Høj overførselshastighed Siderophore Screening fra miljøprøver: plante væv, Bulk jord og rhizosfære jord

* These authors contributed equally
Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Vi præsenterer en protokol til hurtig screening af miljøprøver for siderophore potentielle bidrag til mikronæringsstoffer biotilgængelighed og omsætning i jordbaserede systemer.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lewis, R. W., Islam, A. A., Dilla-Ermita, C. J., Hulbert, S. H., Sullivan, T. S. High-throughput Siderophore Screening from Environmental Samples: Plant Tissues, Bulk Soils, and Rhizosphere Soils. J. Vis. Exp. (144), e59137, doi:10.3791/59137 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Siderophores (lav-Molekylær vægt metal chelaterende forbindelser) er vigtige i forskellige økologiske fænomen spænder fra jern (Fe) biogeokemiske cykling i jorder, at patogenet konkurrence, plante vækstfremmende og cross-Kongerige signalering. Siderophores er desuden også af kommercielle interesser i bioleaching og bioweathering af metalholdigt mineraler og malme. En hurtig, omkostningseffektiv og robust middel til kvantitativt at vurdere siderophore produktion i komplekse prøver er nøglen til at identificere vigtige aspekter af de økologiske konsekvenser af siderophore aktivitet, herunder, Roman siderophore producerer mikrober. Metoden præsenteres her blev udviklet for at vurdere siderophore aktivitet i takt microbiome Fællesskabers miljøprøver, som jord eller plante væv. Prøverne blev homogeniseret og fortyndes i en modificeret M9 medium (uden Fe), og berigelse kulturer blev udruget i 3 dage. Siderophore produktion blev vurderet i prøver på 24, 48 og 72 timer (h) ved hjælp af en roman 96-brønd mikrotiterplade CAS (Chrome azurol f.eks)-Fe agar assay, en tilpasning af den traditionelt kedelige og tidskrævende kolorimetriske metode til vurdering af siderophore aktivitet, udført på enkelte dyrkede mikrobielle isolater. Vi anvendte vores metode til 4 forskellige genotyper/linjer af hvede (Triticum aestivum L.), herunder Lewjain, Madsen, og PI561725 og PI561727 almindeligt dyrket i indre Pacific Northwest. Siderophore produktion var tydeligt påvirket af genotype hvede og i bestemte typer af plantevæv observeret. Vi har med held brugt vores metode til hurtigt skærmen for anlægget genotype indflydelse på siderophore produktion, en nøglefunktion i terrestriske og akvatiske økosystemer. Vi producerede mange tekniske replikater, giver meget pålidelige statistiske forskelle i jord og i plantevæv. Vigtigere, viser resultaterne den foreslåede metode kan bruges til hurtigt at undersøge siderophore produktion i komplekse prøver med en høj grad af pålidelighed, på en måde, der giver mulighed for lokalsamfund til at blive bevaret for det senere arbejde at identificere taxa og funktionelle gener.

Introduction

Siderophores er vigtige biomolekyler involveret primært i jern-kelation for biotilgængelighed, men med en lang række yderligere formål i terrestriske og akvatiske økosystemer spænder fra mikrobielle quorum sensing, signalering til mikrobiel plante-værter, plante vækstfremmende, samarbejde og konkurrence inden for komplekse mikrobielle samfund1,2. Siderophores kan groft inddeles efter deres aktive steder og strukturelle træk, oprettelse af fire grundlæggende typer: carboxylat, hydroxamate, catecholate, og blandede typer3,4. Mange mikroorganismer er i stand til at udskille mere end én type af siderophore5 og i komplekse samfund, et stort flertal af organismer biosynthesize membranreceptorer at tillade optagelsen af en endnu bredere vifte af siderophores1, 6. Seneste arbejde viser, at siderophores er særligt vigtigt på fællesskabsplan, og selv i Inter Kongerige kommunikation og biogeokemiske overførsler7,8,9,10 ,11.

Chrome azurol f.eks (CAS) er blevet brugt i over 30 år som en chelatdanner til at binde jern (Fe) på en sådan måde, at tilsætning af ligander (dvs. siderophores) kan resultere i dissociation af CAS-Fe komplekset, skaber en let identificerbare farveskift på mellemlang 12. når the CAS er bundet med Fe, farvestoffet vises som en royal blå farve, og som CAS-Fe kompleks dissocieres, medium skifter farve afhængigt af ligand bruges til at skyllepumpetab Fe13. Den indledende, væskebaseret medium etableret af Schwyn og Neilands i 1987, er blevet ændret på mange måder at imødekomme skiftende mikrobielle mål14, vækst vaner og begrænsninger15, samt en lang række metaller udover Fe, herunder aluminium, mangan, kobolt, cadmium nikkel, lithium, zink16, kobber17, og endda arsen18.

Mange menneskelige patogener, så godt som plant vækst fremme mikroorganismer (PGPM) er blevet identificeret som siderophore-producerende organismer3,19,20, og vigtige rhizosfære og endophytic PGPM ofte teste positivt for siderophore-produktion4. Den traditionelle Fe-baseret flydende metode er blevet tilpasset til mikrotiter afprøvning af isolater i dyrkning for siderophore produktion21. Men disse teknikker undlader at erkende betydningen af den mikrobielle samfund som helhed (microbiome), i samarbejde og potentielle regulering af siderophore produktion i jord og plante systemer22. Derfor har vi udviklet en høj overførselshastighed fællesskabsplan vurdering af siderophore produktion fra et bestemt miljø, baseret på traditionelle CAS analysen, men med replikering, nem måling, pålidelighed og repeterbarhed ved en mikrotiterplade assay.

I denne undersøgelse præsenteres en omkostningseffektiv, høj overførselshastighed CAS-Fe assay til påvisning af siderophore produktion for at vurdere berigelsen af siderophore produktion fra komplekse prøver (dvs. jord og plante væv homogeniseret). Bulk, løst bundet og stramt bundet rhizosfære jord (med hensyn til hvordan jorden var bundet til roden) blev opnået sammen med korn, skyde og root væv fra fire forskellige hvede (Triticum aestivum L.) genotyper: Lewjain, Madsen, PI561725, og PI561727. Det var den hypotese, at grundlæggende forskelle i hvede genotyper kan resultere i forskelle i rekruttering og udvælgelse af siderophore producerer Fællesskaber. Af særlig interesse er forskellen mellem mikrobielle samfund tilknyttet PI561725 isogene linje, som er aluminium tolerante, fordi det besidder ALMT1 (aluminium-aktiveret malat Transporter 1), sammenlignet med aluminium følsomme PI561727 isogene linje, som besidder en ikke-aluminium lydhør form af genet, almt123,24,25,26. Chief formålet med undersøgelsen var at udvikle en enkel, hurtig metode til kvantitativ vurdering af siderophore produktion i siderophore berigelse kulturer af komplekse prøve typer samtidig bevare kulturer for det fremtidige arbejde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bemærk: Placeringen af feltet Site: Washington State University, plante patologi Farm (46 ° 46' 38,0" N 117 ° 04' 57,4" W). Frø blev sået ved hjælp af en mekanisk plantageejer på 19 oktober 2017. Hver hvede genotype blev plantet i headrows, ca 1 meter fra hinanden til at undgå overlapning af rodsystemet. Plante og jord prøver blev indsamlet på August 9, 2018, når planterne er klar til høst. Prøverne blev indsamlet fra tre replikater af fire hvede genotyper: PI561727, PI561725, Madsen, Lewjain.

1. forberedelse af modificerede M9 medium

  1. Brug Na2PO4∙7H2O (12,8 g/200 mL), KH2PO4 (0,3 g/200 mL), NaCl (0,5 g/200 mL) og NH4Cl (1 g/20 mL) reagenser til at forberede M9 saltopløsning.
  2. Bruge 18 g af MgSO4∙7H2O i 100 mL dobbelt ionbyttet vand (ddH2O) til at forberede 0,75 M MgSO4∙7H2O.
  3. Gøre 1 M CaCl2∙2H2O ved at tilføje 14,7 g CaCl2∙2H2O med 100 mL af Hedeselskabet2O.
  4. Forberede bufferopløsning ved at opløse 6.048 g af rør til 156 mL af Hedeselskabet2O under omrøring. PH indstilles til 6,8 med 5 M NaOH.
  5. Forberede 20% glukose (dextrose monohydrat) ved at opløse 20 g af glukose i 100 mL af Hedeselskabet2O.
  6. Forberede løsninger og individuelt autoklave alle men glukose. Filter sterilisere glukose løsning for tilføjelse til M9 medier efter autoklavering (0,22 µm).
  7. Forberede den modificerede M9 medium ved at blande 156 mL rør stødpudeopløsning, 40 mL af M9 salte løsning, 20 μL CaCl2·2H2O løsning, 266 μL MgSO4·7H,2O og 4 mL af 20% glukose løsninger sammen i biosikkerhed kabinet, ved hjælp af steril teknik.
  8. For bevarelse af den modificerede M9, forsegle beholderen, dække med aluminiumsfolie til at beskytte mod UV, og placere ved 4 ° C.

2. forberedelse af CAS-Fe-agarsubstratet

  1. Syre vaske alle glasvarer i 100 mM HCl/100 mM HNO3 i mindst 2 h før udnyttelse i CAS assay.
  2. Forberede en aluminium bradepande fyldt med laboratoriet grade sand og dække det med aluminiumsfolie. Autoklavering ved 121 ° C i 30 min og sæt til side.
  3. Forberede HDTMA (hexadecyltrimethylammonium bromid) ved at tilføje 0.0365 g til 20 mL ddH2O og placere løsningen ved 37 ° C at fremme oploesning.
  4. Forberede 10 mM HCl og generere 1 mM FeCl3·6H2O ved hjælp af 10 mM HCl som opløsningsmiddel. Tilføj 0.0302 g af CAS til 25 mL af Hedeselskabet2O mens forsigtigt omrøring med en steril magnetiske rør bar. Derefter tilsættes 5 mL af 1 mM FeCl3·6H2O (i 10 mM HCl) til 25 mL af CAS løsning samtidig med at forsigtigt rør (løsning bliver til mørk rødlig sort farve).
  5. Langsomt tilsættes 20 mL HDTMA mens forsigtigt omrøring i Fe-CAS løsning (dette giver en mørk blå løsning).
  6. Forberede bufferopløsning ved at opløse 15.12 g af rør til 375 mL af Hedeselskabet2O, med blid omrøring. PH indstilles til 6,8 med 5 M NaOH. Tilsæt vand for at bringe volumen til 450 mL. Tilsaettes 5 g Agarosen til løsningen. Autoklave RØRENE buffer løsningen og CAS-Fe løsning ved 121 ° C i 30 min.
  7. Forsigtigt tilføje helhed af CAS-Fe løsning for PIPES Buffer i biosikkerhed kabinet efter hver af dem er autoklaveres.
  8. Sted den blandede opløsning i et vandbad på 50 ° C.
    Bemærk: Frisk forberede alle reagenser i CAS-Fe-Agar-medium før hvert assay, som langtidsopbevaring ved 50 ° C resultater i udfældning af CAS-Fe komplekse og afkøling resultater i størknede medium.
  9. Placer en steril reagens båd i sterilt sand i biosikkerhed kabinet og opvarmes til 50 ° C. Overføre CAS-Fe-Agar til båden og derefter hurtigt alikvot 100 µL til hver brønd i en klar, flad bund, sterile 96-brønd mikrotiterplade.

3. Pyoverdine/EDTA standardpraeparat

  1. Pyoverdine forberedelse
    1. Forberede 800 μM pyoverdine standard (blanding af ravsyre syre, 2-hydroxy glutaramide og succinaminde former for pyoverdine – Se Tabel af materialer), i tidligere forberedt modificerede M9 medium.
    2. Fortyndes denne opløsning til 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 og 6,25 μM løsninger.
  2. EDTA standardpraeparat
    1. Tilføj 0.594 g af dinatrium ethylendiamintetra syre (EDTA: C10H14N2Na2O8.2H2O), til 500 mL af tidligere forberedt modificerede M9 medium at forberede 3200 μM EDTA standard.
    2. Fortyndes denne opløsning til 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 og 6,25 μM løsninger.
  3. Standardkurven generation
    1. Tilsæt 100 μL af hver koncentration af pyoverdine og EDTA at adskille wells af en 96-brønd mikrotiterplade indeholdende 100 μL af CAS-Fe agarsubstratet. Gøre dublerede tekniske replications af hver koncentration. Også, tilføje blanke brønde med kun M9 (ingen EDTA eller pyoverdine).
    2. Bruger en mikrotiterplade læser, måling af absorbans (på 420 nm og 665 nm) efter 1, 6 og 24 h inkubation ved 22 ° C, og brug absorbans målinger til at generere standard kurver.
      Bemærk: 420 nm målinger, subtrahere absorbansen af tomme fra absorbansen af pyoverdine eller EDTA indeholdende brønde. For 665 nm, subtrahere absorbansen af pyoverdine eller EDTA indeholdende wells fra absorbansen af tomme. Derefter svandt log10(µM pyoverdine eller EDTA) mod absorbans målinger. For at lette fortolkningen prøveresultater, bruge absorbans som x-aksen og log10(µM pyoverdine eller EDTA) som y-aksen.

4. indsamling af miljøprøver: jord og plante væv

  1. Vaske prøveudtagningsudstyr (skovle og saks) med 0,22 µm filtreret ddH2O efterfulgt af 70% ethanol og tørres med køkkenrulle inden prøvetagning og i mellem prøver at opretholde steril teknik og reducere krydskontaminering.
  2. Punktafgifter plantevæv (korn og skyder) fra planter i feltet, og placere dem i en mærket plastik opbevaringspose, forlader nok skyde stubbe for lethed i rodløshed de ønskede jord og rod prøver.
  3. Udgrave et lille rod bolden ca 15 cm dyb og 23 cm bred og læg det i en separat, mærket plastikpose for prøveforberedelse i laboratoriemiljø. Dette trin er lignende metoder af McPherson et al.27.
  4. Placer alle prøver (korn, skud, bulk jord og root bolde i separate poser) direkte på is og holde ved 4 ° C indtil prøver behandles for siderophore produktion assay.
  5. Separat root forbundet jordprøver i bulk, løst bundet rhizosfære jord og stramt bundet rhizosfære jord.
    1. Tage root bolde ud af poserne. Forsigtigt ryste jord fra rodklumpen. Rystet jorden, sammen med jorden tilbage i posen består af "bulk" jord.
    2. Bruge en gummihammer yderligere fjerne jord fra rodklumpen. Dette er løst bundet rhizosfære jord.
    3. Generere stramt bundet rhizosfære jorden ved at tage rødderne med stramt bundet prøve og sætte dem i et centrifugeglas. Der tilsættes 30 mL af Hedeselskabet2O og vortex i 2-3 minutter. Fjerne rødder for at få den stramt bundet rhizosfære jord gylle fortynding.

5. forberedelse af siderophore berigelse kulturer og CAS-Fe siderophore produktion assay

Bemærk: Alle glasvarer skal være acid vasket forud for begyndelsen af assays.

  1. Jord Prøveforberedelse (for hver af de tre jordtyper for prøve)
    1. Omrystes hver jordprøve i udtagningssækken, ved at blande og dreje jorden så meget som muligt uden at åbne posen.
      Bemærk: Dette hjælper med at reducere naturlige jord rumlig variabilitet og flugter med normal jord prøveudtagningsprocedurer. Andre metoder kan udnyttes til at homogenisere miljøprøver, som passende, og afhængigt af forsøgets udformning.
    2. Efter hver prøve har været grundigt blandet, alikvot og suspendere 2,0 g af hver jordtype i 20 mL af modificerede M9 medium, derefter fortyndes 10-3 for en samlet maengde paa 20 mL i en steril 50 mL-centrifugerør med en steril skum plug til at tillade beluftning.
    3. Tilsættes 2 mL af rhizosfære jord gylle til 20 mL af modificerede M9 medium stramt bundet rhizosfære prøver, og derefter fortynde 10-3 for en samlet maengde paa 20 mL i en steril 50 mL-centrifugerør med en steril skum plug til at tillade beluftning.
  2. Væv forberedelse af prøver (rod-, skyde og korn)
    1. Overfladen sterilisere prøve med 70% ethanol. Udblødte 2,0 g frisk væv i 20 mL af modificerede M9 medium ved hjælp af en blender på høj i 30 sekunder. Overføre prøven til et sterilt 50 mL-centrifugerør og derefter fortynde 10-3 for en samlet maengde paa 20 mL i en steril 50 mL-centrifugerør med en steril skum plug til at tillade beluftning.
  3. Berigelse af Siderophore produktion gennem Fe begrænsning
    1. Inkuber 50 mL centrifugeglas ved stuetemperatur og ryste på 160 rpm.

6. CAS-Fe agar assays til påvisning af siderophore produktion i miljøprøver

  1. 24, 48 og 72 timer efter indledningen berigelse kultur, fjerne 1 mL delprøver fra berigelse rør med steril teknik og centrifuge på 10.000 x g i 1 min i 2 mL centrifugeglas til pelletize celler.
  2. Indsamle adskilt supernatanten. Brug steril teknik, Tilsæt 100 μL af supernatanten til 100 μL løsning af CAS-Fe-Agar i to eller tre eksemplarer i mikrotiterplade. Også tilføje 100 µL i sterile M9 medium (som tomme). Derefter inkuberes plade ved 28 ° C.
  3. Suspendere de resterende supernatanten og pellet for hver prøve (ikke føjet til mikrotiter plade) i sin egen, sterile 2 mL-centrifugerør. Tilsæt 400 μL steril glycerol til hver prøve-supernatanten tube og resuspenderes for at oprette glycerol bestande. Fryse bestanden ved-80 ° C for senere analyser.
    Bemærk: Dette trin kan ændres til at generere glycerol lagre efter nogen foretrukne in-house protokol.
  4. Måling af absorbans ved 6, 24, 48 og 72 h, på 420 nm bølgelængde.
  5. Bruge standard kurver genereret fra pyoverdine eller EDTA for at fortolke prøve absorbans målinger i pyoverdine ækvivalenter.
    NOTE: Pyoverdine var besluttet på at være en overlegen standard sammenlignet med EDTA (vide infra), så EDTA ikke blev brugt til at fortolke resultaterne i den aktuelle undersøgelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

En pyoverdine blanding biosynthesized af Pseudomonas fluorescens blev brugt som standard til at fortolke og kvantificere absorbans (på 420 nm) af prøver i form af pyoverdine ækvivalenter i µM. figur 1 viser forholdet mellem absorbans (420 nm) og starter koncentration af pyoverdine (Log10 molariteten i µM). EDTA ikke give en tilstrækkelig standard, fordi prøver udstillet større absorbans målinger end var opnåeligt med pyoverdine og R2 var lavere (figur 2). Mens indledende arbejde ved hjælp af CAS-Fe assay som en metode til siderophore påvisning målte absorbans på 630 nm, i en relaterede undersøgelse ved hjælp af en meget lignende metode (CAS-Fe-Agar var blandes 1:1 med modificerede M9 til at generere en 200 µL kolonne i mikrotiterplade), det blev observeret, peak absorbans var på 665 nm, men at 420 nm var mere reproducerbare med hensyn til ændringer i absorbans induceret af prøver (figur 3).

Siderophore produktion blev observeret i berigelse kulturer af alle vævstyper efter 72 h Fe-underskud berigelse og siderophore aktivitet syntes at stabilisere efter 48 h inkubation (tillægs figur 1). Således blev siderophore aktivitet af 72 h berigelse vurderet på 48 h inkubation at bestemme genotype og prøve type indflydelse på siderophore isolation (figur 4). Siderophore aktivitet i bulk jordprøver var forholdsvis lavt og gjorde ikke udviser forskelle mellem hvede genotype hvorfra bulk jord var stikprøven (figur 4A). Enrichments af løst bundet jord isoleret fra PI561725 genotype udstillet større siderophore produktion sammenlignet med løst bundet jord fra Madsen og PI561727, men ikke Lewjain (figur 4B). Siderophore produktion i enrichments fra stramt bundet jord var ikke stærkt påvirket af genotype (figur 4 c).

Berigelse kulturer af korn væv givet relativt lav siderophore produktion uafhængigt anlægspræg (figur 4D). Enrichments af Lewjain skyde væv havde signifikant lavere siderophore produktion end de andre genotyper, og PI561725 skyde vævskulturer resulterede i mere variabel siderophore produktion (figur 4E). Siderophore aktivitet var mere end 200% større i i roden vævskulturer berigelse af PI561725 sammenlignet med alle andre genotyper (figur 4F).

Figure 1
Figur 1. Absorbansen ved 420 nm og 655 nm svandt mod log10 koncentrationen af pyoverdine. (A) absorbansen ved 420 nm svandt mod log10 koncentrationen af pyoverdine i µM. En polynomisk kurven var egnet til at opnå en forklarende ligning for at fortolke absorbans i forhold til pyoverdine ækvivalenter. (B) absorbans ved 665 nm svandt mod Log10 koncentrationen af pyoverdine i µM. R2 er kvadratet af Pearson korrelationskoefficienten, og ligningen forklarer monteret kurven. Punkter er dubletter af absorbans målinger på 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 og 6,25 µM pyoverdine efter 6 h inkubation ved 28 ° C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Absorbansen ved 420 nm og 655 nm svandt mod log10 koncentrationen af EDTA. (A) absorbansen ved 420 nm svandt mod log10 koncentrationen af EDTA i µM. En polynomisk kurven var egnet til at opnå en forklarende ligning for at fortolke absorbans i forhold til pyoverdine ækvivalenter. (B) absorbans ved 665 nm svandt mod Log10 koncentration af EDTA i µM. R2 er kvadratet af Pearson korrelationskoefficienten, og ligningen forklarer monteret kurven. Punkter er dubletter af absorbans målinger på 3200, 1600, 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5 og 6,25 µM EDTA efter 6 h inkubation ved 28 ° C, og fejllinjer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Absorbansen scanner fra 315−1000 nm af mikrotiterplade wells indeholdende 200 µL kolonner af 1:1 CAS-Fe-Agar og modificeret M9 eller M9 medium med siderophore producerer prøver. Pladen blev inkuberet ved 28 ° C 72 timer før måling af absorbans i en mikrotiterplade læser. Absorbansen scanninger viser de tre tomme felter, der indeholder ingen prøve (sorte linjer) givet stramt grupperet kurver med et højdepunkt på 665 nm. Absorbansen scanner viser de tre tomme felter, der indeholder siderophore producerer prøver (grå linjer) givet kurver med mere variation, men med mere konsekvent absorbansen ved 420 nm sammenlignet med 665 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Pyoverdine ækvivalenter af siderophore berigelse kulturer. Pyoverdine ækvivalenter af siderophore berigelse kulturer i forbindelse med (A) bulk (B) løst bundet, og (C) bundet stramt jord, og i væv homogeniseret hvede skyder (D) korn (E) og (F) rødder. Siderophore berigelse kulturer var inkuberes i 72 timer før overførsel delprøver til en mikrotiterplade og inkubere ved 28 ° C. Siderophore produktion blev vurderet efter 48 h inkubation med Chrome azurol S. genotyper/linjer er Lew = Lewjain, Mad = Madsen, 725 = PI561725 og 727 = PI561727. Stjerner repræsenterer betydning på alpha = 0,008 (efter Bonferroni korrektion). Barer er standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Tillægs figur 1. Pyoverdine ækvivalenter over tid. Pyoverdine ækvivalenter af siderophore berigelse kulturer vurderet efter 24, 48 og 72 h inkubation med Chrome azurol S. Sderophore berigelse kulturer i forbindelse med (A) bulk (B) løst bundet, og (C) stramt bundet jord, og i væv homogeniseret hvede (D) skyder korn (E) og (F) rødder. Siderophore berigelse kulturer var inkuberes i 72 timer før overførsel delprøver til en mikrotiterplade og inkubere ved 28 ° C. og subsampled til at vurdere siderophore produktion på hvert tidspunkt. Genotyper/linjer er Lew = Lewjain, Mad = Madsen, 725 = PI561725 og 727 = PI561727. Siderophore produktion blev vurderet efter 24, 48 og 72 h inkubation. Barer er standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det primære resultat af dette arbejde er produktion af en ny metode, der kan bruges til hurtigt berige for siderophore producerer mikrober mens kvantitativt måling siderophore produktion/aktivitet i den miljømæssige prøve. Metoden er hurtig, enkel og omkostningseffektiv, og resultaterne viser, hvordan det kan bruges til at registrere siderophore aktivitet fra komplekse og roman prøve typer (e.g., jord og plante væv). Protokollen også resulterer i produktionen af glycerol lagre af berigelse kulturer, som kan nemt tages gennem tiden til at rumme undersøgelser af forskydninger i mikrobielle samfund struktur og funktion under Fe mangel gennem DNA eller RNA baseret teknikker . Dem interesseret i at undersøge kinetik af siderophore aktivitet i økologiske undersøgelser kunne sandsynligvis også drage fordel af denne metode. Resultaterne viser også, at pyoverdine ækvivalenter (pyoverdines er vigtige siderophores med hensyn til miljøet28 og medicin29) giver en god metode til kvantitativ vurdering af siderophore produktion. En vigtig konklusion er at absorbans målinger på 665 nm er utilstrækkelige til at bestemme siderophore aktivitet sammenlignet med de observerede på 420 nm (figur 1). Særlig vigtig var konstateringen at absorbans ved 665 nm grupperet på tværs af en bred vifte af pyoverdine koncentrationer (Pyoverdine µM = 50-800 µM, log10(µM pyoverdine) = 0,18-0,76), tyder på en afsløring loft ved denne bølgelængde (figur 1b). det skal bemærkes, at mens pyoverdine blev en overlegen standard sammenlignet med EDTA, det er også dyrt, så det er foreslået at indledende arbejde er udført med EDTA eller andre omkostningseffektive chelatorer at sikre, at metoden, der er behersket før generere pyoverdine standarder.

Der er flere kritiske trin i hele protokollen, der kræver opmærksomhed. For det første er det vigtigt at fastholde metalfri glasvarer og andet bagværk så vidt muligt når arbejde med metaller, navnlig de nødvendige i lave koncentrationer, som Fe. For det andet fordi kulturer blev beriget til siderophore produktion igennem Fe begrænsning, er det vigtigt at opretholde aseptiske betingelser i hele arbejdsprocessen til at reducere indflydelsen af miljøforurenende. Endelig forberedelse af CAS-Fe-agar kræver omhyggelig opmærksomhed for detaljer og bør være forberedte som nøje kan beskrives som muligt. For eksempel, hvis CAS-Fe-agar løsning holdes varm men ikke bruges hurtigt, vil CAS-Fe bundfald. Desuden er det vigtigt at holde CAS-Fe-Agar varm under overførsel til mikrotiterplade. Dette blev opnået ved hjælp af opvarmet, sterilt sand og hurtigt overføre medium til mikrotiterplade i en biosikkerhed kabinet.

En begrænsning af metoden er, at fordi nogle planter producerer også siderophores (phytosiderophores); disse kan bidrage til målte siderophore aktivitet i berigelse kulturer af plante væv homogeniseret. Der var også relativt høj variation i resultaterne fra feltet replikater, flere replikering kunne være gavnlig i fremtidige undersøgelser. En anden begrænsning af teknik er, at mens metoden mikrotiterplade er høj overførselshastighed, prøven indsamling og forberedelse er tidskrævende. Stadig, fordi en enkelt mikrotiterplade kan bruges til 96 prøver (herunder standarder), de tids- og input er meget lavere sammenlignet med eksisterende teknikker. Dette er primært fordi andre eksisterende metoder afhængige udfører CAS-Fe assay i petriskåle30, som er i sagens natur mindre tid og omkostningseffektiv at forberede end en mikrotiterplade. Derudover fordi solubilized CAS-Fe komplekser er tilbøjelige til nedbør12, er den foreslåede metode ved hjælp af CAS-Fe-agarsubstratet overlegen i forhold til væske-baserede metoder, der har også tilpasses til 96-brønds format.

Med hensyn til de rapporterede resultater, at den primære forskel mellem PI561725 og PI561727 er tilstedeværelsen af ALMT1 vs.almt1, henholdsvis tyder resultaterne tilstedeværelsen af ALMT1 sandsynlige resultater i udvælgelsen af mikrobielle samfund i både planten og jorden, som har et større potentiale for siderophore produktion, som er vurderet via berigelse kulturer. Fremtidige arbejde skal yderligere at undersøge fænomenet ved hjælp af et større antal flergangsbestemmelser, især til at præcisere, hvis tilstedeværelsen af ALMT1 specifikt vælger for forbedret siderophore aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at videregive.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Kalyani Muhunthan for assistance i laboratorieprocedurer, Lee Opdahl for hvede genotype høst, Washington State Concord Grape Research Council og Washington State University Center for opretholdelse af landbrug og Naturlige ressourcer for en BIOAg tilskud til støtte for dette arbejde. Yderligere støtte blev leveret af USDA/NIFA gennem lugen projekt 1014527.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Apex LF451320014
Aluminum Baking Pan
Aluminum Foil
Ammonium chloride, granular Fiesher Scientific 152315A
Autoclave and Sterilizer Thermo Scientific
Calcium chloride dihydrate Fiesher Scientific 171428
CAS (Chrome Azurol S) Chem-Impex Int'l Inc) 000331-27168
Dextrose Monohydrate (glucose), crystalline powder Fiesher Scientific 1521754
EDTA, disodium salt, dihydrate, Crystal J.T.Baker JI2476
Glycerol, Anhydrous Baker Analyzed C22634
HDTMA (Cetyltrimethylammomonium Bromide Reagent World FZ0941
Hydrochloride acid ACROS Organic B0756767
Infinite M200 PRO plate reader TECAN
Iron (III) chloride hexahydrate, 99% ACROS Organic A0342179
Laboratory Fume Hood Thermo Scientific
Laboratory Incubator VWR Scientific
Magnesium Sulfate Fiesher Scientific 27855
Niric Acid, (69-70)% J.T.Baker 72287
PIPES buffer, 98.5% ACROS Organic A0338723
Potassium phosphate, dibaisc,powder J.T.Baker J48594
Pyoverdine SIGMA-ALDRICH 078M4094V
Sand
SI-600R Shaker Lab Companion
Sodium chloride, granular Fiesher Scientific 136539
Sodium hydroxide, pellets J.T.Baker G48K53
Sodium phosphate, dibasic heptahydrate, 99% ACROS Organic A0371705

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butaite, E., Baumgartner, M., Wyder, S., Kummerli, R. Siderophore cheating and cheating resistance shape competition for iron in soil and freshwater Pseudomonas communities. Nature Communications. 8, (2017).
  2. Ghirardi, S., et al. Identification of Traits Shared by Rhizosphere-Competent Strains of Fluorescent Pseudomonads. Microbial Ecology. 64, (3), 725-737 (2012).
  3. Hider, R. C., Kong, X. L. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27, (5), 637-657 (2010).
  4. Saha, M., et al. Microbial siderophores and their potential applications: a review. Environmental Science and Pollution Research. 23, (5), 3984-3999 (2016).
  5. Bhattacharyya, P. N., Jha, D. K. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR): emergence in agriculture. World Journal of Microbiology, Biotechnology. 28, (4), 1327-1350 (2012).
  6. Lewis, R. W., Islam, A., Opdahl, L., Davenport, J. R., Sullivan, T. S. Phylogenetics, Siderophore Production, and Iron Scavenging Potential of Root Zone Soil Bacteria Isolated from 'Concord' Grape Vineyards. Microbial Ecology. Accepted (2018).
  7. Li, S. S., et al. The opportunistic human fungal pathogen Candida albicans promotes the growth and proliferation of commensal Escherichia coli through an iron-responsive pathway. Microbiological Research. 207, 232-239 (2018).
  8. Lorenz, N., Shin, J. Y., Jung, K. Activity, Abundance, and Localization of Quorum Sensing Receptors in Vibrio harveyi. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
  9. O'Brien, S., Fothergill, J. L. The role of multispecies social interactions in shaping Pseudomonas aeruginosa pathogenicity in the cystic fibrosis lung. Fems Microbiology Letters. 364, (15), (2017).
  10. Ozkaya, O., Balbontin, R., Gordo, I., Xavier, K. B. Cheating on Cheaters Stabilizes Cooperation in Pseudomonas aeruginosa. Current Biology. 28, (13), (2018).
  11. Popat, R., et al. Environmental modification via a quorum sensing molecule influences the social landscape of siderophore production. Proceedings of the Royal Society B-Biological Sciences. 284, (1852), (2017).
  12. Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160, (1), 47-56 (1987).
  13. Sullivan, T. S., Ramkissoon, S., Garrison, V. H., Ramsubhag, A., Thies, J. E. Siderophore production of African dust microorganisms over Trinidad and Tobago. Aerobiologia. 28, (3), 391-401 (2012).
  14. Buyer, J. S., DeLorenzo, V., Neilands, J. B. Production of the siderophore aerobactin by a halophilic Pseudomonad. Applied and Environmental Microbiology. 57, (8), 2246-2250 (1991).
  15. Perez-Miranda, S., Cabirol, N., George-Tellez, R., Zamudio-Rivera, L., Fernandez, F. O-CAS, a fast and universal method for siderophore detection. Journal of Microbiological Methods. 70, (1), 127-131 (2007).
  16. Nakouti, I., Hobbs, G. A new approach to studying ion uptake by actinomycetes. Journal of Basic Microbiology. 53, (11), 913-916 (2013).
  17. Wang, L. J., et al. Diisonitrile Natural Product SF2768 Functions As a Chalkophore That Mediates Copper Acquisition in Streptomyces thioluteus. Acs Chemical Biology. 12, (12), 3067-3075 (2017).
  18. Retamal-Morales, G., et al. Detection of arsenic-binding siderophores in arsenic-tolerating Actinobacteria by a modified CAS assay. Ecotoxicology and Environmental Safety. 157, 176-181 (2018).
  19. Desai, A., Archana, G. Role of Siderophores in Crop Improvement. (2011).
  20. Dertz, E. A., Raymond, K. N. Comprehensive coordination chemistry II. Que, L., Tolman, W. B. 8, Elsevier, Ltd. (2003).
  21. Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7, 9 (2017).
  22. Bandyopadhyay, P., Bhuyan, S. K., Yadava, P. K., Varma, A., Tuteja, N. Emergence of plant and rhizospheric microbiota as stable interactomes. Protoplasma. 254, (2), 617-626 (2017).
  23. Lakshmanan, V., Castaneda, R., Rudrappa, T., Bais, H. P. Root transcriptome analysis of Arabidopsis thaliana exposed to beneficial Bacillus subtilis FB17 rhizobacteria revealed genes for bacterial recruitment and plant defense independent of malate efflux. Planta. 238, (4), 657-668 (2013).
  24. Sasaki, T., et al. A wheat gene encoding an aluminum-activated malate transporter. The Plant Journal. 37, (5), 645-653 (2004).
  25. Mahoney, A. K., Yin, C., Hulbert, S. H. Community Structure, Species Variation, and Potential Functions of Rhizosphere-Associated Bacteria of Different Winter Wheat (Triticum aestivum) Cultivars. Frontiers in Plant Science. 8, (132), (2017).
  26. Rayburn, A. L., Wetzel, J., Baligar, V. Mitotic analysis of sticky chromosomes in aluminum tolerant and susceptible wheat lines grown in soils of differing aluminum saturation. Euphytica. 127, (2), 193-199 (2002).
  27. McPherson, M. R., Wang, P., Marsh, E. L., Mitchell, R. B., Schachtman, D. P. Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments. Journal of Visualized Experiments. (137), 57932 (2018).
  28. Mirleau, P., et al. Fitness in soil and rhizosphere of Pseudomonas fluorescens C7R12 compared with a C7R12 mutant affected in pyoverdine synthesis and uptake. FEMS Microbiology Ecology. 34, (1), 35-44 (2000).
  29. Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: from biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15, (1), 22-30 (2007).
  30. Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of Blue Agar CAS Assay for Siderophore Detection. Journal of Microbiology, Biology Education. 12, (1), 51-53 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics