Visualisere værdiforringelse af endotel og Glial barrierer af neurovaskulære enhed under eksperimentelle Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vi præsenterer her, protokoller for at undersøge værdiforringelse af neurovaskulære enhed under eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis in vivo. Vi behandle specifikt, hvordan du bestemme blod - hjerne barrieren permeabilitet og gelatinase aktivitet involveret i leukocyt migration på tværs af glia limitans.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. J. Vis. Exp. (145), e59249, doi:10.3791/59249 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Den neurovaskulære enhed (NVU) er sammensat af mikrovaskulære endotelceller danner blod - hjerne barrieren (BBB), en endotel basalmembranen med integreret pericytes, og glia limitans sammensat af parenkymalt basalmembranen og astrocytic ende-feed omfavne abluminal aspekt af centralnervesystemet (CNS) microvessels. Ud over at opretholde CNS styrer homøostase i NVU immun celle indsmugling til CNS. Under immunosurveillance af CNS kan lave antal aktiverede lymfocytter krydser i endothelial barriere uden at forårsage BBB dysfunktion eller klinisk sygdom. Derimod under neuroinflammation som i multipel sklerose eller dens dyremodel kan eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis (EAE) et stort antal af immunceller krydse BBB og efterfølgende glia limitans nåede til sidst CNS parenkym fører til klinisk sygdom. Immun celle migration i CNS parenkym er således en to-trins proces, der involverer en sekventiel migration over endotel og glial barrieren af NVU ansætte forskellige molekylære mekanismer. Hvis efter deres passage på tværs i endothelial barriere, T-celler støder deres beslægtet antigen på perivascular antigen-præsenterer celler deres lokale reaktivering vil indlede efterfølgende mekanismer fører til fokale aktivering af gelatinases, som vil sætte T-celler til at krydse den glial barriere og Indtast CNS parenkym. Herigennem, vurdering af både BBB permeabilitet og MMP aktivitet i rumlige korrelationen til immun celle ophobning i CNS under EAE tillader for at angive tab af integritet i endothelial og glial hindringer af NVU. Her viser vi hvordan du fremkalde EAE i C57BL/6 mus ved aktiv immunisering og efterfølgende analysere BBB permeabilitet in vivo, ved hjælp af en kombination af eksogene fluorescerende sporstoffer. Yderligere viser vi, hvordan man visualisere og lokalisere gelatinase aktivitet i EAE hjerner af in situ zymogaphy koblet til immunfluorescent stainings BBB kælderen membraner og CD45 + invaderende immunceller.

Introduction

Det centrale nervesystem (CNS) koordinerer alle krop og mentale funktioner i hvirveldyr, og CNS homeostase er afgørende for en korrekt kommunikation af neuroner. CNS homeostase er berettiget af den neurovaskulære enhed (NVU), som beskytter CNS fra blodet skiftende miljø. NVU er sammensat af CNS mikrovaskulære endotelceller, som er biokemisk unikke og etablere blod - hjerne barrieren (BBB) i kontinuerlig krydstale med pericytes, astrocytter, neuroner og ekstracellulære matrix (ECM) komponenter, oprettelse af to særskilte kælderen membraner1. I endothelial basalmembranen at ensheathes abluminal aspekt i endothelial celler, BBB havne et stort antal af pericytes og er sammensat af laminin α4 og laminin α5, ud over andre ECM proteiner2. Derimod parenkymalt basalmembranen består af laminin en1 og laminin en2 og omfavnet af astrocytic end-fødder. Parenkymalt basalmembranen sammen med astrocyte ende-fødder komponerer glia limitans, der udskiller CNS neuronal netværk fra cerebrospinalvæsken fyldt perivascular eller subarachnoidale rum3. På grund af den unikke arkitektur af NVU er immun celle indsmugling til CNS adskiller sig fra, at i perifere væv som det kræver en totrinsproces med immunceller, først misligholdelse i endothelial BBB og efterfølgende glia limitans for at nå CNS parenkym.

Multipel sklerose (MS) er en fælles neuroinflammatory sygdom i CNS, hvor et stort antal cirkulerende immunceller Angiv CNS og forårsage neuroinflammation, demyelinering og fokale tab af BBB integritet4. Tab af BBB integritet er en tidlige kendetegnende for MS, som angivet ved tilstedeværelsen af gadolinium kontrast styrke læsioner i CNS som visualiseret ved magnetisk resonans imaging (MR)5. Leukocyt ekstravasation i CNS opstår på niveau med postcapillary venules; de præcise mekanismer involveret i immun celle diapedesis på tværs af BBB basalmembranen og efterfølgende glial barriere er dog stadig at blive udforsket. Eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis (EAE) fungerer som en dyremodel for MS og har bidraget betydeligt til vores nuværende viden om MS patogenese. For eksempel, er ved hjælp af EAE model det blevet opdaget at leukocyt ekstravasation opstår i en omstændelig proces, herunder en indledende tilfangetagelse og rullende trin medieret af selectins og mucin-lignende molekyler såsom P-selectin glycoprotein ligand (PSGL) -1, efterfulgt af integrin-afhængige fast anholdelse og kravler af T-celler på BBB endotelceller til eftergivende sider til diapedesis6.

Når T-celler har passeret i endothelial BBB og i endothelial basalmembranen, de har brug at støde deres beslægtet antigen på makrofager og dendritiske celler strategisk lokaliseret i leptomeningeal eller perivascular mellemrummene. Denne interaktion inducerer fokale produktion af pro-inflammatoriske mediatorer der udløser de efterfølgende mekanismer kræves for CNS væv invasion af immunceller via glia limitans7,8,9. Fokale aktivering af matrix-metalloproteinases (MMP) -2 og MMP-9 ændrer chemokine aktivering og inducerer nedbrydning af ekstracellulære matrix receptorer på astrocyte ende-fødder, hvilket er en forudsætning for immun celle migration på tværs af glia limitans ind i den CNS parenkym og til at fremkalde den kliniske symptomdebut EAE10,11.

Kombinere påvisning af CNS infiltrerer immun celle med BBB giver lækage og gelatinase aktivitet i CNS væv sektioner værdifulde oplysninger om funktionelle integritet i endothelial og glial barrieren i forbindelse med neuroinflammation. For eksempel, vi for nylig undersøgt de konstitutive tab i endothelial tight junction molekyle junctional vedhæftning molekyle (JAM)-B i immun celle indsmugling til CNS i forbindelse med EAE. I forhold til sund vildtype C57BL/6 mus, sund JAM-B-mangelfuld littermates viste ingen forringelse af BBB integritet, som det fremgår af in vivo permeabilitet vurdering ved hjælp af endogene samt eksogene røbestoffer12. I forbindelse med EAE, JAM-B-mangelfuld C57BL/6 mus viste afhjælpes sygdomssymptomer, som var forbundet med inflammatoriske celle diffusering i leptomeningeal og perivascular rum12. For at undersøge dette fænomen vi anvendte i situ zymography, så identifikation af gelatinase aktivitet for at teste, hvis manglende gelatinase aktivitet i JAM-B-mangelfuld mus kan være ansvarlig for den reducerede antallet af immunceller stand til at bryde den glia limitans12.

Givet tilgængeligheden af genmodificerede forskellige mus modeller mangler, fx forskellige BBB tight junction molekyler, der kan forårsage ændringer i BBB funktion, metoder til at undersøge BBB integritet er vigtigt. Derudover kan nyudviklede stoffer indvirke på NVU barrierer. Her viser vi hvordan du fremkalde EAE i C57BL/6 mus ved aktiv immunisering med myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG)-peptid aa35-55 i komplet Freund adjuvanser. Vi så forklare hvor hen til lokalisere immun celle infiltration over i endothelial og glial barrierer af NVU og hvordan at studere in vivo endotel og glial barriere integritet af in situ påvisning af eksogene roebestoffer og gelatinase aktivitet, henholdsvis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle undersøgelser blev gennemført under retningslinjerne efter den schweiziske lovgivning om beskyttelse af dyr og blev godkendt af Veterinærkontoret i kanton Bern, Schweiz (tilladelse numre: BE 31/17 og være 77/18).

1. boliger af C57BL/6 mus i specifikke patogen gratis (SPF) betingelser

  1. Hus mus i individuelle ventileret bure med en 12/12 h lys-mørke cyklus. Leverer mad og vand ad libidum. For at overvåge mikrobiologiske kvalitet af mus, undergik den eksperimentelle kohorte kvartalsvise sundhedsovervågning af beskidt sengetøj sentinels følge FELASA anbefalinger13.
  2. Brug øret slag til individuelt mark 8-12 uge gammel C57BL/6 hunmus.

2. vaccination af C57BL/6 mus

  1. Forberedelse af løsninger14:
    1. For komplet Freund adjuvans (CFA), inaktiveret mix 30 mL af ufuldstændige Freund adjuverende med 120 mg frisk pestled varme Mycobacterium tuberculosis (H37RA) under et stinkskab. Gemme stamopløsning ved 4 ° C.
    2. For MOGaa35-55-peptid stamopløsning, opløses MOGaa35-55-peptid i steril PBS (4 mg/mL) og opbevares ved-80 ° C.
    3. Forberede MOG-emulsion:
      1. Fortynd CFA 1:2 med MOG-peptid stamopløsning i et 2 mL microtube.
      2. Forsegle microtube med forsegling film og fastsætte en Vortex-mixer fra helt dækker tube med dobbeltklæbende tape. Vortex emulsion i 4 timer ved 4 ° C.
    4. Forberede sprøjter med stabilt emulsion:
      1. Tag microtube og hurtigt spin ned emulsion ved hjælp af en lille tabel centrifuge. Indsamle emulsion i en sprøjte ved hjælp af en 18G x 1½'' (1,2 mm x 40 mm) injektion nål.
      2. Efter antallet af mus justere emulsion lydstyrken i sprøjten (100 µL/mus) og erstatte 18 G nåle med 27G x ¾'' (0,4 mm x 19 mm) injektion nål. Forsegle injektion nålen knyttet til sprøjte med forsegling film.
    5. For pertussis toksin (PTx) stamopløsning, opløses 50 µg af frysetørrede PTx i 500 µL sterilt PBS (100 ng/µL). Gemme stamopløsning ved 4 ° C.
    6. For brugsopløsning PTx Bland 97 µL sterilt PBS med 3 µL af PTx stamopløsning (300 ng/100 µL) pr. mus (for intraperitoneal injektion brug 30G x ½'' (0,3 mm x 13 mm) nål).
  2. EAE induktion
    1. Bedøver C57BL/6 mus med isofluorane ved hjælp af en vaporizer system. For at fremkalde anæstesi i mus, afsløre musen til 4,5% isofluorane i ilt i et lille inkubation kammer inden flytningen musen til en ansigtsmaske med 2,1% isofluorane. Bruge en anæstesi enhed udstyret med varme pad til at forhindre hypotermi af musen.
    2. Fix bedøvede musen i den ene hånd og først injicere 30 µL af MOG35-55/CFA-emulsion subkutant i bagben flanker (figur 1:1 + 2; i alt 60 µL; venstre flanke 30 µL og højre flanke 30 µL) i umiddelbar nærhed af de lyskelymfeknuder lymfeknuder.
    3. Placer musen på sin mave og tilføre den venstre og højre blødt fedtvæv hale roden 20 µL af MOGaa35-55/CFA-emulsion (figur 1:3 + 4 i alt 40 µL; venstre side hale roden 20 µL og højre hale roden 20 µL) og en lille dråbe af MOGaa35-55/CFA-emulsion int o halsen af musen (figur 1: 5).
    4. Indsprøjtes 100 µL af PTx løsning intraperitoneal i musen. Hold hovedet af musen under byens kroppen at undgå injektion i tarmen.
    5. Erstatte vedligeholdelse kost (extrudate vigtige næringsstoffer: råprotein 18,5% rå fedt 4,5% grov fiber 4,5%, råaske 6,5%; stivelse 35%; metaboliske energi: 13,1 MJ/kg) til avl kost (extrudate vigtige næringsstoffer: råprotein 23,5%; rå fedt 5,5%, grov fiber 3%; råaske 5,7%; stivelse 36%; metaboliske energi: 14,3 MJ/kg) for at give musene med mad af højere energiindhold, før og under den forventede kliniske sygdom.
    6. Fjerne ansigtsmaske og overføre musen til sit hjem bur med en opvarmning pad. Sørg for, at musen er fuldt vågen og motile efter 10 minutter.
    7. Gentag PTx injektion (2.2.4) 48 timer efter den første behandling.

