Uppdelning av mänskliga stamceller-härledda neuroner inom förmonterade plast Microfluidic chips

Neuroscience
 

Summary

Detta protokoll visar användningen av uppdelade mikroflödessystem chips, injektion gjuten i en cyklisk olefin sampolymer till odlade nervceller åtskilda från mänskliga stamceller. Dessa chips är förmonterade och lättare att använda än traditionella uppdelade poly (dimethylsiloxane) enheter. Flera vanliga experimentella paradigm beskrivs här, inklusive viral märkning, fluidic isolering, axotomy, och immunofärgning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Paranjape, S. R., Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Compartmentalization of Human Stem Cell-Derived Neurons within Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips. J. Vis. Exp. (147), e59250, doi:10.3791/59250 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Användning av mikroflödessystem enheter för att kategoriserar odlade nervceller har blivit en standardmetod i neurovetenskap. Detta protokoll visar hur man använder en förmonterad multi-fack chip som gjorts i en cyklisk olefin sampolymer (COC) att kategoriserar nervceller åtskilda från mänskliga stamceller. Fotavtryck av dessa COC-chips är desamma som en vanlig Mikroskop bild och är lika kompatibla med högupplöst mikroskopi. Neuroner skiljer sig från mänskliga neurala stamceller (NSCs) i glutamatergic neuroner inom chip och underhålls i 5 veckor, vilket ger tillräcklig tid för dessa nervceller att utveckla synapser och dendritiska taggar. Vidare visar vi flera vanliga experimentella procedurer med hjälp av dessa multi-fack chips, inklusive viral märkning, upprättande av mikromiljöer, axotomy, och immunocytochemistry.

Introduction

Mänskliga stamceller differentierade neuroner (hSC-neuroner) används alltmer för biologisk forskning. Dessa nervceller, som kan härledas från mänskligt källmaterial, är av stort intresse för translationell forskning, inklusive studiet av traumatiska hjärnskador och neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom. Sålunda, verktyg för att förbättra och underlätta studiet av hSC-neuroner är efterfrågade.

För att studera den unika polariserade morfologin av nervceller, många forskare använder multi-compartmentalized mikroflödessystem enheter1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,11. Dessa enheter möjliggör mätningar och manipulationer av långa projektion nervceller med unik subcellulär åtkomst. Multi-compartmentalized mikroflödessystem enheter består av två parallella mikroflödessystem fack åtskilda av microgrooves, som styr axonal tillväxt. Neuroner eller neurala stamceller (NSCs) är pläterade i somatodendritic facket, och sedan hålla sig till botten av utrymmet ytan efter minuter. Differentierade nervceller växa och utvidga sina axoner/projektioner genom Microgroove regionen i ett angränsande och isolerade axonal fack. Förr i tiden var dessa anordningar uteslutande görs med hjälp av poly (dimethylsiloxane) (PDMS) replika gjutning. PDMS enheter har många nackdelar som tidigare beskrivits12, inklusive ihållande vattenavvisande egenskaper och behovet av att montera till en glastäckslip omedelbart före användning. Förmonterade formsprutade chips övervinna många av dessa nackdelar och säljs kommersiellt (se tabell över material)12. De delar av dessa chips är permanent tillverkade hydrofila och hela chip är formsprutade i optiskt transparent cyklisk olefin sampolymer (COC).

Detta protokoll visar hur man använder detta COC-chip för att skilja mänskliga NSCs i excitatoriska nervceller, och att separera och fluidiskt isolera sina långa neuronala projektioner. För denna demonstration, neuroner differentierades från NIH-godkända H9 stamceller. Liknande procedurer kan användas för att differentiera humana inducerade pluripotenta stamceller.

Protocol

Anmärkning: figur 1a, B visar en schematisk av förmonterade COC-chip, inklusive platser för de viktigaste kanalerna eller fack, brunnar och microgrooves. Den uppdelade chip kan etablera distinkta fluidic mikromiljöer inom ett fack som visar genom isolering av mat färgämne (figur 1c). Protokollet för beredning av det förmonterade flerfacks-chip ges i Nagendran et al., avsnitt 112.

1. beläggning av flera fack chips för hSC-neuroner

Anm.: figur 2A visar en översikt över beläggnings procedurerna.

  1. Lös Poly-L-Ornithine i cellodling-grade destillerat vatten för att göra 600 μL lösning per chip av en 20 μg/mL arbetslösning.
  2. Aspirera resterande PBS kvar efter beredning av flis från brunnarna. När aspirera, se till att Pipettera spetsen är borta från kanal öppningen.
    Obs: mikrofluidiska kanaler måste förbli ifyllda för hela denna procedur. Sug inte upp vätska från kanalerna/facken, endast brunnarna.
  3. Ladda 150 μL av poly-L-Ornithine arbetslösning i den övre högra brunnen. Vänta 90 s eller tills vätskan börjar fylla den nedre högra brunnen. Tillsätt 150 μL media till den nedre högra brunnen och vänta i 5 min för att låta vätskan passera genom mikrospåren.
  4. Tillsätt 150 μL media till den övre vänstra brunnen. Vänta 90 s och tillsätt sedan 150 μL till den nedre vänstra brunnen. Linda hållaren av chip (s) med parafilm och plats vid 4 ° c över natten.
    Obs: alternativt placera chip och hållare vid 37 ° c i 1 h.
  5. Aspirera media från brunnarna och se till att Pipettera-spetsen är placerad bort från kanal öppningen. Tillsätt 150 μL sterilt vatten till den övre högra brunnen. Vänta 90 s och tillsätt sedan 150 μL till den nedre högra brunnen. Vänta 5 min för att låta vätskan passera genom microgrooves.
  6. Tillsätt 150 μL sterilt vatten till den övre vänstra brunnen, vänta 90 s och tillsätt sedan ytterligare 150 μL till den nedre vänstra brunnen.
  7. Upprepa steg 1.5-1.6.
  8. Tina laminin långsamt vid 2 ° c till 8 ° c och Bered en arbetslösning på 10 μg/mL.
  9. Fyll 150 μL av lamininarbetslösning till den övre högra brunnen. Vänta 90 s eller tills vätskan börjar fylla den nedre högra brunnen. Pipet 150 μL till den nedre högra brunnen. Vänta 5 min för att låta laminin gå igenom microgrooves.
  10. Tillsätt 150 μL laminin i övre vänstra brunnen. Vänta 90 s och tillsätt sedan 150 μL till den nedre vänstra brunnen. Inkubera chippet i hållaren i 2 h vid 37 ° c.
  11. Skölj chipet med PBS (utan ca2 + och mg2 +). Ladda 150 μL PBS till den övre högra brunnen. Vänta 90 s eller tills vätskan börjar fylla den nedre högra brunnen. Tillsätt 150 μL PBS till den nedre högra brunnen och vänta i 5 min för att låta PBS gå igenom mikrospåren.
  12. Pipet 150 μL PBS till den övre vänstra brunnen. Efter 90 s Pipettera 150 μL till den nedre vänstra brunnen.
  13. Aspirera PBS från chip och skölj sedan chip med NSC media (se tabell över material). Ladda 150 μL media till den övre högra brunnen. Efter 90 s eller när vätskan passerar genom rätt kanal i den nedre högra brunnen, tillsätt 150 μL till den nedre högra brunnen. Vänta i 5 min för att låta medierna flöda genom microgrooves.
  14. Tillsätt 150 μL media till den övre vänstra brunnen och en annan 150 μL till den nedre vänstra brunnen. Inkubera chippet i en inkubator på 37 ° c med 5% CO2 för att förkonditionera chippet tills det är färdigt att Seed nscs.
    Obs: chips kan förkonditioneras över natten om det behövs.

2. sådd NSCs i multifacks chip

Anmärkning: detta protokoll används kommersiellt inköpta NSCs, till skillnad från vår tidigare publikation som inleddes med mänskliga embryonala stammar celler5. I detta protokoll är neurala stamceller pläterade direkt i plast chips där de differentieras till nervceller. Cellerna kan tillåtas att förgöra sig som NSCs (utan differentiering) för upp till 2 passager och lagras i flaskor i flytande N2 för vidare användning. Detta protokoll använder NSC-injektionsflaskor lagrade i Liquid N2 efter passage 1 eller 2. Figur 2b visar en översikt över beläggnings procedurerna.

  1. NSCs enligt tillverkarens anvisningar.
    ANMÄRKNINGAR: den här proceduren gäller för H9-härledda NSCs. Andra cellinjer kommer att kräva celltäthet optimering.
  2. Räkna cellkoncentrationen med hjälp av en hemocytometern och justera med hjälp av NSC media för att få en koncentration av 7 x 106 celler per ml.
  3. Aspirera media från varje brunn av chip. Undvik aspirera media från de viktigaste kanalerna.
  4. Pipet 5 μL av cell lösningen till den övre högra brunnen, följt av 5 μL till den nedre högra brunnen (totalt 70 000 celler). Kontrollera att cellerna pipetteras mot de viktigaste kanal öppningarna. Använd ett mikroskop för att kontrollera att celler har kommit in i kanalen. Vänta 5 min för celler att hålla sig till botten av chip.
    Anmärkning: antingen eller båda fack kan användas för att ladda celler.
  5. Pipet ~ 150 μL av NSC-mediet till den övre högra brunnen och sedan 150 μL till den nedre högra brunnen. Upprepa på vänster sida. Inkubera vid 5% CO2, 37 ° c i en lämplig fuktad behållare.
  6. Efter 48 timmar, aspirera NSC media från brunnarna och ersätta med neurala differentiering Media genom att lägga till 150 μL till varje topp väl och varje botten väl.
  7. Kultur nervceller inom en 5% CO2, 37 ° c inkubator i en lämplig fuktad behållare.
    Obs: Media bör bytas ut var 2-3 dag. På grund av de små volymer som används i chipet kan avdunstning även inom en fuktad inkubator väsentligen påverka cellernas lönsamhet. Använd en lämplig sekundär behållare för att ge ytterligare fukt för långsiktig kultur av celler med chip (se tabell över material).

3. viral fluorescerande märkning av hSC-neuroner inom chip

Obs: flera virus kan användas för att märka nervceller inom chip. Instruktionerna nedan beskriver användningen av G-utgår rabies-mCherry eller – eGFP virus. Potentiellt smittsamma material måste hanteras i enlighet med tillämpliga regler och förordningar, och kan kräva ytterligare utbildning och institutionellt godkännande.

  1. Varm ~ 400 μL av färska neurala differentierings medier per chip till 37 ° c.
  2. Ta bort 50 μL media från en brunn i Axon-facket till ett centrifugrör och tillsätt sedan 100 000 virala enheter av modifierat rabiesvirus till röret.
    Obs: kassera förbrukade Pipettera-spetsar och centrifugrör som innehåller virus.
  3. Ta bort kvarvarande neurala differentiering media från axonal facket och placera i ett centrifug röret. Förvaras vid 37 ° c.
    Obs: se till att kanalerna förblir fyllda med vätska.
  4. Blanda 50 μL virus lösning med 150 μL värmda media. Pipet 100 μL till en brunn i axonfacket och 100 μL till det andra axonfacket väl. Inkubera i 2 timmar inom en inkubator på 37 ° c.
    Obs: skillnaden i volym mellan axonala och somatiska fack hjälper till att säkerställa att viruset stannar i axonal facket under infektion/inkubationstider.
  5. Ta bort och kassera virusinnehållande media.
    FÖRSIKTIGHET: ta inte bort vätska i de medföljande mikrofluidiska kanalerna.
  6. Försiktigt Pipettera 75 μL av färska medier till ett Axon fack väl och låt Media flödet genom kanalen till andra Axon väl.
  7. Ta bort material från Axon-facket och kassera det på rätt sätt.
  8. Upprepa steg 3,6 och 3,7.
  9. Fyll Axon-facket med det sparade mediet. Pipet ytterligare 50 μL färsk media, om det behövs, och sedan returnera kretsen till inkubatorn. Denna extra fräscha media är att räkna mot förlust av media vid vätskeöverföring och avdunstning under processen.
    Obs: synlig fluorescerande märkning med dessa modifierade rabiesvirus sker genom 48 h och upp till 8 dagar efter vilken celldöd av infekterade nervceller uppstår i allmänhet på grund av virustoxicitet. Neuron avbildning kan utföras som med andra vanliga kulturplattformar (t. ex. glasbotten rätter), men särskild hänsyn behövs för att bibehålla tillräcklig fuktighet för att förhindra avdunstningsförluster.

4. fluidic isolering, axotomy, och immunofärgning inom chip

  1. Följ fluidic isolation, axotomy och immunofärgning med chip som beskrivs i Nagendran et al.12.

Representative Results

Efter en vecka (7-10 dagar) i chip med differentiering media, NSCs differentiera till nervceller och neuronala projektioner in i axonal facket (figur 3). Inom chip, nervceller fäster och fördela jämnt inom det somatiska facket. I jämförelse, neuroner i PDMS enheter klumpar/aggregat så tidigt som 5 dagar efter tillsats av differentiering media, vilket leder till nedsatt cell hälsa som kan ses i figur 3b (dag 13 förstorade bilden). Nervceller i markerna ser friska med medföljande axoner. Friska nervceller kan upprätthållas inom markerna för 4-5 veckor.

För att visualisera neuron mognad och dendritiska ryggraden utveckling, modifierad rabiesvirus levererades till axonal facket på dag 29 till retrograd etikett nervceller, inklusive dendritiska taggar, med mCherry fluorescerande protein. Fyra dagar efter rabiesvirus infektion, neuroner utvidga axoner i axonal facket uttryckte mCherry. Nervceller på differentiering dag 33 visade bildandet av dendritiska Taggar (figur 4). Visualisering av dendritiska Taggar visar att NSC härledda neuroner åtskilda i markerna bildar mogna synapser.

Multi-fack chip är också kompatibel med vävnad att visualisera cellulära lokalisering av protein. Efter 26 dagar för att upprätthålla nervceller i differentiering media, neuroner var märkta för excitatoriska synaptisk markör, vGlut1 (figur 5). Dessa resultat visar att viralt märkta neuroner Co-Localize med vGlut1 (figur 5E) och neuron specifik markör, β-TUBULIN III (figur 5F-H).

Förmågan att skapa olika mikromiljöer isolerade till axoner visades också med hjälp av Alexa fluor 488 hydrazid, en låg molekylvikt fluorescerande färgämne (figur 6).

Axon skade studier utförs ofta inom uppdelade enheter. Ett bevis på princip experiment utfördes för att selektivt skada axoner av differentierade nervceller med förmonterade COC chip (figur 7). Resultat var likvärdiga med silikon uppdelade enheter6,13,14.

Figure 1
Figur 1: den förmonterade COC, multifacks mikroflödessystem chip. Aen ritning av det chip som identifierar de övre och nedre brunnarna. Storleken på chip är 75 mm x 25 mm, storleken på standard Mikroskop diabilder. (B) en zoomad region som visar kanalerna och mikrospåren som separerar kanalerna. Ytterligare detaljer finns i Nagendran et al.12. (C) Detta fotografi illustrerar skapandet av isolerade mikromiljöer inom varje fack med hjälp av karamellfärg färgämne. Hela denna siffra har reproducerats från 12. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: plast uppdelade chip beläggning och NSC cellplätering tidslinje. (A) plast multifacks chips var belagda med en pre-Coating lösning, och sedan Poly-L-Ornithine och laminin innan förkonditionering med NSC media. (B) nscs var pläterade med 7 x 104 celler i somatiska avdelning av chip. Cellerna odlades i NSC media för 24 h och sedan medierna ersattes med neurala differentiering media. Differentierade neuroner observerades av 7-10 dagar efter differentiering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: hSC-neuron tillväxt jämförelse i chips och PDMS enheter. (A) en faskontrast bild av HSC-neuroner som odlas vid 13 dagar efter differentiering i plast multifacks chip. (B) en inzoomad region av HSC-neuroner odlade inom den vita rutan i (a) och en likvärdig region inom en PDMS-enhet (höger). hSC-neuroner inom spånorna fäster väl. Aggregerad neuron kluster form i PDMS-baserade enheter. Representativ för 2 oberoende experiment. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: mänskliga NSC-härledda neuroner visar dendritiska ryggraden morfologi. Retrograd märkt mCherry neuron på differentiering dag 33 odlas inom chip. Den förstorade regionen som beskrivs i rött, belyser närvaron av dendritiska taggar, som ger belägg till stöd för utvecklingen av mogna glutamatergic synapser. Röda pilar pekar mot dendritiska taggar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: mänskliga NSC härledda nervceller odlade inom chips uppvisar excitatoriska synapser. Immunofärgning utfördes vid differentierings dag 26. Neuron avbildning utfördes i somatiska facket. A) vGlut1 (grön) och (B) DAPI (blå) immunolabeling. (C) mcherry-märkta neuroner (röd) retrograd märkt med hjälp av en modifierad rabiesvirus. D) en sammanslagen fluorescerande Mikrograf (a-C). (E) dendritiska Taggar och vGlut1 positiva Auktor samlokaliserade med mcherry-positiva dendriter, visas i en inzoomad region från (D). Immunofluorescensmikrografer av (F) neuron specifik markör, β-TUBULIN III (magenta) och (G) vGlut1 (grön). H) överlagring av β-TUBULIN III och vGlut1. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: viralt sensorik mcherry neuroner förlänga projektioner till en Axon lokaliserad mikromiljö etablerad inom den förmonterade COC-chip. (A) mcherry märkt neuron förlänga axoner genom mikrospår av chip och i ett isolerat Axon fack. Isoleringen av axon-facket visualiseras med hjälp av Alexa fluor 488 maleinhydrazid. Avbildning av nervceller inträffade vid differentiering dag 26 och 3 dagar efter infektion med den modifierade Rabiesviruset. (B) fluorescensbilden i (a) slås samman med en DIC-bild. Notera placeringen av microgrooves. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Axotomi som utförs inom COC multifacks chip. (A) mcherry märkta neuroner vid differentiering dag 33 var avbildas före axotomy. "Fire" färg look-up tabell. Bomedelbart efter axotomi, som visar att axoner är helt avbrutit. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Multifacks-chips i plast PDMS-enheter med flera fack
isolera axoner isolera axoner
etablera mikromiljöer etablera mikromiljöer
axotomize nervceller axotomize nervceller
optiskt transparent optiskt transparent
kompatibel med högupplöst avbildning kompatibel med högupplöst avbildning
kompatibel med fluorescens-mikroskopi kompatibel med fluorescens-mikroskopi
färdigmonterad montering till substrat krävs
friska axoner > 21 dagar friska axoner > 14 dagar
hydrofila odlingsyta Hydrofoba
gas ogenomtränglig gas genomsläpplig
rundade mikrospår och kanaler raka mikrospår
inte kompatibel med laser ablation Kan användas för laser ablation när PDMS Chambers monteras på speciella laser ablation kompatibla bilder.
enheten kan inte ändras för att ta bort toppen är avtagbar för färgning inom microgrooves
inte kompatibel med mineraloljebaserade doppoljor (silikon-baserade oljor är bra) kompatibel med mineraloljebaserade immersionsolja
ogenomtränglig för små molekyler och organiska lösningsmedel absorption av små molekyler & organiska lösningsmedel
Inga läckage problem med chip beläggning med poly-L-Ornithine och laminin gör enheterna läckande
differentierade neuroner förblir jämnt fördelade (> 4 veckor) vid de testade cell tätheter differentierade nervceller börjar aggregera efter 3-4 dagar i kulturen vid den testade cell tätheter

Tabell 1: jämförelse av multi-kupé COC-chips och silikon enheter för odling av neuroner

Discussion

Den förmonterade multi-kupé COC chip är en enkel att använda uppdelade plattform för att differentiera och underhålla mänskliga nscs i nervceller för långsiktig (> 4 veckor). I detta protokoll visar vi differentiering av mänskliga NSCs i glutamaterga neuroner, retrograd etikett nervceller, utföra immunocytokemi, visualisera dendritiska ryggraden morfologi och utföra axotomy. Dessa chips är kompatibla med högupplöst avbildning och det finns ingen autofluorescence med COC12.

COC multi-kupé chips är funktionellt likvärdiga med silikon-baserade uppdelade enheter, och har fördelar och nackdelar som beskrivs tidigare12. Tabell 1 jämför multi-fack COC chips och silikon enheter för odling HSC-neuroner. COC uppdelade chips ger en bättre hydrofila yta för fastsättning och underhåll av stamceller under en lång kultur period. PDMS-baserade enheter måste monteras och fästas på glas täckband. Den hydrofoba karaktären av PDMS enheter orsakar aggregering av stamceller5; Detta leder till både utmaningar i Imaging på cellnivå och större känslighet för fysiska skador på grund av förflyttning av cell aggregat under Media förändringar. Plastchip övervinner dessa utmaningar. COC är gas ogenomtränglig, till skillnad från PDMS, så luftfickor fångade eller bildas inom kanalerna måste tas bort av användaren. Pre-Coating lösning minskar möjligheten för luft att fastna i kanalerna. Denna lösning består av etanol och andra agenter. Ett tidigare publicerat protokoll för odling av murina neuroner inom dessa plast chips ger ytterligare information om Pipettera celler och media inom markerna12. NSCs är mer bräckliga att murina nervceller, så måste hanteras mer försiktigt. Det är också viktigt att blanda stamcellerna grundligt före pläteringen genom att försiktigt Pipettera dem upp och ner.

Användning av nervceller som härrör från in vitro-differentierade mänskliga stamceller blir allt populärare inom medicin och forskning. Dessa nervceller är viktiga för forskning och kliniska tillämpningar för många CNS-sjukdomar, inklusive neurodegenerativa sjukdomar och traumatiska hjärnskador. Dessa nervceller liknar nära mänskliga foster nervceller15. I framtiden, lämpligt åldrade nervceller kan genereras från stamceller för att efterlikna åldersrelaterade neuronala funktion och används i samband med dessa uppdelade enheter. Dessa enheter kommer att underlätta forskning om sjukdomar som påverkar Axon hälsa och funktion såsom Axon underskott i nervceller av patienter som diagnostiserats med autismspektrumstörningar och axonal förnyelse efter skada16,17.

Disclosures

S.P. och T.N. deklarerar inga konkurrerande ekonomiska intressen. V.P. är anställd hos Xona microfluidics, LLC. J.H. är medlem i Xona microfluidics, LLC. A.M.T. är en uppfinnare av mikroflödessystem avdelningen/chip (US 7419822 B2, EPO 2719756 B1) och är medlem i Xona microfluidics, LLC.

Acknowledgments

Författarna erkänner stöd från Xona microfluidics, LLC, National Institute of Mental Health (R42 MH097377), och det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och stroke (R41 NS108895, P30 NS045892). Innehållet är uteslutande författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikter som finns hos National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor hydrazide 488 ThermoFisher Scientific A10436
Alexa Fluor secondary antibodies ThermoFisher Scientific 1:1000
anti_beta-tubulin III Aves TUJ 1:1000
anti-vGAT antibody Synaptic Systems 131 003 1:1000
anti-vGlut1 antibody NeuroMab 75-066 clone N28/9, 1:100
complete neural stem cell media:
 REC HU EGF
10 UG BIOSOURCE (TM) 
ThermoFisher Scientific PHG0314 20ng/mL 
REC HU FGF BASIC
10 UG BIOSOURCE (TM) 
ThermoFisher Scientific PHG0024 20ng/mL 
GlutaMAX Supplement (100X) ThermoFisher Scientific 35050061 2mM 
KnockOut DMEM/F-12 ThermoFisher Scientific  12660012
StemPro Neural Supplement ThermoFisher Scientific A1050801 2%
Epifluorescence imaging system EVOS Fluorescence imaging system AMF4300 10x objective
fluorinated ethylene propylene film American Durafilm 50A 0.5 mil thickness
Fluoromount G ThermoFisher Scientific 00-4958-02
Gibco DPBS without Calcium and Magnesium ThermoFisher Scientific 14190144
GIBCO HUMAN NSC (H9) KIT
COMBO KIT
 
 
Gibco N7800200
Gibco Laminin ThermoFisher Scientific 23017015
Glass Pasteur pipettes Sigma-Aldrich CLS7095D5X SIGMA 5.75 in length
H9-DERIVED HU NEURAL STEM CELL
1E6 CELLS/VIAL; 1 ML 
ThermoFisher Scientific 510088
hibernate-E Medium ThermoFisher Scientific A1247601
Incubator, 5% CO2 37 °C
Laser scanning confocal imaging system Olympus FV3000RS 30x silicone oil objective
modified rabies virus Salk Institute for Biological Studies G-deleted Rabies-eGFP Material Transfer Agreement required
Mr. Frosty  ThermoFisher Scientific 5100-0001
Neural differentiation media Per 100 mL. 
Antibiotic-Antimycotic (100x) ThermoFisher Scientific 15240112 1mL (100X)
Ascorbic acid Sigma Aldrich A8960 200mM 
BDNF ThermoFisher Scientific PHC7074 40 ng/mL 
Gibco B27 Plus Supplement (50X) FisherScientific A3582801 2mL (50X)
Gibco CultureOne Supplement (100X)  FisherScientific A3320201 1mL (100X)
Gibco Neurobasal Plus Medium FisherScientific A3582901
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent ThermoFisher Scientific A1110501
Taylor Wharton Liquid N2 dewar FisherScientific 20HCB11M
triton X-100 ThermoFisher Scientific 28314
XC pre-coat  Xona Microfluidics, LLC XC Pre-Coat included with XonaChips
XonaChip Xona Microfluidics, LLC XC450 450 µm length microgroove barrier
Humidifier Tray Xona Microfluidics, LLC humidifier tray

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal translation of beta-catenin regulates synaptic vesicle dynamics. The Journal of Neuroscience. 33, (13), 5584-5589 (2013).
  2. Virlogeux, A., et al. Reconstituting Corticostriatal Network on-a-Chip Reveals the Contribution of the Presynaptic Compartment to Huntington’s Disease. Cell Reports. 22, (1), 110-122 (2018).
  3. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36, (46), 11573-11584 (2016).
  4. Pinto, M. J., et al. The proteasome controls presynaptic differentiation through modulation of an on-site pool of polyubiquitinated conjugates. The Journal of Cell Biology. 212, (7), 789-801 (2016).
  5. Bigler, R. L., Kamande, J. W., Dumitru, R., Niedringhaus, M., Taylor, A. M. Messenger RNAs localized to distal projections of human stem cell derived neurons. Scientific Reports. 7, (1), 611 (2017).
  6. Nagendran, T., et al. Distal axotomy enhances retrograde presynaptic excitability onto injured pyramidal neurons via trans-synaptic signaling. Nature Communications. 8, (1), 625 (2017).
  7. Van Laar, V. S., et al. Evidence for compartmentalized axonal mitochondrial biogenesis: Mitochondrial DNA replication increases in distal axons as an early response to Parkinson's disease-relevant stress. The Journal of Neuroscience. (2018).
  8. del Río, J. A., Ferrer, I., Gavín, R. Role of cellular prion protein in interneuronal amyloid transmission. Progress in Neurobiology. 165-167, 87-102 (2018).
  9. Jia, L., et al. MiR-34a Regulates Axonal Growth of Dorsal Root Ganglia Neurons by Targeting FOXP2 and VAT1 in Postnatal and Adult Mouse. Molecular Neurobiology. (2018).
  10. Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66, (1), 57-68 (2010).
  11. Menon, S., et al. The E3 Ubiquitin Ligase TRIM9 Is a Filopodia Off Switch Required for Netrin-Dependent Axon Guidance. Developmental cell. 35, (6), 698-712 (2015).
  12. Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons. Journal of visualized experiments : JoVE. (141), (2018).
  13. Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2, (8), 599-605 (2005).
  14. Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29, (15), 4697-4707 (2009).
  15. Oh, J. H., Jung, C. R., Lee, M. O., Kim, J., Son, M. Y. Comparative analysis of human embryonic stem cellderived neural stem cells as an in vitro human model. International Journal of Molecular Medicine. 41, (2), 783-790 (2018).
  16. Lazar, M., Miles, L. M., Babb, J. S., Donaldson, J. B. Axonal deficits in young adults with High Functioning Autism and their impact on processing speed. Neuroimage Clinical. 4, 417-425 (2014).
  17. DePaul, M. A., Lin, C. Y., Silver, J., Lee, Y. S. Combinatory repair strategy to promote axon regeneration and functional recovery after chronic spinal cord injury. Scientific Reports. 7, (1), 9018 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics