6,838 Views
•
09:01 min
•
November 17, 2020
DOI:
Den protokol, vi præsenterer her, vil være nyttigt for os at forstå, hvordan lymfocytter er involveret i udviklingen af centralnervesystemet autoimmun sygdom. Med denne metode, lymfocytter i hjernen kan studeres på celle for celle basis. Denne protokol kan også anvendes på andre modeller og centralnervesystemet sygdom, der er nødvendige for at analysere de karakteristika og funktioner af immunceller.
I denne video kan protokollen nemt demonstrere, hvordan man inducerer model og isolere enkelte celler i hjernen. Efter at have bekræftet manglende reaktion på pedalrefleks, skal du bruge en en milliliter sprøjte til subkutant injicere bedøvet C57BL/6 mus med 100 mikrogram emulgeret MOG 35-55 i 100 mikroliter af komplet Freund’s adjuvans i to forskellige steder i ryggen nær halsen. Samme dag og på dag to postimmunisering injicerer intraperitoneally musene med 200 mikroliter af et nanogram pr. mikroliter pertussis-toksinarbejdsløsning.
Efter den anden injektion, overføre musene tilbage til deres hjem bur med en opvarmning pad og overvågning, indtil fuld recumbency. Den næste dag og i hele sygdomsforløbet undersøge og grade alle mus i en blindet måde for de neurologiske tegn, der er skitseret i tabellen og for eventuelle ændringer i vægt. Ved det relevante eksperimentelle endepunkt skæres kraniumet omhyggeligt fra næsen til halsen, og hjernen for hvert dyr overføres fra kraniekassen til individuelle 50 milliliterrør indeholdende 10 milliliter RPMI-medium.
Bland rørene godt at fjerne de klæbende røde blodlegemer og fjerne mediet ved aspiration. Tilsæt 10 milliliter frisk medium til hvert rør og overføre hjerner i individuelle 100 millimeter retter. Endelig hugge hver hjerne med en barbermaskine og bruge en plastik pipette til at overføre så meget væv fra en skål ad gangen og seks milliliter medium i en icecold syv milliliter centreret glas homogenisator.
Grind hjernen ved hjælp af løs stemplet af støderen, før du bruger den stramme stemplet til at bringe vævet, indtil suspensionen er homogen. Derefter hældes den resulterende vævsgylle i et forkølet 15 milliliter konisk rør på is. Når alle prøverne er homogeniseret, justeres volumenet i hvert rør til syv milliliter med frisk medium, før hver vævssuspension til et nyt kølet 15 milliliterrør indeholdende tre milliliter 100% kældermembranmatrix pr. rør.
Bland ved inversion et par gange og bruge en tre milliliter pipette til omhyggeligt og langsomt tilføje en milliliter 70 procent tæthed gradient løsning under hver vævsopløsning prøve. Adskaf cellerne ved tæthedsgradientuering og fjern næsten hele det øverste lag, idet du skal passe på helt at fjerne alle myelinen. Overfør grænsefladen til et nyt 15 milliliterrør, og juster lydstyrken til 10 milliliter med frisk medium.
Derefter centrifuge prøverne igen og fjerne supernatant før resuspending pellets i omkring 100 mikroliter af medium pr rør. For flow cytometrisk analyse af de høstede hjerneceller, afsætte ca to gange 10 til de seks celler i 100 mikroliter af medium i individuelle brønde af en 96-brønd plade. Når alle cellerne er blevet belagt, tilsættes 100 mikroliter 500X cellestimulering cocktail plus protein transport hæmmere til brøndene og placere pladen i cellen kultur inkubator i fire timer.
I slutningen af inkubationspuljen cellerne i bunden af brøndene ved centrifugering og resuspenderet pellets i 100 mikroliter af flow cytometri buffer per brønd. Præinkubere cellerne med tre mikroliter anti-mus CD16/CD32 Fc Block i 10 minutter ved fire grader Celsius før farvning. For at blokere alle uspecifikke Fc-medierede interaktioner.
I slutningen af inkubationen tilsættes antistofcocktailen af interesse til hver brønd og anbring pladen ved fire grader Celsius beskyttet mod lys. Efter 30 minutter vaskes brøndene med 100 mikroliter flowcytometribuffer pr. brønd og sediment cellerne ved centrifugering. Efter kassering af supernatanterne tilsættes 200 mikroliter intracellulær fikseringsbuffer til hver brønd.
Efter 30 til 60 minutters inkubation ved stuetemperatur udtages prøverne ved centrifugering og pellets i 200 mikroliter af 1X permeabilitetsbuffer pr. brønd. Centrifuge prøverne igen, og efter udsmid af supernatant, resuspend pellets i 100 mikroliter med frisk permeabilization buffer. Dernæst tilsættes de relevante antistoffer til påvisning af eventuelle intracellulære antigener af interesse for en 30 minutters inkubation ved fire grader Celsius, beskyttet mod lys.
Ved slutningen af inkubationen tilsættes 100 mikroliter 1X permeabiliseringsbuffer til hver brønd og drejer prøverne ned ved centrifugering. Derefter resuspenderede pletcellerne i 200 mikroliter af flow cytometri farvning buffer og analysere cellerne ved flow cytometri i henhold til standard protokoller. Et typisk klinisk forløb af EAE bør resultere i en sygdomskurve og ændring i kropsvægt som illustreret.
C57BL/6 mus immuniseret med MOG 35-55 begynder normalt at udvikle sygdomssymptomer omkring dag 10 til 12 og opnå toppen af sygdommen omkring dag 15 til 21. Før sygdommens indtræden stiger kropsvægten af immuniserede mus gradvist, før den falder i sammenhæng med de stigende sygdomssymptomer Musene viser den laveste kropsvægt på toppen af EAE, hvor kropsvægten stiger en smule, efterhånden som de kliniske symptomer falder. Musene normalt ikke fuldt ud komme sig dog og typisk gå på at udvikle en monofasisk kronisk sygdom patologi.
Som denne repræsentative flowanalyse illustrerer, øges interferongammaproducerende Th1- og IL17-producerende Th17-celler betydeligt i EAE-mus. Det vigtigste skridt er 3.10. Operatøren skal overføre mellemlag og lys, være omhyggeligt, tage så få andre lag som muligt.
Efter denne protokol kan vi yderligere T lymfocytter til yderligere transskriptionsanalyse for at
Dette manuskript præsenterer en protokol til at fremkalde aktiv eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) i mus. En metode til isolering og karakterisering af de infiltrerede lymfocytter i centralnervesystemet (CNS) præsenteres også for at vise, hvordan lymfocytter er involveret i udviklingen af CNS autoimmun sygdom.
Read Article
Cite this Article
Ji, Z., Zhou, C., Niu, H., Wang, J., Shen, L. Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (165), e61050, doi:10.3791/61050 (2020).
Copy