3. scoring af EAE mus

  1. Kontrollere sundhedstilstanden af EAE mus hver morgen ved at tage et kig inde i bure.
  2. Score EAE mus hver eftermiddag.
  3. Tage alle de individuelle mus inkluderet i EAE eksperiment ud af buret og check om halen har tonus ved at flytte den opad med fingeren. En sund mus vil holde halen (halen har en tonus). Hvis klinisk EAE har startet, vil hale tonus være lavere, synlig ved en gradvis nedgang af halen. Til sidst vil musen ikke kunne løfte halen på alle.
  4. Placere alle de individuelle mus inkluderet i EAE eksperiment på den rene bænk og iagttage og dokumentere den omvandrende adfærd. Se tabel 115 for scoring kriterier for vurdering af sygdommens sværhedsgrad (EAE score).
  5. Vurdere og dokumentere vægten af alle de mus inkluderes i eksperimentet.
  6. For at sikre tilstrækkelig mad og vand optagelse af mus viser en klinisk EAE score på 1 levere fugtede mad i en plastik skål i bunden af buret og opdateres dagligt.

4. In vivo permeabilitet assay

  1. Forberedelsen af løsninger:
    1. Dextran stamopløsninger, opløse 10 mg i 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 samt 3 kDa Dextran Texas rød i 500 µL af 0,9% natriumchlorid løsning (20 mg/mL).
    2. For brugsopløsning dextran lige før injektion afpipetteres 55 µL af 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 materiel løsning (20 mg/mL) på et stykke af forsegling film og tilføje 55 µL af 3 kDa dextran Texas rød stamopløsning (20 mg/mL). Bland og indsamle 100 µL i en engangs fine sprøjte (endelig koncentration 2 mg/100 µL).
    3. For de 10% formaldehyd (PFA) stamopløsning, kombinere 10 g af PFA ekstra ren pulver, 100 mL PBS og 200 µL af 1N NaOH i et rent glas bægerglas og varme op til præcis 56 ° C under omrøring med en magnetomrører; holde ved 56 ° C i 30 min. indtil PFA er helt opløst; køle ned til stuetemperatur; justere pH til 7.4. og filtreres gennem et filter af papir. Opbevares ved - 20 ° C. Stamopløsningen kan fortyndes yderligere ved hjælp af PBS.
  2. Snart bedøver sunde C57BL/6 mus eller C57BL/6 mus lider EAE med isofluran (musen vil blive bedøvet for ca 1 min). Bruge et automatisk system som i trin 2.2.1 (mus bliver udsat for 4,5% isofluran ilt i en induktion kammer og derefter overføres til en ansigtsmaske med 2,1% isofluran).
  3. Opstille den bedøvede mus i sideleje på bordet, derefter intravenøst (fx retro-orbitally) indsprøjtes 100 µL af fluorescerende sporstoffer i musen, før musen vågner op.
  4. Umiddelbart fjerne ansigtsmaske og sørg for, at musen er fuldt vågen og motile efter den korte anæstesi. Lad tracer cirkulere i 15 min.
  5. Fortsæt med trin 5.1.

5. perfusion af mus

  1. For in vivo permeabilitet vurdering:
    1. Starte procedure 15 min efter fluorescerende tracer injektion ved at inducere dyb isofluran anæstesi. For at fremkalde dyb anæstesi i mus bruger 2,3% af isofluran i ilt. Bruge pote tilbagetrækning refleks for at bedømme dybden af anæstesi (klemme huden mellem tæerne, en mangel på fleksion angiver en tilstrækkelig dybde), og sonde reflekser af både forelimb og hindlimb i mus udsættes for EAE.
    2. Ret musen på ryggen og spray bugen med ethanol. Åbne brystkassen ved hjælp af en saks og fjerne mellemgulvet. Åbn højre atrium af bankende hjerte ved hjælp af en saks og perfuse musen gennem den venstre hjertekammer af hjertet med 10 mL PBS efterfulgt af 10 mL af 4% PFA i PBS.
      Forsigtig: For at undgå at indånde PFA, perfuse musen i et stinkskab.
    3. Gå videre til afsnit 6.
  2. For i situ zymography:
    1. Fremkalde dyb isofluran anæstesi med 2,3% isofluran ilt i en mus lider EAE, og kontrollere dybde af anæstesi som i trin 5.1.1.
    2. Næste, lave musen på ryggen og spray bugen med ethanol. Åbne brystkassen ved hjælp af en saks og fjerne mellemgulvet. Åbn højre atrium af bankende hjerte ved hjælp af en saks og perfuse musen gennem den venstre hjertekammer af hjertet med 20 mL PBS.
    3. Gå videre til afsnit 6.

6. dissektion og indefrysning af hjerner

  1. Forberedelse af køling bad:
    1. Fylde en flade dewar container med knust tøris og tilføje 2-methylbutane (Isopentane), indtil væsken når omkring 1 cm over tøris pack. Dække med en løs låg – fx en isspand dækning.
  2. Klip fra lederen af perfused musen med en skarp saks og fjerne hud og ører ved hjælp af et mindre sæt af saks.
  3. Omhyggeligt dissekere kalot af skæring fra foramen magnum mod fronten på venstre og højre side gør det muligt at upfold kalot over hjernen. Derefter, løft forsigtigt ud intakt hjernen fra bunden af kraniet mens severing optiske nerver med en flad metal spatel.
  4. Placere hjernen på aluminiumsfolie og klippe hjernen i tre stykker (frontal hjernen, midterste hjernen og lillehjernen + hjernestammen) ved at placere to koronale nedskæringer.
  5. Udfylde en cryomold (25 mm x 20 mm x 5 mm) til første kvartal med optimal temperatur skæring (O.C.T.) matrix, sted hjernen skiver med den forreste side af hvert hjernen stykke vender nedad i cryomold og dække væv helt med O.C.T. matrix.
  6. Placer cryomold med vævet i en horisontal orientering til 2-Methylbutane badekar og sørg for, at vævet fryser fra bunden til toppen i 1 minut ved at undgå at dyppe hele væv blokken ind i badet.
  7. Overføre frossen væv til-80 ° C til opbevaring og Fortsæt med kapitel 7.

7. forberedelse af frossen væv sektioner

  1. Reagensglasset temperatur fra frossen væv fra-80 ° C-20 ° c i kryostaten i 30 min.
  2. Fjern væv blok fra cryomold og mount på kryostater væv indehaveren (indstillet til-15 ° C) ved hjælp af O.C.T. matrix.
  3. Trim kanterne af væv blok på indehaveren af kryostaterne med en skarp skalpel, og begynder at skære i væv blok ved at fjerne 20 µm sektioner med kryostaten kniv, indtil væv er synlige.
  4. Til analyse af in vivo BBB permeabilitet:
    1. Skær 6-10 µm væv sektioner, indsamle dem på vedhæftning glas lysbilleder, og straks billede afsnittene dækkes med et dække slip ved hjælp af et fluorescens mikroskop.
    2. Vurdere udseende af blodkar i hjernen (Vær opmærksom på skarpe kanter af ikke-utætte blodkar sammenlignet med diffuse fluorescens mønstre observeret for Utætte blodkar). Som positiv kontrol, skal du kontrollere udsivningen af sporstof ind i grønkornets stroma circumventricular organer eller plexus chorioideus, som mangler en BBB.
  5. For i situ zymography:
    1. Skær 6 µm væv sektioner ved hjælp af en kryostaten, indsamle dem på vedhæftning glas lysbilleder, og fryse væv sektioner på-20 ° C i en indefrysning kasse med silicagel i låget.

8. in situ zymography kombineret med laminin/CD45 immunofluorescens farvning

  1. Forberede løsninger:
    1. Forberede indlejring løsning:
      1. Bland 6 g af glycerol (analysekvalitet), 2,4 g af poly (vinylalkohol), 6 mL af ddH2O og 12 mL 0,2 M Tris buffer, pH 8, og rør (magnetomrører) løsning til 4 h på RT.
      2. Opløsningen overføres til en 50 mL-centrifugerør og lad det hvile i 2 timer ved RT. Efterfølgende Inkuber løsning i 10 min ved 50 ° C (vandbad), og der centrifugeres i 20 min. på 2.700 x g ved stuetemperatur.
      3. Tage supernatanten og fryse i alikvoter ved-20 ° C.
    2. Forberede kolde gelatine løsning:
      1. Opløses 0,1 g af kolde gelatine fra kvæg huden i 10 mL af ddH2O.
      2. Lad det trække i mindst 1 dag og gemme alikvoter ved 4 ° C.
    3. Forberede iskold methanol (-20 ° C):
      1. Sætte 100% methanol i en coplin krukke og køle ned til-20 ° C.
    4. Forberede 10% natrium indeholder stamopløsning:
      1. Tilføje 1 g af natriumazid til 10 mL af ddH2O og opbevares ved stuetemperatur.
    5. Forberede 0,1% natrium indeholder brugsopløsning:
      1. Mix 99 µL af ddH2O med 1 µL af 10% natrium indeholder stamopløsning.
    6. Opløs 1 mg af fluorescein konjugeret dye-slukkes (DQ) gelatine fra svinehud i 1 mL natriumazid arbejder løsning og store 100 µL delprøver beskyttet mod lys ved 4 ° C.
    7. Opløs 30 mg af 1,10-phenanthroline monohydrat i 76 µL af ethanol og opbevares ved-20 ° C.
    8. Forberede 25 x protease hæmmer løsning:
      1. Tilføj 1 tablet af EDTA gratis protease hæmmer til 2 mL af ddH2O. Opbevares ved-20 ° C.
    9. Lige før brug, forberede reaktion løsning (150 µL/afsnit):
      1. Der centrifugeres 1 mg/mL DQ gelatine løsning for 5 min på 13,300 x g.
      2. Mix 127.2 µL af ddH2O, 15 µL af 10 x reaktion buffer (Gelatinase/Collagenase Assay Kit; Se Tabel af materialer), 0,3 µL af 20 mg/mL koldt gelatine, 1,5 µL af 1 mg/mL DQ gelatine og 6 µL af 25 x protease hæmmer løsning.
    10. Lige før brug, forberede phenantroline negativ kontrol reaktion løsning (150 µL/afsnit):
      1. Mix 125.2 µL af ddH2O, 15 µL af 10 x reaktion buffer, 0,3 µL af 20 mg/mL koldt gelatine, 1,5 µL af 1 mg/mL DQ gelatine, 6 µL af 25 x protease hæmmer EDTA gratis og 2 µL af 2 M 1,10-phenantroline (MMP hæmmer).
    11. Lige før brug, forberede kolde gelatine (ikke-fluorescerende) negativ kontrol reaktion løsning (150 µL/afsnit):
      1. Mix 128.7 µL af ddH2O, 15 µL af 10 x reaktion buffer, 0,3 µL af 20 mg/mL koldt gelatine og 6 µL af EDTA-gratis 25 x protease hæmmer.
    12. Forberede primære antistof cocktail for counterstaining, for eksempel, 0,95 g/mL polyklonale kanin anti-laminin antistof og 10 µg/mL polyklonale rotte anti-CD45 antistof i 1% BSA i PBS, og udarbejde passende isotype kontrol primære antistof cocktails.
    13. Forberede sekundær antistof løsning, for eksempel, 7,5 µg/mL Cy3 ged anti-rotte + 15 µg/mL AMCA anti-kanin i 1% BSA i PBS (beskyttelse mod lys).
  2. Tø 6 µm ikke-fast hjernen væv sektioner fra EAE mus inde i plast indefrysning kassen indeholdende silica gel i låget i et stinkskab at undgå opbevaring af vand til væv og adskille 2 væv sektioner på ét dias ved at tegne linjer med vand repelling pen
  3. Forberede reaktion løsninger (trin 8.1.9-8.1.11), centrifugeres i 5 min på 13.400 x g ved stuetemperatur, og før varme til 37 ° C ved hjælp af et vandbad.
  4. Rehydrere afsnittene væv i 5 min ved 37 ° C ved hjælp af 1 x reaktion buffer. Derefter, hæld 1 x reaktion buffer, tilføje reaktion løsning på afsnittene væv og Inkuber i 4 timer ved 37 ° C. Vask dias 5 gange i ddH2O.
  5. Fix sektioner for 5 min med iskold methanol ved-20 ° C og bagefter vaskes sektioner med PBS ved stuetemperatur.
  6. Tilsættes 1% BSA i PBS afsnittene og der inkuberes i 20 min. ved stuetemperatur (beskyttelse mod lys). Derefter, kassere 1% BSA i PBS fra afsnittene af flipping dias på væv, tilføje primære antistof cocktail og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur (beskyttelse mod lys).
  7. Vaske sektioner to gange med PBS, tilføje sekundær antistof cocktail og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur (beskyttelse mod lys).
  8. Vaske sektioner to gange med PBS, montere dias med indlejring løsning, lad tilsluttede sektioner tørrer over natten ved stuetemperatur (beskyttelse mod lys). Endelig, analysere farves væv sektioner ved hjælp af et mikroskop for fluorescerende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vurdering af det kliniske forløb af EAE i C57BL/6 mus bør resultere i en sygdom kurven som afbilledet i figur 2A og ændringer i kropsvægt mus som præsenteret i figur 2B. C57BL/6 mus immuniseret med MOGaa35-55 normalt begynde at udvikle sygdomssymptomer omkring dag 10-12 efter aktiv immunisering (figur 1A). Typisk, immuniserede mus viser et forbigående fald i kropsvægt dagen efter injektion af emulsion og den første dosis af kighoste toksin (figur 1B). Fra dag 2 efter EAE induktion øges kropsvægt af immuniserede mus derefter gradvist indtil sygdommen starter, når kropsvægten typisk falder én dag forud for udviklingen af kliniske symptomer og fortsætter med at falde korrelerede til den stigende sygdomssymptomer (figur 1A,B). EAE sygdommens sværhedsgrad stiger til toppen af den sygdom, der kan forventes mellem dage 16 og 20 efter EAE induktion (figur 2A). På toppen af kliniske EAE vise mus også den laveste kropsvægt (figur 2B), hvilket øger i korrelation til forbedring af EAE i fasen remission af sygdommen (figur 2A,B). EAE induktion i C57BL/6 mus bruger MOGaa35-55 resultater i en kronisk sygdom patologi og mus typisk ikke fuldt ud genvinder (figur 1A).

Figur 3A viser et repræsentativt billede af plexus chorioideus og tilstødende hjernen parenkym C57BL/6 musen lider EAE, var intravenøst sprøjtes med fluorescerende 3 kDa Dextran (rød) og 10 kDa Dextran (grøn) 15 min før at ofre ; skalere bar 50 µm. Som vi tidligere har påvist, angivet røbestoffer let diffus på tværs af den fenestrated microvessels til stomien af plexus chorioideus (venstre og midterste billede), mens BBB ikke tillader diffusion af cirkulerende røbestoffer i hjernen parenkym, ved den stiplede linje (højre billede), som er således blottet for enhver fluorescerende signal. Figur 3B viser repræsentative utætte blodkar i lillehjernen med C57BL/6 musen lider EAE, var intravenøst sprøjtes med fluorescerende 3 kDa Dextran (rød) og 10 kDa Dextran (grøn) 15 min før at ofre. Pilespidser angive røbestoffer spredt på tværs af hjernen microvessels i CNS parenkym (venstre og midterste billede), hvilket tyder på, at funktionen BBB er forringet i disse fartøjer. I CNS parenkym er rød og grøn fluorescerende signal synlige uden for blodkarrenes vægge, som angives med stiplede linjer. I EAE, kan i lillehjernen hvor inflammatoriske manchetter vises røbestoffer også findes i perivascular rum mellem i endothelial basalmembranen og glia limitans med angivelse af funktionelle tab i endothelial BBB integritet. Hvis tracer er fundet for at diffuse i hjernen parenkym, viser det yderligere dysfunktion af glial barriere12.

Figur 4 viser repræsentative billeder af analysen af gelatinase (MMP) aktivitet i en EAE hjerne af en C57BL/6 mus visualiseret af in situ zymography og lokaliseret til specifikke hjerne barrieren rum af anti-pan-laminin (blå) og tilstedeværelsen af inflammatoriske celler af anti-CD45 (rød) immunofluorescens farvning. Proteolytisk kløvningen af dye-slukkes (DQ) gelatine unquenches en fluorescein signal, som giver mulighed for lokalisering af gelatinase aktivitet på afsnittet væv. Når kold gelatine (ikke-fluorescerende kontrol) er udruget, ingen grøn fluorescerende signal kan registreres i hjernen sektioner fra EAE mus (øverste række) samt i sektioner, der har været inkuberet med DQ-gelatine kombineret med phenantroline, en potent Zn +- kompleksdannende middel og MMP inhibitor (midterste række). I den nederste række er fokale gelatinase/MMP aktivitet synlig som typisk kornede lyse grønne fluorescens signal, som fremhævet af pilespidserne. I inflammatorisk manchetter i lillehjernen af en EAE mus forekommer specifikke MMP aktivitet ud over glia limitans (blå) på websteder af inflammatoriske celler infiltration (rød).

Figure 1
Figur 1 : Grafisk repræsentation af injektionssteder for EAE induktion. 1) injektionsstedet til 30 µL MOG-emulsion til højre flanke, 2) injektionsstedet til 30 µL MOG-emulsion i venstre flanke, 3) injektionsstedet til 20 µL MOG-emulsion i venstre hale roden, 4) injektionsstedet til 30 µL MOG-emulsion i den højre hale roden 5) injektionsstedet til en lille dråbe af MOG-emulsion i halsen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Repræsentant forløbet af EAE. (A) sygdomssymptomer på EAE i C57BL/6 mus over tid. Betyde +/-SEM er vist. (B) ændring i legeme last under EAE over tid. Betyde +/-SEM er vist.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Repræsentativt billede af in vivo permeabilitet. (A) venstre billede: grøn fluorescerende 10 kDa dextran på niveauet af plexus chorioideus. Midterste billede: rød fluorescerende 3 kDa dextran på niveauet af plexus chorioideus. Højre billede: flette de højre og midterste billeder. Skala bar 50 µm. (B) venstre billede: grøn fluorescerende 10 kDa dextran i mus lillehjernen. Midterste billede: rød fluorescerende 3 kDa dextran i mus lillehjernen. Højre billede: fletning af de venstre og mellemste billeder. Stiplede linjer er vejledende for blodkarrenes vægge; pilespidser peg på fluorescerende sporstoffer i CNS parenkym. Skala bar 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Repræsentant billeder af i situ zymography. Første kolonne: grøn fluorescerende kanal (unquenched signal af dye-slukkes (DQ) gelatine). Anden kolonne: blå fluorescerende kanal (laminin). Tredje kolonne: rødt fluorescerende kanal (CD45). Fjerde kolonne: fletning af fluorescerende kanaler. Øverste række: kolde gelatine (ikke-fluorescerende) negativ kontrol. Mellemste række: phenantroline (MMP-hæmmer) negativ kontrol. Laveste række: DQ gelatine. Skala bar 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

0-3 point score kriterier vægtændring
0 ingen tegn normal vægt
~ svage hale (svage tonus) - inhouse kriterier: ikke inkluderet i dokumenterede scoring vægttab (vejledende for 2nd check)
0,5 Limp hale (hale dråber) vægttab
1 hindleg svaghed, usikker gangart (musen gåture på bænken som en and) vægttab
2 hindleg paraplegi (musen bevæger sig ikke sin hindlimbs) svær vægttab (vejledende for 2nd check)
3 hindleg paraplegi, inkontinens tab af lavere organ kontrol (musen falder til en side men kan flytte i buret ved hjælp af ist forben + inkontinens; døende) meget lav kropsvægt (vejledende for 2nd check)

Tabel 1: Scoring kriterier for vurdering af EAE sygdommens sværhedsgrad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi præsenterer her, en protokol for at fremkalde og overvåge EAE i C57BL/6 hunmus. Hunnerne er fortrinsvis valgt, og der er en forekomst af kvinder: mænd 3:1 i MS. For at vurdere sværhedsgraden af EAE, vi har gjort brug af en 3-punkts scoring ark. EAE sværhedsgraden er generelt scorede med hensyn til sværhedsgraden af motor dysfunktioner. Mus med avancerede stadier af EAE, dvs udstiller en score over 2 må ofres for at undgå unødvendige lidelser for dyrene. Derfor anbefales det at score mus med tætte mellemrum f.eks. to gange dagligt som forklaret i protokollen.  Der er flere scoring rutiner ansat, at nå fra 0-3 point til 0-6 point16,17,18,19 , eller endnu mere subpoints20. Vi har dog tidligere vist at angiveligt raffineret EAE scoring ikke medføre nogen forbedring i bestemmelse af potentielle statistisk signifikante forskelle i sygdom scorer mellem grupper, når de overvejer de samlede sygdom sværhedsgrad15. Baseret på denne observation vi gjort brug af 3-punkts skala for at vurdere sygdomsprogression i EAE for at reducere mus ekspeditionstid således nød for mus gennemførelsesbestemmelser 3R. Et andet kritisk punkt ved hjælp af EAE model til at studere forskellene mellem knockout og wild-type mus eller forskelle mellem behandlingsgrupper er ved at oprette en præcis eksperimentelle planlægning. Sammenlignet wild-type mus til knockout mus, er det vigtigt at sammenligne littermates med oprindelse fra heterozygous parringer for at sikre identiske genetiske baggrunde af wild-type og knockout mus sammenlignet i EAE eksperiment. Det er også vigtigt at holde de samme betingelser for alle mus inkluderet i et eksperiment, fx ændringer i bur, administration af anti-afholdsmand næring, og især med musen boligforhold (tilstand). For at undgå bur-specifikke fænomener induceret af investigator, bør cross-vaccination udføres. Mere præcist, hvis mere end én sprøjten er nødvendig for at vaccinere en række mus, bør de være tilfældigt tildelt forskellige sprøjter anvendes. Sidstnævnte bør ligeledes anvendes til udførelse af undersøgelser, behandling. Sidst men ikke mindst, sundhedstilstanden hos mus har til huse i forskellige dyrs faciliteter kan have indflydelse på sygdomsforekomst og sværhedsgraden og dermed mere21 eller mindre Mycobacterium tuberculosis22 kan være forpligtet til at fremkalde en ordentlig kliniske sygdom. Derudover kan injektionsstedet indvirkning på udvikling af sygdom. I denne protokol foreslår vi at injicere relativt små mængder i fem forskellige subkutane websteder: 30 µL i to bredder, 20 µL til venstre og højre hale roden, og en lille dråbe i nakken. I andre protokoller placeret 50 µL depoter subkutant i hale roden kun23 eller i de fire flanker21. Injektioner af mindre depoter, minimere dog risiko for at forårsage hudirritation, hvilken mus kan forsøge at ridse.

In vivo permeabilitet kan udføres til at vurdere BBB lækage under EAE, men også at vurdere, om den specifikke genetiske sletning af et molekyle eller en narkotikabehandling indvirkning på BBB integritet in vivo. Dette kan være udført enten af påvisning af endogene plasma røbestoffer såsom IgG indskud12 eller eksogen trancer, der anvendes til omsætning af en levende mus24. I denne protokol vi gjort brug af to forskellige eksogene røbestoffer (3 kDa og 10 kDa Dextran), der blev samtidig injiceres og lov til at cirkulere til en defineret tid i 15 min. ved hjælp af to røbestoffer med forskellige størrelser giver mulighed for at bestemme sværhedsgraden af BBB dysfunktion og kan gøre det muligt for at definere en cutoff for tracer størrelser at diffuse eller ikke på tværs af BBB. Fluorescerende dextrans er hydrofile polysaccharider karakteriseret ved god vandopløselighed, lav toksicitet, og lav relativt immunogenicitet. Derudover er dextrans sammensat af poly-(α-D-1,6 glukose), som er resistente over for spaltning af endogene cellulære glykosidaser. Her brugte vi dextran varianter, der har lysin restkoncentrationer indarbejdet i dextran konjugat. Lysinated dextrans er aldehyd fixable, som giver mulighed for at fastsætte sporstof i vævet. Udover fluorescently mærket dextrans, kan andre kemikalier bruges til at vurdere in vivo permeabilitet, f.eks., Hoechst farvestof i kombination med Evans blå, som binder sig til en stor del til serum albumin. Hoechst pletter i endothelial cellekerner fra BBB foring CNS microvessels, og Evans blå kan påvises i perivascular rum på BBB dysfunktion og spreder yderligere når glia limitans er forstyrret25,26. Derimod giver vurderer in vivo permeabilitet af immunfluorescent farvning af endogene markører indblik i ophobning af fx IgG molekyler eller fibrinogen, et glykoprotein, der cirkulerer i blodet over tid. I sund betingelser, perivascular rum er meget smalle og i endothelial basalmembranen og glia limitans er tæt forbundet og, således, visualisere de to ECM hindringer af NVU kræver laminin isoform-specifikke antistof farvning27 .

Endogene IgG molekyler er til stede under sundhed og sygdom inde i blodkarrene, der så godt som i væv af circumventricular organer, hvor ingen BBB er etableret12. I gen modificeret mus med hjerne barrieren mangler, under medicinsk behandling, eller under neuroinflammation endogene molekyler, der normalt cirkulerer i blodet kan deponeres i CNS parenkym, som kan visualiseres ved counterstaining med anti-laminin antistoffer enten anerkende alle laminin isoformer (pan-laminin antistoffer) eller laminin isoform-specifikke antistoffer gør det muligt for at differentiere laminins, laminin α4 og α5 fra i endothelial basalmembranen og laminin en1 og laminin en2 fra glia limitans. Under neuroinflammatory forhold kan perivascular rum udvides af infiltrerer immunceller, der gør det muligt for at identificere både i endothelial basalmembranen og glia limitans ved hjælp af en pan-laminin antistof. Counterstaining af laminins findes på NVU giver mulighed for at vurdere, om endogene men også eksogene røbestoffer er deponeret i CNS parenkym og counterstaining af CD45 giver mulighed for at vurdere, om fokale lækage af BBB er knyttet til immun celle infiltration.

Immun celle migration i CNS parenkym kræver en sekventiel krydsning af to forskellige barrierer inden for NVU, i endothelial BBB og efterfølgende glia limitans28. Krydser glia limitans og CNS indtastning for immunceller korrelerer med udbrud af kliniske EAE29, mens CNS infiltrerer celler fanget i leptomeningeal og perivascular rum udløser ikke kliniske EAE. Immun celle diffusering i leptomeningeal og perivascular rum mellem kælder membraner er blevet observeret i flere gen-modificerede musemodeller fx L-selectin knockout mus30, TNF knockout mus23, MMP2/MMP9 dobbelt knockout mus10 , og JAM-B knockout mus12. Disse resultater understregningstegn, mangel på disse molekyler ikke påvirker immun celle migration på tværs af BBB, men snarere på tværs af glia limitans, understregning, molekylære mekanismer mægle immun celle migration på tværs af BBB og glia limitans er særskilt. Hjernen i situ zymography er en metode til at undersøge for focal gelatinase aktivitet i et væv afsnit i præcise rumlige korrelationen til CNS patologi. Påvisning af in vivo BBB permeabilitet sammen med udførelse af in situ zymography for at registrere MMP2/MMP9 aktivitet således gør det muligt for at afgrænse endotel versus glia barriere forstyrrelse i korrelation til immun celle infiltration. Kombineret med pan-laminin og CD45 immunofluorescens farvning på EAE hjernen sektioner, det giver mulighed for lokalisering af gelatinase aktivitet af unquenching DQ-gelatine og lokalisering af infiltrerer immunceller på samme tid. Unquenching af fluorescein fra DQ-gelatine resultater i en typisk kornede lyse grønne fluorescens signal, mens fragmentarisk svagt grønt fluorescerende områder på væv sektioner skal betragtes som uspecifik signal12. Omhyggelig vurdering af væv sektioner og ordentlig kontrol er således uundværligt, når du udfører i situ zymography. I denne protokol udførte vi i situ zymography i kombination med CD45 og laminin farvning. Primære antistoffer mod både CD45 og laminin blev udruget som en blanding på samme tid. På samme måde, sekundære antistoffer blev udruget som en blanding i et andet farvning trin. Sådan en kombination af antistoffer behov for test for at sikre, at anden fase antistoffer optages mod andre IgGs for at undgå krydsreaktivitet.

Taget sammen, giver de protokoller, der præsenteres her værktøjer til at undersøge i detaljer hvilket element i NVU er forringet i neuroinflammatory betingelser for EAE. In vivo permeabilitet vurdering af eksogene røbestoffer gør det muligt for at identificere aktuelle værdiforringelse af mikrovaskulære endotel celle integritet eller aktuelle svækkelse af NVU. Derudover indførelsen af røbestoffer med forskellige størrelser giver mulighed for at vurdere sværhedsgraden af BBB værdiforringelse. Yderligere in situ zymography afdækker focal gelatinase aktivitet i astrocytter og potentielt inflammatoriske celler, som er nødvendig for at bryde glia limitans som en sidste barriere før at få adgang til CNS parenkym10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Vi parlamentsarbejdet Lydia Sorokin, der har delt sin oprindelige in situ zymography protokol10 med os.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AMCA anti-rabbit antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-045 Store at 4 °C; protect from light
Anti-CD45 Antibody (30F11) Pharmingen 07-1401 Store at 4 °C
Anti-Laminin Antibody DAKO Z0097 Store at 4 °C
Breeding food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3336
Individually ventilated cages, Blue line Type II or III e.g. Tecniplast 1145T, 1285L
BSA fraction V Applichem A1391 Store at 4 °C
Cold gelatine Sigma-Aldrich G 9391
Coplin jar + rack e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG H554.1; H552.1
Cy3 anti-rat antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-144 Store at 4 °C; protect from light
Cover slips 24 x 40 mm # 1 e.g. Thermo Scientific 85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) e.g. Molecular probes D22910 Store at -20 °C; protect from light
Dextran Texas Red (3000 MW) Invitrogen D3328 Store at -20 °C; protect from light
EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit  Thermo Fisher Scientific; EnzCheck E12055 Store at -20 °C; protect form light
Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) e.g. Janvier Labs Females, 8-12 weeks
Freezing box for histology slides e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 2285.1
18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304622
27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 302200
30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304000
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Santa Cruz Biotechnology sc-24648 Store at 4°C
Maintenance food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3436
MOGaa35-55 peptide e.g. GenScript Store at -80 °C
microscope slides (Superfrost Plus ) Thermo Scientific J1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA e.g. BD 231141 Store at 4 °C 
NaCl 0.9 % B. Braun 3535789
O.C.T. compound (Tissue-Tek ) Sakura 4583
Omnican 50 30G x ½’’ B. Braun 9151125S
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4
Pertussis toxin e.g. List biological laboratories, Inc. 180 Store at 4 °C
poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) Sigma-Aldrich 81381
Protease Inhibitor EDTA free (Roche) Sigma-Aldrich 4693132001 Store at 4 °C
repelling pen e.g. DAKO Pen e.g. DAKO S2002
sealing film e.g. Parafilm M e.g Sigma-Aldrich P7793
Silica gel e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 9351.1
Stitch scissor F.S.T 15012-12
syringe 1 ml e.g. PRIMO 62.1002
syringe 10 ml e.g. CODAN Medical ApS 2022-05
vaporizer system Univentor 400 UNO.BV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  2. Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
  3. Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
  4. Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113, (Pt 5), 1477-1489 (1990).
  5. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. (2017).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
  7. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
  8. Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
  9. Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
  10. Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
  11. Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
  12. Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
  13. Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48, (3), 178-192 (2014).
  14. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. (2014).
  15. Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
  16. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  17. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, Chapter 15 Unit 14 (2007).
  18. Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
  19. Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
  20. Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
  21. Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363 (2014).
  22. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
  23. Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
  24. Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
  25. Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
  26. Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
  27. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
  28. Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
  29. Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
  30. Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics