Tillämpningar av plats och tid kartläggning och partikel analystekniker för att kvantifiera intracellulära Ca2 + signalering In Situ

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Genetiskt kodade Ca2 + indikatorer (GECIs) har radikalt förändrat hur jordbaserad Ca2 + imaging utförs. För att maximera dataåterställning från sådana inspelningar, krävs lämplig analys av Ca2 + signaler. Protokollen i denna uppsats underlätta kvantifiering av Ca2 + signaler inspelad på plats med hjälp av spatiotemporal kartering och partikel-baserad analys.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Drumm, B. T., Hennig, G. W., Baker, S. A., Sanders, K. M. Applications of Spatio-temporal Mapping and Particle Analysis Techniques to Quantify Intracellular Ca2+ Signaling In Situ. J. Vis. Exp. (143), e58989, doi:10.3791/58989 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ca2 + avbildning av isolerade celler eller specifika typer av celler inom intakta vävnader ofta avslöjar komplexa mönster av Ca2 + signalering. Denna aktivitet kräver noggrann och djupgående analyser och kvantifiering att fånga så mycket information som möjligt om de bakomliggande händelserna. Spatial, tidsmässiga och intensitet parametrar inneboende till Ca2 + signaler såsom frekvens, varaktighet, förökning, hastighet och amplitud kan ge några biologiska information som krävs för Intracellulär signalering. Högupplösta Ca2 + imaging vanligtvis resultat i förvärvet av stora datafiler som är tidskrävande att process när det gäller att översätta imaging informationen till mätbara uppgifter och denna process kan vara mottagliga för mänskliga fel och fördomar. Analys av Ca2 + signaler från celler jordbaserad är vanligtvis beroende av enkel intensitet mätningar från godtyckligt valda områden av intresse (ROI) inom ett synfält (FOV). Denna strategi ignorerar mycket av viktiga signalering informationen i FOV. Således, för att maximera återvinning av information från sådana högupplösta inspelningar som erhållits med Ca2 +färgämnen eller optogenetic Ca2 + bildskapande, lämpliga rumsliga och tidsmässiga analys av Ca2 + signaler krävs. De protokoll som beskrivs i denna uppsats kommer att beskriva hur en hög volym av data kan erhållas från Ca2 + imaging inspelningar att underlätta mer komplett analys och kvantifiering av Ca2 + signaler inspelade från celler som använder en kombination av spatiotemporal karta (STM)-baserad analys och partikel-baserad analys. Protokoll som beskriver också hur olika mönster av Ca2 + signalering observerade i olika cell populationer jordbaserad kan analyseras på rätt sätt. För illustration undersöker metoden Ca2 + -signalering i en specialiserad population av celler i tunntarmen, interstitiella celler av Cajal (ICC), med hjälp av GECIs.

Introduction

Ca2 + är en allestädes närvarande intracellulära budbärare som styr ett brett utbud av cellulära processer, såsom muskel kontraktion1,2, metabolism3, cell spridning3,4, 5, stimulering av neurotransmitterfrigöraren nerv terminaler6,7, och aktivering av transkription faktorer i kärnan. 7 intracellulära Ca2 + signaler ofta ske i form av övergående förhöjningar i cytosoliskt Ca2 +, och dessa kan vara spontan eller uppkommer agonist stimulering beroende på det cell typ8. Spatial, tidsmässiga och intensitet parametrar inneboende till Ca2 + signaler såsom frekvens, varaktighet, förökning, hastighet och amplitud kan ge den biologiska information som krävs för Intracellulär signalering5, 7 , 9. cytoplasmiska Ca2 + signaler kan resultera från inflödet av Ca2 + från extracellulära eller via Ca2 + release från endoplasmatiska retiklet (ER) via Ca2 + release kanaler såsom ryanodine receptorer (RyRs) och inositol-tri-fosfat receptorer (IP3Rs)10. RyRs och IP-3Rs kan både bidra till generation av Ca2 + signaler och samordnade öppnandet av dessa kanaler, som i kombination med olika Ca2 + tillströmning mekanismer kan resultera i en myriad av Ca2 + signalering mönster som formas av siffrorna och öppna sannolikheten Ca2 + tillströmning kanaler, uttryck profilen Ca2 + release kanaler, närheten mellan Ca2 + tillströmning och release kanaler, och uttryck och distribution av Ca2 + återupptaget och extrudering proteiner. Ca2 + signaler kan ta form av enhetliga, långvarig, hög intensitet globala svängningar som kan pågå i flera sekunder eller ens minuter, förökningsmaterial intracellulära och intercellulära Ca2 + vågor som kan korsa intracellulära avstånd över 100 µm10,11,12,13,14,15,16, eller mer kort, rumsligt lokaliserad händelser såsom Ca2 + gnistor och Ca2 + puffar som inträffar på tiotals millisekund tidsskalor och sprida mindre än 5 µm17,18,19,20.

Fluorescerande mikroskopi har använts allmänt att övervaka Ca2 + signalering i isolerade och odlade celler och i intakta vävnader. Traditionellt dessa experiment involverade fluorescerande Ca2 + indikatorer, proportionerlig och icke-proportionerlig färgämnen som Fura2, Fluo3/4 eller Rhod2, bland annat 21,22,23. Dessa indikatorer avsedda att vara genomsläppliga för cellmembranen och sedan fastna i celler genom klyvning av en estergrupp via endogena esteraser. Bindningen av Ca2 + till hög affinitet indikatorer orsakade förändringar i fluorescens när celler och vävnader var upplyst av lämpliga våglängder av ljus. Användningen av cell genomsläpplig Ca2 + indikatorer förbättras avsevärt vår förståelse av Ca2 + signalering i levande celler och tillåtna rumslig upplösning och kvantifiering av dessa signaler som inte var möjligt av testmetoder Ca2 + signaler annat sätt, till exempel elektrofysiologi. Traditionella Ca2 + indikatorer har dock flera begränsningar, såsom fotoblekning som uppstår över utökade inspelning perioder24. Medan nyare Ca2 + indikator färgämnen som Cal520/590 har kraftigt förbättrat signal-brus nyckeltal och förmågan att upptäcka lokala Ca2 + signaler25kan frågor med fotoblekning fortfarande förbli en angelägenhet för vissa utredare 26,27,28. Brant fotoblekning också begränsar förstoringen, grad av bilden, och upplösning som kan användas för inspelningar, ökad objektiv effekt och högre bild förvärv kräver ökad excitation ljusintensiteten som ökar fotoblekning.

Dessa begränsningar av traditionella Ca2 + indikator färgämnen förvärras när inspelning Ca2 + signaler på plats, till exempel när inspelning intracellulära Ca2 + signaler från intakta vävnader. På grund av problemen ovan, visualisering av Ca2 + signaler i situ använder cell genomsläpplig Ca2 + indikatorer har begränsats till låg förstoring och reducerade Bildinsamling, begränsa möjligheten för utredarna att registrera och kvantifiera temporally eller rumsligt begränsade subcellulär Ca2 + signaler. Således har det varit svårt att fånga, analysera och uppskattar den rumsliga och tidsmässiga komplexiteten av Ca2 + signaler, vilket kan vara viktigt i generation av önskad biologiska svar, enligt ovan. Analys av Ca2 + signaler från celler jordbaserad är vanligtvis beroende av enkel intensitet mätningar från utvalda områden av intresse (ROI) inom ett synfält (FOV). Godtyckliga val av antal, storlek och placering av ROIs, beroende på ett infall av forskaren kan allvarligt bias resultaten. Samt inneboende bias med ROI-analys, ignorerar detta tillvägagångssätt mycket av de viktiga signalering informationen i FOV, som dynamiska Ca2 + händelser inom ett godtyckligt valt ROI väljs för analys. Vidare underlåter analys av ROIs att tillhandahålla information om rumsliga egenskaper av de Ca2 + signaler som observerats. Exempelvis kan det inte vara möjligt för att skilja mellan en ökning av Ca2 + följd en föröknings Ca2 + våg och en starkt lokaliserad Ca2 + släppa händelsen från tabelluppställning av Ca2 + signaler inom ett ROI.

Tillkomsten av genetiskt kodade Ca2 + indikatorer (GECIs) har radikalt förändrat hur Ca2 + imaging kan vara utförda i situ29,30,31,32,33 . I området i närheten finns det flera fördelar med att använda GECIs över färgämnen. Det viktigaste är kanske att uttryck för GECI kan utföras på ett särskilt sätt för cellen, vilket minskar oönskade bakgrundshalter från celler inte av intresse. En annan fördel med GECIs över traditionella Ca2 + indikatorer är att fotoblekning minskas (fluorescens och följdriktigt fotoblekning bara uppstår när celler är aktiv), jämfört med dye-loaded exemplar, särskilt vid höga förstoring och hög bild fånga34. Således imaging med GECIs, såsom GCaMP serien av optogenetic sensorer, ger utredarna förmågan att spela kort, lokaliserade sub cellulära Ca2 + signaler i situ och undersöka Ca2 + signalering i celler inom deras inhemska miljöer som inte har varit möjligt tidigare. För att maximera återvinning av information från sådana högupplösta inspelningar, krävs lämpliga rumsliga och tidsmässiga analys av Ca2 + signaler. Det bör noteras att medan GECIs kan erbjuda några tydliga fördelar, senare studier visat att Ca2 + avbildning kan utföras framgångsrikt från stora populationer av olika neurokemiska klasser av nervceller samtidigt använder konventionella Ca2 + indikatorer som inte är genetiskt kodade till djur35. Detta tillvägagångssätt används post hoc-immunohistokemi för att avslöja flera olika klasser av neuroner avfyras på hög frekvens i synkroniserade skurar, och undvek den potential som genetiska modifieringar att djuret kan ha stört fysiologiska beteende utredaren försöker förstå35,36.

De protokoll som beskrivs i detta dokument underlätta mer komplett analys och kvantifiering av Ca2 + signaler inspelade från celler på plats med en kombination av spatiotemporal karta (STM)-baserad analys och partikel-baserad analys. Protokoll som beskriver också hur olika mönster av Ca2 + signalering observerade i olika cell populationer jordbaserad kan analyseras på rätt sätt. För illustration undersöker metoden Ca2 + -signalering i en specialiserad population av celler i tunntarmen, interstitiella celler av Cajal (ICC). ICC är specialiserade celler i den gastrointestinala (GI) tarmkanalen som uppvisar dynamiska intracellulära Ca2 + signalering, som visualiseras med möss som uttrycker GCaMPs37,38,39,40, 41,42. Ca2 + transienter i ICC är kopplade till aktivering av Ca2 +-aktiverade Cl kanaler (kodad av Ano1) som är viktiga i regleringen av retbarhet av tarmens muskulatur celler (SMCs)43, 44,45. Studien av Ca2 + signalering i ICC är alltså grundläggande att förstå tarmens motilitet. Murina tunntarmen erbjuder ett utmärkt exempel för denna demonstration, som det finns två klasser av ICC som är anatomiskt separerade och kan visualiseras självständigt: jag) ICC ligger i området mellan den cirkulära och längsgående glatta muskulaturen lager, kring den myenteric plexus (ICC-min). Dessa celler fungera som pacemaker celler och generera den elektriska aktiviteten som kallas långsamma vågor46,47,48,49; (II) ICC ligger också bland en plexus som är rik på terminalerna av motoriska nervceller (djupt muskulös plexus, således ICC-DMP). Dessa celler fungera som medlare av Svaren till enteriska motor neurotransmission37,39,40,50. ICC-min ICC-DMP skiljer sig morfologiskt och sina Ca2 + signalering beteenden skiljer sig radikalt för att utföra sina specifika uppgifter. ICC-min är stjärnformade i form och bildar ett nätverk av sammankopplade celler via gap junctions51,52. Ca2 + signaler i ICC-min manifest som kort och rumsligt lokaliserad Ca2 + release händelser som inträffar på flera platser asynkront via ICC-MY network som visualiseras i en FOV (avbildas med ett 60 X-objektiv)38. Dessa asynkron signaler är organiserade temporally i 1 sekund kluster som, när i tabellform tillsammans, uppgå till en netto 1 s cellulära ökning Ca2 +. Dessa signaler propagera cell till cell inom ICC nätverket och därför organisera Ca2 + signalering, genereras från sub cellulära webbplatser, till en vävnad brett Ca2 + våg. Tidsmässiga klustring och summering av Ca2 + signaler i ICC-MY har kallats Ca2 + övergående kluster (CTCs)38. CTCs uppstå rytmiskt (t.ex. ganska liknande varaktigheter och liknande perioder mellan CTCs) 30 gånger per minut i musen. Omvänt, ICC-DMP är spindeln formade celler, några med sekundära processer, som distribuerar mellan SMCs och åderbråck nerv processer och inte självständigt bildar ett nätverk51,52. ICC-DMP form gap-junctions med SMCs, dock och funktion inom detta större syncytium, känd som SIP syncytium53. Ca2 + signaler förekommer på flera platser längs längderna av celler, men dessa transienter inte fångas upp eller temporally klustrade, som observerats i ICC-min37. Ca2 + signaler i ICC-DMP uppstå på en stokastisk sätt, med varierande intensitet, varaktighet och rumsliga egenskaper. Protokollen nedan, i exemplet med Ca2 + signalering i ICC-MY och ICC-DMP, beskriver tekniker för att analysera komplexa signalering i specifika typer av celler på plats. Vi utnyttjade inducerbara Cre-Lox p-systemet för att uttrycka GCaMP6f uteslutande i ICC, efter att förmå aktivering av Cre-Recombinase (Cre) drivs av en ICC specifika promotorn (Kit).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla djur som används och de protokoll som utförs i denna studie var i enlighet med den nationella institut för hälsa Guide för skötsel och användning av försöksdjur. Alla förfaranden godkändes av institutionella djur användning och eftervård kommittén på vid University of Nevada, Reno.

1. generering av KitGCaMP6f möss

  1. Cross Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f möss) och c-Kit+/ Cre-ERT2 (Kit-Cre möss) för att generera ICC specifika GCaMP6f uttrycker djur (Kit-Cre-GCaMP6f möss).
    Obs: GCaMP6f användes på grund av dess rapporterade effektivitet i rapportering lokaliserade, signaler kort intracellulära Ca2 + på plats och in vivo54.
  2. Injicera Kit-Cre-GCaMP6f möss med tamoxifen i åldrarna 6 – 8 veckor att inducera Cre Recombinase aktivering och efterföljande GCaMP6f uttryck i ICC (figur 1).
    1. För att skapa tamoxifen lösningen, lös 80 mg Tamoxifen (se Tabell för material) i 800 μL av etanol (se Tabell för material) i en kyvetten och virvel för 20 minuter.
    2. Tillsätt 3,2 mL tistelolja (generiska) att skapa lösningar av 20 mg/mL och sedan Sonikera i 30 minuter före injektion.
    3. Injicera möss (intraperitoneal injektion; IP) med 0,1 mL av tamoxifen lösning (2 mg tamoxifen) för tre dagar. Bekräfta GCaMP6f uttryck genom genotypning och använda möss 10 dagar efter den första injektionen.
      1. Genotyp möss av klippning en liten bit av örat från varje djur. Använd sedan den HotSHOT metod55 för genomisk DNA isolering av ruvning öra klipp vid 95 ° C i 60 min i 75 mL NaOH och sedan neutraliserande 75 ml av Tris buffert. Använd standard PCR för att avgöra genotyp av varje djur, 2 mL av DNA i en 20 mL reaktion med GCaMP6f specifika primers56. Kör 10 mL av PCR-produkten på en 2% agarosgel att bestämma vildtyp (297 bp) och mutant (~ 450 bp) band.

2. förberedelse av vävnader för Ca2 + Imaging

  1. Bedöva möss genom inhalation med isofluran (4%, se Tabell för material) i en ventilerad huva och sedan offer av cervikal dislokation.
  2. Hjälp av vass sax öppna buken av möss, ta bort tunntarmen och placera i Krebs-ringsignalen bikarbonat lösning (KRB). Öppna tunntarmen längs mesenterica gränsen och tvätta bort eventuella intraluminal innehållet med KRB. Använda skarp dissektioner, ta bort de slemhinna och sub slemhinna lagrarna.
    Obs: KRB lösning har följande sammansättning (i mM): NaCl 118,5, KCl 4,7, CaCl2 2,5, MgCl2 1.2, NaHCO3 23,8, KH2PO4 1.2, dextros 11,0. Denna lösning har ett pH på 7,4 vid 37 ° C när bubblade till jämvikt med 95% O2- 5% CO2.
  3. Använda små stift, stift tunntarmen vävnaden på basen av en 5 mL volym, 60 mm diameter Sylgard-belagda maträtt med cirkulära glatta muskulaturen lagret uppåt. BEGJUTA preparatet med värmde KRB lösning vid 37 ° C under en Jämviktstiden 1 tim innan experiment.
  4. Efter denna Jämviktstiden period, utför på plats Ca2 + imaging av små intestinal ICC-MY och ICC-DMP använder konfokalmikroskopi (bilder i detta protokoll har förvärvats med en confocal Mikroskop som är utrustat med en spinning-skiva). På grund av fördelarna med GECIs som beskrivs ovan, använda högupplösta time-lapse bilder (> 30 bilder per sekund, bps) kombinerat med hög effekt mål (60 – 100 x) att förvärva filmer av dynamiska Ca2 + signaler i ICC.
    Obs: För att minska vävnad rörelse, tillämpa nikardipin (0,1 – 1 μM) under inspelningar som tidigare beskrivits37,38,39,40,41.
  5. Skilja ICC-MY och ICC-DMP i tunntarmen med hjälp av deras skilda anatomiska läge, morfologi och basala Ca2 + aktivitetsmönster.
    1. Leta upp ICC-mitt på nivå i plexus myenteric, mellan cirkulära och längsgående glatta muskeln skikten av tunntarmen. De är stjärnformade formade, bildar ett anslutet nätverk (figur 3A). CTCs (beskrivs ovan) spridits genom nätverket av ICC-min med en regelbunden förekomst av ~ 30 cykler per minut.
    2. Omvänt, lokalisera ICC-DMP i ett enda plan på nivå av djup muskulär plexus, mellan lagrets cirkulär muskulatur och submukosala plexus. ICC-DMP utgör inte ett nätverk och är spindeln formade celler (figur 2A) som uppvisar inga regelbundna förökningsmaterial händelser och istället eld stokastiska, lokaliserad intracellulära Ca2 + transienter.
  6. Oavsett förvärv programvaran utnyttjas, spara filmer som en stack av TIFF-bilder.

3. analys av stokastiska Ca2 + signaler i ICC-DMP med plats och tid mappning (STM)

  1. Analysera ICC-DMP med plats och tid mappning med en kombination av ImageJ programvara (NIH, USA, gratis att ladda ner på http://imagej.nih.jov/ij) och anpassade gjort programvara (Volumetry, version G8d, GWH, manövreras på Mac OS, kontakta Grant Hennig grant.hennig@ med.UVM.edu angående förfrågningar för Volumetry tillgång och användning)
    Obs: En alternativ metod att fullt ut analysera dessa plats och tid kartor med ImageJ ensam finns också i senare avsnitt (början vid steg 3.9).
  2. Öppna Volumetry och Använd höger musknapp klick för att öppna mappar som innehåller filmfiler. Vänster klicka på filmfilen som ska analyseras för att öppna den i Volumetry (måste vara i okomprimerad TIFF-format). Öppnad, kommer filmen att finnas inom ett blå-gränsas fönster (film fönster) som kommer att omfatta ett stort område av skärmen högra. Vänster sida av skärmen innehåller fönstret tomt (övre 4/5ths) och fönstret spår (lägre 1/5th).
  3. Justera måtten på filmen genom att hålla ned SKIFT och samtidigt rullning upp med musens mittknapp (MMB, minskar storlek) eller rulla ner med den MMB (ökar storlek). Starta eller stoppa uppspelningen genom att trycka på 'A', hastigheten på uppspelningen kan justeras genom att trycka upp och ned piltangenterna.
  4. För att skapa en STM använder Volumetry, rita en ROI över en hela cellen genom att hålla ned SKIFT-tangenten samtidigt att klicka och dra med vänster musknapp. Justera orienteringen av ROI genom att bläddra med MMB i hörnen av ROI. När ROI är på plats över cellen ska analyseras (figur 2A), använda rätt klick i fönstret film åt ' ROI STM – STMyAvg > xRow' och Vänsterklicka för att skapa en STM för aktiviteten cell i fönstret tomt (det finns också möjlighet att välja ' STMxAvg > yRo w ', vilket som väljs beror på huruvida orienteringen av cellen är mer i linje med x eller y-axeln, till exempel cellen markerad figur 2A är mer orienterade på y-axeln').
  5. Vänster klicka på STM i fönstret tomt och tryck 'P' för att subtrahera genomsnittliga bakgrundsljud och tryck på 'H' för att öka kontrasten i STM. Spara STM vid rätt klickande på den för att komma åt ' STM belastning Spara - Spara STM som .tif' och sedan vänster Klicka om du vill spara som TIFF.
  6. Resten av analysen av ICC-DMP kommer att genomföras i ImageJ. ImageJ består av två huvudkomponenter, ett verktygsfält med en fast position på toppen av skärmen och ett mobilt användargränssnitt. Öppna med ImageJ STM TIFF-filen av ICC-DMP Ca2 + aktivitet (Arkiv-Öppna i verktygsfältet Bild J).
  7. Öppna Volumetry skapade STM, som kommer att ha tid vertikalt orienterade. ImageJ kommer automatiskt öppna TIFF-filer som antingen RGB eller 16-bitars bilder. För att förbättra bildkvaliteten, vänster klicka 'Bild' i verktygsfältet ImageJ. Bläddra på det första alternativet ' Skriv 'för att avslöja en nedrullningsbar meny med olika bildformat, rulla över ' 32-bitars' och vänster Klicka om du vill ändra.
  8. För att göra STM läsbar mot tiden från vänster till höger, vänster klicka på verktygsfältet ImageJ på följande sökväg: 'Bild-Transform-Rotera 90 grader åt vänster'. Det är också möjligt att skapa STM på plats ca2 + aktivitet med linescans med ImageJ ensam utan Volumetry och detta beskrivs nedan.
    Obs: När STM skapas, analyseras de på samma sätt oavsett vilken programvara användes för att generera dem. Om du vill hoppa över detta alternativ metod för att skapa STM i ImageJ, hoppa till steg 3.19.
  9. För att skapa STM med ImageJ, öppna bunten med TIFF-filer som utgör inspelningen av ICC-DMP Ca2 + aktivitet (Arkiv-öppna verktygsfältet ImageJ). ImageJ kommer automatiskt öppna TIFF-filer som antingen RGB eller 16-bitars bilder. För att förbättra bildkvaliteten, vänster klicka 'Bild' i verktygsfältet ImageJ. Bläddra på det första alternativet ' Skriv 'för att avslöja en nedrullningsbar meny med olika bildformat, rulla över ' 32-bitars' och vänster Klicka om du vill ändra.
  10. Bakgrundsljud (följd av auto fluorescens eller kamera buller) bör nu dras från filmen. Vänster klicka 'Rektangulär markering' funktionen i ImageJ gränssnittet och rita en ROI (genom att vänster Klicka och dra till önskad storlek och form) över bakgrunden fluorescensen av filmen.
  11. Vänster klicka på 'Analysera' i ImageJ verktygsfältet väljer du ROI, och sedan vänster klicka 'Histogram' från menyn resulterande. Ett popup-fönster visas då frågande om pixel intervallvärden att beräkna; ImageJ har värdena för ROI förvalda så vänster klicka 'OK'.
  12. Klicka på 'OK' och visas en ny popup-ruta som innehåller ett histogram visar fördelningen av värden för pixel buller i bakgrunden inom ROI. Notera medelvärdet nedan histogrammet och Stäng popup-rutan.
  13. Klicka på tillbaka till 32-bitars filmen och välj hela FOV genom att vänsterklicka 'Redigera' i verktygsfältet ImageJ rullning till 'Urval', och vänster klicka på 'Välj alla' från menyn avslöjade.
  14. Vänster klicka 'Förlopp' i ImageJ verktygsfältet, bläddra till 'Matte' och vänster klicka 'Subtrahera' från menyn avslöjade.
  15. En popup-ruta kommer upp där ett värde ska dras från FOV kan infogas. Ange medelvärdet förvärvats från histogrammet i steg 3.12 ovan och klicka på 'OK'. ImageJ kommer sedan be att bearbeta alla bildrutor i TIFF stacken (och inte bara den enda bildrutan filmen är för närvarande på). Klick 'Ja'.
  16. Klicka på 'Ja' och blir filmen svart. För att korrigera detta, vänster klicka 'Bild' i ImageJ verktygsfältet och rulla över ”justera”. Vänster klicka på alternativet uppenbarade först för 'Ljusstyrka/kontrast' (B & C). Detta kommer att ta upp en pop up-ruta där olika aspekter av ljusstyrka och kontrast kan ändras. Vänster klicka på 'Auto' alternativet en gång avslöja ökad kvalitet i filmen. Lämna denna B & C pop upp rutan öppen för framtida bruk.
  17. För att skapa en linescan, först högerklicka på verktyget linje urval i ImageJ gränssnittet att avslöja alternativ för olika linjer; vänster klicka på 'Segmenterade Line' att välja det i listan. Med verktyget 'Segmenterad linje' valts, klick lämnade användning enda för att rita en linje längs mitten av axeln av en enskild ICC-DMP. Varje enda vänsterklick kommer fixa linjen just då och linjen kan då fritt flyttas vidare på någon önskad vinkel. När raden är klar, dubbel vänster Klicka för att fixa raden på plats.
  18. Vänster klicka 'Bild' i ImageJ verktygsfältet och rulla över 'Stackar' och vänster klicka på alternativet 'Reslice'. En popup-ruta kommer att visas; vänster klicka på alternativet att ”rotera 90 grader”, detta kommer att orientera linescan från vänster till höger så att den kan kalibreras och läsa mot tiden på x-axeln, med utrymme på y-axeln. Klicka på 'OK' för att skapa STM.
  19. Intensiteten i STM kommer att skapas på en gråskala med hög intensitet Ca2 + signaler visas som olika grader av vit, off vit eller ljusgrå beroende på deras intensitet. Kontrasten i den skapade linescan kommer normalt behöver förbättras. Gör detta genom att klicka på 'Auto' på B & C pop upp rutan.
  20. Intensiteten av fluorescensen av linescan presenteras på STM i godtyckliga pixelvärden. För att noggrant mäta amplituden av Ca måste2 + signaler från STM, fluorescens värdena av STM (F) nu normaliseras. Funktionen 'Rektangulär markering' i gränssnittet ImageJ rita en ROI på en yta av STM som visar området mest enhetliga och minst intensiv av fluorescens (F0).
  21. Upprepa de steg som tagits i 3.11-3.12 att få ett medelvärde (F0) av intensiteten inom den valda ROI och välj sedan hela STM genom att vänsterklicka på 'Redigera-urval-Välj alla' från verktygsfältet ImageJ.
  22. Vänster klicka 'Förlopp' i ImageJ verktygsfältet och bläddra till 'Matte'; vänster klicka 'Dela' från de visade alternativen. I efterföljande popup rutan, ange medelvärdet (F0) erhålls från steg 3.21. Vid divideras (F0) hela STM blir STM svart; korrigera detta genom att klicka på 'Auto' på B & C pop up-rutan. Linescan är nu kalibrerad för amplitud, med fluorescensintensitet uttryckt som F/F0.
  23. STM visar för närvarande antalet bildrutor i TIFF stack på x-axeln och antalet pixlar som motsvarar längden på cellen på y-axeln. För att kvantifiera temporal och spatial information från Ca2 + signaler, kalibrera STM för utrymme och tid. Vänster klicka 'Bild' i verktygsfältet ImageJ och vänster klicka på 'Egenskaper'. En popup-ruta kommer att visas. Inom fönstret, ange lämpliga värden för att kalibrera helt STM.
  24. För 'Pixelbredd', anger du hur lång tid det tar för att fånga en enskild bildruta i sekunder. För exempel, på 5 FPS, ange ett värde på 0,2, för 50 FPS anger värdet 0,02, 33 FPS anger värdet 0.033 etc. För 'pixelhöjd', ange hur många mikrometer varje pixel representerar (beror på de mål som används och kamera används för förvärvet). 'Voxel djup' är kvar på 1 innan du klickar på 'OK'. Inga andra parametrar behöver justeras inom fönstret.
    Obs: Klicka på 'OK' och kommer STM vara fullt kalibrerad för amplitud, utrymme och tid. Amplituden på STM kommer att uttryckas som F/F0, tiden på x-axeln kommer att uttryckas i sekunder och utrymme på y-axeln kommer att uttryckas i μm (figur 2B). Ca2 + händelser på STM är nu redo att mätas, kalibrerad STM kan också sparas som en enda TIFF-bild att analysera senare.
  25. ImageJ har ett antal inbyggda färgkodade uppslagstabell (LUTs) som kan användas för att färgkod STM. Applicera en inbyggd LUT genom att vänsterklicka på verktygsfältet ImageJ på vägen 'Bild-uppslagstabeller' och välja en LUT att tillämpa. Skräddarsydd LUTs kan också importeras till STM genom vänster Klicka i verktygsfältet ImageJ på vägen 'Fil-Import-LUT' och sedan välja LUT att importera. Till exempel har STM visas i figur 2 c haft den anpassade LUT 'QUBPallete' (Queens University Belfast, UK) tillämpas på det, till koden varma färger (röd, orange) som områden av intensiv Ca2 + fluorescens och kalla färger (svart, blå) som områden för låg Ca2 + fluorescens.
  26. Om du vill infoga en amplitud kalibrering bar för att indikera spänna av amplituder som representeras av olika färger, vänster klicka 'Analysera' från verktygsfältet ImageJ, rulla till 'Verktyg' och välj 'Kalibrering Bar' från menyn avslöjade. Alternativ ges för storlek, zoom, sortiment och positionen på STM för kalibrering bar; justera inställningarna efter behov och klicka på 'OK'. Observera att när baren kalibrering sätts, ImageJ skapar en nya STM som innehåller det, lämnar den ursprungliga versionen utan kalibrering baren intakt och separat.
    Obs: Om 'Overlay' rutan är ikryssad när du infogar fältet kalibrering, genereras inte en ny STM.
  27. För att börja analysera enskilda Ca2 + händelser, vänster klicka på 'Rak linje' väljaren på gränssnittet ImageJ. Genom att inledningsvis vänsterklicka på STM, rita en rak horisontell linje genom centrum av en Ca2 + händelse parallellt med x-axeln (mot klockan). Slutföra linje genom att vänsterklicka en andra gång (figur 2D).
  28. Klicka på 'Analysera' i verktygsfältet ImageJ och vänster klicka på 'Rita profil'. En ny ruta med tomt för Ca2 + händelsen (figur 2E).
    Obs: Alternativet 'Lista' i denna ruta kommer att generera en lista med XY värden av genererade tomten, som kan kopieras till ett kalkylprogram för att skapa spår om så önskas.
  29. För att mäta amplituden av Ca2 + evenemanget representerade i tomt profilen, vänster klicka på 'Rak linje' väljaren på gränssnittet ImageJ. Sedan, dra en vertikal linje från baslinjen av tomt profilen till toppen av Ca2 + händelsen; längden på raden (visas på gränssnittet ImageJ) representerar amplituden av händelsen uttryckt som ΔF/F0 (figur 2E).
  30. Använder värdet förvärvade amplitud, varaktigheten av händelsen Ca2 + kan mätas genom att rita en rak linje tvärs över händelsen vid 50% maximal amplitud (full längd på halv maximal amplitud, FDHM) eller den hela varaktigheten av händelsen kan mätas om så önskas (figur 2E).
    Obs: Praktiker kommer att behöva designa kriterium för tröskelvärde giltigt Ca2 + händelser i dessa inspelningar. I vårt experiment, designerades Ca2 + händelser som giltigt för analys om dess amplitud var > 15% av maximal amplitud händelsen i kontrollavsnittet av inspelning. Men dessa tröskelvärden kommer att bero på de specifika vävnaderna och celler under studien och är bara godtyckliga riktlinjer som kräver specifika optimering för varje typ av vävnader och celler.
  31. Genom att rita en linje längs upstroke eller nedåt på den Ca2 + händelse tomt profilen, kan den stiger eller faller beräknas med detta. Efter linjen dras, kan muspekaren flyttas till punkten där linjen börjar och där den slutar. När markören står stilla över dessa punkter, x, y koordinater för platsen visas i den nedre vänstra sidan av gränssnittet ImageJ. Således, genom att förvärva x, y-värden för där linjen börjar (x1, y1) och slutar (x2, y2), andelen stiger eller faller (ΔF/s) kan beräknas som lutningen av linje, y2 - y1 / x2 - x1 (figur 2F ).
  32. För att beräkna den förökning eller rumslig spridning av en Ca2 + händelse, vänster klicka på 'Rak linje' väljaren på gränssnittet ImageJ. Sedan, dra en rak vertikal linje längs den Ca2 + händelsen längs y-axeln. Längden på raden (visas på gränssnittet ImageJ) kommer att representera rumslig spridning av händelsen uttryckt som μm (figur 2 g).
  33. Bestämma hastigheten hos en förökningsmaterial Ca2 + händelse genom att dra en linje längs förökningsmaterial framsidan av händelsen och beräkna lutningen på linjen. Detta kan utföras manuellt på ett liknande sätt som beskrivs i steg 3,32, genom att bestämma x, y-värden för där linjen börjar (x1, y1) och slutar (x2, y2); dessa värden visas i den nedre vänstra sidan av gränssnittet ImageJ när muspekaren är belägen på STM.
  34. Vid insamling av de önskade parametrarna för Ca2 + händelse kvantifiering, pool dessa värden genomsnittet för att generera medelvärden för varje parameter på basis per cell; Alternativt placera alla rå värden i en distribution histogram Visa sitt sortiment (figur 2 H).

4. kvantifiering av CTCs i ICC-min använder partikel baserat analys

  1. Innan analysera filmer i Volumetry med PTCLs, kommer att rumsliga och tidsmässiga kalibrering av filmen behöva införas i filnamnet. Redigera alla filer som ska analyseras i Volumetry innehålla inom avdelning antalet sekunder som varje bildruta är lika med och också antalet mikrometer som varje pixel motsvarar separerade med ett enda streck, med värden inneslutet i hakparenteser. Till exempel, en film som förvärvats på 33 FPS med ett 60 x-objektiv (512 x 512) bör ha [0,22 – 0,033] infogas i dess filnamn.
  2. Öppna Volumetry och Använd höger musknapp klick för att öppna mappar som innehåller filmfiler. Vänster klicka på filmfilen som ska analyseras för att öppna den i Volumetry (figur 3A, måste vara i okomprimerad TIFF-format).
  3. För att exakt beräkna Ca2 + signaler från hela FOV, kommer filmen först genomgå differentiering och utjämning för att ta bort bakgrunden störningar (kamera buller, auto fluorescens osv) och öka signal-brusförhållande. I fönstret film, högerklicka för att få upp en meny och använda rätt klick tillgång STK Filter-differentiera, högerklicka igen för att ange ett värde för att differentiera, tryck på RETUR och Vänsterklicka för att tillämpa (för filmer förvärvade på 33 FPS värdet 2 (∆t = ± 66-70 MSEK) fungerar bra, värdet ökas som graden av image capture ökar).
    Obs: Differentiering i detta sammanhang kommer att minska intensiteten i områden av inspelning (pixlar) som visar ingen dynamisk aktivitet över antalet ramar som anges. Således, om värdet '2' sätts, varje bildpunkt i varje bildruta av inspelningen analyseras och om inom ramen det finns ingen dynamisk förändring i pixel fluorescens 1 bildruta före och 1 bildruta efter, intensiteten inom dessa pixlar dras från inspelningen. Således icke-dynamisk bakgrundsljud tas bort och signal till brus ökas.
  4. Slät differentierade filmen genom att använda Gaussiska filtret. Högerklicka i fönstret filmen att få upp en meny och använda rätt klick tillgång 'STK Filter-Gauss KRNL', högerklicka igen om du vill infoga ett värde (Använd alltid ett udda tal, för filmer som förvärvats på 33 FPS, värdet 5 fungerar bra, 1,5 x 1,5 µm StdDev 1.0) mata in ett värde, tryck på RETUR och Vänsterklicka för att tillämpa (figur 3B).
  5. Börja skapa PTCLs genom att först välja en period av filmen som inkluderar en quiescent perioden (20 – 40 ramar) följt av förekomsten av en CTC och också 20 – 40 ramar efter CTC. Detta gör bläddra igenom filmen genom att använda MMB att rulla åt vänster till höger på det gula fältet.
  6. Med det val som gjorts, klick använda rätt i fönstret filmen komma åt 'STK Ops – Ramp DS PTCLinfo' och Vänsterklicka för att gälla. Denna funktion körs en PTCL analys rutin som successivt ramper tröskeln från högsta till lägsta intensitet. Detta visas grafiskt i fönstret tomt som en handling av buller och även i fönstret spår som tre färgade spår, med gröna spårningen visar antalet PTCLs, röda spårningen visar genomsnittliga PTCL storlek, och den blå spår visar den absoluta intensiteten tröskelvärdet.
    Obs: PTCLs nummer och genomsnittliga storlek på varje tröskelvärde beräknas automatiskt och sedan en semi manuell tröskel tillämpas med intensitet som vid som den genomsnittliga storleken på PTCLs börjar släppa, som inträffar vid en brytpunkt i det röda spåret i Fönstret Trace (figur 3D, dvs på grund av stort antal rumsligt inskränkt buller PTCLs att minska den genomsnittliga storleken på PTCLs).
  7. Tryck 'H' histogram balans tomten visat PTCL buller inom fönstret tomt. Cykel genom färgscheman genom att trycka på ' [' tills bakgrunden är färgade vita med färgade spår på toppen.
  8. Tryck på 'F' för att få upp ett mätverktyg och vänster klicka på tomten vid korsningen där färgade tomterna skiftar till höger sida. Detta kommer att markera en enda vertikala linjen i rullningslisten i spår fönstret nedan.
  9. Inom fönstret Trace bläddra MMB vänster till höger från en brytpunkt om det röda spåret tills den markerade vita vertikala linjen skapade i steg 4.10 och att se till att det blå spåret är markerat vid rätt klickande på det, Läs av den 'yAVG' som kommer att visas i t Han nedre vänstra sidan av fönstret spår. Avmarkera markeringen genom att trycka MMB en gång inuti fönstret spår.
  10. Inom fönstret film, tryck 'C' för att få upp ett färghjul, då pressen skulle ' att justera tröskeln. Giltig PTCLs visas nu som red i fönstret film (figur 3 c) och de som mättar kommer vara vit. Ta bort de vita områdena genom att rulla upp med vänster musknapp.
  11. Rulla uppåt eller nedåt med MMB justera det gula numeriska värdet i färghjulet, justera det här värdet till det yAVG värdet tas från steg 4.11. Detta kommer att tilldela allt i rött som en aktiv Ca2 + övergående PTCL vid den fastställda tröskel punkten. För att spara denna som en samordna baserat partikel fil, använda rätt klick till access ' STK 3D-Spara PTCLS 0 och sedan vänster Klicka för att spara filen.
  12. Avsluta Volumetry och starta om. Öppna den PTCL fil (.gpf) skapade i steg 4.13. I denna filtyp sparas alla aktiva Ca2 + transienter som en enhetlig blå PTCL (figur 3E). Eftersom varje PTCL är en enskild enhet med sin egen ID, området och omkretsen koordinater, staten flaggor (se nedan) och resultatet matriser, är analys av plats och tid kännetecken av PTCLs, eller mellan PTCLs strömlinjeformad.
  13. För att börja PTCLs analys, ta bort återstående PTCL buller (små ogiltig PTCLs skapades när filen .gpf genereras) genom att använda rätt klick i fönstret film åt ' PTCL STKOPS-flaggan ptcls > Min = 70' och Vänsterklicka för att gälla. Denna åtgärd kommer att flagga PTCLs större än 6 µm2 (~ diameter > 2µm) och Volumetry kommer att tilldela dem till 'Flagga 1' urval. När denna är klar, visas PTCLs som är över denna tröskel (flagga 1) som en ljus lila färg i fönstret film, medan alla PTCLs tröskelvärdet förblir deras bas blå färg (figur 3F).
  14. Skapa värme karta representationer av PTCL aktivitet genom att använda rätt klick i fönstret film åt ' PTCL STKops-StatMap flagga ='. Genom att högerklicka på den slutliga vägen, kan en flagga uppdrag att analysera anges. Således, om önskar att kvantifiera de PTCLs som tilldelats Flagga1, helt enkelt ange '1', tryck på RETUR och sedan vänster Klicka om du vill använda. Detta genererar en intensitetskarta visar de totala PTCLs för hela längden av inspelning, med olika färger som representerar förekomst (%) hela inspelningen (figur 3 g, varma färger indikera ökad förekomst på den platsen).
  15. Spara värmekartor vid rätt klickande på dem tillgång till ' STM belastning Spara - Spara STM som .tif' och sedan vänster Klicka om du vill spara som TIFF.
  16. Kvantifiera PTCL aktivitet genom att använda rätt klick i fönstret film åt ' PTCL åtgärd-PTCLStats STK =', genom att högerklicka på den slutliga vägen, en flagga uppdrag att analysera kan anges. Således, om önskar att kvantifiera de PTCLs som tilldelats Flagga1, helt enkelt ange '1', tryck på RETUR och sedan vänster Klicka om du vill använda. Detta genererar en rad spår i fönstret Trace.
  17. Volumetry kommer som standard Superponera PTCL tracesna genereras i steg 4.17 ovanpå varandra. Separera dem med rätt klick i fönstret Trace komma åt 'Align-separat Trace' och Vänsterklicka för att gälla. Detta kommer att avslöja de fyra olika PTCL spår att kvantifiera Ca2 + PTCL aktivitet i filmen visar PTCL område (grön), PTCL count (röd), PTCL storlek (cyan) och PTCL storlek standardavvikelse (blå) plottas mot tiden (figur 3 H).
  18. Dessa spår kan sparas som en textfil som kan importeras till ett kalkylprogram för vidare analys. För att spara spår, håll ned SKIFT och använder klickar rätt i fönstret Trace komma åt 'Assorted-Dump ROI som Text' och vänster Klicka för att spara filen. Denna information samlas sedan och illustreras i histogram eller andra lämpliga grafiska representationer (figur 3 H).
  19. För att titta på den första förekomsten av PTCLs (dvs. att titta på bränning platser), får dessa inledande PTCLs en annan flagga uppdrag. Bättre isolerat bränning platser förekommer inom nätverket, endast de PTCLs som inte överlappa med några partiklar i den föregående bildruta utan överlappning med partiklar i nästa 70 ms anses bränning platser.
  20. För att tillämpa denna tröskel, använda rätt klick i fönstret film åt ' PTCL beteende-F1 InitSites > F = 3' och vänster Klicka för att ansöka. Detta kommer att tilldela inleda PTCLs som 'Flagga 3' och PTCLs som uppfyller detta villkor visas nu som en limegrön färg i filmen (figur 4A).
  21. Volumetry ger också möjligheten att kvantifiera och rita antalet PTCL sprängplats i en given FOV samt plottning deras sannolikheten för bränning under en CTC. För att analysera dessa parametrar, skapa en intensitetskarta av inleder PTCLs (flagga 3) som beskrivs i steg 4.16 (figur 4B).
  22. Vänster Klicka i fönstret tomt och tryck på 'C' för att få upp en färghjulet och tryck skulle då ' tröskel. Stresskartan att inleda PTCLs kommer sedan tur grått och vitt. Ta bort alla vita genom att rulla upp med vänster musknapp och tröskeln i PTCLs i stresskartan så att endast giltiga PTCLs täcks i grått (justera tröskeln genom att bläddra uppåt och nedåt med MMB).
  23. Använda klick rätt över stresskartan i fönstret tomt att komma åt 'STM PTCLs-hitta PTCLs 70' och Vänsterklicka för att gälla. Detta kommer att tilldela alla grå PTCLs i kartan som är större än 70 pixlar2 i storlek ska fördelas som en separat färgkodade initiation PTCL eller PTCL bränning webbplats (figur 4 c).
  24. Rita aktiviteten av varje av dessa sprängplats mot tiden vid rätt klickande på den PTCL bränning karta och åtkomst till 'STM PTCLs-skapa PTCL rois' och vänster klicka att tillämpa. Detta kommer att generera en ny bild i fönstret film med alla de separata färgade PTCL bränning platser visas med en ROI runt dem.
  25. Använda rätt klick i fönstret film åt ' PTCL åtgärd-PTCLpixROIBM > = 1' och Vänsterklicka för att gälla. Detta kommer att identifiera alla ROIs i fönstret film som innehåller minst en PTCL och kommer att rita all aktivitet inom dessa ROIs i fönstret spår. Som standard, kommer att dessa spår vara ovanpå varandra. För att separera dem, klick använda rätt i fönstret Trace komma åt 'Align-separat Trace' och Vänsterklicka för att gälla. För att spara spår, håll ned SKIFT och använder klickar rätt i fönstret Trace komma åt 'Assorted-Dump ROI som Text' och vänster Klicka för att spara filen.
  26. Aktiviteten av varje bränning webbplats kan också ritas som en förekomst karta. För att göra detta, använda rätt klick i fönstret film åt ' PTCL åtgärd-ROI Pianola = 10' och Vänsterklicka för att gälla. Detta genererar en tomt på alla bränning webbplatser mot tiden i fönstret tomt. Varje bränning plats visas som en separat färgade enhet, var och en i sin egen ”lane” och dessa tomter motsvarar Ca2 + PTCLs påbörjas under CTCs (figur 4 dE) Spara dessa förekomst kartor vid rätt klickande på dem tillgång till ' STM Ladda Spara - Spara STM som .tif ' och sedan vänster Klicka om du vill spara som TIFF.
  27. För att kvantifiera sannolikheten för bränning på varje bränning plats under en CTC, använda rätt klick i fönstret film åt ' PTCL beteende-märket är = 1' och Vänsterklicka för att gälla. Detta kommer att identifiera alla bildrutor i filmen som innehåller PTCLs över tröskeln och dessa kommer att markeras i botten av fönstret film som vertikala blå linjer.
  28. CTCs manifesteras som snabb klustring av asynkrona bränning från flera sprängplats inom FOV ~ 1 s luckor mellan varje CTC cykel. Denna regelbundenhet och lång lucka på inga aktiva PTCLs mellan CTCs används för att definiera ytterligare en CTC för analys.
  29. Använda rätt klick i fönstret film åt ' PTCL beteende-Block är Gap < =', och använda en rätt klick på den sista punkten för att ange ett nummer. Detta kommando kommer att gruppera aktiva PTCL bildrutorna identifierade i steg 4.28 i block och block är baserade på antalet ramar som separata active PTCLs. För inspelningar av 33 FPS till exempel fungerar ett värde på 10 bra. Om aktiv PTCLS är mindre än 10 bildrutor isär (330 ms) är de grupperade i ett enda block för analys (block visas sedan som rosa rektanglar över de vertikala blå linjerna längst ned i fönstret film med varje rosa rektangel som nu visar en CTC).
  30. Använda klick rätt i fönstret film åt 'PTCL åtgärd-PTCL händelse Prob'. Detta kommer att generera en fil som kan importeras till ett kalkylprogram. Denna textfil tillhandahåller en stor mängd data på arten av de inledande webbplatser som definierades från trappan 4.16 – 4.23 och deras bidrag till CTCs.
    Obs: Textfilen visas antalet inledande webbplatser (benämnd 'domäner'), storleken på webbplatsen i pixlar och μm2, sannolikhet för varje inledande plats bränning antingen en gång eller flera gånger under varje CTC (ges som en %), den genomsnittliga varaktighet och storlek PTCLs inträffar vid den inledande webbplatsen, antalet CTC cykler (som definieras i steg 4.23) och andelen sprängplats som sköt under varje CTC cykel. Denna information samlas in och illustreras i histogram eller andra lämpliga grafiska representationer (figur 4F).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Använda Kit-Cre-GCaMP6F möss (figur 1), dynamisk Ca2 + signalering beteenden av ICC i mag-tarmkanalen kan avbildas på plats. Med konfokalmikroskopi, kan högupplösta bilder av specifika populationer av ICC förvärvas utan att förorena signaler från andra populationer av ICC inom samma vävnaden men i anatomiskt distinkta plan i fokus (figur 2A)37 , 39 , 40 , 41. det är möjligt att spela in korta (< 100 ms), lokaliserad Ca2 + händelser som inte var möjligt med membran genomsläpplig Ca2 + indikatorer. Plats och tid mappningen med Volumetry eller ImageJ programvara kan användas för att generera STM alla Ca2 + händelser inom celler på plats. Använder denna metod, Ca2 + händelser i en hela FOV kan visualiseras och mappas (figur 2BC), snarare än bara inspelning aktiviteten begränsad av en enda ROI. Dessa metoder kan förlängas till varje cell inom en given FOV, säkerställa representativ datainsamling från alla celler och ger kvantitativ information om relativa amplituder, övergående varaktigheter, graden av löneförhöjningen och nedgången av transienter, etc. (figur 2E , F). STM analys, i motsats till ROI-baserad intensitet tomter, ger också möjlighet att övervaka och spela in rumsliga egenskaper hos Ca2 + signalering, såsom rumslig spridning och förökning velocity, som visas i figur 2 g. Denna information kan vara samlat för att ge en ganska komplett bild av Ca2 + signalering beteenden i celler i deras infödda miljöer (figur 2 H).

PTCL analys kan användas för att kvantifiera mer komplexa Ca2 + signalering beteenden, såsom de som förekommer inom sammankopplade mobilnät. Ett exempel på denna ansökan tillhandahålls av analysen utförs på ICC-min (figur 3A). Oftast i sådana komplexa preparat, kan bakgrundsljud och signal för buller vara ett problem. Dock kan använder Volumetry programvara för att använda differential- och utjämnande filter på filmer av Ca2 + aktivitet och sedan tillämpa buller tröskel protokoll att filtrera bort bakgrundsljud brus (figur 3B-D) tas bort från komplexa inspelningar av dynamiska verksamhet. Använda PTCL analys såsom de visas i figur 3E-G, kvantitativ information om Ca2 + kan signalering beräknas genom att mäta PTCL område, PTCL greve och PTCL storlek som indikerar rumsliga spänner av aktivering av Ca2 + signaler i en FOV. Dessa data kan sammanställas som visas i figur 3 H och analyseras statistiskt, så är lämpligt. Figur 4 illustrerar hur PTCL analys tillåter i djup kvantifiering av sub cellulära Ca2 + signalering genom att undersöka platsen och bränning sannolikheter för Ca2 + bränning platser. Genom att fördela PTCLs till olika flaggor baserat på deras temporala egenskaper, inleda PTCLs kan korrekt mappas som visas i figur 4 c-E och en rikedom av hårda data förvärvade på antalet inledande webbplatser (kallas ' domäner), storleken på webbplatsen i pixlar och µm2, sannolikheten för varje inledande webbplats bränning antingen en gång eller flera gånger under varje CTC (ges som en %), den genomsnittliga varaktighet och storleken på PTCLs som förekommer på webbplatsen för initiering, antalet CTC cykler (som definierade i steg 4.23) och % av sprängplats som sköt under varje CTC cykel. Dessa tekniker tillåter en hög nivå av Datamining och kvantifiering avjordbaserad Ca 2 + signaler som inträffar inom en intakt mobilnät som inte är möjligt med ROI-baserade analyser.

Figure 1
Figur 1: Generation av KitGCaMP6f möss. Schematisk bild av hur Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D (GCaMP6f möss) korsades med c-Kit+/ Cre-ERT2 (Kit-Cre möss) för att generera Kit-Cre-GCaMP6f möss. Dessa möss injiceras med tamoxifen på åldrar 6-8 veckor att inducera Cre Recombinase och efterföljande GCaMP6f uttrycket uteslutande i ICC. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Analys av stokastiska Ca2 + signaler i ICC-DMP med plats och tid mappning (STM). (A) representativ bild av flera ICC-DMP från tunntarmen av en Kit-Cre-GCaMP6F mus på plats. En grön ROI anger storlek och riktning av ROI att dra runt en enda ICC-DMP inom FOV att skapa en STM i Volumetry. (B), STM Ca2 + aktivitet i den ICC-DMP markeras i panel A efter det har varit rätt kalibrerad för amplitud, utrymme och tid. (C) samma STM visas i panelen B efter det varit färgkodade med en uppslagstabell (QUBPallete). (D) expanderad bild av ICC-DMP Ca2 + transienter visas på en färg kodade STM, som anger var att rita en linje genom en Ca2 + händelse över dess tidsaxeln (x) att skapa en tomt profil av dess aktivitet i ImageJ. (E) tomt profil av Ca2 + händelsen markeras i panelen D, som visar där raderna som visas vara dras till exakt mått amplituden och varaktigheten av händelsen. (F) tomt profil av Ca2 + händelsen markeras i panelen D, som visar där raderna som visas vara dras till exakt mäta graden av upphov och graden av nedgången av händelsen. (G) expanderad bild av ICC-DMP Ca2 + transienter visas på en färg kodade STM, som anger var att rita en linje genom en Ca2 + händelse över dess utrymme (y) axeln att noggrant mäta dess rumsliga utbredning. (H) representativa histogram av poolade data från ICC-DMP illustrerar hur man grafiskt Visa amplitud, varaktighet och rumslig spridning värden förvärvats från följa stegen ovan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: kvantifiering av CTCs i ICC-MY med partikel baserat analys. (A) representativ bild av en ICC-mitt nätverk från tunntarmen av en Kit-Cre-GCaMP6F mus på plats. (B) bild tagen från inspelningen visas i panel A efter det har genomgått en differentiell filter av Δt = ±66 – 70 ms och Gaussisk filter 1,5 x 1,5 µm, StdDev 1.0. (C) bild tagen från video i B efter tröskelvärde avslutades med PTCLs tröskelvärdet visas i rött. (D) spår av PTCL räkna och menar PTCL storlek i ett tröskelvärde protokoll till eliminera brus i filmen visas i panelen B. PTCLs har skapats med en-Fyll algoritm som markerade strukturen för alla angränsande pixlar som hade stödnivåer tröskelvärdet, Ca 2 + övergående PTCLs var större än buller PTCLs. Tröskeln där ett stort antal små medelstora buller PTCLs uppstod och började att minska den genomsnittliga storleken på PTCLs kan användas som en gemensam tröskel för alla inspelningar. (E) representativ bild från koordinatbaserade Ca2 + PTCL filen skapas från thresholded inspelningen i C. (F) representativ bild tagen från filen PTCL e efter en granskningskriterierna för > 6 µm2 (diameter ~ 2 µm eller mindre) tillämpades; PTCLs ovan denna gräns är flaggad (flagga 1) som ljusa lila partiklar och anses giltiga PTCLs. (G) värmekarta som visar de totala PTCLs (flagga 1) för hela inspelningen av videon visas i panelen F, med totalt PTCLs summated med färger som representerar förekomst hela inspelningen (varma färger indikera ökad förekomst på den platsen). (H) representativa spår av PTCL område (blå) och PTCL räkna (röd) härrör från den PTCL fil som skapas i panel A-G. Representativa histogram av sammanslagna data från flera experiment visas nedan spår. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Analys av Ca2 + bränning platser i ICC-MY med partikel baserat analys. (A) representativ bild tagen från filen PTCL av figur 3E efter flagga 1 PTCLS förädlas vidare till flagga 3, flaggstatus för Ca2 + bränning platser. FLAGGA 3 PTCLs visas som limegrön (endast de PTCLs som inte överlappa med några partiklar i den föregående bildruta utan överlappning med partiklar i nästa 70 ms ansågs sprängplats). (B) värme karta som visar de totala PTCLs (flagga 3) för hela inspelningen av videon visas i panelen A, med totalt PTCLs summeras med färger som representerar förekomsten hela inspelningen (varma färger indikera ökad förekomst på den platsen). (C) representativa karta över Ca2 + bränning platser visas i panelen B, med varje olika bränning plats tilldelas en annan identifierande färg. (D) representativa spår av PTCL område (blå) och PTCL räkna (röd) härrör från den PTCL fil som skapas i figur 3A-G. (E) en förekomst karta av enskilda sprängplats verksamhet. Varje bränning plats inom FOV visas som en färgade block i sin egen ”lane” mot tiden. (F) representativa histogram av sammanslagna data från flera experiment visas illustrera värden ackumulera för Ca2 + bränning webbplats bränning sannolikhet / CTC och antalet Ca2 + förbränner platser i en FOV. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ca2 + avbildning av specifika typer av celler inom intakta vävnader eller inom nätverk av celler ofta avslöjar komplexa mönster av Ca2 + transienter. Denna aktivitet kräver noggrann och djupgående analyser och kvantifiering att fånga så mycket information om bakomliggande händelser och kinetik av dessa händelser som möjligt. STM och PTCL analys ger en möjlighet att maximera mängden kvantitativa uppgifter som framkommit från inspelningar av den här typen.

Smala, spindel formade morfologi av ICC-DMP gör dem väl lämpade för STM analys härrör från de STM som beskrivs ovan. Denna analys är dock inte väl lämpad till ICC-min som är stjärnformade formade och ansluten i ett nätverk (figur 3A). Dessutom är Ca2 + signalering mönstren i ICC-mina mer komplex, manifesterar sig som förökningsmaterial CTCs från flera platser med ursprung i ICC-min nätverket. Således, för att kvantifiera aktivitet som förekommer i hela ICC-mitt nätverk inom en FOV, Partikelanalys (PTCL) genomfördes med hjälp av anpassade gjort programvara (Volumetry, version G8d, GWH, manövreras på Mac OS, kontakta Grant Hennig grant.hennig@med.uvm.edu När det gäller förfrågningar för Volumetry tillgång och användning).

STM analys tillåter alla Ca2 + händelser inom enstaka celler och alla celler i en FOV analyseras kritiskt inom en rad olika rumsliga och tidsmässiga parametrar. Protokollet beskrivs illustrerar hur dessa metoder kan tillämpas på ICC-DMP av mus tunntarmen. Av fullt kvantifiera Ca2 + signalering i ICC-DMP, som visas i figur 2B-G, Ca2 + signalering mönster har präglats i detalj37. Dessa analyser har tillämpats på inspelningar där ICC-DMP genomgår interventioner fint kvantifiera effekterna av blockering eller stimulerande Ca2 + release / Ca2 + tillströmning / neurotransmission vägar37,39 , 40 , 41. dessa tekniker enkelt kan appliceras på andra intakt vävnad preparat. STM analys som beskrivs här har till exempel använts för att identifiera nya mekanistiska vägar inblandade i generation av intracellulära Ca2 + vågor registreras i urinrörets glatt muskulatur i situ57.

Beredning av STM i Volumetry kräver viss försiktighet, eftersom funktionen i Volumetry som skapar STM från dragna ROI (figur 2A) är ett genomsnittligt värde av intensitet. Amplituden av Ca2 + signaler kunde således potentiellt spädas om ROI dras bredare eller längre än Ca2 + händelsen eller cell av intresse. Således, användare bör vara försiktig att dra ROIs, som tätslutande som möjligt till Ca2 + signaler eller viss cell som de analyserar för att lindra problemet är. Likaså skapar STM med enstaka pixel linescans i ImageJ innebär att noggrann kartläggning av Ca2 + händelser omfattas av närheten av Ca2 + signalen till den ritade linjen. Sådana farhågor är mindre i tunn spindeln formade celler såsom ICC-DMP, men andra cell typer med en mer stjärnformade eller rund morfologi kan göra denna typ av analys olämpligt att mappa alla Ca2 + signaler korrekt. När du förbereder STM för analys, oavsett om de var gjorda i Volumetry eller med ImageJ linescans, finns det några områden belysas för felsökning. Det är viktigt att ändra bildkvaliteten till 32-bitars innan utför någon kalibrering på den stm. underlåtenhet att göra detta, eller gör det efter kalibrering för F/F0 kan leda till inkonsekvent mätningar över experiment. Kontrollera alltid bildkvaliteten på STM, som anges i den övre delen av den vita ramen av STM själv när öppnas med ImageJ. En annan potentiellt område av inkonsekvens är att välja F0 -värdet vid kalibrering för amplitud. Det är viktigt att för att välja region för F0, att den täcker en yta av cellen som är enhetlig och i fokus. Av denna anledning delar av cellen som har en instabil basala fluorescens eller som ändras på grund av rörelse eller andra föremål är inte idealiska och rigorösa motion stabilisering protokoll bör användas i dessa fall.

Inom jordbaserad eller odlade preparat som innehåller sammankopplade mobilnät, såsom ICC-mitt i den små inälva, PTCL analysen ger en strömlinjeformad teknik för att kvantifiera komplexa, subcellulär Ca2 + händelser i nätverket. Dessutom kan också alla Ca2 + händelser i nätverket inom en given FOV ska analyseras, snarare än med godtyckliga ROIs, som endast ger information om frekvens och intensitet inom ROI. En fördel med PTCL analysen beskrivs här är att genom att tillämpa differential- och Gaussisk utjämnande filter till inspelningar, en stor mängd buller kan tas bort från filmer som kan innehålla kontaminerande ljus från celler inte av intresse eller på grund av icke-dynamisk ljusa fläckar eller inneslutningar. Det är viktigt att notera att mängden differentiering tillämpas på inspelningar beror till stor del på den förvärv som används av experimenter. Att differentiera filmer som beskrivs i protokollet tillhandahåller ett sätt att tillämpa ett filter på filmen ta bort högfrekvent brus från inspelningar. Tillämpa differentiering värdet '2' när förvärva på 33FPS fungerar väl för att ta bort bakgrundsljud bibehållen bra signal för buller (om värdet är för lågt, buller kommer att plockas upp men signalen för buller kommer att äventyras om värdet är för högt). Differentiering värdet tillämpas bör ökas med snabbare förvärv priser, till exempel vid 100 FPS, differentiering värdet '7' ger ungefär samma signal-brus-förhållande som ett värde för '2' på 33FPS inspelning. Praktiker kommer att behöva optimera inställningarna följaktligen för deras preparat och inspelningsförhållanden.

Tröskelvärde protokollet beskrivs i figur 3D tillåter ett konsekvent tröskelvärde förfarande som skall tillämpas på olika inspelningar som gjorts av olika system med olika förvärv programvara. Denna flexibilitet gör data från flera utredare arbetar på olika system för att sammanställa sina inspelningar i den samma datamängder. Med hjälp av flagga systemet i Volumetry, tillåter PTCL analys visualisering och kvantifiering av enskilda Ca2 + bränning platser inom ett nätverk i detalj. Information kan samlas på antalet inledande platser, storleken på webbplatsen i pixlar och µm2, och den genomsnittliga längden på PTCLs som förekommer på webbplatsen. Denna PTCL analys får första karakterisering av CTC aktivitet i tunntarmen på sub cellnivå, och använder olika flaggorna i Volumetry software, PTCLs på både nätverket och enskilda bränning webbplats nivå kvantifierades i intakt vävnad preparat från Kit-Cre-GCaMP3 möss38. Från dessa inledande observationer, denna analys ytterligare har använts för att studera roman Ca2 + tillströmning vägar i GI ICC-min såsom store-drivs-Ca2 +-intrade42 och rollen av mitokondriell Ca2 + signalering på GI pacemaking 41. mycket som STM analys beskrivs ovan, PTCL analys kan lätt anpassas till olika intakt preparat än de som beskrivs i detta protokoll. Till exempel en nyligen genomförd studie använde PTCL analys för att studera nya rytmiska Ca2 + händelser som inträffar i de intakta mobilnät av lamina propria av råtta urinblåsan58,59 och därmed enkelt kunde appliceras på andra komplexa, intakt cellulära system såsom neuronala system. Medan denna uppsats fokuserar på Ca2 + imaging i intakta vävnader med GECIs, kan dessa analysmetoder också köras på isolerade celler och vävnader laddad med traditionella Ca2 + indikator färgämnen. STM baserat analysen har använts framgångsrikt kvantifiera lokaliserad Ca2 + signaler och Ca2 + vågor från spindeln formade interstitiella celler och glatta muskelceller från en mängd preparat11,60 , 61 , 62 , 63. Dessutom de rutiner för analys av PTCL som beskrivs här har också tillämpat jordbaserad nätverk preparat visualiseras med Cal 52058,59. Dock behålla dessa studier också nackdelarna med sådana dye lastning protokoll som tvetydig cell identifiering och problem med signal till brus.

Exemplen illustreras ovan visar att både STM och PTCL analys är mycket formbara tekniker som kan användas för att kvantifiera komplexa Ca2 + signalering i ett varierat utbud av intakt vävnad preparat. Metoderna som erbjuder många fördelar jämfört med traditionella ROI baserade intensitet skiften som rutinmässigt använts tidigare och bör förse utredare med mer värdefull kvantitativa uppgifter om Ca2 + signalering än tidigare kunde uppnås.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Finansieringen tillhandahölls av NIDDK, via P01 DK41315.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ImageJ software NIH 1.5a ImageJ software
Volumetry GWH Volumetry 8Gd Custom made analysis software
Isoflurane Baxter, Deerfield, IL, USA NDC 10019-360-60
Tamoxifen Sigma T5648
GCaMP6F mice Jackson Laboratory Ai95 (RCL-GCaMP6f)-D
Kit-Cre mice Gifted From Dr. Dieter Saur c-Kit+/Cre-ERT2
Ethanol Pharmco-Aaper SDA 2B-6

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wellman, G. C., Nelson, M. T. Signaling between SR and plasmalemma in smooth muscle: Sparks and the activation of Ca2+-sensitive ion channels. Cell Calcium. 34, (3), 211-229 (2003).
  2. Mironneau, J., Arnaudeau, S., Macrez-Lepretre, N., Boittin, F. X. Ca2+sparks and Ca2+waves activate different Ca2+-dependent ion channels in single myocytes from rat portal vein. Cell Calcium. 20, (2), 153-160 (1996).
  3. Berridge, M. J. Inositol trisphosphate and calcium signalling mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1793, (6), 933-940 (2009).
  4. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. Calcium signalling. Current biology. 9, (5), R157-R159 (1999).
  5. Bootman, M. D., et al. Calcium signalling—an overview. Seminars in Cell & Developmental Biology. 12, (1), 3-10 (2001).
  6. Brain, K. L., Bennett, M. R. Calcium in sympathetic varicosities of mouse vas deferens during facilitation, augmentation and autoinhibition. The Journal of Physiology. 502, (3), 521-536 (1997).
  7. Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1, (1), 11-21 (2000).
  8. Dupont, G., Goldbeter, A. Problems and paradigms: Oscillations and waves of cytosolic calcium: Insights from theoretical models. BioEssays. 14, (7), 485-493 (1992).
  9. Bootman, M. D., Berridge, M. J. The elemental principles of calcium signaling. Cell. 83, (5), 675-678 (1995).
  10. Berridge, M. J., Dupont, G. Spatial and temporal signalling by calcium. Current Opinion in Cell Biology. 6, (2), 267-274 (1994).
  11. Drumm, B. T., et al. The role of Ca 2+ influx in spontaneous Ca 2+ wave propagation in interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. The Journal of Physiology. 593, (15), 3333-3350 (2015).
  12. Bayguinov, P. O., Hennig, G. W., Smith, T. K. Ca 2+ imaging of activity in ICC-MY during local mucosal reflexes and the colonic migrating motor complex in the murine large intestine. The Journal of Physiology. 588, (22), 4453-4474 (2010).
  13. Drumm, B. T., Sergeant, G. P., Hollywood, M. A., Thornbury, K. D., McHale, N. G., Harvey, B. J. The role of cAMP dependent protein kinase in modulating spontaneous intracellular Ca2+ waves in interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. Cell Calcium. 56, (3), 181-187 (2014).
  14. Nathanson, M. H., Padfield, P. J., O’Sullivan, A. J., Burgstahler, A. D., Jamieson, J. D. Mechanism of Ca2+ wave propagation in pancreatic acinar cells. Journal of Biological Chemistry. 267, (25), 18118-18121 (1992).
  15. Straub, S. V., Giovannucci, D. R., Yule, D. I. Calcium wave propagation in pancreatic acinar cells: functional interaction of inositol 1,4,5-trisphosphate receptors, ryanodine receptors, and mitochondria. The Journal of General Physiology. 116, (4), 547-560 (2000).
  16. Sneyd, J., Tsaneva-Atanasova, K., Bruce, J. I. E., Straub, S. V., Giovannucci, D. R., Yule, D. I. A model of calcium waves in pancreatic and parotid acinar cells. Biophysical Journal. 85, (3), 1392-1405 (2003).
  17. Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. Calcium sparks in smooth muscle. American Journal of Physiology. Cell. 278, (2), C235-C256 (2000).
  18. Nelson, M. T., et al. Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks. Science. 270, (5236), 633-637 (1995).
  19. Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks: Elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle. Science. 262, (5134), 740-744 (1993).
  20. Parker, I., Choi, J., Yao, Y. Elementary events of InsP3-induced Ca2+ liberation in Xenopus oocytes: Hot spots, puffs and blips. Cell Calcium. 20, (2), 105-121 (1996).
  21. Diliberto, P. a, Wang, X. F., Herman, B. Confocal imaging of Ca2+ in cells. Methods in Cell Biology. 40, 243-262 (1994).
  22. Martínez-Zaguilán, R., Parnami, G., Lynch, R. M. Selection of fluorescent ion indicators for simultaneous measurements of pH and Ca2+. Cell Calcium. 19, (4), 337-349 (1996).
  23. Hayashi, H., Miyata, H. Fluorescence imaging of intracellular Ca2. The Journal of Pharmacology & Toxicology Methods. 31, (1), 1-10 (1994).
  24. Thomas, D., Tovey, S. C., Collins, T. J., Bootman, M. D., Berridge, M. J., Lipp, P. A comparison of fluorescent Ca2+indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+signals. Cell Calcium. 28, (4), 213-223 (2000).
  25. Lock, J. T., Parker, I., Smith, I. F. A comparison of fluorescent Ca2+indicators for imaging local Ca2+signals in cultured cells. Cell Calcium. 58, (6), 638-648 (2015).
  26. Flagmeier, P., et al. Ultrasensitive Measurement of Ca 2+ Influx into Lipid Vesicles Induced by Protein Aggregates. Angewandte Chemie International Edition. 56, (27), 7750-7754 (2017).
  27. Tsutsumi, S., et al. Structure-Function Relationships between Aldolase C/Zebrin II Expression and Complex Spike Synchrony in the Cerebellum. Journal of Neuroscience. 35, (2), 843-852 (2015).
  28. Rietdorf, K., Chehab, T., Allman, S., Bootman, M. D. Novel improved Ca indicator dyes on the market - a comparative study of novel Ca indicators with Fluo-4. Calcium Signalling: The Next Generation. 590 (2014).
  29. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. Journal of Neuroscience. 32, (40), 13819-13840 (2012).
  30. Seidemann, E., et al. Calcium imaging with genetically encoded indicators in behaving primates. eLife. 5, (2016JULY), (2016).
  31. Su, S., et al. Genetically encoded calcium indicator illuminates calcium dynamics in primary cilia. Nature Methods. 10, (11), 1105-1109 (2013).
  32. Kaestner, L., et al. Genetically encoded Ca2+ indicators in cardiac myocytes. Circulation Research. 114, (10), 1623-1639 (2014).
  33. Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor design. Current Opinion in Chemical Biology. 27, 90-97 (2015).
  34. Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. Deciphering the molecular mechanism responsible for GCaMP6m’s Ca2+-dependent change in fluorescence. PLoS ONE. 12, (2), 1-24 (2017).
  35. Spencer, N. J., et al. Identification of a rhythmic firing pattern in the enteric nervous system that generates rhythmic electrical activity in smooth muscle. The Journal of Neuroscience. 3489 (2018).
  36. Hibberd, T. J., et al. Synaptic Activation of Putative Sensory Neurons By Hexamethonium-Sensitive Nerve Pathways in Mouse Colon. American Journal of Physiology - Gastrointestinal and Liver Physiology. (861), (2017).
  37. Baker, S. A., Drumm, B. T., Saur, D., Hennig, G. W., Ward, S. M., Sanders, K. M. Spontaneous Ca(2+) transients in interstitial cells of Cajal located within the deep muscular plexus of the murine small intestine. The Journal of Physiology. 594, (12), 3317-3338 (2016).
  38. Drumm, B. T., et al. Clustering of Ca2+ transients in interstitial cells of Cajal defines slow wave duration. The Journal of General Physiology. 149, (7), 703-725 (2017).
  39. Baker, S. A., Drumm, B. T., Cobine, C. A., Keef, K. D., Sanders, K. M. Inhibitory Neural Regulation of the Ca2+ Transients in Intramuscular Interstitial Cells of Cajal in the Small Intestine. Frontiers in Physiology. 9, (April), 1-24 (2018).
  40. Baker, S. A., et al. Excitatory Neuronal Responses of Ca 2+ Transients in Interstitial Cells of Cajal in the Small Intestine. eNeuro. 5, (2), (2018).
  41. Drumm, B. T., Sung, T. S., Zheng, H., Baker, S. A., Koh, S. D., Sanders, K. M. The effects of mitochondrial inhibitors on Ca2+signalling and electrical conductances required for pacemaking in interstitial cells of Cajal in the mouse small intestine. Cell Calcium. 72, 1-17 (2018).
  42. Zheng, H., Drumm, B. T., Earley, S., Sung, T. S., Koh, S. D., Sanders, K. M. SOCE mediated by STIM and Orai is essential for pacemaker activity in the interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. Science Signaling. 11, (June), (2018).
  43. Zhu, M. H., et al. A Ca(2+)-activated Cl(-) conductance in interstitial cells of Cajal linked to slow wave currents and pacemaker activity. The Journal of Physiology. 587, (20), 4905-4918 (2009).
  44. Zhu, M. H., Sung, T. S., O’Driscoll, K., Koh, S. D., Sanders, K. M. Intracellular Ca(2+) release from endoplasmic reticulum regulates slow wave currents and pacemaker activity of interstitial cells of Cajal. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 308, (8), C608-C620 (2015).
  45. Zhu, M. H., et al. Muscarinic activation of Ca2+-activated Cl- current in interstitial cells of Cajal. The Journal of Physiology. 589, (Pt 18), 4565-4582 (2011).
  46. Ward, S. M., Burns, A. J., Torihashi, S., Sanders, K. M. Mutation of the proto-oncogene c-kit blocks development of interstitial cells and electrical rhythmicity in murine intestine. The Journal of Physiology. 480, (Pt 1), 91-97 (1994).
  47. Huizinga, J. D., Thuneberg, L., Klüppel, M., Malysz, J., Mikkelsen, H. B., Bernstein, A. W/kit gene required for interstitial cells of cajal and for intestinal pacemaker activity. Nature. 373, (6512), 347-349 (1995).
  48. Ordog, T., Ward, S. M., Sanders, K. M. Interstitial cells of Cajal generate electricial slow waves in the murine stomach. The Journal of Physiology. 518, (1), 257-269 (1999).
  49. Sanders, K. M., Ward, S. M., Koh, S. D. Interstitial cells: regulators of smooth muscle function. Physiological Reviews. 94, (3), 859-907 (2014).
  50. Ward, S. M., McLaren, G. J., Sanders, K. M. Interstitial cells of Cajal in the deep muscular plexus mediate enteric motor neurotransmission in the mouse small intestine. The Journal of Physiology. 573, (1), 147-159 (2006).
  51. Komuro, T. Structure and organization of interstitial cells of Cajal in the gastrointestinal tract. The Journal of Physiology. 576, (3), 653-658 (2006).
  52. Komuro, T. Comparative morphology of interstitial cells of Cajal: ultrastructural characterization. Microscopy Research and Technique. 47, (4), 267-285 (1999).
  53. Sanders, K. M., Ward, S. M., Koh, S. D. Interstitial Cells: Regulators of Smooth Muscle Function. Physiological Reviews. 94, (3), 859-907 (2014).
  54. Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+dynamics in the awake mouse brain. PLoS ONE. 12, (7), e0181113 (2017).
  55. Truett, G. E., Heeger, P., Mynatt, R., Truett, A. A., Walker, J. A., Warman, M. L. Preparation of PCR quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT). BioTechniques. 29, (52), 54 (2000).
  56. The Jackson Laboratory. Available from: https://www2.jax.org/protocolsdb/f?p=116:5:0::NO:5:P5_MASTER_PROTOCOL_ID,P5_JRS_CODE:27076,028865 (2017).
  57. Drumm, B. T., et al. Ca 2+ signalling in mouse urethral smooth muscle in situ role of Ca 2+ stores and Ca 2+ influx mechanisms. The Journal of Physiology. 596, (8), 1433-1466 (2018).
  58. Heppner, T. J., Hennig, G. W., Nelson, M. T., Vizzard, M. A. Rhythmic Calcium Events in the Lamina Propria Network of the Urinary Bladder of Rat Pups. Frontiers in Systems Neuroscience. 11, (December), 1-16 (2017).
  59. Heppner, T. J., Hennig, G. W., Nelson, M. T., May, V., Vizzard, M. A. PACAP38-Mediated Bladder Afferent Nerve Activity Hyperexcitability and Ca 2 + Activity in Urothelial Cells from Mice. Journal of Molecular Neuroscience. 1, (2018).
  60. Griffin, C. S., et al. Muscarinic Receptor Induced Contractions of the Detrusor are Mediated by Activation of TRPC4 Channels. Journal of Urology. 196, (6), 1796-1808 (2016).
  61. Sergeant, G. P., Craven, M., Hollywood, M. A., Mchale, N. G., Thornbury, K. D. Spontaneous Ca2+waves in rabbit corpus cavernosum: Modulation by nitric oxide and cGMP. Journal of Sexual Medicine. 6, (4), 958-966 (2009).
  62. Bradley, E., et al. Novel Excitatory Effects of Adenosine Triphosphate on Contractile and Pacemaker Activity in Rabbit Urethral Smooth Muscle. Journal of Urology. 183, (2), 801-811 (2010).
  63. Drumm, B. T., et al. The effect of high [K + ] o on spontaneous Ca 2+ waves in freshly isolated interstitial cells of Cajal from the rabbit urethra. Physiological Reports. 2, (1), e00203 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics