Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes-transformação mediada de batata e a atividade de promotor de um Gene de suberina por GUS Staining

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Summary

Aqui, apresentamos dois protocolos para transformar plantas de batata. A transformação de Agrobacterium tumefaciens leva a uma planta transgénica completa enquanto o Agrobacterium rhizogenes produz raízes peludas transgênicas em uma selvagem tipo de fotos que podem ser propagados Self. Nós então detectar atividade de promotor por GUS coloração nas raízes transformadas.

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Fernández-Piñán, S., López, J., Armendariz, I., Boher, P., Figueras, M., Serra, O. Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. J. Vis. Exp. (145), e59119, doi:10.3791/59119 (2019).

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Abstract

Agrobacterium SP. é um dos métodos mais utilizados para obter plantas transgênicas, pois tem a capacidade de transferir e integrar sua próprias T-DNA no genoma da planta. Aqui, apresentamos dois sistemas de transformação para modificar geneticamente as plantas de batata (Solanum tuberosum). Na transformação da . tumefaciens , folhas são infectadas, as células transformadas são Selecionadodas e uma nova planta completa de transformada é regenerada usando fitohormônios em 18 semanas. Na transformação da . rhizogenes , hastes estão infectados por injetar a bactéria com uma agulha, as novas raízes peludas surgiu transformadas são detectadas usando um marcador fluorescente vermelho e as raízes não-transformadas são removidas. Em 5-6 semanas, a planta resultante é um composto de um tiro de tipo selvagem com raízes peludas transformados totalmente desenvolvidos. Para aumentar a biomassa, as raízes peludas transformadas podem ser extirpadas e self propagadas. Nós aplicamos os dois métodos de transformação Agrobacterium -mediada para obter raízes expressando o gene repórter GUS impulsionado por um promotor do gene biossintética de suberina. O procedimento de coloração GUS é fornecido e permite a localização de célula da indução promotor. Em ambos os métodos, as raízes de batata transformada mostraram GUS coloração na cor endoderme e exoderme e além disso, em raízes de a. rhizogenes transformou a atividade de GUS também foi detectado o surgimento de raízes laterais. Estes resultados sugerem que a. rhizogenes pode ser uma ferramenta rápida alternativa para estudar os genes que são expressos em raízes.

Introduction

Além de interesse econômico, a geração de plantas transgênicas tem sua própria relevância na pesquisa para demonstrar a função final dos genes e para entender melhor a fisiologia vegetal e desenvolvimento. O mais amplamente utilizado método para inserção de DNA de plantas é Agrobacterium-mediado transformação. Agrobacterium tumefaciens é capaz de gerar coroa galhas em muitas espécies de plantas, o tecido infectado pela ação do seu do plasmídeo indutor de tumor (Ti). O plasmídeo contém uma região de T-DNA com um conjunto de genes que será integrado no genoma da planta e induzir o tecido quê1,2. A troca destes genes dentro do T-DNA pelo transgene permitiu a geração de modificações específicas planta evitando efeitos fenotípicos3. Para facilitar o transgene clonagem no T-ADN, a região de T-DNA tem sido retirada em um plasmídeo independente chamado um plasmídeo de binário, enquanto o resto dos genes do plasmídeo Ti (os genes de virulência que permitem que os mecanismos de transferência e inserção de T-DNA) têm sido colocadas em um plasmídeo ajudante. Para pesquisa de biotecnologia de plantas, transformação pela . tumefaciens tem várias vantagens: não necessita de dispositivos caros, é capaz de gerar tanto transformação planta estável e transitória e baixo número de cópias são integradas de gene a cromossoma4. No entanto, para a maioria das plantas, mas não de Arabidopsis, a geração de transformants estável requer regeneração de plantas de uma única ou algumas células usando fitohormônios exógenos, tornando este processo trabalhoso e demorado. A. rhizogenes também é capaz de modificar o genoma da planta, produzindo raízes peludas ou adventícias raízes dos locais de infecção devido a expressão de genes de rol (raiz loci) codificado na raiz de indução (Ri) do plasmídeo5. Embora menos estudado do que a. tumefaciens, a. rhizogenes também é usado para a obtenção de raízes transgénicas. Neste caso, a a. rhizogenes contém o T-DNA original no plasmídeo Ri e um plasmídeo binário com um segundo T-DNA carregando o transgene. Quando o local de infecção é em hastes ou hipocótilo, uma planta composta pode ser obtida, com novas raízes transgénicas peludas emergentes de rebentos de tipo selvagem. Alternativamente, raízes transformadas peludas podem crescer autonomamente em vitro na mídia com entradas de fonte de carbono. O uso de a. rhizogenes em vez de a. tumefaciens para produzir tecidos transgênicos está ganhando relevância quando a raiz é o órgão-alvo, porque a regeneração da planta não é necessária e, portanto, é mais rápido e menos dispendioso. Estudos anteriores têm demonstrado esta metodologia apropriada para a caracterização fenotípica de raiz genes específicos6,7,8,9.

A batata (Solanum tuberosum) é a quarta mais importante colheita no mundo de acordo com a organização a alimentação e agricultura das Nações Unidas (FAO) desde que o tubérculo tem relevância nutricional para consumo humano, por ser uma boa fonte de vitaminas e minerais. Por esse motivo, a batata foi colocada no centro do atenções da biotecnologia agrícola e também é considerada como um bom modelo biológico para genética e do desenvolvimento de estudos de10,11. Transformação de batata contribuiu significativamente para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes tecidos cor através da caracterização de genes envolveram em suberina e cera biossíntese12,13,14 ,15,16,17, suberina monômero transporte18 e transcrição Regulamento19. Gene da suberina feruloyl transferase, FHT, é um destes genes biossintéticos caracterizadas; seu downregulation dá origem a um forte comprometimento da proteção periderme, que está correlacionado com uma forte diminuição em ésteres Ferulato de suberina e ceras em tubérculos de batata14. Concomitantemente, nas raízes e sementes de Arabidopsis, o nocaute do seu putativo orthologue (ASFT/RWP1), também demonstrou seu papel na produção de ferulates de alquila em suberina20,21. Na batata, a linha de repórter transcriptional FHT e o anticorpo FHT mostraram respectivamente que a atividade de promotor e a proteína estão localizados na exoderme, a endoderme, os felogênio-derivados e em tecidos feridos,15.

Neste trabalho, detalhamos um protocolo utilizando a. rhizogenes para produzir transgênicas raízes peludas que são mantidas em uma sessão do tipo selvagem, gerando plantas de batata composto ou extirpado para crescer autonomamente em vitro. Nós também fornecemos o protocolo utilizando a. tumefaciens para obter plantas de batata transgénica completa. Como um estudo de caso, a. rhizogenes e a. tumefaciens transformada com o vetor binário mesmo são usados para obter as raízes com o promotor FHT dirigindo a expressão do gene repórter GUS . Os resultados são relatados e comparados.

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Protocol

O protocolo de transformação a. rhizogenes foi adaptado e modificado de Horn et al.7 e o genótipo testado foi S. tuberosum ssp. tuberosum (CV Désirée). O protocolo de transformação da . tumefaciens foi adaptado e modificado de Banerjee et al.22 e os genótipos testados foram S. tuberosum ssp. tuberosum (CV Désirée) e S. tuberosum SSP. andigena. As principais etapas de ambos os procedimentos são resumidas na Figura 1 e Figura 2, respectivamente.

Nota: Em todas as etapas do procedimento de realizar transferências em vitro , fazê-lo rapidamente e quando possível, manter as placas ou vasos fechados, minimizando assim a exposição da planta ao ar para evitar contaminação e murcha. Contrário, toda a incubação do planta foram feitas em armários sob as condições de 12 h de 24 ° C luz/12 h de 20 ° C escuro e 67 µmol m-1 s-1. Contrário, realize todas as bactérias e manipulação em vitro planta transferências em condições assépticas numa vizinhança de fluxo laminar. Todas as receitas de mídia para culturas de plantas de Agrobacterium e in vitro são fornecidas na Tabela S1.

Atenção: Deposite todas as bactérias geneticamente modificadas e as plantas para o recipiente de resíduos adequado.

1. culturas de Agrobacterium usadas para transformação

Nota: A tensão usada para a transformação da. rhizogenes foi o C58C1:Pri15837 (gentilmente cedido pelo Dr. Inge Broer) e para a a. tumefaciens foi o GV2260 (gentilmente cedido pelo Dr. Salomé Prat). A. rhizogenes foi transformada com o vetor binário PK7GWIWG2_II-RedRoot (VIB-departamento de biologia de sistemas planta na Universiteit Gent; http://gateway.psb.ugent.be) que contém um T-DNA carregando um marcador de transformação para monitorar a raiz pilosa formação. Para comparar as raízes transformadas geradas pela . rhizogenes e a. tumefaciens, ambos foram transformados com o vetor binário pKGWFS7 que contém um T-DNA carregando o promotor FHT dirigindo o gene repórter β-glucoronidase (GUS) e o gene de resistência de canamicina como um marcador selecionável de15.

  1. Escolher uma colônia de Agrobacterium e cultivá-la durante a noite (O/N) em 5 mL de meio YEB suplementado com antibióticos (Tabela S1) num tubo de centrífuga de 50 mL a 28 ° C com agitação a 200 rpm.
  2. Para a transformação da . tumefaciens , medir a densidade óptica, o que deve ser OD600 = 0.6-1.0.
    1. Se a densidade óptica é mais elevada, fazer uma subcultura abaixá-la para OD600 = 0.3 com mídia fresca e espere até que a cultura atinja OD600 = 0,6-1.
  3. Centrifugar 1 mL da cultura de Agrobacterium a 3.000 x g em uma centrífuga de bancada para 10 min à temperatura ambiente.
  4. Remover o sobrenadante por pipetagem e ressuspender as células em 1 mL de meio fresco de YEB sem antibióticos. Repita esta etapa para assegurar a remoção completa dos antibióticos.
    1. Para a transformação da . tumefaciens , no último ressuspensão adicionar o volume apropriado de YEB para obter uma densidade óptica final de OD600 = 0,8.
  5. Manter as células no gelo enquanto prepara as plantas para ser infectado.

2. material para a transformação da planta

  1. Fazer um ou dois nó estaquia também contendo o apical ou os botões auxiliares de estéril em vitro batata plantas (doador); cultivá-las em meio sólido 2MS em uns potenciômetros para 3 a 4 semanas (figura 1A e Figura 2A).

3. planta de transformação usando a. rhizogenes (Figura 1)

Nota: Este procedimento permite a obtenção de raízes peludas transformadas. Para avaliar a expressão do transgene, é necessário um controlo negativo. Para preparar o controlo negativo, siga o procedimento utilizando uma cepa da . rhizogenes unlit ou transformada com o vetor vazio que inclui o gene marcador de transformação.

  1. Usar placas de mídia fresco; Alternativamente, as placas podem ser mantidas a 4 ° C, com a tampa para cima, firmemente seladas com película transparente para evitar a desidratação de mídia. Para preparar os pratos quadrados mídia, inclinai-los ~ 15°, enchê-lo com 40 mL de MS e deixar solidificar. Isto irá minimizar o contato da parte aérea da planta com o meio.
  2. Transferência de cuidadosamente uma planta doadora do meio de 2MS para uma placa quadrada de 120 x 120 mm.
  3. Injetar a um haste entrenó 3 μL da cultura a. rhizogenes usando uma agulha cirúrgica e repeti-lo duas vezes por planta em diferentes entrenós quando possível.
    Nota: Considere cada injecção como um evento de transformação independente (figura 1B).
  4. Transferi imediatamente a planta inteira para uma placa quadrada com sólido MS suplementado com 0,1 mM acetosyringone. Acomodar 2 plantas por placa.
    Nota: A solução 1 M acetosyringone é preparada em DMSO e pode ser armazenada a-20 ° C.
  5. Selar a placa usando fita cirúrgica e organizá-lo verticalmente dentro de um armário de crescimento por 4 dias.
  6. Transferi a fábrica para uma nova placa quadrada com MS suplementado com cefotaxima sódio [500 µ g/mL] para matar a. rhizogenes.
  7. Depois de 10-12 dias, peludas raízes começarão aparecer (Figura 1,1D). Em seguida, excisar as raízes nativas da planta e transferir a fábrica para uma nova placa quadrada com MS suplementado com cefotaxima sódio [500 µ g/mL].
    Nota: Raízes peludas transformadas podem ser verificadas por fluorescência vermelha quando usando um marcador DsRed de transformação (Figura 3D).
  8. Para obter uma planta composta (Figura 1E), deixe as raízes transgénicas peludas crescer por 3-4 semanas em MS suplementado com cefotaxima sódio [500 μg/mL] (mudar o médio toda semana).
  9. Dependendo da finalidade, propaga as raízes transgénicas peludas e os controles negativos como segue.
    1. Transferi a planta inteira composta para uma hidropônico (Tabela S2) ou média de solo para permitir o desenvolvimento maciço.
    2. Para propagar individualmente as raízes peludas transformadas, usar um bisturi corta as raízes expressando o marcador vermelho fluorescente transformação (proteína DsRed) quando eles são 4-8 cm de comprimento (Figura 1E) e transferi-los para uma placa de Petri com meio sólido de Gamborg B5 suplementado com 2% de sacarose e cefotaxima sódio [500 μg/mL]. Selar as placas com película de plástico de laboratório e cultivá-las no escuro a 20 ° C.
      Nota: As raízes podem ser manipuladas sob um microscópio estereoscópico equipado para detectar a fluorescência sob condições estéreis (ver Tabela de materiais).
    3. Para a produção de biomassa (ou seja, análise de expressão do gene), cortar uma raiz muito peludo de 5cm e propagá-la em um Erlenmeyer de 150 mL com 20 mL de meio líquido de Gamborg B5 suplementado com 2% de sacarose e cefotaxima sódio [500 µ g/mL]. Cultivá-la por 6 semanas no escuro a 20 ° C e 60 rpm.

Figure 1
Figura 1: Linha do tempo para obter batata transgênicas raízes peludas usando a. rhizogenes. As semanas cumulativas para alcançar cada etapa do processo de transformação e as etapas subsequentes para crescer as raízes peludas são mostradas. Imagens representativas das diferentes fases são descritas: a iniciação do processo usando 3 semanas em vitro de plantas (A), em seguida de infecção das plantas injetando a. rhizogenes (B), a formação da proliferativa tecido (C, setas) com raízes peludos emergentes (D) e as raízes peludas desenvolvidas expressando o marcador vermelho fluorescente transformação DsRed (E). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. plante transformação usando a. tumefaciens (Figura 2)

Nota: Este procedimento permite a obtenção de plantas transformadas. Para avaliar efeito do transgene, é necessário um controlo negativo. Uma opção é seguir o procedimento usando um a. tumefaciens transformada com o vetor vazio. Alternativamente, podem ser usadas plantas tipo selvagem.

  1. Corte e coloque uma folha das plantas de 3-4 semana de idade (Figura 2A) em uma placa de Petri. Usando um bisturi excluir o pecíolo e fazer cortes transversais (1-3, dependendo do tamanho da folha) no centro da folha para as bordas, evitando cortá-los (Figura 2B).
  2. Coloque a folha a flutuar em 10 mL de 2MS fresco media líquidos em uma placa de Petri com o lado abaxial imediatamente e fechar a chapa. Repita a etapa, acomodando até 15 folhas para CV Désirée e 25 folhas para SSP. umndigena (dependendo do tamanho da folha).
  3. Imediatamente adicione 80 µ l da . tumefaciens cultura no OD600 = 0,8 nos meios líquidos e homogeneizar a placa manualmente durante 1 min distribuir a solução bacteriana.
  4. Cuidadosamente com filme de vedação do selo, cubra com papel alumínio e incubar durante dois dias em uma câmara de 24 ° c e deixe a transformação ocorrer.
  5. Transfira as folhas mantendo lado abaxial até meio CIM (Figura 2B) e incube-os por uma semana em um armário de crescimento.
    1. Raspe o meio CIM com a pinça para que as folhas podem ser melhor acomodadas na mídia.
  6. Transfira as folhas mantendo lado abaxial até meio SIM (Figura 2) e incube-os em um armário, refrescando o meio cada 7-10 dias, até que os brotos são cerca de 2 cm de altura de crescimento.
    1. Raspe o meio SIM com a pinça, para que as folhas podem ser totalmente cercadas pela mídia. Quando os brotos surgiu alcançar a tampa, trabalho com altos pratos de Petri (100 x 20 mm, altura x diâmetro).
      Nota: Os calos formarão após 2-3 semanas SIM médio (Figura 2D) e os brotos após 6-7 semanas (Figura 2E). Os brotos serão considerados eventos de transformação independente quando eles emergem do calo, formado a partir de feridas independentes.
  7. Corte três tiros surgiu do cada calo (considerado o mesmo evento de transformação) (Figura 2E), transferência para frascos de cultura com meio MG suplementados com cefotaxima sódio [250 mg/L] para permitir a torcer, rotular o subconjunto com um número e incube em um crescimento do armário para 3-4 semanas ou até que os brotos são vigorosas (Figura 2F).
    Nota: Ao cortar os brotos, remova bem o calo senão que não formará a raiz.
    1. Repita o passo tantas vezes quantas linhas independentes são necessários. Até 5 transformação diferentes eventos podem ser colocados em um frasco de cultura com um diâmetro de 8 cm para trabalhar em plena confiança que as plantas de eventos diferentes não se misturam.
  8. Selecione a planta mais vigorosa de cada evento, cortar o segmento apical das filmagens com 3-4 entrenós e colocá-lo em um novo frasco de cultura com 2 MS suplementado com cefotaxima sódio [250 mg/L].
    Nota: Em 3-6 semanas que a planta crescerá com eficiência, desenvolvendo um broto vigoroso e raízes.
    1. Trazer de volta para a câmara os brotos não selecionado até que a planta selecionada desenvolveu-se plenamente.
  9. Cortar segmentos de caule da planta pelo menos um entrenó ou com o broto apical e transferi-los para nova 2 MS suplementado com cefotaxima [250 mg/L]. Incube-os no crescimento do armário.
    1. Replica a cada 3-4 semanas para estabelecer as linhas em vitro transformado.
      Nota: O sódio cefotaxima é necessária pelo menos três transferências subsequentes a 2MS médio para ter a certeza para matar a a. tumefaciens; Depois, se supercrescimento da . tumefaciens é observado, transferi as plantas novamente para mídia de 2 MS suplementada com sódio de cefotaxima.
  10. Para caracterizar o fenótipo da planta, transferir as plantas ao solo para a sua caracterização completa ou a cultura de hidroponia para inspeção de raiz.
    1. Manter os tubérculos produzidos no solo para propagar e manter as linhas estabelecidas.

Figure 2
Figura 2: Linha do tempo para obter batata transformou plantas usando a. tumefaciens. As semanas cumulativas para alcançar cada etapa do processo de transformação e as etapas subsequentes para crescer as plantas são mostradas. Imagens representativas dos diferentes estágios são descritas: o início do processo, usando folhas de plantas em vitro 3 semana de idade (A), a transferência dos feridos e infectados deixa para a mídia CIM (B), as folhas quando transferido para SIM media (C), a visualização do calo em torno das áreas feridos após 2-3 semanas na mídia (D) SIM, a formação de tiro depois de 9-11 semanas na mídia SIM (E) e os brotos depois sendo transferido para mídia MG (F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. hidropônica cultura

  1. Preparar a solução de Hoagland a uma metade da força (0.5 x) (Tabela S2) em um balde de 10L.
  2. Mergulhe uma bomba de aquário para manter a homogeneidade e condições adequada de oxigênio.
  3. Cobrir as paredes do balde com folha de alumínio para criar raízes no escuro.
  4. Evitando danos de raiz, transferi em vitro plantas para cultura hidropónica.
    Nota: Remova qualquer meio restantes em vitro de raízes para evitar a proliferação de microorganismos durante a incubação, agitando cuidadosamente as raízes imergidas em água.
  5. Cobrir as plantas com película transparente como uma estufa de vidro para permitir a adequada aclimatação e incubar em câmara de crescimento.
  6. Faça furos no filme depois de 3 dias e removê-lo completamente uma semana depois.
  7. Substitua com mídia fresca em 10 dias.

6. ensaio de gene repórter histochemical GUS

Nota: No nosso caso o GUS análise foi realizada com raízes de 2-3 semanas, cultivadas em hidroponia ou in vitro.

  1. Corrigir as raízes com acetona gelada de 90% (v/v) e incube-lo por 20 minutos no gelo.
  2. Execute duas lavagens com água destilada.
  3. Adicione fresco GUS coloração solução (tabela 1) e aplicar vácuo (-70 Pa) por 20 min.
  4. Incube a 37 ° C, no escuro, para proteger o GUS fotossensível por 4h ou até uma cor azul é visível.
    Nota: A presença de ferri - e ferrocianeto em solução GUS minimizar a difusão dos produtos de reação e fornecer localização mais precisa.
    Atenção: Usar uma coifa e utilizar vestuário de protecção ao manusear os derivados tóxicos de cianeto em solução GUS (o ferricianeto de potássio e ferrocianeto de potássio). O substrato de GUS e o material de descarte devem ser descartados com segurança.
  5. Remover o GUS solução de coloração e descartá-lo em recipientes apropriados.
  6. Execute duas lavagens com etanol 70% (v/v).
  7. Observe em um microscópio de campo claro.
    Nota: GUS coloração é estável por algumas semanas; no entanto, durante a primeira semana, o sinal de GUS é claro e difunde-se menos em células de vizinhos. Para uma conservação mais longa, fechar o tubo e armazená-lo em 4 ° C.

Table 1
Tabela 1: Receita de solução coloração de GUS.

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Representative Results

Agrobacterium rhizogenes -mediado transformação de batata

Neste manuscrito, é apresentado o procedimento passo a passo para obter a raiz transformada com a. rhizogenes . A Figura 1 apresenta uma visão geral do processo, que ao todo leva cerca de 5-6 semanas (a partir de injeção da . rhizogenes para obtenção de raízes peludas totalmente desenvolvidas). Em seguida, a planta pode ser estudada como um composto (tiro de tipo selvagem, raiz transgênico) ou a raiz peluda transgênica clones podem ser extirpados e crescidos autonomamente em sólido Gamborg B5 suplementado com 2% de sacarose. Alternativamente, as raízes peludas podem ser maciçamente propagadas usando a mídia de Gamborg B5 líquida. O procedimento apresentado realizado com S. tuberosum spp. tuberosum (CV Désirée).

O método para monitorar o processo e obter batata transgênicas raízes peludas foi validado através de um vetor binário com a DsRed como um marcador de transformação (PK7GWIWG2_II-RedRoot do VIB-departamento de biologia de sistemas planta na Universiteit Gent). Isto permitiu a distinção de raízes peludas transgênicas dos não-transgênicos por fluorescência vermelha. De acordo com isso, na Figura 3 , as raízes peludas transformadas exibiram fluorescência vermelha quando iluminado com luz verde. O controle negativo usando o sem transformação Agrobacterium não mostrou nenhuma fluorescência vermelha (Figura 3), em geral indicando a adequação do marcador DsRed transformação para identificar as raízes peludas transgénicas (Figura 3D). Outros marcadores de transformação, tais como a resistência aos antibióticos podem ser usados como descrito por outros autores23,,24; no entanto, os antibióticos na mídia podem produzir um atraso de crescimento nas raízes transgénicas contendo o marcador.

Figure 3
Figura 3: Fluorescentes transgênicas peludas raízes da batata (CV Désirée) transformadas pela . rhizogenes. As peludo raízes foram obtidas utilizando um não-transformadas a. rhizogenes (estirpe C58C1: pRI1583) (A e C) e com a. rhizogenes (tensão C58C1:pRI1583) transformada com o vetor vazio pK7GWIWG2_II-vermelho-raiz carregando um DsRed marcador de transformação (B e D). As raízes peludas são formadas em ambas as infecções (A, B) mas fluorescência vermelha é única observados em raízes peludas, transformadas com o a. rhizogenes contendo o vetor binário. As imagens foram tiradas com um microscópio estereoscópico equipado com uma lâmpada e um filtro específico para visualizar a fluorescência vermelha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Agrobacterium tumefaciens -mediado transformação de batata

O segundo protocolo descrito neste manuscrito está configurado para obter o passo a passo, uma planta completa batata transformada com a. tumefaciensA Figura 2 apresenta uma visão geral do processo, que ao todo leva entre 15-18 semanas (a partir de infecção da folha com a. tumefaciens para obtenção de plantas totalmente regeneradas). A parte mais demorada do processo é a regeneração da planta por organogênese. Esta etapa específica faz com que este método mais trabalhoso do que usar a. rhizogenes. O procedimento foi realizado com S. tuberosum spp. tuberosum (CV Désirée) e S. tuberosum SSP. andigena, o primeiro sendo menos dependente de condições short-day para induzir tuberization.

Na a. tumefaciens-transformação mediada, em contraste com o a. rhizogenes -mediada de transformação, as plantas regeneradas são organismos transgénicos completamente. No entanto, embora as plantas transgénicas são regeneradas em uma mídia seletiva de canamicina, não todas as linhas expressam eficientemente o transgene. Portanto, a validação da expressão do transgene é necessária.

Comparação da atividade FHT promotor em raízes obtidas usando A. tumefaciens e a. rhizogenes

Os procedimentos acima mencionados foram aplicados para produzir raízes que expressa o gene GUS sob o promotor do gene FHT . O completo transformou plantas com a. tumefaciens foram anteriormente relatados15, usando o pKGWFS7 do vetor binário que contém o promotor FHT . Agora, esse vetor binário tem sido usada para produzir novas raízes peludas transformadas para comparar os tecidos onde o promotor está ativo e, portanto, para testar o sistema de raiz peludo como uma ferramenta para estudar a ativação do promotor.

A Figura 4 mostra o GUS coloração nas raízes das plantas transgênicas obtidas por a. tumefaciens (Figura 4AB) e transgênicas peludas raízes obtidas por a. rhizogenes (Figura 4D, E, F), respectivamente. Como pode ser visto, raízes transformaram com a. tumefaciens e crescido em vitro mostram coloração azul na endoderme (Figura 4A), uma camada de células entre o córtex e a Estela. No mais desenvolvido raízes, a rotulagem azul é desigual na camada externa correspondente a exoderme (Figura 4B). Em transformado peludas raízes cultivadas em hidroponia, o marcador GUS especificamente localizava-se na endoderme (Figura 4E), com o surgimento de raízes laterais (Figura 4E), nas áreas feridas (Figura 4E ) e na exoderme (Figura 4F). As raízes não mostrou nenhuma mancha de GUS em controles negativos que foram também raízes peludas sem as raízes de gaveta ou tipo selvagem de PromFHT:GUS T-DNA.

Figure 4
Figura 4: Histochemical observação das raízes de batatas transgênicas expressando o gene repórter GUS conduzido pelo promotor da FHT. As raízes de plantas transgénicas completas obtidas por blue show de transformação (A-B) do (S. tuberosum SSP. andigena) a. tumefaciens coloração na endoderme (A) e exoderme (B). As raízes peludas transgênicas obtidas por a. rhizogenes (S. tuberosum SSP. tuberosum CV Désirée) transformação (C-F) exibir GUS manchando a endoderme (C e E), na raiz lateral emergência (D e E), na zona de cicatrização de feridas (E) e na exoderme (F). Endoderme (pt); Exoderme (EX); Xilema (XL); Primordia de uma raiz lateral (LR). A seta vermelha indica a área ferida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela S1: Receitas de mídia plantas usadas para crescente bactérias e in vitroPor favor clique aqui para baixar esta tabela

Tabela S2: Solução de Hoagland metade da força para o cultivo de plantas de batata em hidroponia. Por favor clique aqui para baixar esta tabela

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Discussion

Em batata, o sistema mais comum para obter plantas transgênicas completas estáveis usa a transformação por cepas de Agrobacterium tumefaciens que exigem organogênese usando fitohormônios exógenos. Embora os protocolos de Agrobacterium baseado tem potencial para integrar o vetor não-T-DNA sequência25, esta metodologia é ainda o mais fácil e menos caro disponível para transformar plantas de batata. Durante os últimos anos, o interesse na . rhizogenes-transformação mediada tem a atenção dos pesquisadores por permitir obter raízes transgénicas em períodos mais curtos do que usando a. tumefaciens. O a. rhizogenes ainda preserva o plasmídeo (Ri) raiz de indução que carrega um conjunto de genes que codificam enzimas para a biossíntese de controle e citocinina de auxina phytohormone e codificação para opina26. Uma vez que o T-DNA Ri é inserido o DNA genômico de anfitrião, o novo equilíbrio hormonal desregulamenta as células infectadas, induzindo a formação de raízes proliferando, chamado raízes peludas, emergentes nos pontos de infecção27. Quando um vetor binário adicional é usado para integrar um DNA estranho, a preservação do plasmídeo Ri confere a possibilidade de obter raízes peludas transformadas sem necessidade de organogênese usando fitohormônios exogenamente aplicado28. As raízes peludas podem ser mantidas anexada para o tiro de tipo selvagem, gerando um composto vegetal ou podem ser propagadas Self. Essa capacidade de raízes peludas para propagar Self está a ser explorada para produzir nas raízes peludo de várias plantas como um sistema biológico para Mass-producing valiosos metabolitos ou proteínas estranhas, gerando interesses em farmácia e até mesmo fitorremediação áreas ( Veja revisão29,30). Na batata (var. Kufri Bahar), plantas transgénicas completas foram infectadas com a cepa da . rhizogenes tipo selvagem para produzir raízes peludas, expressando a hepatite B antígenos de superfície (HBsAg)23. Alternativamente, uma completa de plantas transgênicas regenerada de raízes peludas podem ser obtida, mas planta batata e tubérculos mostraram desenvolvimento distinto em comparação com os controles sem transformação. Estas diferenças o fenótipo são devido o Ri T-DNA original integrado dentro do genoma31,32.

Neste trabalho, os procedimentos detalhados para obter transgénicos estável peludas raízes usando a. rhizogenes e plantas transgénicas estáveis, usando a. tumefaciens são apresentadas (Figura 1 e Figura 2). Obtiveram-se as raízes peludas transgênicas totalmente desenvolvidas em 5-6 semanas, enquanto raízes transgénicas usando a. tumefaciens precisava de 15 a 18 semanas devido à exigência de organogênese de células transformadas e a seleção e propagação de plantas transformadas. Em nossas mãos, o procedimento de transformação da . tumefaciens funciona eficientemente em S. tuberosum SSP. andigena e SSP. tuberosum (CV Désirée), com uma eficiência de transformação relatados cerca de 35%22 e 48% 12, respectivamente. O descrito a. rhizogenes procedimento de transformação é baseado em que relatado por Horn7, que mostrou uma alta (80-100%) eficiência de transformação em CV Désirée e outras cultivares de três batata (Albatros, Sabina e Saturna).

Para apresentar a. rhizogenes como um sistema alternativo de transformação batata para estudos funcionais e para indicar que se a presença inicial de Ri T-DNA foi motivo de preocupação, nós usamos os dois sistemas para transformar as raízes da batata com o mesmo binário vetor que continha um T-DNA com um promotor de um gene biossintética de suberina (FHT) dirigindo a expressão do gene repórter GUS . As análises histoquímicas revelaram que na . tumefaciens transformado as plantas, a atividade do promotor FHT estava nas camadas cor internas e externas das raízes (endoderme e exoderme, respectivamente) (Figura 4A,B ) e também em áreas da folha, caule e tubérculo15feridas. Em a. rhizogenes transformado peludas raízes, a atividade também foi detectada na endoderme e exoderme e zonas de raiz feridos (Figura 4E). A co-ocorrência da atividade de promotor de suberina em ambos os tipos de raízes transformadas indica que o Ri integrado T-DNA não está afetando os processos de desenvolvimento relacionados com suberization pelo menos nestes tecidos da raiz. Em raízes peludas transformadas também detectamos atividade do promotor FHT do entorno o surgimento de raízes laterais (Figura 4,E). Isto concorda com a atividade de promotor relatada por outros genes envolvidos no transporte de monômeros de suberina, tais como ABCG11 / WBC1133,34,35,36 ou o regulador StNAC103 19. a transformação de batata por a. rhizogenes para estudar um gene de suberina já foi relatada recentemente37 e raízes também nesse caso cabeludas têm permissão para mostrar a ativação de promotor de CYP86A33, um ácido graxo Ω-hidroxilase. No entanto, o GUS em raízes de coloração foi quantificado usando um ensaio fluorométrica de granel, daí a expressão específica em tecidos de cor apenas presumiu.

No total estas evidências de resultados que a. rhizogenes transformação é uma ferramenta alternativa mais rápida para explorar a ativação de promotor tipo específico de célula de genes relacionados com suberina nas raízes, que podem ser estendidas para estudos baseados em outros processos que ocorrem nas raízes. De acordo, alguns outros estudos genéticos funcionais foram bem sucedidos em usando a. rhizogenes em batata, tomate e eucalipto para demonstrar o gene função6,8,7,9, para estudar a resposta hormonal38,39 , ou o promotor atividade40,41. No entanto, esta estratégia pode ainda apresentar limitações, especialmente quando estudar firmemente controlado por processos de desenvolvimento que podem ser desregulamentados por Ri T-DNA ou quando a planta inteira ou tubérculos ou outros órgãos diferentes de raízes querem ser estudado. Nessas situações, o sistema de transformação da . tumefaciens é ainda preferido.

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Disclosures

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, FPI grant para PB), o Ministerio de Economía y competitividade e FEDER financiamento (36725-AGL2012, AGL2015-67495-C2-1-R) e a Universidade de Girona (bolsa de doutorado para SF e grant SING11/1). Os autores são gratos ao Dr. Inge Broer (Instituto para o uso da terra, Universidade de Rostock, Rostock, Alemanha) e Dr. Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, Espanha) para fornecer o a. rhizogenes e a cepa da . tumefaciens , respectivamente e Dr. Marçal Soler e Dr. Anna Plasencia para a ajuda e o apoio recebido no início das experiências de transformação a. rhizogenes (Toulouse III Paul Sabatier University — CNRS, laboratório de pesquisa da planta (LRSV), Castanet Tolosan, A França). Os autores agradecer sua valiosa assistência na realização do trabalho de laboratório e cuidar de plantas e Ferran Fontdecaba e Carla Sánchez assistida com alguns dos experimentos enquanto eles estavam fazendo Sara Gómez (Departament de Biologia, UdG, Girona) seus projetos de grau final.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

Acetone

Panreac

1.310.071.21

Acetosyringone

Acros

115540050

Aquarium pump

Prodac

MP350

Autoclave

Ragpa Strelimatic

Bacteriological agar

Lab Conda

1800

BAP

Duchefa

B0904

Beef extract

Lab Conda

1700

Plant growing cabinet

Nuaire

Carbenicillin

Duchefa

C0109

Cefotaxime sodium

Duchefa

C0111

DMSO

Merck

1029310161

Ecotron infors

HT

29378

Ethanol

Merck

1,009,831,011

Falcon tube

Control tecnica

CFT011500

Ferricyanate

Sigma

101001081

Ferrocyanate

Sigma

100979088

Flask (8.06 cm diameter and 11.3 cm height) and plastic lid for in vitro culture

Apiglass

ref16

GA3

Sigma

G7645

Gamborg B5 media

Duchefa

G0210

Gelrite

Duchefa

G1101

Glucosa

Sigma

G5767

Kanamycin

Sigma

K1377

Leukopor tape

BSN Leukopor

BDF47467

Lupe

Wild-Heerbrugg

M420

Magnetic shaker

Agimatic

7000243

MES hydrate

Sigma

M2933-25G

MgSO4

Panreac

131404

Microscope

Olympus

Minufugue centrifugue 5415R

Eppendorf

Murashige and Skoog media

Duchefa

M0254.0050

Na2HPO4

Panreac

131679

NAA

Duchefa

N0903

NaCl

Panreac

131659

NaH2PO4

Sigma

58282

NightSea Stereo

SFA Moonting Adapter

Parafilm

Anorsa

PRFL-001-001

Peptone

Lab Conda

1616

Petri dishes (90 x 14)

Anorsa

200200

pHmetre

Crison

Phytotron

Inkoa

RFTI-R5485

Plant Agar

Duchefa

P1001

Refrigeratot

Liebherr Medline

Rifampicin

Duchefa

R0146

Spectinomycin

Sigma

59007

Spectrophotometer

Shimadzu

Square plates (120 x 120)

Deltalab

200204

Streptomycin

Sigma

S6501

Sucrose

Panreac

131621

Surgical blades

Swann-Morton

201

Surgical needle

NIPRO

015/0204

Triptone

Lab Conda

1612

Triton

Serva

37240

Unimax 1010 shaker

Heidolph

Vacuum

Dinko

x-GlcA (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronic acid, sodium salt anhydrous)

Biosynth

B-7398

Yeast extract

Lab Conda

1702.00

Zeatin riboside

Sigma

1001042850

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