Aqui, apresentamos dois protocolos para transformar plantas de batata. A transformação de Agrobacterium tumefaciens leva a uma planta transgénica completa enquanto o Agrobacterium rhizogenes produz raízes peludas transgênicas em uma selvagem tipo de fotos que podem ser propagados Self. Nós então detectar atividade de promotor por GUS coloração nas raízes transformadas.
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Artigo de método
Agrobacterium tumefaciens e Agrobacterium rhizogenes-transformação mediada de batata e a atividade de promotor de um Gene de suberina por GUS Staining
Neste artigo
Resumo
Resumo
Agrobacterium SP. é um dos métodos mais utilizados para obter plantas transgênicas, pois tem a capacidade de transferir e integrar sua próprias T-DNA no genoma da planta. Aqui, apresentamos dois sistemas de transformação para modificar geneticamente as plantas de batata (Solanum tuberosum). Na transformação da . tumefaciens , folhas são infectadas, as células transformadas são Selecionadodas e uma nova planta completa de transformada é regenerada usando fitohormônios em 18 semanas. Na transformação da . rhizogenes , hastes estão infectados por injetar a bactéria com uma agulha, as novas raízes peludas surgiu transformadas são detectadas usando um marcador fluorescente vermelho e as raízes não-transformadas são removidas. Em 5-6 semanas, a planta resultante é um composto de um tiro de tipo selvagem com raízes peludas transformados totalmente desenvolvidos. Para aumentar a biomassa, as raízes peludas transformadas podem ser extirpadas e self propagadas. Nós aplicamos os dois métodos de transformação Agrobacterium -mediada para obter raízes expressando o gene repórter GUS impulsionado por um promotor do gene biossintética de suberina. O procedimento de coloração GUS é fornecido e permite a localização de célula da indução promotor. Em ambos os métodos, as raízes de batata transformada mostraram GUS coloração na cor endoderme e exoderme e além disso, em raízes de a. rhizogenes transformou a atividade de GUS também foi detectado o surgimento de raízes laterais. Estes resultados sugerem que a. rhizogenes pode ser uma ferramenta rápida alternativa para estudar os genes que são expressos em raízes.
Introdução
Além de interesse econômico, a geração de plantas transgênicas tem sua própria relevância na pesquisa para demonstrar a função final dos genes e para entender melhor a fisiologia vegetal e desenvolvimento. O mais amplamente utilizado método para inserção de DNA de plantas é Agrobacterium-mediado transformação. Agrobacterium tumefaciens é capaz de gerar coroa galhas em muitas espécies de plantas, o tecido infectado pela ação do seu do plasmídeo indutor de tumor (Ti). O plasmídeo contém uma região de T-DNA com um conjunto de genes que será integrado no genoma da planta e induzir o tecido quê1,2....
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Protocolo
O protocolo de transformação a. rhizogenes foi adaptado e modificado de Horn et al.7 e o genótipo testado foi S. tuberosum ssp. tuberosum (CV Désirée). O protocolo de transformação da . tumefaciens foi adaptado e modificado de Banerjee et al.22 e os genótipos testados foram S. tuberosum ssp. tuberosum (CV Désirée) e S. tuberosum SSP. andigena. As principais etapas de ambos os procedimentos são resumidas na Figura 1 e Figura 2, respectivamente.
Nota: Em todas as etapas do procedimento de re....
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Resultados
Agrobacterium rhizogenes -mediado transformação de batata
Neste manuscrito, é apresentado o procedimento passo a passo para obter a raiz transformada com a. rhizogenes . A Figura 1 apresenta uma visão geral do processo, que ao todo leva cerca de 5-6 semanas (a partir de injeção da . rhizogenes para obtenção de raízes peludas totalmente des.......
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Discussão
Em batata, o sistema mais comum para obter plantas transgênicas completas estáveis usa a transformação por cepas de Agrobacterium tumefaciens que exigem organogênese usando fitohormônios exógenos. Embora os protocolos de Agrobacterium baseado tem potencial para integrar o vetor não-T-DNA sequência25, esta metodologia é ainda o mais fácil e menos caro disponível para transformar plantas de batata. Durante os últimos anos, o interesse na . rhizogenes-transformação mediada .......
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Divulgações
Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Ministerio de Innovación y Ciencia (AGL2009-13745, FPI grant para PB), o Ministerio de Economía y competitividade e FEDER financiamento (36725-AGL2012, AGL2015-67495-C2-1-R) e a Universidade de Girona (bolsa de doutorado para SF e grant SING11/1). Os autores são gratos ao Dr. Inge Broer (Instituto para o uso da terra, Universidade de Rostock, Rostock, Alemanha) e Dr. Salomé Prat (Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, Espanha) para fornecer o a. rhizogenes e a cepa da . tumefaciens , respectivamente e Dr. Marçal Soler e Dr. Anna Plasencia para a ajuda e o apoio recebido no início das experiências de transformação
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Acetona | Panreac | 1.310.071.21 | |
| Acetosiringona | Acros | 115540050 | |
| Bomba de aquário | Prodac | MP350 | |
| Autoclave | Ragpa Strelimatic | ||
| Ágar bacteriológico | Lab Conda | 1800 | |
| BAP | Duchefa | B0904 | |
| Extrato de carne | Lab Conda | < p>1700 | |
| Armário de cultivo de plantas | Nuaire | ||
| Carbenicilina | Duchefa | C0109 | |
| Cefotaxima sódica | Duchefa | C0111 | |
| DMSO | Merck | 1029310161 | |
| Ecotron infors | HT | 29378 | |
| Etanol | Merck | 1.009.831.011 | |
| Falcon tube | Control tecnica | CFT011500 | |
| Ferricianato | Sigma | 101001081 | |
| Ferrocianato | Sigma | 100979088 | |
| Frasco (8,06 cm de diâmetro e 11,3 cm de altura) e tampa plástica para cultura in vitro | Apiglass | ref16 | |
| GA3 | Sigma | G7645 | |
| Gamborg B5 media | Duchefa | G0210 | |
| Gelrite | Duchefa | < p>G1101 | |
| Glucosa | Sigma | G5767 | |
| Kanamycin | Sigma | K1377 | |
| Leukopor tape | BSN Leukopor | BDF47467 | |
| Lupe | Wild-Heerbrugg | M420 | |
| Agitador magnético | Agimatic | 7000243 | |
| MES hidrato | Sigma | M2933-25G | |
MgSO4 | Panreac | 131404 | |
| Microscope | Olympus | ||
| Minufugue centrifugue 5415R | Eppendorf | ||
| Murashige and Skoog media | Duchefa | M0254.0050 | |
Na2HPO4 | Panreac | 131679 | |
| NAA | Duchefa | N0903 | |
| NaCl | Panreac | 131659 | |
NaH2PO4 | Sigma | 58282 | |
| NightSea Stereo | SFA Moonting Adapter | ||
| Parafilm | < p>Anorsa | PRFL-001-001 | |
| Peptona | Lab Conda | 1616 | |
| Placas de Petri (90 x 14) | Anorsa | 200200 | |
| pHmetre | Crison | < p> | |
| Phytotron | Inkoa | RFTI-R5485 | |
| Plant Agar | Duchefa | P1001 | |
| Refrigeratot | Liebherr Medline | ||
| Rifampicina | Duchefa | R0146 | |
| Spectinomicina | Sigma | 59007 | |
| Espectrofotômetro | Shimadzu | ||
| Placas quadradas (120 x 120) | Deltalab | < p>200204 | |
| Estreptomicina | Sigma | S6501 | |
| Sacarose | Panreac | 131621 | |
| Lâminas cirúrgicas | Swann-Morton | 201 | |
| Agulha cirúrgica | NIPRO | 015/0204 | |
| Triptone | Lab Conda | 1612 | |
| Triton | Serva | 37240 | |
| Unimax 1010 shaker | Heidolph | ||
| Vácuo | Dinko | ||
| x-GlcA (ácido 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-beta-D-glucurônico, sal de sódio anidro) | Biosynth | B-7398 | |
| Extrato de levedura | Lab Conda | 1702.00 | |
| Zeatin ribosídeo | Sigma | 1001042850 |
Referências
- Gelvin, S. B. Traversing the Cell: Agrobacterium T-DNA's journey to the host genome. Frontiers in Plant Science. 3, 1-11 (2012).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant facto....
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Reimpressões e permissões
