Microelektrod impalement metod för att spela in membran potential från en kanylerade mellersta cerebral artär

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Det primära målet med denna artikel är att ge information om hur man spelar in membranpotential (Vm) från mitten cerebral artär med hjälp av microelektrod impalement metod. Den kanylerade mellersta cerebral artär är utjämnat för att få Myogenic tonen, och kärl väggen spetsad med hög motstånds kraft mikroelektroder.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Reed, J. T., Sontakke, S. P., Pabbidi, M. R. Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery. J. Vis. Exp. (149), e59072, doi:10.3791/59072 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Membranpotential (Vm) av vaskulär glatt muskel celler bestämmer fartygets ton och därmed blod flödet till ett organ. Förändringar i uttryck och funktion av Jon kanaler och elektrogena pumpar som reglerar Vm i sjukdoms tillstånd kan potentiellt förändra vm, vaskulär ton, och blod flöde. Således är en grundläggande förståelse av elektrofysiologi och de metoder som krävs för att korrekt registrera Vm i friska och sjuka stater är viktiga. Denna metod gör det möjligt att modulera Vm med olika farmakologiska medel för att återställa vm. Även om det finns flera metoder, var och en med sina fördelar och nack delar, ger denna artikel protokoll för att spela in Vm från kanylerade motstånds kärl såsom mellersta cerebral artär med hjälp av microelektrod impalement metod. Mellersta cerebral artärer är tillåtna att få Myogenic tonen i en myograph kammare, och kärl väggen spetsad med hög motstånds kraft mikroelektroder. Vm -signalen samlas in genom en elektrometer, digitaliserad och analyseras. Denna metod ger en noggrann avläsning av Vm av en kärl vägg utan att skada cellerna och utan att ändra membran motståndet.

Introduction

Membranpotentialen (Vm) i en cell refererar till den relativa skillnaden av Jon laddning över plasma membranet och membranets relativa permeabilitet för dessa joner. Vm genereras av differential distribution av joner och upprätthålls av Jon kanaler och pumpar. Jon kanaler som K+, na+och cl bidrar väsentligt till vilande Vm. Vaskulär glatt mus kula tur celler (VSMCs) uttrycka mer än fyra olika typer av K+ kanaler1, två typer av spännings-gated ca2 + kanaler (vgcc)2, mer än två typer av cl kanaler3, 4 för att , 5, butiks driven ca2 + kanaler6, stretch-aktiverade katjonkanaler7,8och elektrogena natrium-kaliumatpas pumpar9 i sina plasma membran, som alla kan vara som är involverade i regleringen av Vm.

Vm av VSMCs beror på lumen tryck. I icke trycksatta kärl varierar Vm från-50 till-65 MV, men i trycksatta arteriella segment, vm varierar från-37 till-47 MV10. Höjning av intravaskulära trycket orsakar VSMCs att depolarisera11, minskar tröskeln för vgcc öppning, och ökar kalcium tillströmningen bidrar till utvecklingen av Myogenic ton12. Tvärtom, i passiva eller icke-trycksatta fartyg, membran hyperpolarisering, på grund av hög K+ kanal aktivitet, kommer att förhindra vgcc från att öppna, vilket resulterar i begränsad kalcium inträde och en minskning av intracellulära kalcium, bidrar till mindre vaskulära tonen13. Således verkar Vm på grund av förändringar i lumen tryck att spela en viktig roll i vaskulär ton utveckling, och både Vgcc och K+ kanaler spelar en avgörande roll i regleringen av Vm.

Vm varierar mellan fartygs typ och art. Vm är-54 ± 1,3 MV i marsvin överlägsna mesenteriala arteriella remsor14,-45 ± 1 MV i råtta mellersta cerebral artärer vid 60 mmHg lumen Tryck12, och-35 ± 1 MV i råtta parenkymal artärer vid 40 mmHg lumen Tryck15. Den vilande Vm registreras i osträckt råtta lymfatisk muskel är-48 ± 2 MV16. Vm av cerebral VSMCs är mer negativ än i perifera artärer. I jämförelse, felint mellersta cerebral artärer rapporterades ha en Vm av cirka-70 MV, medan mesenteriska och kranskärl rapporterades ha-49 och-58 MV, respektive17,18. Skillnader i Vm över kärl bäddar kan återspegla skillnaderna i uttryck och funktion av Jon kanaler och elektrogena natrium-kalium pumpar.

Ökningar och minskningar i Vm kallas membran depolarisation och hyperpolarisering, respektive. Dessa förändringar i Vm spelar en central roll i många fysiologiska processer, inklusive Jon-kanal gating, cellsignalering, muskelkontraktion, och åtgärder potentiella för ökning. Vid ett fast tryck, många endogena och syntetiska vasodilator föreningar som aktiverar K+ kanaler orsaka membran hyperpolarisering, vilket resulterar i vasodilatation1,13. Omvänt, ihållande membran depolarisation är avgörande för agonist-inducerad eller receptor-medierad vasokonstriktion19. Vm är en kritisk variabel som inte bara reglerar ca2 + tillströmning genom vgcc13 men också påverkar utsläpp av ca2 + från interna butiker20,21 och ca2 +-känslighet den kontraktila apparaten22.

Även om det finns flera metoder för att registrera Vm från olika cell typer verkar data som samlats in från mikroelektrodens impalement-metod för kanylerade fartyg vara mer fysiologiska än data från isolerade VSMCs. När det registreras från isolerade VSMC med nuvarande klämma metoder, Vm ses som spontana övergående hyperpolarizations i VSMCs24. Isolerade VSMCs är inte i syncytium, och förändringarna i serien motståndet kan bidra till oscillatoriska beteendet hos Vm. Å andra sidan, oscillatoriska beteende observeras inte när Vm registreras från intakt fartyg, troligen på grund av cell-cell kontakt mellan VSMCs som är i syncytium i artären och summerade hela fartyget leder till en stabil Vm 24. mätningen av Vm från tryck kärl med standard teknik för mikroelektrodlösning är således relativt nära de fysiologiska förhållandena.

Inspelning av Vm från kanylerade fartyg skulle kunna ge viktig information, eftersom vm av vsmcs som är i syncytium är en av de viktigaste bestämnings faktorerna för vaskulär ton och blod flöde, och modulering av vm kan ge ett sätt att vidga eller blod kärlen. Därför är det viktigt att förstå den metod som deltar i inspelningen av Vm. Denna artikel beskriver intracellulär inspelning av Vm från kanylerade mellersta cerebral artärer (MCAS) med hjälp av en microelektrod impalement metod. Detta protokoll kommer att beskriva hur man förbereder MCAs, mikroelektroder, ställa in elektrometern och utföra impalement metoden att spela in Vm. Dessutom diskuteras representativa data, vanliga problem som har uppstått när du använder den här metoden och potentiella problem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hanråttor var inhysta i djur vård anläggningen i UMMC, som är godkänd av föreningen för bedömning och ackreditering av laboratorie djur vård (AAALAC). Djuren hade fri till gång till mat och vatten under hela studien. Djuren bibehölls i en kontrollerad miljö med en temperatur på 24 ± 2 ° c, fuktighets nivåer på 60 – 80% och 12 h ljus/mörker-cykler. Samtliga protokoll godkändes av UMMC ' s djur Vårds-och användnings kommitté.

1. beredning av utrustning

  1. Placera en dubbel kanals differential elektrometerförstärkare (se material tabellen) nära fartygs kammaren och på önskad plats.
  2. Anslut utgången på förstärkarens kanal A eller B till digitizer-kanalens kanal ingång med en BNC-BNC-kabel.
  3. Montera sonden i mikromanipulatorn och placera den nära Mikroskop och myograph. Inspelnings inställningen måste installeras på ett vibrations fritt bord.
  4. Placera rattarna och omkopplare på fram sidan av förstärkaren i positioner som konfigurerar den för detta experiment som beskrivs i manualen.
  5. Anslut badet marken till kretsen marken av förstärkaren via med en lämplig elektrod. På samma sätt, se till att buren är jordad till chassit på förstärkaren.

2. beredning av Mikroelektroder och montering

  1. Använd mikroelektroder av borosilikatglas (se material tabellen) och dra glas spetsen för att ha en 8 – 10 mm Kona, diameter på < 1 μm och motstånd på 80 – 120 MΩ när den fylls med 3 M KCl.
    1. Använd en standard avdragare för att uppnå en kort gradvis avsmalning med följande inställningar: värme = 650; hastighet = 20; pull = 25; tid = 250 och slinga två gånger för högre motstånd och mindre tips. Se material tabellen eftersom inställningarna är instrumentspecifika.
      Anmärkning: Spets diametern < 1 μm vilja orsak minimal skada till cell när spetsad.
  2. Fyll mikroelektroden med 3 M KCl med en mikrofiberspruta (se material tabell).
    1. Dra långsamt kolven på mikrofibersprutan upp medan injicera 3 M KCl i mikroelektroden för att ge utrymme för vätskan att fylla och för att förhindra bildandet av luft bubblor inuti mikroelektroden.
    2. Fyll mikroelektroden tills den är full och säkerställ att det inte finns några luft bubblor innan du placerar den i mikroelektrodhållaren. Om det finns bubblor, Knacka försiktigt på mikroelektroden med ett finger för att ta bort bubblorna.
  3. Utöva vård, tryck hårt elektrod skaftet i hållaren genom det borrade hålet. Om överflödig vätska finns, ta bort den med en vävnad.
  4. Anslut elektrod hållaren till förstärkarens sond. Utför ett elektrod test, justera ingångs förskjutningen, kontrol lera nollinställningen och kontrol lera läckageinmatningsläckage enligt förstärkarens manual.
  5. Mät elektrod motståndet med hjälp av ett elektrod test enligt tabell 1.
  6. Observera att en fungerande elektrod visar en positiv DC-spänningsförskjutning på 1 mV/MΩ vid kanal utgången. Å andra sidan, om en stor spänning visas vid kanalens utgång och på mätaren, indikerar detta en blockerad eller trasig elektrod.
  7. Öppna inspelnings program varan, tilldela ett namn till filen och spara den för framtida analys i en lagrings program vara.

3. isolering och kanylering av mellersta cerebral artär

  1. Beredning av reagenserna.
    1. Bered normal och låg kalcium fysiologisk saltlösning (PSS) enligt beskrivningen i tabell 2.
  2. Förbered myograph.
    1. Skölj myografkammaren (se material tabellen) med destillerat vatten flera gånger för att hålla den fri från skräp. Ladda kammaren med 5 mL normal PSS.
    2. Fyll båda glaskanylerna med filtrerad normal PSS med en 5 – 10 mL spruta. Fyll försiktigt hela kanylen och den bifogade slangen utan att införa några luft bubblor.
    3. Förbered två monofilament nylon suturer (10-0, 0,02 mm) med en halv-Knut vardera med trubbiga pincett.
    4. Placera de delvis slutna suturen knop på båda Kanylerna något bort från spetsen med dissektion pincett under en dissektion Mikroskop. Senare kommer dessa knutar att glida av och knytas försiktigt på de kanylerade arteriella ändarna för att säkra kärlet.
  3. Isolera och kannulate mitten cerebral artär.
    1. Framkalla djup anestesi i en Sprague Dawley råtta genom att använda 2 – 4% inhalerad isofluran.
    2. Hals huggningen råttan med hjälp av giljotinen under djup anestesi.
    3. Ta försiktigt bort skallen med hjälp av en benfräs och en sax.
    4. Ta bort hjärnan från skallen och placera den i 5 mL låg kalcium PSS på is.
    5. Identifiera och dissekera en oförgrenad segment av råtta mellersta cerebral artär (MCA) med en inre diameter på 100 – 200 μm från hjärnan med hjälp av våren sax och pincett.
    6. Montera MCA på glaset Kanylerna med hjälp av fina pincett och säkra genom att dra åt suturer i myograph innehåller normala PSS.
    7. Stäng av den distala kanylen så att det inte blir något flöde inom MCAs.
    8. Anslut inflödes pipetten till en reservoar som håller PSS för att möjliggöra kontroll av intraluminaltryck som kommer att övervakas med en in-line tryck givare.
    9. Visualisera de kanylerade MCA: erna med en laddkopplad enhets kamera (se material tabellen) som är monterad på ett inverterat Mikroskop och ett bild program.
    10. Ställ in den axiella längden av MCA till en ungefärlig längd där det bör visas varken styv eller slapp.
    11. Equilibrate bad lösningen med O2 (95%) och CO2 (5%) vid 37 ° c för att ge adekvat syresättning, temperatur och för att bibehålla pH vid 7,4.
  4. Impale (penetrera cell plasma membranet) de vaskulära glatta muskel cellerna.
    1. Anslut marken elektroden och hålla den nedsänkt i PSS av myograph.
    2. Belysa kärlet kammaren och titta genom Mikroskop för att visualisera spetsen av mikroelektroden i badet lösningen.
      Anmärkning: Alternativt kan man visualisera MCA och microelektrod på en dator med en bild program.
    3. Använd mikromanipulatorernas reglage för att flytta spetsen på mikroelektroden nära blod kärlets yttervägg. Mikromanipulatorn och spetsen på mikroelektroden måste vara i ett stabilt läge i förhållande till vävnaden.
      Anmärkning: Innan du påbörjar experiment, bekräfta att membran spänningen har stabiliserats. Om den uppmätta spänningen är instabil, är anslutningen mellan elektroden och cellen inte förseglad, vilket indikerar en läcka.
    4. Starta inspelningen.
    5. Flytta långsamt spetsen av mikroelektroden mot kärlet, med sikte på mitten av kärlet med hjälp av kursen eller fin kontroll av mikromanipulatorn.
      Anmärkning: Ibland kan en liten deformation i inspelningen observeras när mikroelektroden spetsen kontakter en muskel fiber membran.
    6. När spetsen kommer i närheten av kärlet, avancera elektroden framåt i en snabb rörelse med hjälp av mikromanipulatorn att spetsa membranet i muskeln.
    7. Vid denna punkt kan man börja Observera förändringarna i Vm registreras. Vidrör inte mikromanipulatorn när mikroelektroden spetsar membranet i cellen.
      Anmärkning: Skillnaden i spänning mellan inspelnings-och referens elektroden minskar från 0 mV till mellan-40 mV och-75 mV beroende på nivån av intravaskulär tryck eller andra excitatoriska eller hämmande stimuli. Dessa avläsningar karakteriserar transmembranets potentiella skillnad i den aktuella cellen.
    8. Utför flera impalements på ett enda fartyg i olika områden av fartyget utan att skada VSMCs för att få exakta mätningar.
    9. Efter inspelningen, Använd manipulator för att ta bort mikroelektroden i en snabb rörelse.
    10. Stoppa inspelningen och spara datafiler för ytterligare analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den presenterade metoden kan tillförlitligt användas för att registrera Vm i kanylerade kärl. En kort procedur som beskriver hur man isolerar MCA från hjärnan presenteras i figur 1a. Efter att separera hjärnan från skallen, var MCA dissekera ut och placeras i en petriskål som innehåller låg kalcium PSS. En del av bindväv som bifogats var också dissekeras tillsammans med MCA med hjälp av våren sax och pincett för att förhindra skador på MCA under isoleringen. Försiktigt, bindväv togs också bort, och dissekerades MCA var redo att överföra till myograph. MCA var monterad på Kanylerna och bunden med sutur knop på båda ändar av Kanylerna i myograph. En schematisk representation av en typisk metod för att ställa in mikroelektrodens impalement visas i figur 1b. En mikroelektrod fylld med 3 M KCl var ansluten till elektrometern via en hållare i sonden. Kanal utgången på elektrometern var ansluten till en analog ingångs kanal för en digitizer med hjälp av en BNC-BNC-kabel. Digitizer utdata var ytterligare ansluten till ett oscilloskop för att visualisera signalen i inspelnings program. Marken är etablerad med hjälp av en AgCl pellettråd som förlängdes från chassit av elektrometer till badet lösningen i myograph. Slutligen visualiserades digitala spår i inspelnings programmet på dator skärmen.

MCA inkuberades sedan i nylagad varm PSS och var trycksatt till 60 mmHg. Endast fartyg som får ton användes för Vm -inspelning. Efter att fartyget fått betydande ton, var mikroelektroden avancerade in i kärl väggen. Arteriell diameter och impalement av artären visualiserades med hjälp av video Microscopy. Impalement anses framgångs rik när det finns en snabb nedböjning till negativa värden, Vm är stabil för ≥ 30 s, och spänningen återgår abrupt till 0 MV vid avlägsnande av elektroden som visas i figur 212,15. Våra resultat tyder på att, i ett MCA som är trycksatt till 60 mmHg, Vm är ~-43,2 ± 2,9 MV.

Efter en lyckad impalement och Vm stabilisering, de läkemedel som förändrar vm var parfymerade i badet och förändringar i v m registrerades. Vi använde 20 mm KCl att depolarisera och 20 μM NS1619, en syntetisk stor värmeledningsförmåga kalium kanal öppnare, för att hyperpolarisera membranet. Våra resultat tyder på att per fusion av kammaren med KCl Aricebo membranet med ~ 5,8 ± 0,18 MV. Å andra sidan, per fusion med NS1619 hyperpolarized membranet med ~ 3,8 ± 0,4 mV.

Figure 1
Figur 1: en illustration av isolering av mellersta cerebrala artärer och inspelning av membranpotential med hjälp av microelektrod impalement metod. (A) med hjälp av fjädersax, skär hjärnan eller bindväv längs de streckade linjerna. Överför och montera MCA mellan de två glaskanylerna och säkra den med suturer i myografkammaren fylld med PSS. Ben mikroelektrod fylld med 3 M KCl förs in i hållaren och ansluts till sonden. Förändringar i transmembranpotential resa från sonden till en elektrometer och digitizer via en BNC-kabel (BNC-kabel är ansluten från kanal utgång av elektrometer och till en analog ingång på en digitizer). Den digitaliserade potentialen syns i inspelnings programmet på monitorn. Marken är etablerad med hjälp av en AgCl pellettråd ansluten från elektrometern till badet lösningen i myograph. MCA = mellersta cerebral artär; PSS = fysiologisk saltlösning; AgCl = silverklorid. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: inspelning av membranpotential med hjälp av mikroelektrodens impalement metod från kanylerade mellersta cerebrala artärer. Representativt spår av Vm. Impalement anses framgångs rik om det finns en abrupt avböjning till negativa värden vid elektrod inmatning, Vm är stabil för ≥ 30 s, och spänningen återgår abrupt till 0 MV vid avlägsnande av elektroden. X-axeln representerar tiden och Y-axeln representerar membranpotentialen. Den streckade linjen representerar den justerade bas linjen före fartygets impalement. SEC = sekunder. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: registrering av förändringar i membranpotentialen med hjälp av mikroelektrodens impalement metod när kärlen utsätts för vasoaktiva ämnen. Vm spelades in med hjälp av microelektrod impalement metod från kanylerade mellersta cerebrala artärer före och efter exponering för vasoaktiva medel. Prov spår representerar (a) depolarisering som svar på 20 mm KCl och (b) hyperpolarisering som svar på 20 μM NS1619-en stor värmeledningsförmåga kalium kanal agonist. Csammanfattande stapeldiagram över förändringarna i Vm före och efter applicering av KCl och NS1619. Den streckade linjen representerar vilande Vm. Siffran i parentesen representerar antalet fartyg som använts i studien. Observera att Vm nådde bas linjen så snart läkemedlet tvättas bort. Felstapel representerar medelfelet för medelvärdet. SEC = sekunder. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Inställningar för elektrometer för mätning av elektrod motstånd
Mätarens ingång Kanal A eller B
Växla position I
Mät område Växla till 200 mV
Elektrod I badet
Läge Arbeta med elektrod test
Mätarens indikation 1 mV/MΩ

Tabell 1: inställningar för elektrometer för mätning av elektrod motstånd.

Kemikalier låg kalcium PSS mM Normal PSS mM Företag Katalog
1 Nacl 119,00 119,00 Sigma S7653
2 KCl 4,70 4,70 Sigma P4504
3 MgSO4 1,17 1,17 Sigma M7506
4 CaCl2 0,05 1,60 Sigma C3881
5 HEPES 5,00 5,00 Sigma H7006
6 Glukos 10,00 10,00 Sigma G7021
7 2Po4 1,18 1,18 Sigma S0751
8 NaHCO3 18,00 18,00 Sigma S5761
pH: 7,4 pH: 7,4

Tabell 2: reagenser som används vid beredning av låg kalcium halt och normal fysiologisk saltlösning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denna artikel innehåller de nödvändiga stegen för hur man använder en skarp microelektrod impalement metod för att registrera Vm från en kanylerade kärl beredning. Denna metod används i stor utsträckning, och erbjuder högkvalitativa, konsekventa inspelningar av Vm som svarar på ett brett spektrum av experimentella frågor.

Vissa kritiska överväganden och fel söknings steg beskrivs här för att säkerställa att metoden lyckas. Kvaliteten på mikroelektroden (dess skärpa och motstånd) och den cellulära processen det tränger påverka stabiliteten och noggrannheten av Vm. Om signalen kontinuerligt driver eller är över eller under förstärkarens inspelnings intervall är det troligt att elektroden är blockerad eller att spetsen är trasig. Om impalmenten endast är partiell, otillräcklig eller skadar cellen, klättrar den inspelade potentialen tillbaka till 0 mV vilket resulterar i en instabil signal eller ingen signal. I vissa fall kan innehållet i cellen också blockera mycket hög motstånds elektrod. Alla dessa problem kan övervinnas genom att bara ersätta elektroden med en ny.

För lyckad impalement, måste man se till att det totala motståndet i cell membranet är oförändrad, och den uppmätta membranpotentialen är stabil utan läckor mellan elektroden och membranet. Det är viktigt att elektroden är avancerad mot cellen av en stabil mikromanipulator. När de är avancerade till inom några få mikrometer i cellen, kommer spets potentialen förändras vilket resulterar i en lätt deformation i den upptäckta spänningen. För att undvika att skada spetsen av elektroden eller stretching av cell membranet, krävs snabb utveckling av elektroden. Framgångs rik impalement kännetecknas av en snabb minskning av membranpotential följt av en stabilisering runt vilopotentialen av membranet. Om den potentiella behandlingen fluktuerar, är det möjligt att spetsen på elektroden har stört membranet som orsakar natrium att läcka in i cellen och kalium för att läcka ut ur cellen, vilket resulterar i progressiv depolarisering. Ett annat problem i denna metod är att Knut potentialer och elektrod spets potentialer kan lägga till en onödig artefakt till Vm inspelningen. Knut potentialer uppstår när olika ledare kommer i kontakt. Det finns två olika typer av Knut potentialer, flytande-metall, och flytande-vätska. Vätske-metall korsningar bildas när spetsen av sonden kontakter elektrolyten i mikropipett. Flytande-flytande korsningar, även kallad vätska Knut punkt potential, uppstår när två lösningar av varierande koncentrationer kommer i kontakt. Diffusionen av jonerna mellan lösningarna bidrar till utvecklingen av potentialen. Dessutom kan egenskaperna hos glas elektrod spetsen interagerar med vätska generera spets potentialer. För att minimera korsningen och spets potentialer, nollning den uppmätta potentialen i badet kan minska oönskade bias. Under impalement, kan man inte utesluta möjligheten att endothelial, snarare än glatt mus kula tur, kunde Vm oavsiktligt provtas i vissa experiment. Emellertid, studier visar att endotel och VSMC lagren är elektriskt kopplade i små arterioler och uppvisar liknande Vm svar23.

I ändan är tre steg i denna process avgörande för att uppnå framgångs rika inspelningar. För det första måste fartygen vara korrekt för beredda och se till att de inte skadas i processen. För det andra måste mikroelektroder dras till rätt elektriska egenskaper. Slutligen, snabb impalement av membranet utan att bryta spetsen är avgörande för korrekta resultat. Utredaren måste förstå elektrofysiologi, hur man skapar livskraftiga mikroelektroder, och hur man ställer in och använder en elektrometer.

Trots dess betydelse har denna metod olika begränsningar. Först, den sammanlagda kostnaden för att anskaffa all utrustning är hög (~ $30-40000). För det andra behövs det nya fartyg för alla dessa experiment. därför ett djur är euthanized för varje experiment, lägga till den totala kostnaden. För det tredje, dissektion av cerebrala artärer, kanylering av fartygen är tråkigt, dyrt och har en inlärnings kurva. För det fjärde, förbereder mikroelektroder, impalement, och inspelning Vm kräver en grundlig förståelse av elektrofysiologi. Slutligen, för att etablera denna inrättas i labbet kräver dedikerad personal, tid och ansträngning.

Vm är en essentiell Elektrofysiologisk egenskap som bestämmer den vaskulära tonen och därmed blod flödet till ett organ. Vm kan ändras av flera vasoaktiva kemikalier som frigörs från nerv celler, endotel och blod komponenter. Medan vasoconstrictors depolarisera membranet, plast stavar hyperpolarisera membranet. Flera proteiner inklusive K+ kanaler, vgcc, natrium kalium ATPas, ca2 + ATPas, cl- kanaler, lagra-operated och stretch kanaler reglera Vm. Förändringar i något av dessa proteiner i sjukdoms tillstånd kan potentiellt förändra Vm och därmed vaskulär ton och blod flöde. Den microelektrod impalement metoden är användbar för att registrera vila samt förändringar i Vm som svar på vasoconstrictors och dilators. Så, denna metod skulle kunna användas på ett tillförlitligt sätt för att förstå normala och förändrade Vm i samband med sjukdom, och kan vara användbara vid utveckling av farmakologiska medel för att modulera Vm, vaskulär ton och blod flöde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes delvis av bidrag från det intramural stöd forsknings programmet (IRSP) från UMMC, AHA Scientist Development Grant (13SDG14000006) tilldelas Mallikarjuna R. Pabbidi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser Parkland scientific V3000PK
Dissection microscope Nikon Instruments Inc., NY Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575 Harvard Apparatus, MA 73-198
Littauer Bone Cutter Fine science tools 16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps Fine science tools 11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt Fine science tools 14008-14
Suture Harvard Apparatus 72-3287
Vannas Spring Scissors Fine science tools 15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera Qimaging, , BC Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier WPI FD223A
In-line pressure transducer Harvard Apparatus, MA MA1 72-4496
Micromanipulator Thor labs PCS-5400
Microelectrodes Warner Instruments LLC, CT G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe) WPI MF28G67-5
Microelectrode holder WPI MEH1SF
Myograph Living Systems Instrumentation, VT CH-1-SH
Puller Sutter Instrument, San Rafael, CA P-97
Vibration-free table TMC 3435-14
Softwares
Clampex 10 Molecular devices
p Clamp 10 Molecular devices
Imaging software Nikon, NY NIS-elements
Chemicals
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P4504
MgSO4 Sigma M7506
CaCl2 Sigma C3881
HEPES Sigma H7006
Glucose Sigma G7021
NaH2PO4 Sigma S0751
NaHCO3 Sigma S5761

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nelson, M. T., Quayle, J. M. Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle. American Journal of Physiology. 268, C799-C822 (1995).
  2. Hughes, A. D. Calcium channels in vascular smooth muscle cells. Journal of Vascular Research. 32, (6), 353-370 (1995).
  3. Large, W. A., Wang, Q. Characteristics and physiological role of the Ca(2+)-activated Cl- conductance in smooth muscle. American Journal of Physiology. 271, (2 Pt 1), C435-C454 (1996).
  4. Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. Journal of Physiology. 502, (Pt 2), 259-264 (1997).
  5. Yamazaki, J., et al. Functional and molecular expression of volume-regulated chloride channels in canine vascular smooth muscle cells. Journal of Physiology. 507, (Pt 3), 729-736 (1998).
  6. Gibson, A., McFadzean, I., Wallace, P., Wayman, C. P. Capacitative Ca2+ entry and the regulation of smooth muscle tone. Trends in Pharmacol Sciences. 19, (7), 266-269 (1998).
  7. Davis, M. J., Donovitz, J. A., Hood, J. D. Stretch-activated single-channel and whole cell currents in vascular smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 262, (4 Pt 1), C1083-C1088 (1992).
  8. Setoguchi, M., Ohya, Y., Abe, I., Fujishima, M. Stretch-activated whole-cell currents in smooth muscle cells from mesenteric resistance artery of guinea-pig. Journal of Physiology. 501, (Pt 2), 343-353 (1997).
  9. Shelly, D. A., et al. Na(+) pump alpha 2-isoform specifically couples to contractility in vascular smooth muscle: evidence from gene-targeted neonatal mice. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286, (4), C813-C820 (2004).
  10. Coca, A., Garay, R. Ionic Transport in Hypertension New Perspectives. Taylor & Francis. (1993).
  11. Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circulation Research. 55, (2), 197-202 (1984).
  12. Knot, H. J., Nelson, M. T. Regulation of arterial diameter and wall [Ca2+] in cerebral arteries of rat by membrane potential and intravascular pressure. Journal of Physiology. 508, (Pt 1), 199-209 (1998).
  13. Nelson, M. T., Patlak, J. B., Worley, J. F., Standen, N. B. Calcium channels, potassium channels, and voltage dependence of arterial smooth muscle tone. American Journal of Physiology. 259, C3-C18 (1990).
  14. Harder, D. R., Sperelakis, N. Action potentials induced in guinea pig arterial smooth muscle by tetraethylammonium. American Journal of Physiology. 237, (1), C75-C80 (1979).
  15. Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 300, (3), H803-H812 (2011).
  16. Yvonder Weid, P., Lee, S., Imtiaz, M. S., Zawieja, D. C., Davis, M. J. Electrophysiological properties of rat mesenteric lymphatic vessels and their regulation by stretch. Lymphatic Research and Biology. 12, (2), 66-75 (2014).
  17. Harder, D. R. Comparison of electrical properties of middle cerebral and mesenteric artery in cat. American Journal of Physiology. 239, (1), C23-C26 (1980).
  18. Harder, D. R. Heterogeneity of membrane properties in vascular muscle cells from various vascular beds. Federation Proceedings. 42, (2), 253-256 (1983).
  19. Cogolludo, A., et al. Serotonin inhibits voltage-gated K+ currents in pulmonary artery smooth muscle cells: role of 5-HT2A receptors, caveolin-1, and KV1.5 channel internalization. Circulation Research. 98, (7), 931-938 (2006).
  20. Ganitkevich, V., Isenberg, G. Membrane potential modulates inositol 1,4,5-trisphosphate-mediated Ca2+ transients in guinea-pig coronary myocytes. Journal of Physiology. 470, 35-44 (1993).
  21. Yamagishi, T., Yanagisawa, T., Taira, N. K+ channel openers, cromakalim and Ki4032, inhibit agonist-induced Ca2+ release in canine coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 346, (6), 691-700 (1992).
  22. Okada, Y., Yanagisawa, T., Taira, N. BRL 38227 (levcromakalim)-induced hyperpolarization reduces the sensitivity to Ca2+ of contractile elements in caninse coronary artery. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 347, (4), 438-444 (1993).
  23. Xia, J., Little, T. L., Duling, B. R. Cellular pathways of the conducted electrical response in arterioles of hamster cheek pouch in vitro. American Journal of Physiology. 269, (6 Pt 2), H2031-H2038 (1995).
  24. Jaggar, J. H., Porter, V. A., Lederer, W. J., Nelson, M. T. Calcium sparks in smooth muscle. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 278, (2), C235-C256 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics