Analyse av Fucosylated Human melk Trisaccharides i bioteknologisk sammenheng med genetisk kodet Biosensors

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Vi beskriver her høy gjennomstrømming gjenkjenning og kvantifisering av fucosylated morsmelk oligosaccharides (HMOs) bruker en hel celle biosensor. Også viser vi her, tilpasning av denne plattformen mot analyse av HMO produksjon stammer, fokusere på å forbedre signal til støyforhold.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Enam, F., Mansell, T. J. Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors. J. Vis. Exp. (146), e59253, doi:10.3791/59253 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Morsmelk oligosaccharides (HMOs) er komplekse karbohydrater komponentene i morsmelk som viser rikelig fordeler på spedbarn helse. Imidlertid er optimalisering av deres bioteknologisk syntese begrenset av den relativt lav overføringshastighet gjenkjenning og måling av enkle sukkerarter og sammenhengene. Konvensjonelle teknikker for glycan analyse inkluderer brukt kromatografiske/masse-spectrometric metoder med gjennomstrømming på hundrevis av eksempler per dag uten automatisering. Vi viser her en genetisk kodet bakteriell biosensor av høy gjennomstrømning og sammenhengen-spesifikke kvantifisering av fucosylated HMO strukturer, 2-fucosyllactose og 3-fucosyllactose, som vi oppnådd via heterologous uttrykk for fucosidases. Som tilstedeværelse av laktose melk eller i bioteknologisk prosesser kan føre til falske positiver, viser vi også reduksjon av signalet fra laktose bruke ulike strategier. På grunn av høy gjennomstrømning av denne teknikken, kan mange reaksjonen forhold eller bioreactor parametere være assayed parallelt i løpet av noen timer, slik at optimalisering av HMO produksjon.

Introduction

Morsmelk oligosaccharides (HMOs) er laktose-avledet oligosaccharides, vanligvis bestående av 3-8 sukker monomerer. De har en laktose (Gal-β1, 4-Glc) å redusere ende og er videre forlengede av glycosidic (β-1,3 - eller β-1,6-) glukose (Glc), galaktose (Gal) eller N-acetylglucosamine (GlcNAc). I tillegg fucose (Fuc, α-1,2 - eller α-1,3-) eller sialic syre (Sia eller NeuAc, α-2,3 - eller α-2,6-) rester er ofte lagt1.

Gjeldende analyse av oligosaccharides og andre karbohydrater er begrenset i gjennomstrømming og omfanget av behovet for brukt kromatografiske/masse spectrometric (MS) teknologi2,3,4,5, 6 , 7, som kan ta omtrent en time per prøve, for ikke å nevne behovet for dyrt utstyr, spesialiserte kolonner og derivatizing agenter og ekspertise på drift av dette utstyret8. Oligosaccharide sammenhengene er spesielt vanskelig å fastslå, krever avansert MS9,10 eller kjernefysiske magnetisk resonans (NRM) teknikker11. Rask optimalisering av syntese av disse oligosaccharides er derfor begrenset av gjennomstrømningen av dette langsom analytisk trinnet.

Denne studien vi viser sammenhengen-spesifikke påvisning av fucosylated trisaccharide laktose-baserte HMOs, med fokus på 2-fucosyllactose (2-FL) som er den rikeste HMO i morsmelk, ved hjelp av en genetisk kodet Escherichia coli hele cellen Biosensor med en grense på gjenkjenning på 4 mg/L. En viktig funksjon i dette biosensor er dens evne til å skille mellom isomere trisaccharides. Design prinsippet er basert på uttrykk for bestemte fucosidases i E. coli som frigjøre laktose fra HMOs, tilstedeværelse av som oppdages av lac operon, som igjen genererer et fluorescerende signal. Vi oppnå dette ved å bygge en to-plasmider system, en skjuler sammenhengen-spesifikke fucosidase og den andre et fluorescerende reporter protein. Denne biosensor-plattformen er egnet for høy gjennomstrømming screening av flowcytometri eller mikro-plate leseren. Vi viser også bruken av biosensor i kvantifisere 2-FL produsert av en utvikling belastning12. I denne studien presentere vi også tre strategier på selektiv fjerning av laktose som kan resultere i falske positive signalet fra biosensor, gitt at utvikling produsent belastningen er dyrket på laktose.

Sammen de genetisk kodet biosensors tillater oss å oppdage og kvantifisere HMOs på en kobling-spesifikk måte, som er vanskelig selv med brukt kromatografiske, MS eller NMR teknikker. Dens høy gjennomstrømning og brukervennlighet, bør denne metoden har omfattende programmer på metabolske engineering og syntese av HMOs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. celle kultur og induksjon forhold

Merk: Følgende eksperimentene, tre påkjenningen brukes: E. coli BL21 (DE3) med en tom vektor, E. coli BL21 (DE3) med plasmider pAfcA14 og pET28:green fluorescerende protein (GFP) og E. coli BL21 (DE3) med plasmider pAfcB14 og pET28:GFP. Alle stammer er dyrket i Luria-Bertani kjøttkraft (LB) eller minimal media med aktuelle antibiotika. Klargjør lager løsninger 1000 x kanamycin (50 mg/mL) og carbenicillin (100 mg/mL) i deionisert (DI) vann.

  1. Media forberedelse
    1. Forberede LB media ved å legge til 25 g LB pulver lager 1 L DI vann. Autoclave løsningen på 121 ° C i 20 minutter å sterilisere. Vent til sterilisert LB media temperaturen er under 60 ° C før tillegg av 1 µL av antibiotika lager for hver 1 mL av LB media.
    2. For å forberede LB plater, legge til 15 g agar LB media før sterilisering. Vent til sterilisert LB agar temperaturen er under 60 ° C før addisjon av antibiotika.
    3. 1.1.3 for de biosensing cellene, forberede medier eller plater med dobbelt antibiotika, kanamycin og carbenicillin.
  2. Karbohydrater indusere
    1. Klargjør lager løsninger av karbohydrater indusere på molar ekvivalenter 20 finans av laktose: 29 finans 2-FL og 3-FL.
      Merk: Hver 200 µL av celler krever 20 µL av 2-FL eller 3-FL.
    2. Indusere 200 µL av celler med 2.0 finans siste konsentrasjon av laktose eller 2.9 finans siste konsentrasjonen av 2-FL/3-FL. Incubate på 37 ° C med kontinuerlig risting og la kulturer vokse over natten.
  3. Cellekultur
    1. Dagen før eksperimentet frø 5 mL av LB medium supplert med kanamycin og carbenicillin fra en fersk bakterie kolonien, bruker steril teknikk.
    2. Inkuber alle kulturer på 37 ° C med agitasjon og vokse kulturer over natten.
    3. Overføre 50 µL av natten kultur i 5 mL av fersk LB/M9 media med kanamycin og carbenicillin. Ruge på 37 ° C med kontinuerlig risting og vokse til kultur har nådd optisk densitet ved 600 nm (OD600) på 0,5-0,7. I denne fasen midt logg kan cellene indusert.

2. måling av fluorescens og grensene for gjenkjenning

  1. Utarbeidelse av celler for flowcytometri
    1. Overføre overnatter kulturer til 1,5 mL rør og sentrifuge 12 500 x g for 1 min.
    2. Forkaste nedbryting og å avbryte pellet 500 µL 1 x fosfat-bufret saltoppløsning (PBS, 6 mM Na2HPO4, 1,8 mM NaH2PO4, 145 mM NaCl i DI vann, pH 7.2) for å forberede en enkeltcelle suspensjon og overføre den enkelt cellen suspensjon å 5 mL flyt cytometri rør.
    3. Holde cellene i mørket på 4 ° C før kjører eksemplene på en flyt cytometer. For best resultat, analysere cellene så snart som mulig.
    4. Velg 488 nm laser å opphisse GFP. Samle fluorescein isothiocyanate (FITC) fluorescens nivåer (20.000-40.000 hendelser, gated for fremover og side scatter å unngå aggregert celler og rusk) med en 525/50 nm Båndpassdesign filter.
  2. Kalibrering av biosensor
    1. For å gjøre en kalibreringskurven, gjør 8-10 fortynninger av den standard 2-FL i området 0 – 2 500 mg/L.
    2. Kultur 2-FL biosensing cellene (som inneholder pAfcA og pET28:GFP) og overtale dem med standard fortynninger, som beskrevet tidligere i avsnittet 1.3. Gjennomføre tre biologiske replikerer for hver fortynning.

3. gjenkjenning og kvantifisering av 2-FL i en produsent belastning

  1. Dyrking av produsent belastning
    1. For å gjøre minimal media, forberede separat løsninger av 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, natriumsitrat og 1 M Thiamin-HCl. sterilisere løsninger bruke filtere 0.22 µm. Bland M9 media buljong pulver med 1 L DI vann. Autoclave M9 løsningen ved 121 ° C i 15 min. Cool løsningen ned til-50 ° C. Legg MgSO4, CaCl2, K2HPO4, FeSO4·7H2O, natriumsitrat, og Thiamin til siste konsentrasjoner av 2 mM, 0,1 mM, 12 finans, 11 mg/L, 75 mg/L og 7,5 µg/L, henholdsvis.
    2. Starte en kultur for 2-FL produksjon belastning, eksempelvis JM109 gwBC-F2, i 5 mL av LB media og la det vokse over natten ved 37 ° C, som beskrevet i Baumgartner et al.12.
    3. Subkultur på 1% som beskrevet tidligere i trinn 1.3.3 i 250 mL minimal media i trinn 3.1.1. Legge til glyserol en siste konsentrasjon på 10 g/L og ruge kulturen på 37 ° C.
    4. Når kultur når en OD600 på 0,5-0,7, legge isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) til en siste konsentrasjon på 0,5 mM og laktose til en siste konsentrasjon av 2 g/L.
    5. Ruge på 37 ° C med kontinuerlig risting og la kulturer vokse for 24 timer.
  2. Utvinning av 2-FL
    1. Overføre overnatter kulturer til sterilt 50 mL rør og sentrifuger 900 x g i 15 min.
    2. 3.2.2 forkaste nedbryting og å utsette pellets i DI vann. Gjenta vask trinn tre ganger å fjerne gjenværende laktose og til slutt å avbryte 5 mL DI vann.
    3. For å lyse celle suspensjon, bruker du en sonicator på 30% makt, i 30 s pulser. Holde cellene på is til alle tider.
    4. Sentrifuge lysed celler for 25 min 2000 x g. Fjerne nedbryting, passere gjennom et sterilt (f.eks 0.22 µm) filtrere og lagre den på 4 ° C før analysen.
  3. Kvantifisering med biosensor
    1. Vaksinere en kultur av 2-FL biosensing celler og i midten av Logg fase, indusere med cellen lysate tilsvarer beregnet konsentrasjoner av 2-FL brukes til å lage kalibreringskurven som beskrevet i delen 2.2. Utføre kalibrering i det samme miljøet som prøven skal analyseres (f.eks celle lysate) ved å legge til fortynninger av 2-FL kontroll (dvs. ikke-produsent) filtrert celle lysate før inducing biosensor celler.
    2. Kjøre prøver på en flyt cytometer. Generere en dose-respons kurve ved plotting fluorescens utgang mot oligosaccharide konsentrasjonen. Sammenligne svaret av cellen lysate.

4. selektiv fjerning av laktose

Merk: Biosensing cellene er følsomme for laktose og ønskelig biosensor selektivt oppdage HMOs over laktose. En strategi omfatter vasking av celler som beskrevet i del 3.2. Tre andre strategier er beskrevet nedenfor.

  1. Behandling med kommersielle renset β-galactosidase
    1. Oppløse lyofilisert β-galactosidase til 1000 (FCC laktase) enheter/mL, i 1 mM MgCl2 eller bruke kommersielle β-galactosidase i løsningen.
    2. For å bestemme optimal konsentrasjon av enzymet nødvendig, vokse en inoculum av 2-FL biosensing celler og indusere med 2 finans laktose og 2.9 g / L 2'-FL i midten av Logg fase.
    3. 100 µL kulturer, Legg varierende mengder β-galactosidase, opptil 12 enheter, og la kulturer vokse over natten på 37 ° C med kontinuerlig risting.
    4. Måle fluorescensen som beskrevet i Seksjon 2.1 og beregne de optimale enhetene av enzymet nødvendig ved å bestemme minste enzym konsentrasjonen for å oppnå ønsket demping av signalet.
    5. 2-FL produsere celler dyrket 24 h, legge til optimal enheter av β-galactosidase og ruge over natten på 37 ° C. Fortsett med protokollen for å bestemme 2-FL titer som beskrevet i Seksjon 3.3.
  2. Forbehandling med LacZ + belastning
    1. Start en 25 mL kultur 2-FL produksjon belastning og når indusert i midten av Logg fase, ruge kulturen ved 37 ° C i 24 timer.
    2. Vaksinere en E. coli BL21 (DE3) kultur i LB, vokse det til midten av Logg fase på 37 ° C og legger 50 mL av kultur (2:1) til 24 h kultur.
    3. Inkuber ved 37 ° C i 3 h. Fortsett med protokollen for å bestemme 2-FL titer som beskrevet i Seksjon 3.3.
  3. Laktose nedbør med etanol
    Merk: Denne delen er tilpasset fra Matsuki et al.12.
    1. Start en 25 mL kultur 2-FL produksjon belastning og når indusert i midten av Logg fase, ruge ved 37 ° C i 24 timer.
    2. Legg to bind av 100% etanol kultur, rist godt og ruge på 37 ° C 4 h.
    3. Sentrifuge suspensjon 900 x g i 15 min. samle nedbryting og ruge over natten ved 4 ° C, som precipitates laktose.
    4. Fjern den utfelt laktose ved bestått løsningen gjennom et filter papir (11 µm). Samle filtratet som cellen lysate som inneholder den 2-FL, som kan kvantifiseres av avsnittet 3.3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi laget en hel celle biosensor gjelder for 2-FL som kan brukes i forbindelse med bioteknologisk produksjonen av oligosaccharide. Dette er avhengig av bestemt enzymatisk cleavage avendring terminal sukker generere laktose og dermed aktivering av lac operon, fører til uttrykk for en reporter fluorescerende protein under en laktose induserbart promoter, i den antall 2-FL. For å demonstrere sin kobling spesifisitet, 3-fucosyllactose (3-FL), en isomer, ble også testet. Genetisk krets består av to deler: en fucosidase genet, afcA eller afcB, drevet av en konstituerende promoter resulterer i grunnleggende uttrykk klonet på en vektor med en signal sekvens av pelB kodet oppstrøms av fucosidase genet til lette periplasmic eksport, samt en fluorescerende reporter systemet med T7 selskapet kjører uttrykk for GFP. Den første delen er uttrykt på plasmider pAfcA og andre reporter systemet på plasmider pET28:GFP. Den siste konstruksjonen ble forvandlet til E. coli BL21 (DE3), en utbredt belastning som har T7 RNA polymerase integrert i genomet under kontroll laktose svarer pLacUV5. Figur 1A viser skjematisk design slik at leserne kan følge the Arbeidsprinsipp for biosensor. Figur 1B illustrerer fluorescerende signalet under ulike forhold av induksjon som analyseres på en flyt cytometer. Konsekvent med vår hypotese, over en 100 ganger økning i fluorescens ble observert med 2-FL biosensor sammenlignet med kontrollen bare vektor- eller biosensor for 3-FL. Dette viser høy sammenhengen-spesifisiteten av biosensor. For å sikre at signalet er virkelig defucosylation, kjørte vi en kontroll ved å legge til kommersielle α-1,2-fucosidase kultur under innledning, som er bekreftet som vist av barer til høyre. Følsomheten til analysen kan bestemmes ved å generere en dose-respons kurve med varierende karbohydrater nivåer (figur 2A). Fra handlingen, lineær dynamikkområdet 2-FL gjenkjenning er mellom 40 og 400 mg/L og grensen for påvisning er 4 mg/L. Denne analysen kan gjennomføres i løpet av en arbeidsdag, som vist av øyeblikksbilde målinger av dynamikken i reporter uttrykk (figur 2B).

Til slutt presenterer vi hvordan biosensing cellene kan brukes til å oppdage og kvantifisere 2-FL fra en konstruert 2-FL produsent belastning. Siden denne belastningen bruker laktose som et substrat, utviklet vi strategier for å redusere signal fra eksogene laktose slik at signalet avlesning ville direkte tilsvarer 2-FL konsentrasjonen (figur 3A). En strategi er å nedverdige enzymatisk laktoseintoleranse bruker en β-galactosidase som ikke handler på endrede laktose. Dette kan oppnås ved hjelp av kommersielle β-galactosidase som fortrinnsvis fungerer på laktose, redusere laktose signalet til 20% av opprinnelige (figur 3B) eller via inkubasjon med en LacZ + belastning, vill-type BL21 (DE3), som i tre timer drops av laktose signalet til bakgrunnen nivåer (Figur 3 c). Den siste strategien benytter etanol, som ikke bare selektivt precipitates laktose, men også lyses produsent cellene, cellen lysis som en nødvendig trinn nedstrøms (figur 3D). Dette er en enkel utpakkingen, men forsiktighet bør utvises på grunn av lavere utvinning av 2-FL sammenlignet med andre metoder, muligens fra grunn noen krystallisering av 2-FL. Til tross for tillegg av etanol, vi ikke observerer betydelig hemming av vekst av biosensing celler, sannsynligvis fordi de endelige etanol konsentrasjonene er lav (< 2%, v/v) i kulturer. Endelig er den mest effektive, men tidkrevende metoden vi viser pellets og vaske cellene før cellen lysis å løslate den intracellulær 2-FL (figur 3E). Vi anbefaler leseren å diskresjon for å velge en passende metode for laktose fjerning basert på effektivitet og tilgjengelighet og reagenser.

Figur 3E demonstrerer også vår evne til å pålitelig kvantifisere 2-FL i bioteknologisk sammenheng. Vi kulturperler enten en konstruert 2-FL-produserende belastning11 eller en fucosyltransferase negative mutant (negativ kontroll) med laktose overvåke produksjon av 2-FL i celle lysate. Etter dyrking cellene, målte vi konsentrasjonen hjelp av biosensor og høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) for validering (supplerende figur 1). Dose svar kurvene for produsent lysate og kontroll lysate tilsatt 2-FL er svært like, som viser kvantitativ måling av 2-FL i sammenheng med celle lysate.

Figure 1
Figur 1: skjematisk 2-FL biosensor design og representant data. (A) 2-Fucosyllactose (2-FL) inn i bakteriell periplasm og konverteres til laktose ved heterologously uttrykt fucosidase. Laktose er transportert til cytoplasma og konvertert til allolactose. Dette aktiverer innfødt LacUV5 selskapet i E. coli BL21 (DE3), produksjon T7 RNAP, firehjuls GFP under T7 selskapet, fører til fluorescerende protein uttrykk. (B) oppdagelsen av 2-FL og 3-FL. celler som inneholder pET28:GFP og pAfcA (grønn), pAfcB (magenta), eller en tom vektor kontroll (blå) ble indusert natten med ingen sukker, 2-FL, 2-FL exogenously lagt α-1,2-fucosidase, 3-FL eller laktose. Alle data er et gjennomsnitt av tre biologiske replikat hver analysert i tre eksemplarer, der feilfelt representerer standard avvik fra gjennomsnittet. Statistisk betydning ble bestemt av Tukeys flere sammenligning test og ** antyder p < 0,01.  Dette tallet først dukket opp i Enam og Mansell14 og brukes på nytt med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: karakterisering av biosensor for 2-FL gjenkjenning. (A) begrenser av oppdagelsen og overføring av biosensors. Svar kurver avbilder mener fluorescens for pAfcA/2 ' FL (grønn sirkel) eller tom kontroll vektorgrafikk (blå diamant) på varierende mengder 2-FL kulturperler. (B) tid selvfølgelig reporter uttrykk. Belastning pAfcA ble inkubert med 2-FL (grønne firkanten) og fluorescens var overvåket over 8 timer av induksjon. Belastning pAfcA inkubert med laktose er inkludert som en kontroll. Alle data er et gjennomsnitt av tre biologiske replikat hver analysert i tre eksemplarer, der feilfelt representerer standard avvik fra gjennomsnittet. Dette tallet først dukket opp i Enam og Mansell14 og brukes på nytt med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: gjenkjenning og kvantifisering av 2-FL fra en produsent belastning. (A) arbeidsflyt viser bruken av biosensor i en enkel protokoll med fokus på fjerne støy fra gjenværende laktose. (B) fjerning av laktose av β-galactosidase enzymatisk fordøyelse. Kulturer som inneholder 0,3% 2-FL (grønne firkanten) eller 0,2% laktose (blå sirkel) ble inkubert med biosensor kulturer med varierende mengder eksogene β-galactosidase på induksjon tid var assayed til fluorescens etter inkubasjon over natten. (C) fjerning av laktose av inkubasjon med vill-type LacZ + belastning. LB med 0,3% 2-FL (grønn sirkel), 0,2% laktose (blå firkant), eller en 1:1 blanding (0,2% laktose tilsvarende, dvs. 0,1% laktose + 0,15% 2-FL, magenta trekant) var ruges i ulike tider med BL21 (DE3) celler, og deretter lagt til biosensor kulturer for fluorescens mål etter inkubasjon over natten. (D) utfelling av laktose og celle lysis av etanol forbehandling. Fermentations av JM109 gwBC-F2 (magenta sirkel) eller JM109 gwBC (blå trekant) celler ble inkubert med 2 volumer av etanol og filtrert før inkubasjon med fluorescerende biosensor celler og sammenlignet med fluorescens fra ubehandlet JM109 gwBC-F2 kultur ( grønn firkant). (E) kvantifisering av 2-FL i celle lysate. Biosensor ble evaluert for sin evne til å oppdage 2-FL fra en metabolically utvikling produsent belastning. Fluorescens målinger generert av tillegg enten olje lysate JM109 gwBC-F2 (magenta sirkel, 2-FL som kvantifisert av LC-MS), 2-FL i definerte utgjør nonproducer belastning JM109 gwBC celle lysate (grønne firkanten) eller grov lysate på JM109 gwBC belastninger (blå diamant). Resultatene ble godkjent av HPLC kvantifisering av 2-FL i produsent belastning. Alle data er et gjennomsnitt av tre biologiske replikat hver analysert i tre eksemplarer, der loddrett feilfelt representerer standard avvik fra den mener fluorescensen og vannrette feilfelt representerer standardavviket i 2-FL målt ved HPLC i den triplicates. Dette tallet først dukket opp i Enam og Mansell14 og brukes på nytt med tillatelse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Ekstra figur 1: HPLC-MS analyse av 2-FL. (A) utdraget ion chromatograms av 2-FL (m/z 511). Chromatogram av kommersielle standard vises øverst. Chromatogram av 2-FL fra JM109gwBC-F2 stammen (10 ganger fortynning) vises nederst. Høyden på 511 m/z er natrium adduct. (B) en utvidelse av masse spektrum m/z fra 300−800, hvor de mest tallrike signalene var konsentrert vises for kommersielle standarden (øverst) og de 2-FL fra produsent stammen (nederst). (C) en standardkurve ble opprettet av LC-MS analyse med varierende grad av kommersielle 2-FL. Feilfelt representerer standard avvik fra tre eksemplarer målinger. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi presenterer en høy gjennomstrømming strategi for kobling-spesifikke påvisning av fucosylated morsmelk oligosaccharides. Dette ble gjort ved å bygge hele cellen biosensors med genetisk engineering E. coli som ved induksjon med bestemte glykaner svare med et fluorescerende signal. Protokollen også detaljer på hvordan biosensor kan brukes til å oppdage og kvantifisere HMOs i en metabolically utviklet bakterielle belastningen.

Våre protokollen har fordeler over alternativ metoder på grunn av dens høy gjennomstrømning i tillegg til sin kobling-spesifisitet sammenlignet brukt kromatografiske/MS metoder. Lav grensen for deteksjon og brede dynamiske området tillater direkte måling av HMOs.

Avgjørende skritt i denne protokollen oppstå i utarbeidelsen av cellen lysate av produsent-stammer. For å sikre maksimal titer av 2-FL, er det avgjørende for å gi optimal vilkårene. Variabilities i grupper kan oppstå på grunn av sonication parametere eller induksjon ganger. Forsiktighet bør utvises under karakteristikk av biosensor. Det anbefales også å kjøre riktig kontroller for alle trinnene i eksperimentet å sikre konsekvent resultater.

En begrensning av våre protokollen er sin avhengighet av laktose for induksjon, som blir en flaskehals når laktose naturlig stede, som i morsmelk, eller brukes som underlaget i bioteknologisk produksjon av HMOs. Vi har adressert dette med fire forskjellige strategier for å fjerne signal til støyforhold slik at biosensor finner selektivt HMOs over laktose.

Den genetisk kodet hele celler biosensor presenteres her gjør optimalisering for produksjon av HMOs, som mange reaksjonen forhold eller bioreactor parametere kan være assayed parallelt i løpet av noen timer. Når utført i 96 - eller 384-godt plater, viser metoden potensial til å skjermen tusenvis av prøvene per dag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Iowa State University oppstart midler. Fe var delvis finansiert av NSF Trinect fellesskap og Manley Hoppe professoratet. T.J.M. ble delvis støttet av Karen og Denny Vaughn fakultetet fellesskap. Forfatterne takker Iowa State University Flow cytometri anlegget og WM Keck Metabolomics forskningslaboratoriet for hjelp med fluorescens og LC-MS studier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2’-Fucosyllactose  Carbosynth  41263-94-9
3-Fucosyllactose  Carbosynth  41312-47-4
Agar Fisher Scientific BP9744500
Calcium Chloride, Dihydrate Fisher Scientific C79-500
Carbenicillin  Fisher Scientific BP26481
Dextrose (D-Glucose), Anhydrous Fisher Scientific D16-1
Flow Cytometer BD FACSCanto Plus RUO
HPLC Agilent Technologies 1100 Series HPLC system
HPLC Column Luna C18 reversed phase column
Kanamycin Fisher Scientific 11815024
LB Broth, Miller  Fisher Scientific 12-795-027
Lactose Fisher Scientific 64044-51-5
M9, Minimimal Salts, 5x Sigma-Aldrich M6030
Magnesium Sulfate, Anhydrous Fisher Scientific M65-500
MS Agilent Technologies Mass Selective Trap SL detector
Sodium chloride Sigma-Aldrich 7647-14-5
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich 7558-79-4
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 13472-35-0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ninonuevo, M. R., et al. A strategy for annotating the human milk glycome. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54, (20), 7471-7480 (2006).
  2. Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments. Analytical Chemistry. 86, (1), 196-212 (2014).
  3. Royle, L. Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides. Liquid Chromatography. 185-202 (2013).
  4. Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies. Chromatographia. 78, (5-6), 321-333 (2015).
  5. Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Analytical Biochemistry. 300, (1), 53-68 (2002).
  6. Evangelista, R. A., Liu, M. -S., Chen, F. -T. A. Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection. Analytical Chemistry. 67, (13), 2239-2245 (1995).
  7. Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers). International Journal of Mass Spectrometry. 303, (2-3), 109-117 (2011).
  8. Doherty, M., et al. An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture. Analytical Biochemistry. 442, (1), 10-18 (2013).
  9. Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -P., Tsai, S. -T., Ni, C. -K. Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides. Scientific Reports. 8, (1), 5562 (2018).
  10. Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411, (1), 231-250 (2019).
  11. Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy. Archives of Biochemistry and Biophysics. 434, (1), 116-127 (2005).
  12. Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose. Microbial Cell Factories. 12, (1), 1-13 (2013).
  13. Matsuki, T., et al. A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development. Nature Communications. 7, 11939 (2016).
  14. Enam, F., Mansell, T. J. Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli. Cell Chemical Biology. 25, (10), 1292-1303 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics