Monster voorbereiding methode van scannen en transmissie elektronenmicroscoop voor de aanhangsels van woodboring Kever

Environment

Your institution must subscribe to JoVE's Environment section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Om ultrastructuur van insectensensilla te observeren, werd in de studie het protocol voor de voorbereiding van de insectenensilla, scanning en transmissieelektronenmicroscopie (SEM en TEM) in de studie gepresenteerd. Tween 20 werd toegevoegd aan de fixatie om monstervervorming in SEM te voorkomen. Fluorescentiemicroscopie was nuttig voor het verbeteren van de snijnauwkeurigheid in TEM.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zhang, Y. R., Qiao, H. L., Ren, L. L., Wang, R., Lu, P. F. Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle. J. Vis. Exp. (156), e59251, doi:10.3791/59251 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Dit rapport beschreef monsterbereidingsmethoden die waarnemingen van elektronenmicroscoops scannen en transmissieën, aangetoond door het voorbereiden van aanhangsels van de houtboorkever, Chlorophorus caragana Xie & Wang (2012), voor beide soorten elektronenmicroscopie. Het protocol voor de voorbereiding van het monster van scanning electron microscopy (SEM) was gebaseerd op monsterchemische fixatie, uitdroging in een reeks ethanolbaden, drogen en sputtercoating. Door Tween 20 (Polyoxyethyleen sorbitan laurate) toe te voegen aan de fixatieve en wasoplossing, werd het insectenlichaamsoppervlak van houtboringkever gereinigder gewassen in SEM. Deze studie transmissie elektronenmicroscopie (TEM) monster voorbereiding betrokken een reeks stappen, waaronder fixatie, ethanol uitdroging, inbedding in hars, positionering met behulp van fluorescentie microscopie, sectioning, en vlekken. Fixatief met Tween 20 ingeschakeld doordringen de insecten lichaam muur van houtboring kever gemakkelijker dan het zou zijn geweest zonder Tween 20, en vervolgens beter vaste weefsels en organen in het lichaam, dus leverde duidelijke transmissie elektronenmicroscoop waarnemingen van insect sensilla ultrastructuren. De volgende stap van dit preparaat was het bepalen van de posities van insectensensilla in het monster ingebed in het harsblok met behulp van fluorescentiemicroscopie om de precisie van de positionering van het doel sensilla te verhogen. Dit verbeterde snijnauwkeurigheid.

Introduction

Scanning elektronenmicroscopie is een belangrijk instrument in veel morfologie studies, dat SEM oppervlaktestructuren1,2toont. De aantrekkingskracht van transmissieelektronenmicroscopie is dat het kan worden gebruikt om een breed scala aan biologische structuren op nanometerschaal te bestuderen, van de architectuur van cellen en de ultrastructuur van organellen, tot de structuur van macromoleculaire complexen en eiwitten. TEM toont binnenstructuren3,4,5.

Coleoptera is de grootste groep insecten, waaronder ongeveer 182 families en 350.000 soorten. De meeste coleopteran insecten, in het bijzonder houtboring kever, voeden zich met planten, waarvan vele belangrijke plagen van bossen en fruitbomen, waardoor verwoestende schade aan bomen6. Op dit moment hebben preventie en bestrijding van plagen op basis van chemische ecologie theorie steeds meer aandacht gekregen7. Efficiënte, laag-toxische, vervuiling-vrije feromoon controle methoden zijn uitgegroeid tot een effectieve manier8. Het bestuderen van de sensilla morfologie en ultrastructuur van insecten is een belangrijk onderdeel van het onderzoek naar de chemische ecologie van insecten. De scanning en transmissie elektronenmicroscopie (SEM en TEM, respectievelijk) worden gebruikt om hun morfologie en interne anatomie te bestuderen. Tijdens de bereiding van insectenmonsters voor elektronenmicroscopie (EM) kunnen de objectiviteit en authenticiteit van de observatieplaats echter worden aangetast9. In het algemeen vereist SEM-monstervoorbereiding van insecten reiniging, weefselfixatie, uitdroging, metathesis, drogen en sputtercoating10. Door de complexe omgeving waarin houtboring kever leven, het lichaamsoppervlak heeft vaak verschillende verontreinigende stoffen en hun aanhangsels hebben vaak veel fijne lange sensilla of haren. In het bijzonder zijn sommige houtborers niet beschikbaar bij laboratoriumverhoging, die rechtstreeks in het veld werden verzameld, en vervolgens in bevestigingsvloeistof worden gestopt om de versheid te garanderen en vervolgens in het laboratorium te wassen. Als het monster eerst wordt bevestigd en vervolgens gewassen, is het natuurlijk veel moeilijker om puin te verwijderen, omdat glutaraldehyde het sterk aan het monster bevestigt. Tween 20 is een oppervlakteactievestof 11,12,13,14, die een belangrijke rol speelt in het wasproces, waaronder het verminderen van de oppervlaktespanning van water en het verbeteren van de nattbaarheid van water op het oppervlak van de wasserij. In deze studie werd Tween 20 toegevoegd aan de bevestigingsoplossing en PBS-reinigingsoplossing om de oppervlaktespanning van de vloeistof te verminderen en te voorkomen dat het vuil op het lichaamsoppervlak van de houtboorkever terechtkwam, waardoor het lichaamsoppervlak schoner werd in SEM.

Met behulp van TEM kan sensilla op verschillende organen van insecten worden gesneden om de duidelijke structuren in hen te onthullen, waardoor een basis wordt gelegd voor het analyseren van sensilla-functies. Wanneer het onderwerp insect, zoals houtboring kever, is groot, en het lichaam muur heeft een aanzienlijke mate van sclerotization, dus de fixatie kan niet volledig verzadigen orgaanweefsels in het insectenlichaam. Tween 20 kan de dispersie- en suspensiecapaciteit van het vuil verbeteren. In deze studie werd Tween 20 toegevoegd aan de fixatieve vloeistofpenetratie in de insectenlichaamwand van houtboringkever, waardoor vervorming en instorting van de opperhuid11,12,13werd voorkomen. Bovendien, met behulp van algemene snijtechnologie, is het moeilijk om nauwkeurig te lokaliseren verschillende soorten sensilla, met name voor een aantal kleine sensilla15. Op basis van traditionele TEM monstervoorbereiding combineerde deze studie fluorescentiemicroscopie en SEM om de positie van insectensensilla in het ingebedde blok te bepalen, waardoor de snijnauwkeurigheid werd verbeterd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

LET OP: Raadpleeg de materiaalveiligheidsinformatiebladen van reagentia voordat u ze gebruikt. Verscheidene van de chemische stoffen die tijdens het monsterpreparaat worden gebruikt, zijn giftig, mutageen, kankerverwekkend en/of reprotoxisch. Gebruik persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, labjas, broek over de hele lengte en schoenen met gesloten teen) en werk onder een rookkap tijdens het hanteren van het monster.

1. SEM-monstervoorbereiding en beeldvorming

  1. Proeffixatie en reiniging
    1. Werken in een gebied waar C. caragana voorkomen, trekken volwassenen in het veld vallen aas met planten lokmiddelen, zoals isophorone16. Bewaar schone lichamen van volwassen C. caragana in 0,1 mol L-1 fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7.2), 2,5% (wt/vol) glutaraldehyde (Anhydrous EM Grad) en 0,06% (vol/vol) Tween 20. Bevestig het monster op 4 °C in het weekend.
    2. Verwijder de lichamen uit de conserveringsvloeistof en spoel af in de fosfaatbuffer. Verwijder met behulp van een stereomicroscoop de aanhangsels en reinig ze ultrasoon (40 kHz) in een 0,1 mol L-1 fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7.2) met 0,06% (vol/vol) Tween 20 (PBST). Breng na het schoonmaken gedurende 100 s het monster naar de microscoop om te controleren of het schoon was. Onder normale omstandigheden, schoon voor 400s om ervoor te zorgen dat het monster schoon genoeg was om te observeren en niet beschadigd.
  2. Monster uitdroging, montage en drogen
    1. Dehydrateer de monsters met behulp van 20 min opeenvolgende behandelingen in 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% en 100% (alle vol/vol) ethanol. Gebruik onder een stereomicroscoop koolstofdubbelzijdige plakband om 3 observatieoppervlakken (dorsale ventralen en laterale) afzonderlijk op stompen te bevestigen. Houd er rekening mee dat alle kijkoppervlakken schoon en vrij van verontreiniging moeten worden gehouden. Plaats het monsterstadium in een petrischaaltje met een silicagel desiccant gedurende 48 uur.
  3. Sputter-coat en Sample Insertion
    1. Met behulp van Hitachi Koki (E-1010) ion sputteren instrument, draai main valve naar open positie, verwijder de monsterkamer deksel, en zet het monster in de kamer. Zet de POWER-schakelaar aan en klaar licht was ingeschakeld. Stel de Sputterse tijd in als 45 seconden en dikte de coating als 70.875 Å. Zodra mechanische pomp vacuüm wijzerplaat index gedaald tot onder de 7, druk op DISCHARGE en beginnen spuiten platina. Aan het einde van het experiment, zet de voeding en neem het monster uit de kamer. Spuitfoliedikte: d = KIVt ("d" is de dikte van de film in de eenheid " Å "; " K" is een constante, afhankelijk van het gesputteerde metaal en gas. K van lucht is bijvoorbeeld 0,07; "Ik" is de eenheid mA van plasmastroom; "V" is de spanning die wordt toegepast in de eenheid van "KV". "t" is tijd in seconden.
    2. Plaats de stub met het monster op het stadium van SEM. Zorg ervoor dat de monsterfase met de monsterstrook voldoende hoogte had om een goed beeld mogelijk te maken. Open de SEM-software en selecteer een gewenste bedrijfsspanning, te beginnen bij 20 kV.

2. TEM-monstervoorbereiding en -beeldvorming

  1. Het monster verkrijgen en repareren zoals in de stappen 1.1.1 en 1.1.2.
  2. Reiniging, secundaire fixatie en uitdroging
    1. Verwijder volwassen C. caragana uit de conserveringsvloeistof. Verwijder met behulp van een stereomicroscoop de aanhangsels, was de monsters 3 uur in PBST en bevestig ze vervolgens in 1% (wt/vol) osmium tetroxide in PBS gedurende 1 uur bij 25 °C. Dehydrateer de monsters met behulp van 20 min opeenvolgende behandelingen in 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% en 100% (alle vol/vol) ethanol bij kamertemperatuur.
  3. Hars inbedding en polymerisatie
    1. Veranker de monsters in hars in een platte inbeddingsvorm. Het monster bevond zich aan de onderkant van de plaat en werd zo dicht mogelijk bij de rand van de verzonken groef geplaatst. Plaats het etiket in de blanco en broed de plaat met het monster op 60 °C gedurende 72 uur. Verwijder de capsule uit de couveuse en controleer of de hars gepolymeriseerd is.
  4. Monstersectie en kleuring
    1. Zodra ervoor te zorgen dat het monster was gestold, plaats elk hars blok onder een fluorescentie microscoop en fotografeer ze onder blauw licht. Verplaats de fluorescerende lichtbron van de microscoop, zodat het monster van bovenaf bestraalde. Laat de sensilla in het harsblok duidelijk worden waargenomen. Gefotografeerd en meet afstanden om de sensilla te targeten (figuur 1).
    2. Raadpleeg sem-afbeelding van de palps(figuur 2A) en snijd ruwweg het harsblok met een scheermesje om de doelreceptor te sluiten(figuur 2B).
    3. Vervolgens, met behulp van blauw-licht fluorescentie microscopie, foto van de ruwweg gesneden hars blok, het aanpassen van de lichtbron van bovenaf, zodat de sensilla duidelijk werd waargenomen. Groen licht opgewonden door het blauwe licht creëerde een gunstige observatie. Bij beeldvorming werd de objectieve micrometer (DIV 0.01mm) toegevoegd aan de fluorescentiemicroscoopfase, waarna de afstand van het doel werd gemeten door ImageJ-software (U.S. National Institute of Health) (Figuur 2C). De afbeeldingsliniaal is gemaakt door Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA, USA). Stel vervolgens voor ultramicrotome snijden de snijafstand in met 50-60 nm snijdiktes, totdat de doelpositie werd bereikt. Gebruik fluorescentiemicroscopie om de doelreceptor te lokaliseren.
    4. Monteer de secties op formvar-gecoate, 100-mesh koperen roosters, dubbel gekleurd met uranyl acetaat en loodcitrate.
      1. Voeg ten eerste 3,75 g uranylacetaat toe aan 50 mL aan 50 % methanol. Vlekroosters met een gefilterde spuit (0,45 μm) van een verzadigde oplossing van uranylacetaat bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Dek secties tijdens het vlekken af om licht geïnduceerde neerslag te blokkeren. Spoel 2x methanol af voor 50 %; 2x gefilterd ontgast water.
      2. Voeg ten tweede 0,02 g loodverkeering toe aan 10 mL ontgasteerd gedestilleerd water in centrifugebuis. Voeg 0,1 mL natriumhydroxide van 10 N toe, sluit af en schud om op te lossen. Vlekroosters met een oplossing van loodcitraat voor 8 min. Centrifuge voor gebruik. Kleuring moet worden gedaan in een koolstofdioxide vrije omgeving om de vorming van loodcarbonaat neerslag te voorkomen. Plaats druppels vlek op vierkanten van plastic petrischaaltjes. Spoel af in ontgast gefilterd water en droog17. Observeer ze via TEM die werkt bij 80 kV.

Figure 1
Figuur 1: Een fluorescerende microscoop fotografeerde een harsblok dat het aanhangsel van de Chlorophorus caraganaomsluit. (A) Antenneharsblok; (B) Hars blok aan het einde van de ovipositor. De pijl wees op de rand van het harsblok; stippelcirkel geeft de doelsensilla aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Procedures van de nauwkeurige sensilla-locatiemethode. (A) Het 4e subsegment van een maxillaire palp van Chlorophorus caragana, de stippelcirkel toonde de sensilla gericht door SEM. (B) Het 4e subsegment van een maxillaire palp van C. caragana bekeken door fluorescentie microscopie. Witte pijl toonde de ruwweg gesneden rand van het harsblok en de gestippelde cirkel toonde de nauwkeurige plaats. (C) De gemarkeerde afstand van de rand van het harsblok tot de maxillaire palpdoellocatie (28 μm in dit monster). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Met behulp van reinigings- en fixatieve oplossing met Tween 20 werd een schoner SEM-beeld waargenomen dan dat zonder Tween 20 (figuur 3). Tween 20 bevestigingsoplossing drong door tot de glutaraldehydebevestigingsoplossing in het weefsel. Microtubuli structuur was duidelijk te zien. TEM-afbeelding van de interne structuur van het monster is vervaagd zonder Tween 20 (figuur 4).

Figure 3
Figuur 3: De sensilla lokaliseren op antenne van Chlorophorus caragana onder SEM. Vergelijking van SEM-beeld met Tween 20 (A) en zonder Tween 20 (B), waaruit bleek dat beeld A is schoner dan foto B in het algemeen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Chlorofenacaragana bekeken door transmissie elektronenmicroscopie van sensilla takje basiconica op de labiale palps. Vergelijking van TEM-afbeelding met Tween 20 (A) en zonder Tween 20 (B). Microtubuli structuur van beeld A is duidelijk, terwijl die van beeld B wazig is. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

We gebruikten SEM om de types en ultrastructuren van sensilla op de palps van C te bestuderen. caragana, het vinden van 4 soorten sensilla waaronder 10 sub-types: 1 Böhm's haren (BB.), 3 sensilla chaetica (Ch.1-Ch.3), 1 digitiform sensilla (Dig.), en 5 sensilla takje basiconica (S.tb.1-S.tb.5) (Tabel 1). Sensilla identificatie en ultrastructuur was gebaseerd op hun morfologie en maat18,19,20,21,22,23. Onze monsterbereidingsmethoden maakten duidelijke beelden van de oppervlakken en interne ultrastructuren van insectensensilla.

Nummer Type Lengte (μm)a Diameter aan de basis (μm)a Muur Tip Socket Cuticulaire poriën Distributie
1 Bb. 5,18 ± 1,25 1,70 ± 0,47 Glad Scherpe Breed maxillaire palp, labial palp
2 Ch.1 38,59 ± 8,20 3,15 ± 0,84 Groef Scherpe Breed maxillaire palp, labial palp
3 Ch.2. 81,54 ± 18,07 3,75 ± 0,88 Groef Scherpe Breed maxillaire palp, labial palp
4 Ch.3 282,06 ± 22,60 6,10 ± 0,70 Groef Scherpe Breed labial palp
5 Graven. 24,77 ± 2,98 1,24 ± 0,32 Glad Botte Breed maxillaire palp
6 S.tb.1 6,51 ± 1,01 2,31 ± 0,25 Groef Met uitsteeksels Verhoogd en strak Tip porie maxillaire palp, labial palp
7 S.tb.2 5,91 ± 0,90 2,24 ± 0,30 Glad Botte Verhoogd en strak Tip porie maxillaire palp, labial palp
8 S.tb.3 6,84 ± 0,98 1,96 ± 0,35 Glad Met uitsteeksels Verhoogd en strak Tip porie maxillaire palp, labial palp
9 S.tb.4 2,21 ± 0,59 2,86 ± 0,46 Groef Met uitsteeksels Verhoogd Tip porie maxillaire palp, labial palp
10 S.tb.5 1,16 ± 0,29 1,05 ± 0,19 Glad Botte Verhoogd en breed Tip porie maxillaire palp, labial palp

Tabel 1: Soorten sensilla op de palps van C. caragana.

Om de ultrastructuur in de sensilla op C. caragana palps te onderzoeken, gebruikten we TEM. Een voorbeeld van deze studies was continue dwarsdoorsnede weergaven van de pin van de S.tb.1 op maxillaire palps. Uit de opvattingen bleek dat de dendritische schede de buitenste dendritische segmenten omringde en zich uitstrekte tot de puntporie (figuur 5A-D). Zeven onvertakte buitenste dendritische segmenten bestonden in de binnenste receptor lymfeholte, die werd omgeven door een buitenste holte (Figuur 5D). Het buislichaam werd gescheiden door een dendritische schede van andere buitenste dendritische segmenten op elke sensillar socket basis(figuur 5E). In de ciliaiaire regio, merkten we 8 dendrieten van verschillende diameters, wat wijst op de aanwezigheid van 8 bipolaire neuronen. Ten slotte bevatte het ciliairische segment 9 perifere microtubuli doublets (figuur 5F).

Figure 5
Figuur 5: TEM-weergaven van sensilla type 1 takje basiconica (S.tb.1) op een Chlorophorus caragana maxillaire palp30. (A) S.tb.1 met stippellijnen die gebieden markeren die dicht bij de voor vijgen genomen doorsnedes staan. B-E. (B) Dwarsdoorsnede van vingervormige uitsteeksels met verspreide cuticula. (C) Dwarsdoorsnede van het basale gebied van vingervormige uitsteeksels met binnenste receptorlymfeklieren zonder buitenste dendritische segmenten. (D) Dwarsdoorsnede van het middelste gebied van de pen met de dendritische schede die de sensillum-lymfeholte verdeelt in zowel binnen- als buitenholtes met 7 buitenste dendritische segmenten in de binnenste holte. (E) Basale gebied van de pen met het buislichaam omgeven door een dendritische schede en gescheiden van buitenste dendritische segmenten. Een tormogen cel vormt de buitenkant van de dendritische schede. F) Dwarsdoorsnede van het trilgebied met 8 dendrieten van verschillende diameters. Afkortingen: bb, basale lichaam; cs, ciliaiaal segment; CW, cuticulaire wand; DS, dendritische schede; iRL, binnenste receptor lymfeholte; M, microtubuli; Mi, microvilli; oD, buitenste dendritische segment; oRL, buitenste receptor lymfeholte; S.tb.1, type 1 sensilla takje basiconica; TBC, buislichaam; TH, thecogeencel; AAN, tormogen cel; TR, trichogencel. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In dit artikel presenteerden we een monster voorbereiding sschema voor scanning en transmissie elektronenmicroscopie voor houtboring kever. Met behulp van insectenaanhangsel als representatief studieonderwerp hebben we verschillende verbeteringen ten opzichte van traditionele monsterbereidingsmethoden aangetoond.

De vloeibare olie die loskomt van het vaste oppervlak wordt geëmulgeerd tot kleine druppeltjes, die goed kunnen worden verspreid en opgehangen in het wasmedium om het opnieuw storten op het oppervlak van het object te verminderen. Wasprestaties van oppervlakteactieve stof omvatten alle basiskenmerken zoals nattability, doorlaatbaarheid, emulgerende eigenschap, dispersievermogen, oplosbaarheid11,12,13,14. Effecten van verschillende detergenten op de elektronenmicroscopische monsters voorbereiding van Golden Nematode bleek dat Tween 20 had de beste reiniging effect, gevolgd door natriumbicarbonaat, en gedestilleerd water24. In deze studie, vonden we dat Tween 20 kan worden gebruikt om de oppervlaktespanning van de vloeistof te verminderen, en te voorkomen dat het vuil deponeren op het lichaamsoppervlak van het insect, met name voor houtboring kever direct verzameld in het veld. Het lichaamsoppervlak van het insect werd schooner gewassen in SEM. Fixatief met Tween 20 doordrong de insectenlichaamswand gemakkelijker, en later betere vaste weefsels en organen in het lichaam in TEM. Het voordeel van oppervlakteactieve stof in de voorbereiding van elektronenmicroscopiemonsters is uitgebreid bestudeerd24,25,26,27,28,29,30,31.

Ook hebben we een aangepaste luchtdrogende methode voor SEM monster voorbereiding, waarbij de uitgedroogde monster werd geplaatst in een petrischaalmeteen met een silica gel desiccant die geleidelijk verdampt de dehydrating agent. Het grootste voordeel van deze methode is dat het eenvoudig is, gemakkelijk onderhouden, en het houdt de micro-omgeving lucht droog en geen speciale apparatuur nodig. De natuurlijke droogmethode is een eenvoudige, praktische en effectieve methode voor zaad, moer en langdurige bewaring van insectenmonsters. Hoewel het monstervolume krimpt tijdens het natuurlijke droogproces, blijft de basismorfologie van het monsterbehouden 32. In het algemeen hebben Coleoptera-insecten een relatief laag watergehalte en wordt hun oppervlak omringd door harde chitinemuren. Air-dry is in staat om aan de eisen te voldoen. Deze droogmethode is echter niet geschikt voor het drogen van weefsels met een groot watergehalte, zoals luis, mijten en larven, omdat de oppervlaktespanning het monster tijdens het droogproces zal vervormen.

Om het type en het aantal sensilla verdeeld over het oppervlak van het aanhangsel te observeren en te berekenen, moet worden overwogen om het type en het aantal sensilla te observeren en te berekenen. Sommige sensilla waren weinig, klein, en soms bedekt, scannen en zorgvuldig observeren vanuit alle hoeken te vinden die sensilla volledig uitpuilende de opperhuid of als gevolg van de depressie. Aangezien veel sensilla waren relatief lang en haarachtig, de tip effect kan aanzienlijk zijn. Dus, de elektronenmicroscoop versnellingspanning mag niet te hoog zijn, 5-20kV was het beste en we gebruikten 20kV.

In de TEM-monsterinbedding kon het monster beter dicht bij de rand van de vlakke inbeddingsgotengroeven komen om tijd te besparen bij het voorbewerken van het harsblok. De traditionele TEM-methode voorhet continu snijden van de hars is uitgebreid, en het is meestal blindelings gesneden met behulp van een optische microscoop17,33. Om dit te verbeteren, hebben we eerst een insect sensilla lokalisatietechniek in hars-embedded blokken onderzocht met behulp van fluorescentiemicroscopie om de doelafstand tot de snede te bekijken en te meten. In vergelijking met de traditionele TEM-trimmethode kan deze technologie de voorbereidingstijd van het monster besparen en de doelsensor nauwkeuriger lokaliseren. Bij afwezigheid van meetsoftware kan een geschaalde liniaal in het gezichtsveld worden geplaatst om de doelafstand ruwweg te meten. De combinatie van een ultramicrotoom met een fluorescentiemicroscoop zorgt voor duidelijke waarnemingen van het snijproces, waardoor nauwkeurige sneden van doelsensilla en andere geschikte onderwerpen worden opgebracht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

We hebben geen belangenverstrengeling bekend te maken.

Acknowledgments

Wij waarderen de genereuze hulp van de Beijing Vocational College of Agriculture, het Institute for the Application of Atomic Energy (Chinese Academy of Agricultural Science), het Bioresearch Center van Beijing Forestry University en professor Shan-gan Zhang van het Instituut voor Zoölogie, Chinese Academie van Wetenschappen. Dit onderzoek werd ondersteund door National Key R&D Program of China (2017YFD0600103), de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31570643, 81774015), Forest Scientific Research in the Public Welfare of China (201504304), Inner Mongolië Landbouwuniversiteit High-level Talent Research Startup Plan (203206038), en Binnen-Mongolië Autonome Regio Hoger Onderwijs Research Project (NJZZ18047), Binnen-Mongolië Autonome Regio Linxue "Double First-class" Bouwproject (170001).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anatomical lens Chongqing Auto Optical
limited liability company
1425277
Carbon adhesive tape SPI Supplies, Division of Structure Probes, Inc. 7311
Carbon tetrachloride Sigma 56-23-5
Copper grids GilderGrids G300
Disodium hydrogen phosphate Sinopharm group chemical reagent co., LTD 10039-32-4
Ethanol J.T. Baker 64-17-5
Flat embedding molds Hyde Venture (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. 70900
Fluorescence microscope LEICA DM2500
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich 111-30-8 Anhydrous EM Grade
Isophorone Sigma 78-59-1
Lead citrate Sigma 512-26-5
Methanol Sigma 67-56-1
Monobasic sodium phosphate Its group chemical reagent co., LTD 7558-80-7
Objective micrometer Olympus 0-001-034
Osmium tetroxide Sigma 541-09-3
Petri dish Aldrich 1998
Razor blade Gillette
Resin Spurr ERL4221
Scalpel Lianhui GB/T19001-2008
SEM Hitachi S-3400
Silica gel desiccant Suzhou Longhui Desiccant Co., Ltd. 112926-00-8
Small brush Martol G1220
Sodium hydroxide Sigma 1310-73-2
Sputter ion instrument Hitachi Koki Co. Ltd., Tokyo, Japan E-1010
Stereo microscope Leica EZ4 HD
TEM Hitachi H-7500
Tween 20 Tianjin Damao Chemical Reagent 9005-64-5
Ultramicrotome Leica UC6
Ultrasonic cleaner GT Sonic GT-X1
Uranyl acetate Sigma 6159-44-0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Song, Y. Q., Dong, J. F., Sun, H. Z. Scanning Electron Microscope Technology of Insect Material. Hubei Agricultural Sciences. 52, 1064-1065 (2013).
  2. Liu, C. The development of the scanning electron microscopy (sem) and its application in polymer materials research. Journal of the Graduates Sun Yat-Sen University (Natural Sciences Medicine). 34, 7-12 (2008).
  3. Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Quarterly Reviews of Biophysics. 45, 27-56 (2011).
  4. Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. The Journal of Cell Biology. 202, 407-419 (2013).
  5. Trepout, S., Bastin, P., Marco, S. Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography. Journal of Visualized Experiments. (121), e55215 (2017).
  6. Zhang, X. J., Sun, W., Zhang, J., Zuo, T. T., Wang, Z. Q., Zhao, H. W. Research progress of coleopteran insect species antennal sensilla. Journal of Anhui Agricultural Sciences. 41, 2932-2935 (2013).
  7. Aldrich, J. R., Bartelt, R. J., Dickens, J. C., Knight, A. L., Light, D. M., Tumlinson, J. H. Insect chemical ecology research in the United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service. Pest Management Science. 59, 777-787 (2003).
  8. Thomas, C. B., Marlin, E. R. Pheromone mating disruption: Novel, non-toxic control of the European corn borer. Leopold Center. 8, 57-60 (1999).
  9. Chen, X. F., Hu, M. Y. Studies on the specimen preparation techniques of scanning electron microscope of Ficus simplicissima Lour. Journal of Zhongkai Agrotechnical College. 14, 68-70 (2001).
  10. Zhou, W., Apkarian, R., Wang, Z. L., Joy, D. Fundamentals of Scanning Electron Microscopy (SEM). Scanning Microscopy for Nanotechnology. Springer. 1-40 (2006).
  11. Kothekar, S. C., Ware, A. M., Waghmare, J. T., Momin, S. A. Comparative Analysis of the Properties of Tween-20, Tween-60, Tween-80, Arlacel-60, and Arlacel-80. Journal of Dispersion Science and Technology. 28, 477-484 (2007).
  12. Chai, J. L., Liu, N., Bai, T. T., Zhang, H. M., Liu, N. N., Wang, D. D. Compositions and Physicochemical Properties of Tween Type Surfactants-Based Microemulsions. Journal of Dispersion Science and Technology. 35, 441-447 (2014).
  13. Zhang, L. D., Zhao, L., Han, F., Xu, B. C. Performance and applications of surfactants (XV) Detergency of surfactants and its applications. China Surfactant Detergent and Cosmetics. 45, 132-137 (2015).
  14. Waghmare, P. R., Das, S., Mitra, S. K. Under-water superoleophobic glass: unexplored role of the surfactant-rich solvent. Scientific Reports. 3, 1-25 (2013).
  15. Zhang, Y. R., Ren, L. L., Luo, Y. Q. Microtomy of insect sensilla embedded in resin blocks for transmission electronic microscopy. Chinese Journal of Applied Entomology. 50, 1479-1483 (2013).
  16. Zong, S. X., Liu, X. H., Cao, C. J., Luo, Y. Q., Ren, L. L., Zhang, H. Development of semiochemical attractants for monitoring and controlling Chlorophorus caragana. Zeitschrift für Naturforschung. 68, 243-252 (2013).
  17. Sumner, M. J. Epoxy resins for light and transmission electron microscopy. Plant Microtechniques and Protocols. 83-101 (2015).
  18. Schneider, D. Insect antennae. Annual Review of Entomology. 9, 103-122 (1964).
  19. Zacharuk, R. Antennae and sensilla. Comprehensive Insect Physiology, Biochemistry and Pharmacology. 6, Pergamon Press. Oxford. 1-69 (1985).
  20. Zacharuk, R., Albert, P., Bellamy, F. Ultrastructure and function of digitiform sensilla on the labial palp of a larval elaterid (Coleoptera). Canadian Journal of Zoology. 55, 569-578 (1977).
  21. Shanbhag, S., Müller, B., Steinbrecht, R. Atlas of olfactory organs of Drosophila melanogaster: 1, Types, external organization, innervation and distribution of olfactory sensilla. International Journal of Insect Morphology and Embryology. 28, 377-397 (1999).
  22. Tarumingkeng, R. C., Coppel, H. C., Matsumura, F. Morphology and ultrastructure of the antennal chemoreceptors and mechanoreceptors of worker Coptotermes formosanus Shiraki. Cell Tissue Res. 173, 173-178 (1976).
  23. Zacharuk, R. Y. Ultrastructure and function of insect chemosensilla. Annual Review of Entomology. 25, 27-47 (1980).
  24. Li, Y. Z., Zhong, G. Q. Screening of detergents and floating carriers for treating potato golden nematode cysts to improve the original appearance of electron microscopy. Plant quarantine. 8, 72-75 (1994).
  25. Marzio, L. D., Marianecci, C., Petrone, M., Rinaldi, F., Carafa, M. Novel pH-sensitive non-ionic surfactant vesicles: comparison between tween 21 and tween 20. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 82, 18-24 (2011).
  26. Ren, L. L., Wu, Y., Shi, J., Zhang, L., Luo, Y. Q. Antenna morphology and sensilla ultrastructure of Tetrigus lewisi Candèze (Coleoptera: Elateridae). Micron. 60, 29-38 (2014).
  27. Ren, L., Shi, J., Zhang, Y., Luo, Y. Antennal morphology and sensillar ultrastructure of Dastarcus helophoroides (Fairmaire) (Coleoptera: Bothrideridae). Micron. 43, 921-928 (2012).
  28. Teng, X. H., Liu, X. L., Xie, G. Y., Tang, Q. B., Li, W. Z., Zhao, X. C. Morphology and distribution of ovipositor sensilla of female Helicoverpa armigera (Lepidoptera: Noctuidae). The 11th Henan Plant Protection Society, the 10th Henan Insect Society, and the 5th Member Congress and Academic Symposium of Henan Plant Pathology Society. 138-142 (2017).
  29. Yang, R., Zhang, L. N., Fan, J. W., Wang, J. L., Fang, K. F., Yu, T. Q., Wang, S. H., Du, Y. L. Insect specimens for scanning electron microscopy. Journal of Beijing University of Agriculture. 29, 33-36 (2014).
  30. Zhang, Y. R., Ren, L. L., Zhang, L., Wang, R., Yu, Y., Lu, P. F., Luo, Y. Q. Ultrastructure and distribution of sensilla on the maxillary and labial palps of Chlorophorus caragana (Coleoptera: Cerambycidae). Journal of Morphology. 279, 574-588 (2018).
  31. Harrison, J. D. G. Cleaning and preparing adult beetles (Coleoptera) for light and scanning electron microscopy. African Entomology. 20, 395-401 (2012).
  32. Xiao, Y., Liu, W., Wang, Y., Zuo, Y. X., Hu, R., Li, T. T., Cui, Z. B. Drying methods of biological sample preparation for scanning electron microscope. Research and Exploration Laboratory. 32, 46-53 (2013).
  33. Graef, M. D. Introduction to Conventional Transmission Electron Microscopy. Cambridge University Press. Cambridge. 1 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics