تقسيم الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية داخل رقائق Microfluidic البلاستيكية التي تم تجميعها مسبقًا

Neuroscience
 

Summary

يوضح هذا البروتوكول استخدام رقائق microfluidic المجزأة، والحقن مصبوب في البوليمر الأوليفين دوري إلى الخلايا العصبية المستزرعة المتمايزة عن الخلايا الجذعية البشرية. يتم تجميع هذه الرقائق مسبقا وأسهل للاستخدام من الأجهزة التقليدية متعددة المجزأة (dimethylsiloxane). يتم وصف العديد من النماذج التجريبية الشائعة هنا، بما في ذلك وضع العلامات الفيروسية، والعزل ة السوائل، واستئصال الأكسوتو، وتلطيخ المناعة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips. J. Vis. Exp. (147), e59250, doi:10.3791/59250 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

أصبح استخدام الأجهزة الدقيقة لتقسيم الخلايا العصبية المستزرعة طريقة قياسية في علم الأعصاب. يوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام رقاقة متعددة المقصورات تم تجميعها مسبقًا في بوليمر أوليفين دوري (COC) لتقسيم الخلايا العصبية المتمايزة عن الخلايا الجذعية البشرية. بصمة هذه رقائق COC هي نفس الشريحة المجهر القياسية ومتوافقة على قدم المساواة مع الفحص المجهري عالية الدقة. يتم تمييز الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية العصبية البشرية (NSCs) إلى الخلايا العصبية الجلوتاماستيكداخل رقاقة والحفاظ عليها لمدة 5 أسابيع، مما يسمح بوقت كاف لهذه الخلايا العصبية لتطوير نقاط الاشتباك العصبي والعمود الفقري الددري. وعلاوة على ذلك، نقوم بتوضيح العديد من الإجراءات التجريبية الشائعة باستخدام هذه الرقائق متعددة المقصورات، بما في ذلك وضع العلامات الفيروسية، وإنشاء البيئات الدقيقة، واستئصال الأكسوو، والكيمياء المناعية.

Introduction

الخلايا الجذعية البشرية الخلايا العصبية المتمايزة (hSC-الخلايا العصبية) تستخدم بشكل متزايد للبحوث البيولوجية. هذه الخلايا العصبية، والتي يمكن أن تستمد من المواد المصدر البشري، هي ذات أهمية كبيرة للبحوث الترجمة، بما في ذلك دراسة إصابات الدماغ الصادمة والاضطرابات العصبية مثل مرض الزهايمر. وهكذا، أدوات لتحسين وتسهيل دراسة الخلايا العصبية hSC هي في الطلب.

لدراسة مورفولوجيا الاستقطاب فريدة من الخلايا العصبية، العديد منالباحثين استخدام أجهزة microfluidic متعددة المقصورات 1،6، 7،8،9،10،11. هذه الأجهزة تمكين القياسات والتلاعب من الخلايا العصبية إسقاط طويلة مع وصول تحت الخلية فريدة من نوعها. تتكون الأجهزة الدقيقة متعددة الأجزاء من اثنين من المقصورات الميكروفلويدية المتوازية مفصولة بأخاديد دقيقة، والتي توجه النمو الإبطي. الخلايا العصبية أو الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) مطلية في المقصورة السمادودية، ومن ثم التمسك الجزء السفلي من سطح المقصورة بعد دقائق. تنمو الخلايا العصبية المتمايزة وتوسع محاورها/إسقاطاتها عبر منطقة الميكروgroove إلى مقصورة عصبية مجاورة ومعزولة. في الماضي، تم إجراء هذه الأجهزة حصرا باستخدام بولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان) (PDMS) صب النسخة المتماثلة. أجهزة PDMS لديها العديد من العيوب التي سبق وصفها12، بما في ذلك هيدروفوبيسيتي المستمرة والحاجة إلى تجميع لغطاء زجاجي مباشرة قبل الاستخدام. قبل تجميعها حقن مصبوب رقائق التغلب على العديد من هذه العيوب وتباع تجاريا (انظر جدولالمواد)12. يتم إجراء مقصورات من هذه الرقائق بشكل دائم hydrophilic ورقاقة كاملة هو حقن مصبوب في شفافة بصريا دوري olefin كوبوليمر (COC).

يوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام هذه الشريحة COC للتمييز بين NSCs البشرية في الخلايا العصبية المحفزة، وفصل وعزل بشكل سلس إسقاطاتالخلايا العصبية الطويلة. لهذه المظاهرة، تم تمييز الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية H9 المعتمدة من قبل المعاهد القومية للصحة. ويمكن استخدام إجراءات مماثلة للتمييز بين الخلايا الجذعية المتعددة القوى التي يسببها الإنسان.

Protocol

ملاحظة: الشكل 1A،B يظهر مخطط من رقاقة COC تجميعها مسبقاً، بما في ذلك مواقع القنوات الرئيسية أو المقصورات، والآبار، وmicrogrooves. رقاقة مجزأة يمكن إنشاء البيئات الدقيقة السائلة متميزة داخل مقصورة كما يدل على ذلك من خلال عزل صبغة تلوين الغذاء (الشكل1C). يتم إعطاء بروتوكول لإعداد رقاقة متعددة المقصورة التي تم تجميعها مسبقا في Nagendran وآخرون، القسم 112.

1. طلاء رقائق متعددة المقصورة للخلايا العصبية hSC

ملاحظة: الشكل 2A يظهر نظرة عامة على إجراءات الطلاء.

  1. حل بولي-L-ornithine في خلية الثقافة الصف الماء المقطر لجعل 600 درجة مئوية من الحل لكل رقاقة من 20 ميكروغرام / مل حل العمل.
  2. يستنشق ال [ببس] متبقّي يسارا بعد يعدّ الرقائق من الآبار. عند aspirating، تأكد من أن طرف pipet بعيدا عن فتح القناة.
    ملاحظة: يجب أن تظل القنوات microfluidic ممتلئة لكامل هذا الإجراء. لا يستنشق السائل من القنوات / المقصورات، فقط الآبار.
  3. تحميل 150 درجة مئوية من بولي-L-ornithine حل العمل في أعلى اليمين جيدا. انتظر 90 ق أو حتى السائل يبدأ لملء أسفل الحق جيدا. إضافة 150 درجة مئوية من وسائل الإعلام إلى أسفل اليمين جيدا وانتظر لمدة 5 دقائق للسماح للسائل تمر من خلال microgrooves.
  4. إضافة 150 درجة مئوية من وسائل الإعلام إلى أعلى اليسار جيدا. انتظر 90 ثانية ثم أضف 150 درجة مئوية إلى أسفل اليسار بشكل جيد. التفاف حامل رقاقة (ق) مع parafilm ومكان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: بدلا من ذلك، ضع رقاقة وحامل في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  5. قم بإستنسخ وسائل الإعلام من الآبار، مما يضمن وضع طرف الأنابيب بعيدًا عن فتح القناة. أضف 150 ميكرو لتر من الماء المعقم إلى أعلى اليمين. انتظر 90 ثانية ثم أضف 150 درجة مئوية إلى أسفل اليمين بشكل جيد. انتظر لمدة 5 دقائق للسماح للسائل بالمرور عبر الأخاديد الدقيقة.
  6. إضافة 150 درجة مئوية من الماء المعقم إلى أعلى اليسار جيدا، والانتظار 90 ثانية ثم إضافة 150 ميكرولتر أخرى إلى أسفل اليسار جيدا.
  7. كرر الخطوات 1.5 إلى 1.6.
  8. إذابة لامينين ببطء في 2 درجة مئوية إلى 8 درجة مئوية وإعداد 10 ميكروغرام / مل حل العمل.
  9. تحميل 150 درجة مئوية من حل العمل لايمينين إلى أعلى اليمين جيدا. انتظر 90 ق أو حتى السائل يبدأ لملء أسفل الحق جيدا. Pipet 150 درجة مئوية إلى أسفل اليمين جيدا. انتظر لمدة 5 دقائق للسماح لللامينين بالمرور عبر الأخاديد الدقيقة.
  10. إضافة 150 درجة مئوية من اللامينين إلى أعلى اليسار جيدا. انتظر 90 ثانية ثم أضف 150 درجة مئوية إلى أسفل اليسار بشكل جيد. احتضان رقاقة داخل حاملها لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية.
  11. شطف رقاقة مع PBS (دون كاليفورنيا2 + وملغ2+). تحميل 150 درجة مئوية من PBS إلى أعلى اليمين جيدا. انتظر 90 ق أو حتى السائل يبدأ لملء أسفل الحق جيدا. إضافة 150 درجة مئوية من PBS إلى أسفل اليمين جيدا وانتظر لمدة 5 دقائق للسماح PBS تذهب من خلال microgrooves.
  12. Pipet 150 درجة مئوية من PBS إلى أعلى اليسار جيدا. بعد 90 ثانية pipet 150 μL إلى أسفل اليسار جيدا.
  13. يستنشق PBS من رقاقة ومن ثم شطف رقاقة مع وسائل الإعلام NSC (انظر جدول المواد). تحميل 150 درجة مئوية من وسائل الإعلام إلى أعلى اليمين جيدا. بعد 90 ثانية أو عندما يمر السائل من خلال القناة اليمنى في أسفل اليمين جيدا، إضافة 150 درجة مئوية إلى أسفل اليمين جيدا. انتظر لمدة 5 دقائق للسماح للوسائط بالتدفق من خلال الأخاديد الدقيقة.
  14. إضافة 150 درجة مئوية من وسائل الإعلام إلى أعلى اليسار جيدا وآخر 150 درجة مئوية إلى أسفل اليسار جيدا. احتضان رقاقة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 لشرط مسبق رقاقة حتى على استعداد لبذور NSCs.
    ملاحظة: رقائق يمكن أن تكون مكيفة مسبقا بين عشية وضحاها إذا لزم الأمر.

2. البذر NSCs في رقاقة متعددة المقصورة

ملاحظة: استخدم هذا البروتوكول NSCs التي تم شراؤها تجاريا، على عكس منشورنا السابق الذي بدأ مع خلايا ينبع الجنينية البشرية5. في هذا البروتوكول يتم طلاء الخلايا الجذعية العصبية مباشرة في رقائق البلاستيك حيث أنها تميز في الخلايا العصبية. يمكن السماح للخلايا بالتكاثر كـ NSCs (بدون تمييز) لمدة تصل إلى 2 ممر وتخزينها في قارورة في السائل N2 لمزيد من الاستخدام. يستخدم هذا البروتوكول قارورة NSC المخزنة في السائل N2 بعد مرور 1 أو 2. ويبين الشكل 2باء لمحة عامة عن إجراءات الطلاء.

  1. ذوبان NSCs وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: ينطبق هذا الإجراء على NSCs المشتقة من H9. خطوط الخلايا الأخرى سوف تتطلب تحسين كثافة الخلية.
  2. عد تركيز الخلية باستخدام مقياس الهيموكيتومات وضبط باستخدام وسائل الإعلام NSC للحصول على تركيز 7 × 106 خلايا لكل مل.
  3. يستنشق وسائل الإعلام من كل بئر من رقاقة. تجنب التصاص الوسائط من القنوات الرئيسية.
  4. Pipet 5 μL من محلول الخلية إلى أعلى اليمين جيدا، تليها 5 درجة مئوية إلى أسفل اليمين جيدا (70،000 مجموع الخلايا). تأكد من أن الخلايا يتم توجيهها نحو فتحات القناة الرئيسية. استخدم مجهرًا للتحقق من دخول الخلايا إلى القناة. انتظر 5 دقائق للخلايا التمسك الجزء السفلي من رقاقة.
    ملاحظة: يمكن استخدام أي من المقصورات أو كليهما لتحميل الخلايا.
  5. Pipet ~ 150 درجة مئوية من وسائل الإعلام NSC إلى أعلى اليمين جيدا ثم 150 درجة مئوية إلى أسفل اليمين جيدا. كرر على الجانب الأيسر. حضانة في 5٪CO 2، 37 درجة مئوية داخل حاوية رطبة مناسبة.
  6. بعد 48 ساعة، يستنشق وسائل الإعلام NSC من الآبار واستبدالها بوسائط التمايز العصبي عن طريق إضافة 150 درجة مئوية إلى كل أعلى جيدا وكل أسفل جيدا.
  7. الخلايا العصبية الثقافة داخل5٪ CO 2، 37 درجة مئوية حاضنة داخل حاوية رطبة مناسبة.
    ملاحظة: يجب استبدال الوسائط كل 2-3 أيام. بسبب الأحجام الصغيرة المستخدمة في رقاقة، والتبخر حتى داخل حاضنة رطبة يمكن أن تؤثر بشكل كبير على بقاء الخلية. استخدام حاوية ثانوية مناسبة لتوفير الرطوبة إضافية لثقافة طويلة الأجل من الخلايا مع رقاقة (انظر جدولالمواد).

3. وضع العلامات الفلورسنت الفيروسية من الخلايا العصبية hSC داخل رقاقة

ملاحظة: يمكن استخدام فيروس متعددة لتسمية الخلايا العصبية داخل رقاقة. تصف التعليمات أدناه استخدام فيروس داء الكلب-mCherry g-deleted أو فيروس eGFP. ويجب التعامل مع المواد المعدية المحتملة وفقا للقواعد والأنظمة المعمول بها، وقد تتطلب تدريبا إضافيا وموافقة مؤسسية.

  1. دافئ ~ 400 درجة مئوية من وسائل الإعلام التمايز العصبية الطازجة لكل رقاقة إلى 37 درجة مئوية.
  2. إزالة 50 ميكرولتر من وسائل الإعلام من بئر واحد من مقصورة محور عصبي في أنبوب الطرد المركزي ومن ثم إضافة 100،000 وحدة فيروسية من فيروس داء الكلب المعدلة إلى الأنبوب.
    ملاحظة: التخلص بشكل صحيح من أطراف الأنابيب المستهلكة وأنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على الفيروس.
  3. إزالة وسائل الإعلام التمايز العصبي المتبقية من المقصورة axonal ووضعها في أنبوب الطرد المركزي. يُحفظ عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: تأكد من أن القنوات تبقى مليئة بالسائل.
  4. خلط 50 درجة مئوية من محلول الفيروس مع 150 درجة مئوية من وسائل الإعلام الدافئة. Pipet 100 درجة مئوية إلى بئر واحد من مقصورة أكسون و 100 درجة مئوية إلى مقصورة axon الأخرى بشكل جيد. حضانة لمدة 2 ساعة داخل حاضنة 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يساعد الفرق في وحدات التخزين بين المقصورات الإبطية والجسدية على ضمان بقاء الفيروس في المقصورة الإبطية أثناء أوقات العدوى/الحضانة.
  5. سحب الوسائط المحتوية على الفيروسات والتخلص منها.
    تحذير: لا تقم بإزالة السائل داخل القنوات الدقيقة المغلقة.
  6. بلطف pipet 75 € L من وسائل الإعلام الطازجة إلى حجرة واحدة axon جيدا والسماح للوسائل الإعلام تتدفق من خلال القناة إلى محور آخر بشكل جيد.
  7. إزالة الوسائط من حجرة axon والتخلص بشكل صحيح.
  8. كرر الخطوتين 3.6 و 3.7.
  9. املأ حجرة axon بالوسائط المحفوظة. Pipet إضافية 50 ميكرول وسائل الإعلام الطازجة، إذا لزم الأمر، ومن ثم العودة رقاقة إلى الحاضنة. هذه الوسائط الجديدة الإضافية هي لحساب نحو فقدان وسائل الإعلام أثناء نقل السائل والتبخر خلال هذه العملية.
    ملاحظة: يحدث وضع العلامات الفلورية المرئية باستخدام فيروسات داء الكلب المعدلة هذه بمقدار 48 ساعة وحتى 8 أيام بعد ها هي الوفاة الخلوية للخلايا العصبية المصابة تحدث بشكل عام بسبب سمية الفيروس. يمكن إجراء تصوير الخلايا العصبية كما هو الحال مع منصات الثقافة القياسية الأخرى (على سبيل المثال، الأطباق الزجاجية السفلية)، ولكن هناك حاجة إلى اعتبار خاص للحفاظ على الرطوبة الكافية لمنع فقدان التبخر.

4. عزل السائل، استئصال اللخطات، وتلطيخ المناعة داخل رقاقة

  1. اتبع العزلة المائعة، استئصال الأكسوت، وتلطيخ المناعة مع رقاقة كما هو موضح في Nagendran وآخرون12.

Representative Results

بعد أسبوع واحد (7-10 أيام) في رقاقة مع وسائل الإعلام التمايز، NSCs تميز فيالخلايا العصبية والإسقاطات العصبية تدخل المقصورة axonal (الشكل 3). داخل رقاقة، الخلايا العصبية إرفاق وتوزيع بالتساوي داخل المقصورة الجسدية. في المقارنة، الخلايا العصبية في أجهزة PDMS تكتل / تجميع في وقت مبكر من 5 أيام بعد إضافة وسائل الإعلام التمايز، مما يؤدي إلى خطر صحة الخلية كما يمكن أن نرى في الشكل 3B (اليوم 13 صورة مكبرة). الخلايا العصبية في رقائق تبدو صحية مع محاور المجمعة. يمكن الحفاظ على الخلايا العصبية الصحية داخل رقائق لمدة 4-5 أسابيع.

لتصور نضج الخلايا العصبية وتطوير العمود الفقري التقشري، تم تسليم فيروس داء الكلب المعدل إلى المقصورة الإبطية في اليوم 29 إلى الخلايا العصبية تسمية رجعية، بما في ذلك العمود الفقري التقشري، مع بروتين الفلورسنت mCherry. بعد أربعة أيام من عدوى فيروس داء الكلب، أعربت الخلايا العصبية التي تمتد المحاور إلى المقصورة الإبطية عن mCherry. وأظهرت الخلايا العصبية في يوم التمايز 33 تشكيلالعمود الفقري التقشري (الشكل 4). التصور من العمود الفقري الددرية يوضح أن الخلايا العصبية المشتقة NSC متباينة داخل رقائق شكل نقاط الاشتباك العصبي ناضجة.

رقاقة متعددة المقصورة متوافق ة أيضا مع الكيمياء المناعية لتصور توطين الخلوية للبروتين. بعد 26 يوما من الحفاظ على الخلايا العصبية في وسائل الإعلام التمايز، وصفت الخلاياالعصبية لعلامة متشابك مثير، vGlut1 (الشكل 5). وتظهر هذه النتائج أن الخلايا العصبية المسماة الفيروسية تشارك في توطين vGlut1 (الشكل 5E) وعلامة محددة الخلايا العصبية، β-tubulin III (الشكل5F-H).

كما أظهرت القدرة على خلق بيئات صغيرة متميزة معزولة إلى محاور باستخدام اليكسا فلور 488 هيدرازيد، صبغة الفلورسنت منخفضة الوزن الجزيئي (الشكل6).

عادة ما يتم إجراء دراسات إصابة أكسون داخل الأجهزة المجزأة. تم إجراء دليل على تجربة المبدأ لإصابة انتقائية محاور الخلايا العصبية المتمايزةمع رقاقة COC التي تم تجميعها مسبقا (الشكل 7). وكانت النتائج تعادل أجهزة السيليكون المجزأة6و13و14.

Figure 1
الشكل 1: COC تجميعها مسبقا، رقاقة microfluidic متعددة المقصورات. (أ) رسم للرقاقة تحديد الآبار العليا والسفلى. حجم رقاقة هو 75 مم × 25 ملم، وحجم الشرائح المجهر القياسية. (ب) تكبير في المنطقة التي تظهر القنوات والأخاديد الدقيقة التي تفصل القنوات. وترد تفاصيل إضافية في Nagendran وآخرون12. (C) توضح هذه الصورة خلق بيئات صغيرة معزولة داخل كل مقصورة باستخدام صبغتلوين الطعام. وقد تم استنساخ هذا الرقم بأكمله من 12. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: طلاء رقاقة البلاستيك مجزأة والجدول الزمني لطلاء الخلايا NSC. (أ) كانت مغلفة رقائق البلاستيك متعددة المقصورة مع حل ما قبل الطلاء، ومن ثم بولي-L-ornithine ولامينين قبل تكييف مسبق مع وسائل الإعلام NSC. (B) كانت مطلية NSCs مع 7 × 104 خلايا في المقصورة الجسدية للرقاقة. نمت الخلايا في وسائل الإعلام NSC لمدة 24 ساعة ومن ثم تم استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام التمايز العصبي. لوحظت الخلايا العصبية المتمايزة من قبل 7-10 أيام بعد التمايز. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مقارنة نمو الخلايا العصبية hSC في رقائق وأجهزة PDMS. (أ) صورة تباين المرحلة من الخلايا العصبية hSC نمت في 13 يوما بعد التمايز في رقاقة متعددة المقصورات البلاستيكية. (ب) منطقة مكبرة من الخلايا العصبية hSC المستزرعة داخل المربع الأبيض في (أ) ومنطقة مماثلة داخل جهاز PDMS (يمين). hSC-الخلايا العصبية داخل رقائق نعلق بشكل جيد. تتشكل مجموعات الخلايا العصبية المجمعة في الأجهزة المستندة إلى PDMS. ممثل عن تجربتين مستقلتين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تظهر الخلايا العصبية المشتقة من NSC الإنسان مورفولوجيا العمود الفقري الدنيدري. إلى الوراء المسمى mCherry الخلايا العصبية في يوم التمايز 33 نمت داخل رقاقة. المنطقة المكبرة المبينة باللون الأحمر، يسلط الضوء على وجود العمود الفقري الددري، والتي توفر أدلة تدعم تطوير نقاط الاشتباك العصبي الجلوتاساتية الناضجة. السهام الحمراء تشير نحو العمود الفقري التقشري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: الخلايا العصبية المشتقة من NSC الإنسان المستزرعة داخل رقائق تظهر نقاط الاشتباك العصبي المحفزة. تم إجراء التلطيخ المناعي في يوم التمايز 26. تم إجراء تصوير الخلايا العصبية في المقصورة الجسدية. A)vGlut1 (الأخضر) و (ب) DAPI (الأزرق) تصنيف المناعة. (C) الخلايا العصبية التي تحمل اسم الكرز (الأحمر) إلى الوراء المسمى باستخدام فيروس داء الكلب المعدلة. (د) صورة مجهرية الفلورسنت المدمجة من(A-C). (E) العمود الفقري Dendritic وvGlut1 الملتحمة الإيجابية colocalized مع dendrites mCherry إيجابية، كما هو موضح في التكبير في المنطقة من(D). الميكروغرافيا المناعية من (F) علامة محددة الخلايا العصبية ، β-tubulin الثالث (أرجواني) ، و (G) vGlut1 (الأخضر). (H) تراكب بيتا توبولين الثالث، وvGlut1. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: الخلايا العصبية mCherry المنقولة الفيروسية توسيع التوقعات إلى بيئة صغيرة مترجمة axon أنشئت داخل رقاقة COC تجميعها مسبقا. (أ) mCherry المسمى الخلايا العصبية تمتد المحاور من خلال microgrooves من رقاقة وإلى مقصورة axon معزولة. يتم تصور عزل حجرة محور عصبي باستخدام اليكسا فلور 488 هيدرازيد. تم تصوير الخلايا العصبية في يوم التمايز 26 و 3 أيام بعد العدوى بفيروس داء الكلب المعدل. (ب) يتم دمج صورة الفلورة في (أ) مع صورة DIC. لاحظ موقع microgrooves. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: استئصال الأكسوت يُجرى داخل شريحة COC متعددة المقصورات. (أ) تم تصوير الخلايا العصبية المسماة mCherry في يوم التمايز 33 قبل استئصال الساكسوتوكسي. 'النار' لون نظرة متابعة الجدول. (ب) مباشرة بعد استئصال اللمعة، مما يدل على أن يتم قطع المحاور تماما. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

رقائق بلاستيكية متعددة المقصورة أجهزة متعددة المقصورات PDMS
عزل المحاور عزل المحاور
إنشاء بيئات صغيرة إنشاء بيئات صغيرة
الخلايا العصبية الساكستومية الخلايا العصبية الساكستومية
شفافة بصريا شفافة بصريا
متوافق مع التصوير عالي الدقة متوافق مع التصوير عالي الدقة
متوافق مع مجهريال الفلورية متوافق مع مجهريال الفلورية
تجميعها بالكامل التجميع إلى الركيزة المطلوبة
محاور صحية > 21 يوما محاور صحية >14 يوما
سطح الزراعة المائية مسعور
الغاز لا يمكن نفاذها الغاز نفاذية
مدورة microgrooves والقنوات على التوالي microgrooves
غير متوافق مع الاستئصال بالليزر يمكن استخدامها للاستئصال بالليزر عندما يتم تجميع غرف PDMS على الشرائح الخاصة متوافقة مع الاستئصال بالليزر.
لا يمكن تغيير الجهاز لإزالة أعلى أعلى هو القابلة للإزالة لتلطيخ داخل microgrooves
غير متوافق مع الزيوت المعدنية القائمة على زيوت الغمر (الزيوت القائمة على السيليكون على ما يرام) متوافق مع الزيوت المعدنية القائمة على زيوت الغمر
غير قابل ة للنفاذ إلى جزيئات صغيرة ومذيبات عضوية امتصاص الجزيئات الصغيرة والمذيبات العضوية
لا مشاكل التسرب مع رقاقة طلاء مع بولي-L-ornithine واللامينين جعل الأجهزة راشح
الخلايا العصبية المتمايزة لا تزال موزعة بالتساوي (> 4 أسابيع) في كثافات الخلايا اختبارها الخلايا العصبية المتمايزة تبدأ في التجميع بعد 3-4 أيام في الثقافة في كثافات الخلايا اختبارها

الجدول 1: مقارنة رقائق COC متعددة المقصورات وأجهزة السيليكون للخلايا العصبية التي تُزرع

Discussion

رقاقة COC متعددة المقصورة المجمعة مسبقاً هي منصة مجزأة سهلة الاستخدام للتمييز والحفاظ على NSCs البشرية في الخلايا العصبية على المدى الطويل (>4 أسابيع). في هذا البروتوكول، ونحن نبين التمايز من NSCs الإنسان في الخلايا العصبية الجلوتاماستيك، الخلايا العصبية تسمية رجعية، وأداء الكيمياء المناعية، تصور مورفولوجيا العمود الفقري الدنيدري ة وإجراء استئصال السموم. هذه الرقائق متوافقة مع التصوير عالية الدقة وليس هناك autofluorescence مع COC12.

رقائق COC متعددة المقصورة هي ما يعادل وظيفيا إلى الأجهزة المجزأة القائمة على السيليكون، ولها فوائد وعيوب كما هو موضح سابقا12. يقارن الجدول 1 رقائق COC متعددة المقصورات وأجهزة السيليكون لزراعة الخلايا العصبية hSC. توفر رقائق COC المجزأة سطحًا مائيًا أفضل للربط بالخلايا الجذعية وصيانتها على مدى فترة ثقافية طويلة. يجب تجميع الأجهزة المستندة إلى PDMS وإرفاقها بأغطية زجاجية. الطبيعة الكارهة للماء من أجهزة PDMS يسبب تجميع الخلايا الجذعية5; وهذا يؤدي إلى كل من التحديات في التصوير على المستوى الخلوي وزيادة التعرض للضرر المادي بسبب حركة المجاميع الخلية أثناء التغيرات وسائل الإعلام. الرقاقة البلاستيكية تتغلب على هذه التحديات. COC هو الغاز غير قابل للنفاذ، على عكس PDMS، لذلك جيوب الهواء المحاصرين أو شكلت داخل القنوات يجب إزالتها من قبل المستخدم. حل ما قبل الطلاء يقلل من إمكانية أن يصبح الهواء محاصرا في القنوات. يتكون هذا الحل من الإيثانول وعوامل أخرى. بروتوكول نشر سابقا لزراعة الخلايا العصبية المورين داخل هذه رقائق البلاستيك يوفر تفاصيل إضافية حول خلايا الأنابيب ووسائل الإعلام داخل رقائق12. NSCs هي أكثر هشاشة أن الخلايا العصبية المورين، لذلك يجب التعامل معها أكثر بلطف. ومن المهم أيضا لخلط الخلايا الجذعية تماما قبل الطلاء عن طريق الأنابيب بلطف لهم صعودا وهبوطا.

استخدام الخلايا العصبية المستمدة من الخلايا الجذعية البشرية المتمايزة في المختبر أصبحت شعبية متزايدة في الطب والبحوث. هذه الخلايا العصبية مهمة للبحوث والتطبيقات السريرية للعديد من اضطرابات الجهاز العصبي المركزي, بما في ذلك الأمراض العصبية وإصابات الدماغ الصادمة. هذه الخلايا العصبية تشبه بشكل وثيق الخلايا العصبية الجنينية البشرية15. في المستقبل، يمكن توليد الخلايا العصبية الذين تتراوح أعمارهم بين مناسب من الخلايا الجذعية لتقليد وظيفة الخلايا العصبية ذات الصلة بالعمر واستخدامها جنبا إلى جنب مع هذه الأجهزة المجزأة. هذه الأجهزة سوف تسهل البحث في الأمراض التي تؤثر على صحة axon وظيفة مثل العجز في الخلايا العصبية للمرضى تشخيص اضطرابات طيف التوحد وتجديد axonal بعد الإصابة16,17.

Disclosures

S.P. وT.N. تعلن عن أي مصالح مالية متنافسة. V.P. هو موظف في Xona Microfluidics، LLC. J.H. هو عضو في Xona Microfluidics، LLC. A.M.T. هو مخترع للغرفة microfluidic / رقاقة (الولايات المتحدة 7419822 B2، EPO 2719756 B1) وهو عضو في Xona Microfluidics، LLC.

Acknowledgments

ويعترف المؤلفون بالدعم المقدم من Xona Microfluidics, LLC, the National Institute of Mental Health (R42 MH097377), and the National Institute of Neuro Disorders and Stroke (R41 NS108895, P30 NS045892). والمحتوى هو مسؤولية المؤلفين فقط ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor hydrazide 488 ThermoFisher Scientific A10436
Alexa Fluor secondary antibodies ThermoFisher Scientific 1:1000
anti_beta-tubulin III Aves TUJ 1:1000
anti-vGAT antibody Synaptic Systems 131 003 1:1000
anti-vGlut1 antibody NeuroMab 75-066 clone N28/9, 1:100
complete neural stem cell media:
 REC HU EGF
10 UG BIOSOURCE (TM) 
ThermoFisher Scientific PHG0314 20ng/mL 
REC HU FGF BASIC
10 UG BIOSOURCE (TM) 
ThermoFisher Scientific PHG0024 20ng/mL 
GlutaMAX Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 35050061 2mM 
KnockOut DMEM/F-12 ThermoFisher Scientific  12660012
StemPro Neural Supplement ThermoFisher Scientific A1050801 2%
Epifluorescence imaging system EVOS Fluorescence imaging system AMF4300 10x objective
fluorinated ethylene propylene film American Durafilm 50A 0.5 mil thickness
Fluoromount G ThermoFisher Scientific 00-4958-02
Gibco DPBS without Calcium and Magnesium ThermoFisher Scientific 14190144
GIBCO HUMAN NSC (H9) KIT
COMBO KIT
 
 
Gibco N7800200
Gibco Laminin ThermoFisher Scientific 23017015
Glass Pasteur pipettes Sigma-Aldrich CLS7095D5X SIGMA 5.75 in length
H9-DERIVED HU NEURAL STEM CELL
1E6 CELLS/VIAL; 1 ML 
ThermoFisher Scientific 510088
hibernate-E Medium ThermoFisher Scientific A1247601
Incubator, 5% CO2 37 °C
Laser scanning confocal imaging system Olympus FV3000RS 30x silicone oil objective
modified rabies virus Salk Institute for Biological Studies G-deleted Rabies-eGFP Material Transfer Agreement required
Mr. Frosty  ThermoFisher Scientific 5100-0001
Neural differentiation media Per 100 mL. 
Antibiotic-Antimycotic (100x) ThermoFisher Scientific 15240112 1mL (100X)
Ascorbic acid Sigma Aldrich A8960 200mM 
BDNF ThermoFisher Scientific PHC7074 40 ng/mL 
Gibco B27 Plus Supplement (50X) FisherScientific A3582801 2mL (50X)
Gibco CultureOne Supplement (100X)  FisherScientific A3320201 1mL (100X)
Gibco Neurobasal Plus Medium FisherScientific A3582901
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent ThermoFisher Scientific A1110501
Taylor Wharton Liquid N2 dewar FisherScientific 20HCB11M
triton X-100 ThermoFisher Scientific 28314
XC pre-coat  Xona Microfluidics, LLC XC Pre-Coat included with XonaChips
XonaChip Xona Microfluidics, LLC XC450 450 µm length microgroove barrier
Humidifier Tray Xona Microfluidics, LLC humidifier tray

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal translation of beta-catenin regulates synaptic vesicle dynamics. The Journal of Neuroscience. 33, (13), 5584-5589 (2013).
  2. Virlogeux, A., et al. Reconstituting Corticostriatal Network on-a-Chip Reveals the Contribution of the Presynaptic Compartment to Huntington’s Disease. Cell Reports. 22, (1), 110-122 (2018).
  3. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36, (46), 11573-11584 (2016).
  4. Pinto, M. J., et al. The proteasome controls presynaptic differentiation through modulation of an on-site pool of polyubiquitinated conjugates. The Journal of Cell Biology. 212, (7), 789-801 (2016).
  5. Bigler, R. L., Kamande, J. W., Dumitru, R., Niedringhaus, M., Taylor, A. M. Messenger RNAs localized to distal projections of human stem cell derived neurons. Scientific Reports. 7, (1), 611 (2017).
  6. Nagendran, T., et al. Distal axotomy enhances retrograde presynaptic excitability onto injured pyramidal neurons via trans-synaptic signaling. Nature Communications. 8, (1), 625 (2017).
  7. Van Laar, V. S., et al. Evidence for compartmentalized axonal mitochondrial biogenesis: Mitochondrial DNA replication increases in distal axons as an early response to Parkinson's disease-relevant stress. The Journal of Neuroscience. (2018).
  8. del Río, J. A., Ferrer, I., Gavín, R. Role of cellular prion protein in interneuronal amyloid transmission. Progress in Neurobiology. 165-167, 87-102 (2018).
  9. Jia, L., et al. MiR-34a Regulates Axonal Growth of Dorsal Root Ganglia Neurons by Targeting FOXP2 and VAT1 in Postnatal and Adult Mouse. Molecular Neurobiology. (2018).
  10. Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66, (1), 57-68 (2010).
  11. Menon, S., et al. The E3 Ubiquitin Ligase TRIM9 Is a Filopodia Off Switch Required for Netrin-Dependent Axon Guidance. Developmental cell. 35, (6), 698-712 (2015).
  12. Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons. Journal of visualized experiments : JoVE. (141), (2018).
  13. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2, (8), 599-605 (2005).
  14. Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29, (15), 4697-4707 (2009).
  15. Oh, J. H., Jung, C. R., Lee, M. O., Kim, J., Son, M. Y. Comparative analysis of human embryonic stem cellderived neural stem cells as an in vitro human model. International Journal of Molecular Medicine. 41, (2), 783-790 (2018).
  16. Lazar, M., Miles, L. M., Babb, J. S., Donaldson, J. B. Axonal deficits in young adults with High Functioning Autism and their impact on processing speed. Neuroimage Clinical. 4, 417-425 (2014).
  17. DePaul, M. A., Lin, C. Y., Silver, J., Lee, Y. S. Combinatory repair strategy to promote axon regeneration and functional recovery after chronic spinal cord injury. Scientific Reports. 7, (1), 9018 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics