (चित्र 3E) के रूप में सहेजे जाते हैं । के रूप में प्रत्येक PTCL अपनी आईडी, क्षेत्र और परिधि निर्देशांक, राज्य झंडे के साथ एक व्यक्तिगत इकाई है (नीचे देखें) और परिणाम arrays, spatio के विश्लेषण-PTCLs के लौकिक विशेषताओं, या PTCLs के बीच सुव्यवस्थित है ।
  13. PTCLs विश्लेषण आरंभ करने के लिए, किसी भी शेष PTCL शोर (. gpf फ़ाइल जनरेट किया गया है जब छोटे अमान्य PTCLs बनाया है) ' PTCL STKOPS-झंडा PTCLs > मिन = 70 ' और लागू करने के लिए छोड़ दिया क्लिक करने के लिए फिल्म विंडो में सही क्लिक का उपयोग करके हटा दें । यह क्रिया PTCLs से अधिक 6 µm2 (~ व्यास > 2 µm) और Volumetry उन्हें ' फ्लैग 1 ' चयन करने के लिए आवंटित करेगा फ्लैग करेगा । यह पूर्ण होने पर, PTCLs जो इस थ्रेशोल्ड (ध्वज 1) के ऊपर हैं, चलचित्र विंडो में हल्का जामुनी रंग के रूप में दिखाई देगा, जबकि दहलीज के नीचे कोई भी PTCLs उनके आधार नीला रंग (फिगर 3F) रहेगा ।
  14. ' PTCL STKops-StatMap झंडा = ' का उपयोग करने के लिए फिल्म विंडो में सही क्लिकों का उपयोग करके PTCL गतिविधि के हीट मैप अभ्यावेदन बनाएँ । सही इस अंतिम पथ, एक झंडा काम पर क्लिक करके विश्लेषण करने के लिए दर्ज किया जा सकता है । इस प्रकार, यदि FLAG1 को सौंपा PTCLs यों तो, बस ' 1 ' दर्ज करें, enter दबाएं और फिर क्लिक करें छोड़ दिया लागू करने के लिए इच्छुक हैं । यह एक गर्मी रिकॉर्डिंग की पूरी लंबाई के लिए कुल PTCLs दिखा नक्शा उत्पंन करेगा, अलग (%) रिकॉर्डिंग में घटना का प्रतिनिधित्व रंग के साथ (चित्रा 3 जी, गर्म रंग उस स्थान में वृद्धि की घटना का संकेत) ।
  15. ' STM लोड सहेजें-सहेजें STM के रूप में. tif ' का उपयोग करें, और उसके बाद एक TIFF के रूप में सहेजने के लिए क्लिक छोड़ दिया करने के लिए सही उन पर क्लिक करके हीट मैप्स सहेजें ।
  16. चलचित्र विंडो में सही क्लिक का उपयोग करके PTCL गतिविधि यों तो ' PTCL नाप-PTCLStats STK = ', सही इस अंतिम पथ पर क्लिक करके, एक झंडा काम का विश्लेषण करने के लिए प्रवेश किया जा सकता है । इस प्रकार, यदि FLAG1 को सौंपा PTCLs यों तो, बस ' 1 ' दर्ज करें, enter दबाएं और फिर क्लिक करें छोड़ दिया लागू करने के लिए इच्छुक हैं । यह ट्रेस विंडो में ट्रैस की एक श्रृंखला जनरेट करेगा ।
  17. Volumetry डिफ़ॉल्ट रूप से मिलाना चरण ४.१७ में एक दूसरे के शीर्ष पर जनरेट किया गया PTCL ट्रैस करेगा । उन्हें अलग ट्रेस विंडो में सही क्लिकों का उपयोग करने के लिए ' संरेखित करें-अलग ट्रेस ' और वाम क्लिक करने के लिए लागू करने के लिए. यह चार अलग PTCL अंश है कि Ca2 + PTCL गतिविधि PTCL क्षेत्र (हरे), PTCL गिनती (लाल), PTCL आकार (सियान), और PTCL आकार मानक विचलन (नीला) समय के खिलाफ साजिश रची दिखा रहा है पता चलता है (चित्रा 3H) ।
  18. इन ट्रैस एक पाठ फ़ाइल है कि आगे विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम में आयात किया जा सकता है के रूप में सहेजा जा सकता है । अंश को सहेजने के लिए, shift दबाए रखें और ' मिश्रित-डंप ROI के रूप में पाठ ' तक पहुँचने के लिए ट्रेस विंडो में सही क्लिक का उपयोग करें और बाएँ फ़ाइल को सहेजने के लिए क्लिक करें । यह जानकारी तब संग्रहीत और हिस्टोग्राम या अंय उपयुक्त चित्रमय अभ्यावेदन (चित्रा 3H) में सचित्र है ।
  19. आदेश में PTCLs की प्रारंभिक घटना को देखने के लिए (यानी, गोलीबारी साइटों को देखने के लिए), इन प्रारंभिक PTCLs एक अलग झंडा काम दिया जाता है । बेहतर करने के लिए नेटवर्क के भीतर होने वाली गोलीबारी साइटों को अलग, केवल उन PTCLs कि पिछले फ्रेम में किसी भी कणों के साथ ओवरलैप नहीं किया था, लेकिन अगले ७० में कणों के साथ ओवरलैप ms गोलीबारी साइटों माना जाता है ।
  20. इस थ्रेशोल्ड को लागू करने के लिए, चलचित्र विंडो में ' PTCL बिहेवियर-F1 InitSites > F = 3 ' तक पहुँचने के लिए सही क्लिक का उपयोग करें और लागू करने के लिए बाएँ क्लिक करें । यह ' ध्वज 3 ' के रूप में PTCLs की शुरुआत प्रदान करेगा, और PTCLs है कि इस मानदंड को पूरा अब फिल्म में एक चूने के हरे रंग के रूप में दिखाई देगा (चित्र 4a) ।
  21. Volumetry भी एक सीटीसी के दौरान गोलीबारी की अपनी संभाव्यता की साजिश रचने के रूप में एक दी FOV में PTCL फायरिंग साइटों की संख्या का अंदाजा लगाने और साजिश करने की क्षमता affords । इन मापदंडों का विश्लेषण करने के लिए, चरण ४.१६ (चित्रा 4B) में वर्णित के रूप में PTCLs (फ्लैग 3) की शुरुआत का एक हीट मैप बनाएं ।
  22. प्लॉट विंडो में वाम क्लिक करें और फिर ' सी ' एक रंग पहिया लाने के लिए और दहलीज के लिए प्रेस ' d ' दबाएँ. PTCLs की शुरुआत की गर्मी नक्शा तो भूरे और सफेद बारी होगी । बाएं माउस बटन के साथ स्क्रॉल करके सभी सफ़ेद निकालें और PTCLs को हीट मैप में थ्रेशोल्ड करें ताकि केवल मान्य PTCLs सलेटी रंग में कवर हों (MMB के साथ ऊपर और नीचे स्क्रॉल करके थ्रेशोल्ड समायोजित करें).
  23. ' STM PTCLs-Find PTCLs ७० ' का उपयोग करने के लिए प्लॉट विंडो में हीट मैप पर सही क्लिक का प्रयोग करें और बाएँ क्लिक लागू करने के लिए. यह एक अलग रंग कोडित दीक्षा PTCL या PTCL फायरिंग साइट (चित्रा 4c) के रूप में आवंटित किया जा करने के लिए आकार में ७० पिक्सेल2 से अधिक हैं कि नक्शे में सभी ग्रे PTCLs असाइन करेगा.
  24. सही PTCL फायरिंग मानचित्र पर क्लिक करके और ' STM PTCLs-create PTCL rois ' तक पहुँचने और लागू करने के लिए क्लिक करने के लिए छोड़ दिया द्वारा समय के खिलाफ इन गोलीबारी साइटों में से प्रत्येक की गतिविधि साजिश । यह सब अलग रंग PTCL गोलीबारी उन चारों ओर एक रॉय के साथ प्रदर्शित साइटों के साथ फिल्म की खिड़की में एक नई छवि उत्पंन करेगा ।
  25. ' PTCL माप-PTCLpixROIBM > = 1 ' तक पहुँचने के लिए चलचित्र विंडो में सही क्लिक का उपयोग करें और लागू करने के लिए बाएँ क्लिक करें । यह चलचित्र विंडो में सभी ROIs की पहचान करेगा जिसमें कम से एक PTCL है और इन ROIs के भीतर के सभी गतिविधि को ट्रैस विंडो में प्लॉट करेगा । डिफ़ॉल्ट रूप से, इन ट्रैस एक दूसरे पर आरोपित हो जाएगा । उन्हें अलग करने के लिए, ' संरेखित-अलग ट्रेस ' तक पहुँचने के लिए ट्रेस विंडो में सही क्लिक का उपयोग करें और लागू करने के लिए बाएँ क्लिक करें । अंश को सहेजने के लिए, shift दबाए रखें और ' मिश्रित-डंप ROI के रूप में पाठ ' तक पहुँचने के लिए ट्रेस विंडो में सही क्लिक का उपयोग करें और बाएँ फ़ाइल को सहेजने के लिए क्लिक करें ।
  26. प्रत्येक गोलीबारी स्थल की गतिविधि को एक प्रकटन मानचित्र के रूप में भी प्लॉट किया जा सकता है । ऐसा करने के लिए, चलचित्र विंडो में सही क्लिक का उपयोग ' PTCL माप-रॉय Pianola = 10 ' तक पहुंचने के लिए और लागू करने के लिए बाएं क्लिक करें । यह साजिश खिड़की में समय के खिलाफ सभी गोलीबारी स्थलों का एक भूखंड उत्पन्न करेगा । प्रत्येक गोलीबारी साइट एक अलग रंग की इकाई के रूप में प्रदर्शित किया जाएगा, अपने ' लेन में प्रत्येक ' और इन भूखंडों2 सीए के अनुरूप + PTCLs CTCs के दौरान शुरू (चित्रा 4d, ई) सही उन पर क्लिक करने के लिए ' का उपयोग करने से इन पुनरावृत्ति नक्शे सहेजें STM सहेजें लोड-सहेजें STM. tif के रूप में ' और फिर एक झगड़ा के रूप में सहेजने के लिए क्लिक छोड़ दिया ।
  27. एक सीटीसी के दौरान प्रत्येक गोलीबारी स्थल पर गोलीबारी की संभावना का अंदाजा लगाने के लिए, फिल्म विंडो में सही क्लिक का उपयोग करने के लिए ' PTCL बिहेवियर-मार्क है = 1 ' और लागू करने के लिए छोड़ दिया क्लिक करें । यह थ्रेशोल्ड ऊपर PTCLs होते हैं जो चलचित्र में सभी फ़्रेम की पहचान करेगा और ये अनुलंब नीली रेखाओं के रूप में चलचित्र विंडो के निचले भाग में चिह्नित किया जाएगा ।
  28. CTCs एक सीटीसी चक्र के बीच में ~ 1 s अंतराल के साथ FOV के भीतर कई फायरिंग साइटों से अतुल्यकालिक गोलीबारी के तेजी से क्लस्टरिंग के रूप में प्रकट । इस नियमितता और CTCs के बीच कोई सक्रिय PTCLs के लंबे अंतराल के लिए आगे विश्लेषण के लिए एक सीटीसी को परिभाषित किया जाता है ।
  29. चलचित्र विंडो में सही क्लिक का उपयोग करने के लिए ' PTCL व्यवहार-ब्लॉक अंतराल < = ' है, और एक नंबर दर्ज करने के लिए अंतिम बिंदु पर एक सही क्लिक का उपयोग करें । यह आदेश सक्रिय PTCL फ़्रेम को चरण ४.२८ में ब्लॉक में पहचाना गया समूहीकृत करेगा और ब्लॉक्स पृथक सक्रिय PTCLs फ़्रेम की संख्या पर आधारित हैं । उदाहरण के लिए ३३ एफपीएस की रिकॉर्डिंग के लिए, 10 के एक मूल्य अच्छी तरह से काम करता है । यदि सक्रिय PTCLS से कम 10 फ्रेम के अलावा कर रहे है (३३० ms) वे विश्लेषण के लिए एक ब्लॉक में समूहीकृत कर रहे है (ब्लॉक तो फिल्म खिड़की के नीचे खड़ी नीली लाइनों पर गुलाबी आयतों के रूप में दिखाए जाते हैं, प्रत्येक गुलाबी आयत अब एक सीटीसी का संकेत के साथ) ।
  30. ' PTCL नाप-PTCL घटना की जांच ' का उपयोग करने के लिए फिल्म की खिड़की में सही क्लिकों का प्रयोग करें । यह एक पाठ फ़ाइल है कि एक स्प्रेडशीट प्रोग्राम में आयात किया जा सकता है उत्पंन करेगा । इस पाठ फ़ाइल दीक्षा साइटों है कि चरण 4.16-4.23 और CTCs के लिए उनके योगदान से परिभाषित किया गया था की प्रकृति पर एक विशाल मात्रा में डेटा प्रदान करेगा ।
    नोट: पाठ फ़ाइल (' डोमेन के रूप में संदर्भित) दीक्षा साइटों की संख्या दिखाएगा, पिक्सल और माइक्रोन2में साइट के आकार, प्रत्येक दीक्षा साइट की संभावना या तो एक बार या कई बार एक सीटीसी के दौरान गोलीबारी (एक%), औसत अवधि और आकार के रूप में दिया PTCLs कि दीक्षा स्थल पर होने वाली, सीटीसी चक्र की संख्या (के रूप में ४.२३ कदम में परिभाषित) और गोलीबारी साइटों है कि प्रत्येक सीटीसी चक्र के दौरान गोली का प्रतिशत । यह जानकारी संग्रहीत और हिस्टोग्राम या अंय उपयुक्त चित्रमय अभ्यावेदन (चित्रा 4F) में सचित्र है ।

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Representative Results

किट का प्रयोग-Cre-GCaMP6F चूहों (चित्रा 1), गतिशील Ca2 + आईसीसी के जठरांत्र संबंधी मार्ग में संकेत व्यवहार सीटू में imaged किया जा सकता है. के साथ फोकल माइक्रोस्कोपी, आईसीसी के विशिष्ट आबादी के उच्च संकल्प छवियों को एक ही ऊतक के भीतर आईसीसी के अंय आबादी से संकेत दूषित बिना अधिग्रहण किया जा सकता है, लेकिन ध्यान के anatomically विशिष्ट विमानों में (चित्रा 2a)३७ , ३९ , ४० , ४१. यह संक्षिप्त (< 100 ms) रिकॉर्ड करने के लिए संभव है, स्थानीयकृत ca2 + इवेंट जो झिल्ली पारगंय Ca2 + संकेतक के साथ संभव नहीं थे । Spatio-Volumetry या ImageJ सॉफ्टवेयर के साथ लौकिक मानचित्रण सभी सीए 2 के STMs उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता+ सीटू में कोशिकाओं के भीतर की घटनाओं । इस दृष्टिकोण का प्रयोग, Ca2 + एक पूरे FOV में घटनाओं visualized किया जा सकता है और (चित्रा 2 बी, सी), बजाय सिर्फ एक रॉय की सीमित गतिविधि रिकॉर्डिंग । इन विधियों को दिए गए FOV के भीतर प्रत्येक कक्ष में विस्तारित किया जा सकता है, सभी कक्षों से प्रतिनिधि डेटा संग्रह सुनिश्चित करना और सापेक्ष आयाम, परिवर्तनीय अवधि, यात्रियों की वृद्धि और गिरावट की दर, आदि के बारे में मात्रात्मक जानकारी प्रदान करना (चित्रा 2E , च). STM विश्लेषण, के रूप में रॉय के खिलाफ तीव्रता भूखंड आधारित है, भी निगरानी और सीए 2 के स्थानिक विशेषताओं को रिकॉर्ड करने की क्षमता प्रदान+ संकेतन, स्थानिक प्रसार और प्रसार वेग के रूप में, जैसा कि चित्रा 2gमें दिखाया गया है । इस जानकारी को Ca के एक पूर्ण दृश्य प्रदान करने के लिए जमा किया जा सकता है2 + अपने पैतृक वातावरण में कोशिकाओं में व्यवहार संकेत (चित्रा 2H).

PTCL विश्लेषण अधिक जटिल Ca2 + संकेतन व्यवहार, जैसे परस्पर सेलुलर नेटवर्क के भीतर होने वाली उन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । इस आवेदन का एक उदाहरण आईसीसी पर प्रदर्शन किया विश्लेषण द्वारा प्रदान की जाती है-मेरा (3 ए आंकड़ा). आमतौर पर इस तरह के जटिल तैयारी में, पृष्ठभूमि शोर और शोर करने के लिए संकेत एक मुद्दा हो सकता है. हालांकि, Volumetry सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए अवकलन और स्मूथिंग फ़िल्टर लागू करने के लिए की फिल्मों पर सीए2 + गतिविधि और फिर शोर दहलीज प्रोटोकॉल लागू करने के लिए शोर बाहर फ़िल्टर करने के लिए (चित्र बी-डी) पृष्ठभूमि शोर जटिल से हटाया जा सकता है गतिशील गतिविधि की रिकॉर्डिंग । जैसे चित्रा 3Eमें दिखाए गए उन के रूप में PTCL विश्लेषण का प्रयोग-जी,2 सीए के बारे में मात्रात्मक जानकारी + संकेत PTCL क्षेत्र, PTCL गिनती और PTCL आकार जो 2 सीए के सक्रियण के स्थानिक पर्वतमाला का संकेत मापने के द्वारा गणना की जा सकती+ एक FOV में संकेत । इन आंकड़ों के रूप में चित्र 3H में दिखाया संकलित किया जा सकता है और सांख्यिकीय विश्लेषण, के रूप में उपयुक्त । चित्रा 4 कैसे PTCL विश्लेषण उप के गहराई ठहराव में की अनुमति देता है दिखाता है-सेलुलर सीए2 + स्थान का परीक्षण और ca2 + फायरिंग साइटों की संभावनाओं फायरिंग द्वारा संकेत । अपने लौकिक विशेषताओं के आधार पर विभिंन झंडे में PTCLs का आवंटन करके, PTCLs की शुरुआत सही रूप में चित्र 4c-E में दिखाए गए के रूप में मैप किया जा सकता है और मुश्किल दीक्षा साइटों की संख्या पर अधिग्रहीत डेटा का खजाना (के रूप में संदर्भित ' डोमेन '), पिक्सेल और µm2में साइट के आकार, प्रत्येक दीक्षा साइट की संभावना या तो एक बार या कई बार प्रत्येक सीटीसी के दौरान गोलीबारी (एक%), औसत अवधि और दीक्षा साइट पर होने वाली PTCLs के आकार के रूप में दिया, सीटीसी चक्र की संख्या (के रूप में ४.२३ चरण में परिभाषित) और फायरिंग साइटों की% है कि प्रत्येक सीटीसी चक्र के दौरान निकाल दिया । इन तकनीकों डेटा खनन और ठहराव के एक उच्च स्तरीय सीटू Ca2 + एक बरकरार सेलुलर नेटवर्क है कि लागत पर लाभ के साथ संभव नहीं है के भीतर होने वाले संकेतों की अनुमति देता है विश्लेषण ।

Figure 1
चित्रा 1: KitGCaMP6f चूहों की पीढ़ी. कैसे Ai95 (RCL-GCaMP6f) के योजनाबद्ध आरेख-डी (GCaMP6f चूहों) किट-/Cre-ERT2-Cre चूहों को उत्पन्न करने के लिए सी-किट+ Cre (किट-GCaMP6f चूहों) के साथ पार कर रहे थे. इन चूहों 6-8 सप्ताह की उंर में tamoxifen के साथ इंजेक्शन के लिए Cre Recombinase और बाद में आईसीसी में विशेष रूप से GCaMP6f अभिव्यक्ति प्रेरित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: stochastic Ca 2 का विश्लेषण+ आईसीसी में संकेत-spatio-लौकिक मानचित्रण (STM) का उपयोग कर DMP । (एक) एक किट की छोटी आंत से कई आईसीसी-DMP की प्रतिनिधि छवि-Cre-GCaMP6F माउस में सीटू । एक ग्रीन रॉय के आकार और रॉय के उंमुखीकरण के आसपास आकर्षित करने के लिए FOV के भीतर एक एकल आईसीसी-DMP Volumetry में एक STM बनाने के लिए इंगित करता है । () STM की2 + गतिविधि आईसीसी में एक पैनल में प्रकाश डाला DMP के बाद यह ठीक से आयाम, अंतरिक्ष और समय के लिए तुले किया गया है । (C) एक ही STM के बाद पैनल B में दिखाया गया है एक लुकअप तालिका (QUBPallete) के साथ रंग कोडित किया गया है. () आईसीसी-DMP Ca की विस्तारित छवि2 + एक रंग कोडित STM पर प्रदर्शित यात्रियों, जहां अपने समय में एक Ca2 + घटना के माध्यम से एक लाइन आकर्षित करने के लिए (x) अक्ष ImageJ में अपनी गतिविधि का एक भूखंड प्रोफ़ाइल बनाने के लिए संकेत । () सीए 2 की साजिश प्रोफ़ाइल+ पैनल डी में प्रकाश डाला घटना, यह दर्शाता है जहां लाइनों को सही आयाम और घटना की अवधि को मापने के लिए तैयार हो दिखाया । () सीए2 + घटना के भूखंड प्रोफ़ाइल पैनल डी में प्रकाश डाला, यह दर्शाता है जहां लाइनों को सही वृद्धि और घटना के पतन की दर की दर को मापने के लिए तैयार हो दिखाया । () आईसीसी-DMP Ca की विस्तारित छवि2 + एक रंग कोडित STM पर प्रदर्शित यात्रियों, यह दर्शाता है जहां एक Ca2 + घटना के माध्यम से एक लाइन आकर्षित करने के लिए अपनी अंतरिक्ष (y) अक्ष में सही अपने स्थानिक प्रसार को मापने के लिए । (ज) आईसीसी से परित डेटा के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम-DMP चित्रण कैसे रेखांकन आयाम, अवधि, और स्थानिक प्रसार मूल्यों को प्रदर्शित करने के लिए ऊपर दिए गए चरणों का पालन से प्राप्त की । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: आईसीसी में CTCs के ठहराव-मेरा प्रयोग कण आधारित विश्लेषण । (एक) एक आईसीसी की प्रतिनिधि छवि-एक किट की छोटी आंत से मेरे नेटवर्क-Cre-GCaMP6F माउस में सीटू । () छवि पैनल में दिखाया एक के बाद यह Δt के एक अंतर फिल्टर = ± 66-70 ms और १.५ x १.५ µm, मानक विचलन १.० के एक गाऊसी फिल्टर आया है रिकॉर्डिंग से ले लिया । () में वीडियो से ली गई छवि थ्रेसहोल्ड के बाद PTCLs के साथ पूरा किया गया था दहलीज लाल रंग में दिखाया गया. () PTCL गिनती के निशान और एक थ्रेसहोल्ड प्रोटोकॉल में PTCL आकार का मतलब है पैनल बी PTCLs में दिखाया फिल्म में शोर को खत्म करने के लिए एक बाढ़ का उपयोग कर बनाया गया कलन विधि है कि आसपास के सभी पिक्सल है कि दहलीज के ऊपर तीव्रता, Ca के रूप में चिह्नित की संरचना को भरने 2 + क्षणिक PTCLs शोर PTCLs से बड़े थे । सीमा जिस पर छोटे आकार शोर PTCLs की बड़ी संख्या में उभरा और PTCLs का मतलब आकार को कम करने के लिए शुरू किया सभी रिकॉर्डिंग के लिए एक आम दहलीज के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । () प्रतिनिधि छवि से समंवय-आधारित Ca2 + PTCL में थ्रेशोल्ड रिकॉर्डिंग से बनाई गई फ़ाइल C. (F) प्रतिनिधि की छवि PTCL फ़ाइल से लिया गया ई के एक स्क्रीनिंग मानदंड के बाद > 6 µm2 (व्यास ~ 2 µm या छोटे) लागू किया गया था; इस सीमा के ऊपर PTCLs को ध्वजांकित किया जाता है (ध्वज 1) हल्के बैंगनी कणों के रूप में और वैध PTCLs माने जाते हैं । (जी) हीट मैप कुल PTCLs दिखा वीडियो के पूरे रिकॉर्डिंग के लिए (1) पैनल एफ में दिखाया गया है, कुल PTCLs summated के साथ प्रतिनिधित्व रंग के साथ रिकॉर्डिंग के दौरान प्रकटन (उष्ण रंग उस स्थान में बढ़ी हुई पुनरावृत्ति का संकेत देते हैं) । () PTCL क्षेत्र के प्रतिनिधि अंश (नीला) और PTCL गणना (लाल) पैनल ए जी में बनाई गई PTCL फाइल से ली गई. कई प्रयोगों से परित किए गए डेटा के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम अंश के नीचे दिखाए जाते हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: आईसीसी में सीए2 + फायरिंग साइटों का विश्लेषण-मेरा उपयोग कण आधारित विश्लेषण. (A) प्रतिनिधि छवि PTCL फ़ाइल से लिया गया चित्रा 3E के बाद ध्वज 1 PTCLS आगे झंडा 3 में परिष्कृत कर रहे हैं, 2 सीए के लिए ध्वज स्थिति+ फायरिंग साइटों । फ्लैग करें 3 PTCLs चूने के हरे रंग के रूप में प्रदर्शित कर रहे है (केवल उन PTCLs है कि पिछले फ्रेम में किसी भी कणों के साथ ओवरलैप नहीं किया था, लेकिन अगले ७० ms में कणों के साथ ओवरलैप साइटों पर विचार किया गया था) । () हीट कुल PTCLs (झंडा 3) दिखा रहा है एक पैनल में दिखाया वीडियो की पूरी रिकॉर्डिंग के लिए नक्शा, कुल PTCLs रिकॉर्डिंग भर में घटना का प्रतिनिधित्व रंग के साथ अभिव्यक्त (गर्म रंग उस स्थान में वृद्धि की घटना का संकेत) । () सीए के प्रतिनिधि मानचित्र2 + फायरिंग साइटों पैनल बी में दिखाया गया है, प्रत्येक अलग फायरिंग साइट के साथ एक अलग पहचान रंग आवंटित. () PTCL क्षेत्र के प्रतिनिधि अंश (नीला) और PTCL गणना (red) चित्रा 3ए में बनाया PTCL फ़ाइल से व्युत्पंन-जी। (ङ) व्यक्तिगत गोलीबारी स्थलों की गतिविधि का एक प्रकटन मानचित्र । FOV के भीतर प्रत्येक गोलीबारी स्थल अपने ' लेन ' में समय के खिलाफ एक रंगीन ब्लॉक के रूप में प्रदर्शित किया जाता है । () कई प्रयोगों से pooled डेटा के प्रतिनिधि हिस्टोग्राम एक FOV में सीए2 + फायरिंग साइट गोलीबारी संभाव्यता/सीटीसी और ca2 + फायरिंग साइटों की संख्या के लिए जमा करने के लिए मान illustrating दिखाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

ca2 + बरकरार ऊतकों के भीतर या कोशिकाओं के नेटवर्क के भीतर कोशिकाओं के विशिष्ट प्रकार के इमेजिंग अक्सर सीए2 + यात्रियों के जटिल पैटर्न से पता चलता है । इस गतिविधि के लिए सावधान और गहराई से विश्लेषण की आवश्यकता है और ठहराव अंतर्निहित घटनाओं और संभव के रूप में इन घटनाओं के कैनेटीक्स के बारे में अधिक जानकारी के रूप में कब्जा करने के लिए । STM और PTCL विश्लेषण इस प्रकार की रिकॉर्डिंग से झुकेंगे मात्रात्मक डेटा की मात्रा को अधिकतम करने का अवसर प्रदान करते हैं ।

संकीर्ण धुरी, आईसीसी-DMP के आकार आकृति विज्ञान उंहें अच्छी तरह से ऊपर उल्लिखित STMs से व्युत्पंन STM विश्लेषण के लिए उपयुक्त बनाते हैं । हालांकि, यह विश्लेषण अच्छी तरह से आईसीसी के लिए अनुकूल नहीं है-मेरे कि तारामय के आकार का है और एक नेटवर्क में जुड़ा (3 ए आंकड़ा) । इसके अलावा, Ca2 + आईसीसी में संकेत पैटर्न-मेरे और अधिक जटिल हैं, आईसीसी में मूल के कई साइटों से CTCs प्रचार के रूप में प्रकट-मेरे नेटवर्क । इस प्रकार, आदेश में पूरे आईसीसी में होने वाली गतिविधि को यों तो-मेरे नेटवर्क के भीतर एक FOV, कण (PTCL) विश्लेषण कस्टम मेड सॉफ्टवेयर का उपयोग कर लागू किया गया था (Volumetry, संस्करण G8d, GWH, मैक ओएस पर प्रचलित, संपर्क अनुदान Hennig grant.hennig@med.uvm.edu Volumetry पहुंच और उपयोग के लिए पूछताछ के बारे में) ।

STM विश्लेषण सभी सीए की अनुमति देता है2 + एकल कोशिकाओं के भीतर घटनाओं और एक FOV में कोशिकाओं के सभी के भीतर स्थानिक और लौकिक मापदंडों की एक सीमा भर में गंभीर विश्लेषण किया जाना है । प्रोटोकॉल वर्णन वर्णित कैसे इन तकनीकों आईसीसी के लिए लागू किया जा सकता है-माउस छोटी आंत की DMP । पूरी तरह से ca2 + आईसीसी में संकेतन-DMP, चित्र2-जीमें दिखाया गया है के रूप में, ca3 + संकेत पैटर्न३७विस्तार में विशेषता किया गया है । इन विश्लेषणों रिकॉर्डिंग करने के लिए लागू किया गया है, जहां आईसीसी-DMP हस्तक्षेप से गुजरना करने के लिए पतले ब्लॉक या उत्तेजक के प्रभाव को बढ़ाता है2 + रिलीज/सीए2 + आमद/neurotransmission रास्ते३७,३९ , ४० , ४१. इन तकनीकों को आसानी से अंय बरकरार ऊतक तैयार करने के लिए लागू किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, STM विश्लेषण के रूप में यहां वर्णित नए यंत्रवत intracellular की पीढ़ी में शामिल रास्ते की पहचान के लिए उपयोग किया गया है2 + लहरें५७सीटू में मूत्रमार्ग चिकनी मांसपेशी में दर्ज की गई ।

Volumetry में STMs की तैयारी कुछ सावधानी की आवश्यकता है, Volumetry में समारोह के रूप में है कि तैयार रॉय से STM बनाता है (चित्रा 2a) तीव्रता का एक औसत मूल्य है । इस प्रकार, ca के आयाम2 + संकेतों संभवतः पतला किया जा सकता है अगर रॉय व्यापक या अधिक से अधिक है खींचा सीए2 + घटना या ब्याज की सेल । इस प्रकार, उपयोगकर्ताओं को ROIs कि के रूप में कसकर Ca2 + संकेतों या विशेष सेल है कि वे विश्लेषण कर रहे है ताकि इस मुद्दे को कम करने के लिए संभव के रूप में फिटिंग कर रहे है आकर्षित करने के लिए सावधान रहना चाहिए । इसी प्रकार, ImageJ में एकल पिक्सेल linescans का उपयोग करके STMS बनाने का अर्थ है कि ca2 + ईवेंट्स की सटीक मैपिंग आरेखित लाइन के ca2 + सिग्नल की निकटता के अधीन है. इस तरह की चिंताओं को कम कर रहे है छोटे धुरी के आकार की कोशिकाओं के रूप में आईसीसी-DMP, लेकिन एक अधिक तारामय या गोल आकृति विज्ञान के साथ अंय प्रकार के सेल इस प्रकार के विश्लेषण के लिए अनुपयुक्त सभी सीए2 + संकेतों को सही नक्शा कर सकते हैं । जब विश्लेषण के लिए STMs की तैयारी, चाहे वे Volumetry में या ImageJ linescans के साथ किए गए थे, वहां कुछ क्षेत्रों में समस्या निवारण प्रयोजनों के लिए प्रकाश डाला जा करने के लिए कर रहे हैं । यह करने के लिए छवि गुणवत्ता परिवर्तित करने के लिए महत्वपूर्ण है ३२-बिट STMs पर कोई अंशांकन करने से पहले करने के लिए ऐसा करने के लिए विफलता, या ऐसा करने के बाद f/f0 के लिए जांच कर सकते है असंगत माप के लिए प्रयोग में ले । हमेशा STM की छवि गुणवत्ता की जांच करें, जो STM खुद की सफेद सीमा के शीर्ष क्षेत्र में कहा जाता है जब ImageJ के साथ खोला । विसंगति का एक और संभावित क्षेत्र F0 मान का चयन कर रहा है जब आयाम के लिए जांचना । यह महत्वपूर्ण है कि एफ0के लिए इस क्षेत्र का चयन करने के लिए, कि यह सेल है कि वर्दी और ध्यान में है के एक क्षेत्र को शामिल किया गया । इस कारण से, कक्ष के क्षेत्रों में एक अस्थिर बेसल प्रतिदीप्ति है या कि आंदोलन या अंय कलाकृतियों के कारण परिवर्तन आदर्श और कठोर गति स्थिरीकरण प्रोटोकॉल इन मामलों में नियोजित किया जाना चाहिए नहीं कर रहे हैं ।

छोटी आंत में इस तरह के आईसीसी के रूप में जुड़े सेलुलर नेटवर्क, से युक्त सीटू या कल्चरल तैयारियों में भीतर, PTCL विश्लेषण जटिल, उपसेलुलर Ca2 + नेटवर्क में होने वाली घटनाओं यों तो एक सुव्यवस्थित तकनीक प्रदान करता है. इसके अलावा, यह भी अनुमति देता है सभी Ca2 + एक दिया FOV के भीतर नेटवर्क में घटनाओं का विश्लेषण किया, बल्कि मनमाना ROIs, जो केवल आवृत्ति और रॉय के भीतर तीव्रता के बारे में जानकारी उपलब्ध कराने का उपयोग कर । यहां वर्णित PTCL विश्लेषण का एक लाभ यह है कि विभेदक और गाऊसी स्मूथिंग फिल्टर रिकॉर्डिंग करने के लिए, शोर की एक बड़ी राशि फिल्मों है कि ब्याज की नहीं या गैर के कारण कोशिकाओं से दूषित प्रकाश को नियंत्रित कर सकते हैं से हटाया जा सकता है-गतिशील चमकीले धब्बे या समावेशन । यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि रिकॉर्डिंग के लिए लागू विभेद की मात्रा काफी हद तक प्रयोगकर्ता द्वारा इस्तेमाल की गई अधिग्रहण दर पर निर्भर करेगी । प्रोटोकॉल में वर्णित फिल्मों के रूप में अंतर फिल्म रिकॉर्डिंग से उच्च आवृत्ति शोर को दूर करने के लिए एक फिल्टर लागू करने का एक साधन प्रदान करता है. ' 2 ' जब 33FPS पर प्राप्त करने के एक भेदभाव मूल्य लागू अच्छी तरह से काम करता है पृष्ठभूमि शोर को दूर करते हुए शोर करने के लिए अच्छा संकेत बनाए रखने (यदि मूल्य बहुत कम है, शोर उठाया जाएगा लेकिन शोर करने के लिए संकेत अगर मूल्य बहुत अधिक है समझौता किया जाएगा) । भेदभाव मूल्य लागू तेजी से अधिग्रहण की दर के साथ वृद्धि की जानी चाहिए, उदाहरण के लिए १०० FPS पर, ' 7 ' के एक भेदभाव मूल्य लगभग एक 33FPS रिकॉर्डिंग के लिए ' 2 ' के एक मूल्य के रूप में शोर अनुपात के लिए एक ही संकेत देता है । experimenters अपनी तैयारी और रिकॉर्डिंग की स्थिति के लिए तदनुसार इन सेटिंग्स को ऑप्टिमाइज़ करने की आवश्यकता होगी ।

चित्रा 3d में वर्णित थ्रेशोल्ड प्रोटोकॉल विभिन्न अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ विभिन्न प्रणालियों पर किए गए विभिन्न रिकॉर्डिंग पर लागू करने के लिए एक सुसंगत थ्रेसहोल्ड प्रक्रिया की अनुमति देता है. इस लचीलेपन की अनुमति देता है एकाधिक जांचकर्ताओं से डेटा एक ही datasets में उनकी रिकॉर्डिंग संकलित करने के लिए विभिंन सिस्टमों पर कार्य कर रहा है । Volumetry में झंडा प्रणाली का उपयोग करके, PTCL विश्लेषण दृश्य और एक नेटवर्क के भीतर व्यक्तिगत Ca2 + गोलीबारी साइटों के ठहराव विस्तार में अनुमति देता है । सूचना दीक्षा स्थलों की संख्या, पिक्सल और µm2में साइट के आकार पर इकट्ठा किया जा सकता है, और उस साइट पर होने वाली PTCLs की औसत अवधि । इस PTCL विश्लेषण एक उप सेलुलर स्तर पर छोटी आंत में सीटीसी गतिविधि के पहले लक्षण वर्णन की अनुमति दी, और, Volumetry सॉफ्टवेयर में विभिंन झंडे का उपयोग कर, दोनों नेटवर्क और व्यक्तिगत गोलीबारी साइट स्तर पर PTCLs बरकरार ऊतक में quantified थे किट से तैयारियां-Cre-GCaMP3 चूहों३८। इन प्रारंभिक टिप्पणियों से, इस विश्लेषण के आगे उपंयास सीए 2 का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है+ सैनिक आईसीसी में आमद मार्ग-मेरी ऐसी दुकान के रूप में संचालित-ca2 +-४२ प्रवेश और mitochondrial Ca की भूमिका + सैनिक pacemaking पर2 + संकेत ४१. ज्यादा STM विश्लेषण की तरह ऊपर वर्णित है, PTCL विश्लेषण आसानी से अलग बरकरार तैयारी है कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित के अलावा अंय के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक हाल ही में अध्ययन उपंयास लयबद्ध सीए 2 के अध्ययन के लिए PTCL विश्लेषण का इस्तेमाल किया+ लेमिना propria के बरकरार सेलुलर नेटवर्क में होने वाली घटनाओं के चूहे मूत्राशय५८,५९ और इस तरह आसानी से लागू किया जा सकता है अंय जटिल, बरकरार सेलुलर प्रणालियों जैसे न्यूरॉन सिस्टम । हालांकि इस कागज GECIs के साथ बरकरार ऊतकों में सीए2 + इमेजिंग पर ध्यान केंद्रित, इन विश्लेषण तकनीक भी अलग कोशिकाओं और पारंपरिक Ca2 + संकेतक रंजक के साथ भरी हुई ऊतकों पर चलाया जा सकता है. STM आधारित विश्लेषण सफलतापूर्वक स्थानीयकृत ca2 + संकेतों और ca2 + लहरों से धुरी आकार मध्यवर्ती कोशिकाओं और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं की तैयारी की एक किस्म से11,६० का उपयोग किया गया है , ६१ , ६२ , ६३. इसके अलावा, PTCL विश्लेषण दिनचर्या यहां वर्णित भी है के लिए लागू किया गया है सीटू नेटवर्क की तैयारी काल ५२०५८,५९के साथ visualized । हालांकि, इन अध्ययनों से भी ऐसे अस्पष्ट सेल पहचान और शोर करने के लिए संकेत के साथ समस्याओं के रूप में ऐसे डाई लोडिंग प्रोटोकॉल के नुकसान को बनाए रखने ।

उदाहरण के ऊपर सचित्र प्रदर्शित करता है कि दोनों STM और PTCL विश्लेषण अत्यधिक निंदनीय तकनीक है कि जटिल Ca 2 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है+ बरकरार ऊतक की तैयारी की एक विविध रेंज में संकेत । दृष्टिकोण पारंपरिक रॉय पर कई लाभ की पेशकश तीव्रता भूखंडों कि नियमित रूप से पहले से इस्तेमाल किया गया है और 2 सीए पर अधिक मूल्यवान मात्रात्मक जानकारी के साथ जांचकर्ताओं प्रदान करना चाहिए+ से संकेतन पहले से प्राप्त किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

NIDDK द्वारा P01 DK41315 के माध्यम से धन प्रदान किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ImageJ software NIH 1.5a ImageJ software
Volumetry GWH Volumetry 8Gd Custom made analysis software
Isoflurane Baxter, Deerfield, IL, USA NDC 10019-360-60
Tamoxifen Sigma T5648
GCaMP6F mice Jackson Laboratory Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice Gifted From Dr. Dieter Saur c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol Pharmco-Aaper SDA 2B-6

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References

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