Inducerbar, celle Type-specifikke udtryk i Arabidopsis thaliana gennem LhGR-medieret Trans-aktivering

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Her, vi beskrive generation og anvendelsen af et sæt af gensplejsede Arabidopsis thaliana linjer aktivering inducerbar, væv-specifikke udtryk i de tre vigtigste ildens, skyde yderste meristem, roden yderste meristem og cambium.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

López-Salmerón, V., Schürholz, A. K., Li, Z., Schlamp, T., Wenzl, C., Lohmann, J. U., Greb, T., Wolf, S. Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation. J. Vis. Exp. (146), e59394, doi:10.3791/59394 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Inducerbar, væv-specifikke udtryk er et væsentligt og stærkt værktøj til at studere genetiske undertrykkelse af netbårne spatio-temporale dynamik. Kombinerer den fleksible og effektive GreenGate kloning system med den gennemprøvede og benchmarkes LhGR system (her kaldt GR-LhG4) for inducerbar udtryk, har vi genereret et sæt gensplejsede Arabidopsis linjer, der kan drive et udtryk for en effektor kassette i et udvalg af specifikke celletyper i de tre største plante ildens. Med henblik herpå valgte vi den tidligere udviklet GR-LhG4 system baseret på en kimære transskription faktor og en beslægtet pOp-type promoter stram kontrol over en bred vifte af udtryk niveauer. Derudover for at visualisere domænet udtryk hvor de syntetiske transkriptionsfaktor er aktiv, er en ER-lokaliseret mTurquoise2 fluorescerende reporter under for pOp4 eller pOp6 kontrol kodet i driver linjer. Her beskriver vi de nødvendige skridt til at generere en driver eller effektor linje og demonstrere hvordan celle type specifikke udtryk kan induceret og fulgt i skyde yderste meristem, roden yderste meristem og cambium i Arabidopsis. Ved hjælp af flere eller alle driver linjer, kontekst specifikke virkning at udtrykke en eller flere faktorer (effektorer) under kontrol af syntetiske pOp initiativtageren kan vurderes hurtigt, for eksempel i F1 planter af en krydsning mellem en effektor og flere driver linjer. Denne tilgang er eksemplificeret ved den Ektopisk udtryk for VND7, en NAC transskription faktor i stand til at inducere ektopisk secondary celle væg deposition i en celle autonomt.

Introduction

En stor begrænsning i biologi i den postgenomic æra er at dechifrere sammenhæng specifikke rolle en bestemt faktor eller genetiske undertrykkelse af netbårne. Konstituerende genetiske forstyrrelser såsom tab af funktion og gevinst af funktion tilgange ofte kun tillade end-point analyse af livslang tilpasning processer, obfuscating sondringen mellem primære og sekundære virkninger. Derudover kan sammenhæng specifikke funktioner maskeret eller fortyndet med stor skala effekter i fjerntliggende væv eller i andre faser af udvikling. Desuden, i ekstreme tilfælde, dødelighed kan udelukke enhver mekanistiske indblik. Ideelt, for at omgå disse problemer, kunne man analysere effekten af akut genetiske undertrykkelse af netbårne inden for en bestemt sammenhæng som en bestemt celletype på en gang-løst måde. For at opnå dette, er genetiske værktøjer for inducerbar, celle type-specifikke udtryk nødvendigt1. For at give en ressource for hurtig vurdering af en reaktion på en given effektor spatiotemporelle dynamik, har vi kombineret let kloning fra GreenGate system2 med dokumenteret effekten af GR-LhG4 system3, 4,5,6. Vi har genereret et sæt linjer at udtrykke den kimære transskription faktor LhG4 sammenvoksede til ligand bindende domæne af rotte corticoid receptor (GR)7 under kontrol af godt karakteriseret celle type specifikke initiativtagere8. I hvile betingelser, forbliver transskription faktor uden for kernen, som domænet GR er bundet af det cytosole HSP90. Med tilføjelsen af syntetisk ligand dexamethason (Dex), nukleare translokation er induceret og LhG4 vil mægle transskription af udtryk kassetter under kontrol af en beslægtet syntetiske pOp-type promoter, såsom en mTurquoise2 journalist inkluderet i driver linjer til at visualisere domænet udtryk efter induktion.  Således indeholde driver linjer teknisk også en effektor kassette. Passage af et sæt driver linjer med en linje, der transporterer en effektor kassette med, for eksempel et gen af interesse inden for samme pOp-type kontrol dermed giver mulighed for hurtig vurdering af de akutte eller langvarige konsekvenser af effektor udtryk i en lang række celletyper.

Her, leverer vi en protokol, der beskriver de procedurer, der er nødvendige for at generere driver og effektor linjerne og demonstrere hvordan celle type specifikke udtryk kan induceret og fulgt i skyde yderste meristem, roden yderste meristem og cambium af Arabidopsis. For at illustrere den dygtighed og specificiteten af denne tilgang, vi udnytte den velkendte transskription faktor VND7, som er i stand til at køre vedvævet-lignende secondary celle væg fortykkelser ectopically9. Behandling af F1 fra en krydsning mellem pSCR10,11 driver linje og pOp6:VND7 effektor linje fører til dannelsen af ektopiske vedvævet-lignende celler i den stivelse sheath celler i Arabidopsis stammer.

For at lette generation af store DNA forsamlinger kræves til at konstruere driver og effektor udtryk plasmider, brugte vi den hurtige og effektive GreenGate kloning metode2. GreenGate kloning er baseret på type II S restriktionsenzymer Eco31I eller dens isoschizomer Bsa2. Disse enzymer klippe neden for deres asymmetriske genkendelsessekvenser producerer markiser med varierende base sammensætning. Ved at indarbejde Eco31I /Bsajeg begrænsning sites i oligonukleotider og tildeling af specifikke overhæng sekvenser til DNA elementer, modulære kloning er opnået, at lette generation af store forsamlinger. Inden for rammerne af GreenGate DNA moduler kan inddeles i kategorier A-F baseret på overhæng sekvens, der tjener som adaptere og er samlet i rækkefølgen. Primere designet til at forstærke dit ønskede produkt bør derfor i overensstemmelse med det valgte modul2 (figur 1A). Hvis der er en indre Eco31I /Bsajeg site og rækkefølgen er ikke kompatibel med GreenGate løsning og destination moduler, kan du fortsætte uden mutagenizing, men med lavere effektivitet. Alternativt kan du bruge site-directed mutagenese fjerne Eco31I /Bsajeg begrænsning websteder pas på ikke for at ændre aminosyrer i genprodukter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Vektorer og moduler kan fås fra arkivet non-profit, Addgene (https://www.addgene.org).

1. kloning med GreenGate

  1. Design primere med udhæng i tabel 1anførte, erstatter 'NNNN' med modul typespecifikke adapter sekvenser nedenfor: frem: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + bestemt sekvens 3´, omvendt: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + omvendt supplement af specifikke sekvens 3´. Tilføj de understregede baser for at sikre vedligeholdelse af rammen læsning.
    Modul udhæng:
    Bemærk: I standard GreenGate ramme, seks moduler, A-F, samles med en plante transformation vektor rygraden i ét udtryk plasmid (figur 1 c). Typisk vil A modul havnen promotor sekvenser, en B-modul en N-terminale tag eller "dummy" sekvens6, et C-modul en cd'er, en D-modul en C-terminale tag eller dummy, et E-modul en terminator, og en F-modul en modstand kassette for udvælgelse af transgene planter. Adapter til kobling med andre hovedmeningen enheder er tilgængelige til brug i stedet for F modul2.
  2. PCR-amplifikation
    1. Forstærke sekvensen af interesse med de designede primere ved polymerase kæde reaktion (PCR) Ifølge standardprotokoller.
    2. Adskille PCR produkt på en agarosegel. Punktafgifter og kolonne rense den korrekte fragment ved hjælp af en kommerciel kit (Se Tabel af materialer) ifølge producentens anvisninger.
  3. Posten modul skabelse
    1. Separat fordøje modul vektor og PCR fragment (trin 1.2.) (Figur 1 A, B) med Eco31I/Bsajeg bruger 100-500 ng af DNA (vektor eller Fragment), 3 µL 10 x fordøjelsen buffer og 5-10 U Eco31I i et rør og bringe volumen til 30 µL med ddH2O.
    2. Bland forsigtigt af pipettering op og ned og spin-ned kort på 1000 x g. Der inkuberes ved 37 ° C på en varme blok for 15 min (eller efter tid henstilling af indkøbte begrænsning enzymet).
    3. Efter fordøjelsen, kolonne rense hver stikprøve med en kommerciel kit (Se Tabel af materialer) og kvantificere de fremstillede DNA ved at bestemme den optisk tæthed på 260 nm (OD260) ved hjælp af et spektrofotometer.
    4. Mix 30 – 100 ng fordøjet Indsæt og 10 – 50 ng fordøjet vektor af pipettering op og ned flere gange og der inkuberes med 1 µL T4 Ligase (5 U/µL og 3 µL 10 x T4 ligatur buffer i en samlet maengde paa 30 µL ved stuetemperatur i 1 time (efter henstilling T4 ligase leverandørens) (Se Tabel af materialer).
      Bemærk: Beregne ønskede molære forhold post modul: destination vektor (f.eks. 3:1) til ligatur afhængigt af koncentrationen og længden af posten modul skær.
    5. For at øge effektiviteten af transformation, inaktivere varme T4 ligase ved at inkubere reaktion på 65 ° C i 20 min.
    6. Brug ligatur produkt til at omdanne kompetente E. coli celler efter standard lab protokoller og spredning af bakterier på agar plader suppleret med ampicillin (100 µg/mL)
    7. Inkuber pladen med bakterier ved 37 ° C i natten.
    8. Skærm for kolonier med modulet ønskede løsning af kolonien PCR ved hjælp af primere 86A1 (5 '-GTTGTGTGGAATTGTGAGC-3′) og 86A2 (5 '-GTTTTCCCAGTCACGACG-3′) og PCR standardbetingelser.
      Bemærk: Denne primer kombinationen er gyldig for alle post moduler, som primere binde til posten vektor rygraden.
    9. Vælg enkelt kolonier for plasmid isolation. Bruge 2 mL LB flydende kultur suppleret med ampicillin (100 µg/mL), og der inkuberes natten over i et 37 ° C shaker.
    10. Isoleres plasmider fra overnight flydende kultur med en mini Prep Kit eller den ønskede udvinding protokol (Se Tabel af materialer).
    11. For at identificere plasmider med den korrekte Indsæt, udføre Restriktionsenzymanalyse, for eksempel ved at vælge to enzymer, der skære entydigt i din indsætte ved at blande 200 ng af plasmid, 2 µL 10 x fordøjelsen buffer, 5-10 U af valgt restriktionsenzymer og Hedeselskabet2 O til 20 µL.
    12. Sekvens de valgte plasmider ved hjælp af primere 86A1 og 86A2 (Se trin 1.3.9.).
  4. Destination modul skabelse:
    Bemærk: For destination plasmid bruge den ønskede destination modul pGGZ001, pGGZ002 eller pGGZ0032 (figur 1 c).
    1. I et reagensglas tilsættes og der blandes 50-150 ng Tom destination vektor (pGGZ003, for eksempel), 50-300 ng af hver fyldt post modul, 2 µL 10 x fordøjelsen buffer buffer, 1,5 µL 10 mM ATP, 1 µL T4 Ligase (30 U/µL), 5-10 U µL Eco31I og dH2O til en samlet maengde paa 20 µl.
      Bemærk: Beregne ønskede molære forhold post modul: destination vektor (f.eks. 3:1) til ligatur afhængigt af koncentrationen og længden af posten modul skær.
    2. Bland og udføre GreenGate reaktion2 ved hjælp af en PCR thermocycler skiftevis 30 gange mellem 37 ° C i 5 min og 16 ° C i 2 min., efterfulgt af enkelt skridt 5 min. ved 50 ° C og 5 min. ved 80 ° C.
    3. For at øge effektiviteten, tilføje 1 µL T4 Ligase (30 U/µL) og 1,5 µL 10 mM ATP til reaktionen og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur, efterfulgt af varme-inaktivering af T4 DNA Ligase ved 65 ° C i 20 min.
    4. Bruge ligatur reaktion at omdanne kompetente E. coli og sprede bakterier på agar plader suppleres med passende selektiv agent spectinomycin (50 µg/mL).
    5. Inkuber den transformerede E. coli på plade ved 37 ° C i natten.
    6. For at bekræfte transformation, re streak hver af de valgte enkelte kolonier på spectinomycin (50 µg/mL) og ampicillin (100 µg/mL) der indeholder plader, henholdsvis. Brug kun kolonier, der vokser på spectinomycin, men ikke på ampicillin plader.
    7. Inkuber E. coli kolonier natten over ved 37 ° C.
    8. Vælg enkelt kolonier for plasmid isolation. Bruge 2 mL LB flydende kultur suppleret med spectinomycin (50 µg/mL) og inkuberes natten over ved 37 ° C shaker.
    9. Isolere de tilsvarende plasmider med en mini Prep Kit (Se Tabel af materialer).
    10. Kontrollere ved Restriktionsenzymanalyse (Se 1.3.12.) og sekvensen markeret positive konstruktioner ved hjælp af primere 88C 3 (5 '-ACCTCTCGGGCTTCTGG-3′) 88C 4 (5 '-CCTTTTTACGGTTCCTG-3′). Hvis Indsæt ikke kan fuldt sekventeret med disse primere, design indre primere til sekvensering.
      Bemærk: At identificere kloner med det korrekte antal pOp gentagne sekvenser (Se diskussion), den primere pOp6 (pOp6_F og pOp6_R, 5 '-CTTATATAGAGGAAGGGTCTT-3 ', 5 '-TGCATATGTCGAGCTCAAGAA-3; ') der binder i den kort sagt flankerende sekvenser kan bruges til PCR-amplifikation og efterfølgende gelelektroforese for at diskriminere af størrelse.
  5. Mellemliggende supermodule oprettelse
    1. Hvis du vil kombinere to uafhængige sæt af løsning-moduler, som kræves for at generere GR-LhG4 driver linjerne med integreret reporter-effektor kassette, første bygge to mellemliggende-plasmider, kaldet supermodules2, før montering det endelige udtryk plasmid i pGGZ001 eller pGGZ003.
    2. Sørg for at tilføje F-H adapter i slutningen af den første supermodule og H-en adapter i begyndelsen af det andet supermodule (dem, der tjener som forbindelser mellem to konstruktioner) som beskrevet2.
      Bemærk: Kun de pGGN000 mellemliggende modul bærer modstand kassette. For at generere udtryk plasmid, udføre GreenGate reaktion med destination vektor og pGGN000 og pGGM000 mellemliggende supermodules. Alternativt, bland destination vektor, pGGN000 mellemliggende supermodule, og de resterende enkelte moduler til at udføre GreenGate reaktion2. Sidstnævnte metode er mindre effektiv end den tidligere, men kan være hurtigere.
    3. Hvis du vil oprette en pGGM000/pGGN000 supermodule, Bland 1,5 µL (100-300 ng/µL) af hver af modulerne post med 1 µL (30 ng/µL) tomt formidlende vektor (pGGM000 eller pGGN000), 2 µL 10 x fordøjelsen buffer, 1,5 µL 10 mM ATP, 1 µL T4 Ligase (30 U/µL) , og 5-10 U Eco31I i en samlet maengde paa 20 µL.
      Bemærk: Beregne ønskede molære forhold post modul: destination vektor (f.eks. 3:1) til ligatur afhængigt af koncentrationen og længden af posten modul skær
    4. Bland og udføre GreenGate reaktion som i trin 1.4.2
    5. For at øge effektiviteten, tilføje 1 µL T4 Ligase og 1,5 µL ATP (10 mM), og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur, efterfulgt af varme-inaktivering ved 65 ° C i 20 min.
    6. Brug 10 µL af ligatur reaktion til at omdanne kompetente E. coli og streak på plader der indeholder kanamycin (50 µg/mL).
    7. Udføre natten inkubation af de transformerede E. coli på plade ved 37 ° C.
    8. Re streak hver af de valgte enkelte kolonier på kanamycin (50 µg/mL) og ampicillin (100 µg/mL) der indeholder plader, henholdsvis.
    9. Udføre natten inkubation af E. coli kolonier på pladen ved 37 ° C.
    10. Vælg enkelt kolonier, der vokser kun kanamycin men ikke ampicillin for plasmid isolation. Bruge 2 mL LB flydende kultur suppleret med kanamycin (50 µg/mL), og der inkuberes natten over i et 37 ° C shaker.
    11. Isolere de tilsvarende plasmider ved hjælp af en mini prep kit (Se Tabel af materialer).
    12. Kontrollere plasmider ved Restriktionsenzymanalyse (Se 1.3.12). og bekræfte ved sekventering ved hjælp af primere 87E2 (5´-AGGCATCAAACTAAGCAGAAG-3´) og 87E3 (5´-CGTTTCCCGTTGAATATGGC-3´) udglødning til pGGM000/pGGN000 rygrad. Hvis Indsæt ikke kan fuldt sekventeret med disse primere, design indre primere til sekvensering.
      Bemærk: Hvis kloning til pGGM000 eller pGGN000 vektorerne er mislykket, en mulig løsning er at fordøje pGGM000 eller pGGN000 med Eco31I, køre på en gel og rense fra gel pGGM000 eller pGGN000 rygrad (ca 2000 bp) fragment uden den ccdB kassette (ca 1400 bp). Derefter fortsætte normalt med ligatur reaktion.
  6. Omdanne en A. tumefaciens pSOUP+ stamme (fx ASE), da pSa oprindelsen af replikering (ori A. tum.) i de umiddelbare vektorer kræver tilstedeværelsen af helper plasmidet pSOUP12. Streak ud bakterier på LB plader der indeholder chloramphenicol (34 µg/mL), kanamycin (50 µg/mL), spectinomycin (50 µg/mL) og tetracyklin (12,5 µg/mL). Inkuber den transformerede A. tumefaciens på plade i en 28 ° C inkubator i to til tre dage.

2. generation af Arabidopsis transgene planter

  1. Transformation fra Arabidopsis thaliana.
    Bemærk: Omdanne A. thaliana planter ifølge Zhang et al., 200613.
  2. Udvælgelse af transgene linjer.
    1. For at vælge de transformerede planter, bruge udvalg ordningen anvendes på GABI-Kat14 til modstand mod sulfadiazin15.
    2. For at vælge stabil linjer med et muligt enkelt integration begivenhed, skal du vælge dem i generation T2, der viser forholdet 3:1 adskillelse i modstand markør. Udbrede disse linjer til T3 generation og vælg planter homozygot for resistens-genet. Alternativt kan du udføre en sydlige duppes analyse eller en standard kvantitative real-time PCR (SA-qPCR)16 at vælge enkelt indsættelse linjer.

3. induktion af trans-aktivering i Arabidopsis driver linjer

  1. Roden
    1. At teste reporter udtryk i A. thaliana driver linjer genereret gennem trin 1 og 2, sterilisere frøene som beskrevet nedenfor.
      1. Tilføje 0,5-1,0 mL af 70% Ethanol + 0,01% nonioniske vaskemiddel til ca. 100 frø (20 mg) i en 1,5 ml reaktion rør og inverter rør et par gange. Spin ned ved 1000 x g i 15 s og aspirat supernatanten.
      2. Tilføje 0,5-1,0 mL absolut ethanol. Vend røret flere gange, spin ned til 1.000 x g for 15 s og kassér supernatanten.
      3. Tilføje 0,5-1,0 mL af absolut ethanol og inverter tube t et par gange, derefter spin ned på 1.000 x g for 15 s og kassér supernatanten.
      4. Tillad frøene tørrer inde i hætten. Hvis frø vil være stratificeret i rør fortsætte med trin 3.1.1.6.
      5. Tilføje 0,5-1,0 mL sterilt vand og inverter rør et par gange. Spin ned på 1.000 x g for 15 s og kassér supernatanten.
      6. Tilføje 0,5-1,0 mL sterilt vand og inverter røret flere gange. Spin ned på 1.000 x g for 15 s og kassér supernatanten.
      7. Tilføje 0,5-1,0 mL sterilt vand.
    2. Forberede halv styrke Murashige og Skoog medium, pH 5,8 og tilføje 0,9% plant agar og 1% saccharose. Efter autoklavering tilføje dexamethason (Dex), opløst i DMSO, til en slutkoncentration på 10-30 µM til induktion plader og et tilsvarende beløb af DMSO kontrol plader, henholdsvis.
    3. Sætte frø til roden imaging på plader og stratificere dem for 48 h i mørke og kulde (4 ° C).
    4. Læg pladerne i en lodret position i en plante inkubator (lang dag (16/8 h), 22 ° C, luftfugtighed, 65%) og dyrke dem i fem dage.
    5. Fem dage efter spiring (dag), image udplantningsplanterne bruger Konfokal laser scanning mikroskopi.
  2. Stængel
    1. Sterilisere frøene, som beskrevet i punkt 2.1.1. og sætte frø på ½ MS, 0,9% plant agar og 1% saccharose plader. Stratificere for 48 h i mørke og kulde (4 ° C).
    2. Seks til syv dage efter spiring, overføre stiklinger til jord, hver plante i en enkelt gryde (lang dag (16/8 h), 22 ° C, luftfugtighed, 65%).
    3. Fremkalde trans-aktivering i stængler ved vanding med Dex eller mock løsning eller ved dypning planter i Dex eller mock løsninger, henholdsvis.
    4. Vanding, bruge 25 µM Dex opløsning i vand parat fra et lager af 25 mM Dex opløst i ethanol. Vand hver 2-3 dage, indtil den ønskede tid af induktion.
    5. Til dip, forberede et 1 L bæger, 750 mL vand indeholdende 0,02% silwet L-77 med 25 µM Dex eller tilsvarende beløb i DMSO Dex og mock behandling, henholdsvis. Dyp enkelt planter til 30 s i induktion eller i mock-løsningen. Gentag hver 2-3 dage, indtil den ønskede tid i tænkelig.
      Bemærk: Efter dypning, planterne bør opretholdes i høj luftfugtighed i en time.
  3. Skyde yderste Meristem (SAM)
    1. Sterilisere frøene, som beskrevet i punkt 2.1.1. Forberede plader med ½ MS, 0,9% plant agar og 1% saccharose medium og sætte frø på plader. Gemme pladerne i to dage i mørket og kulden for stratificering.
    2. Sætte plader i en lodret position i en plante inkubator. Seks til syv dage efter spiring, overføre udplantningsplanterne til jorden, hver plante i en enkelt gryde (lang dag (16/8 h), 22 ° C, luftfugtighed, 65%).
    3. Når stilken er ca 1 cm lang (25-30 dag), spray blomsterstand SAM med 10-50 µM Dex i H20 iført en ansigtsmaske. Til induktion og billedbehandling i senere faser af udvikling, fremkalde SAM'er af længere stængler eller side skud.
      Bemærk: SAMs kan også være fremkaldt ved paintbrushing Dex-løsning for at forhindre spray dråber. Brug en maske når Dex anvendes ved sprøjtning.
    4. 24-48 timer efter induktion, dissekere SAMs og gå videre til billeddannelse (Se 4.3).
      Bemærk: Kun un-induceret planterne var anvendes til formering for at reducere sandsynligheden for genhæmning. Planter i T2/T3 blev brugt til billedbehandling.

4. imaging reporter udtryk i Arabidopsis driver linjer.

  1. Roden
    1. Overføre stiklinger fra plade til en 10 µg/mL propidium Iodid (PI) løsning og modvirke bejdse dem i 5 min.
    2. Placere rødderne i et mikroskop imaging kammer (1-godt vævskultur kammer på dækslet glas II, se Tabel af materialer) og image dem ved hjælp af en Konfokal laser scanning mikroskop med en 63 x vand fordybelse mål (Se Tabel af materialer).
    3. For at visualisere PI fluorescens, bruge en excitation boelgelaengden 488 nm og indsamle emission mellem 590 og 660 nm. For mTurquoise2 fluorescens bruge 458 nm excitation og indsamle emission mellem 460 og 615 nm.
  2. Stængel
    1. Udføre vandrette hånd skære dele af plante stængler med et barberblad, udtagelse et segment af ca 3 cm. Fix stænglen med finger på den modsatte side af den ønskede sektion til at skære. Udføre flere fine udskæringer sekventielt, men Bemærk, at kun dele fra en lignende stilling i stænglen skal sammenlignes.
    2. Efter hvert snit, fordybe razorblade i en petriskål, som indeholder vand fra hanen og indsamle afsnittene stilk. Pletten sektioner på dette tidspunkt eller direkte mount på objektglas.
    3. Til farvning, forberede en 1 mL 250 µg/mL PI løsning af vand i en lille petriskål (Se Tabel af materialer). Fordyb sektioner i 5 min. og skyl dem i vand. Overfør dem til objektglas med fine pincet eller en fin pensel. Passe på at ikke presse prøver med coverslip.
    4. Billede prøver ved hjælp af en Konfokal laser scanning mikroskop med et 25 x dypning vand fordybelse linse (Se Tabel af materialer). Brug 561 nm laserlys til at ophidse PI fluorescens og indsamle fra 570 til 620 nm. Brug 405 nm at ophidse mTurquoise2 fluorophore effektor kodet af driveren linje konstruktioner og indsamle emission fra 425 til 475 nm.
  3. Skyde yderste Meristem
    1. Skær stilken 2 cm nedenfor skyde tip med pincet. Hold stilken i én hånd og bruge fine pincet til at fjerne de blomsterknopper og store primordia. Hvis du vil fjerne unge primordia, lave SAM i en oprejst position i en petriskål, der indeholder 3% agarosegelelektroforese. Bruge en kikkert og pincet til at fjerne unge primordia tæt på SAM. Alternativt kan du bruge en injektion kanyle (Se Tabel af materialer) at afskære disse primordia.
    2. Pletten dissekerede SAM i en 250 µg/mL PI løsning for 5-10 min. udføre farvning enten direkte af pipettering et par dråber af farvning løsning på toppen af den forberedte SAM eller overføre prøven til et rør fyldt med farvning løsning. Holde SAM fuldt neddykket under proceduren farvning.
    3. Placere den farvede SAM i en lille petriskål (Se Tabel af materialer) med 3% Agarosen medium og dækker SAM med ddH2O.
    4. Billede dissekeret SAMs ved hjælp af en Konfokal laser scanning mikroskop udstyret med en 25 x dypning vand fordybelse linse (Se Tabel af materialer).
    5. Brug 561 nm laserlys til at ophidse PI fluorescens og indsamle fra 570 til 620 nm. Brug 405 nm til at vække den mTurquoise2 fluorophore og indsamle emission fra 425 til 475 nm.
      Optage billedstakke spænder over 50 µm i z-retning med et trin størrelse på 0,5 µm.
      Bemærk: SAM imaging som beskrevet her kræver en opretstående Konfokal laser scanning mikroskop og en linse (her, en vand dypning linse) med lange arbejde afstand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Generation af driveren og effektor linjer gennem GreenGate kloning

GreenGate kloning system er baseret på GoldenGate kloning og brug type IIS begrænsning liv1975 Bsajeg eller dens isoschizomer Eco31I. Som enzym producerer udhæng fjernt fra sin asymmetriske genkendelsessekvens, base sammensætningen af udhæng kan være frit danne valgte, som er grundlaget modularitet af systemet. Hver PCR-genereret element, for eksempel en promotor sekvens, cd'er eller terminator, indsættes først en udpegede post vektor med matchende udhæng produceret af begrænsning digest til at generere et modul. Efter subcloning anvendes en række tilsvarende moduler, som regel seks, til GreenGate ligatur reaktion resulterer i forsamlingen af konstruktion i en binær plante destination vektor.

Driver streger, moduler, der indeholder DNA-sekvenser af væv-specifikke promotor (pTS), GR-LHG4 transskription faktor, pOp6 -promotor og mTurquoise2 reporter smeltet til en N-terminale signal peptid og en C-terminal ER opbevaring signal var smeltet, herunder terminators og forskellige adapter moduler og et modul til transgene udvalg som tidligere beskrevet 2,8 (figur 2). Effektor linjer blev bygget med pOp6 promotor og en effektor kassette, for eksempel bestående af et gen af interesse og terminator samt et modul kodning en modstand genet for transgene planter udvalg (figur 2).

Induktion af driver linjer og visualisering af reporter fluorescens

Induktion med Dex fører til celle type specifikke mTurquoise2 udtryk i roden endodermis (pSCR>> SP-mTurquoise2-HDEL, figur 3A), phloem prækursorer og cambium (pSMXL5>> SP-mTurquoise2-HDEL 17, Figur 3B), og stamceller i skyde yderste meristem (pCLV3>> SP-mTurquoise2-HDEL 18, figur 3 c).

Trans-aktivering af VND7 i stivelse kappe celler af cambium

Som en prøvesag for trans-aktivering genereret vi en effektor linje kodning secondary celle væg master transskription faktor VND7 sammenvokset til VP16 aktivering domæne, som har vist sig at fremkalde secondary celle væg dannelse celle autonomt Hvornår misexpressed 8,9,19,20.

Efter 5 dage efter en enkelt behandling med enten 15 µM Dex eller DMSO for induceret eller mock planterne henholdsvis blev stængel dele udarbejdet for visualisering af ektopiske lignification i stivelse kappe. Propidium Iodid viser i stilken stærk affinitet til lignificerede væv. Stivelse kappe celler i induceret prøver af Dex, men ikke i mock viste et stærkt signal til PI-kanal og nogle celler viser den typiske reticulate fortykkelse af cellevæggen i vedvævet celler (figur 4).

Figure 1
Figur 1. GreenGate kloning princippet. A) Type IIS-restriktionsendonukleaser, ligesom Bsajeg /Eco31I, genkender ikke-palindromiske sekvenser (rød) og skæres asymmetrisk i en defineret afstand uafhængigt af sekvens (blå). Eco31I genkender 'GGTCTC', skærer fra den anden nukleotid nedstrøms af webstedet anerkendelse og skaber en fire base 5' udhæng. B) den GreenGate kloning system er baseret på et modulopbygget system med seks forskellige post vektorer pGGA000-pGGF000. Disse vektorer indeholder en Ampicillin modstand kassette (AmpR) og et ccdB kassettebånd flankeret af de specifikke adaptere for hver indrejse vektor (e.g pGGA000 post vektor) og 'GGTCTC' øko31I anerkendelse websteder. Eco31I fordøjelsen af pGGA000 udgivelser ccdB og skaber pGGA000-specifikke fire nukleotid udhæng (mørkeblå). Insert1 er forstærket af primere husly 'GGTCTC' og pGGA000 specifikke adaptere og efter fordøjelsen forbundet til pGGA000. Den samme procedure følges med de andre moduler. C) den endelige GreenGate reaktion kombinerer Eco31I fordøjelsen af destination vektor pGGZ001 og seks post vektorer pGGA000-pGGF000 og den samtidige ligatur af alle moduler i destination vektor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Oversigt over Dex-inducerbar LhGR/pOp-system med driver og effektor linjer. i driver linjer, væv-specifikke initiativtagere (pTS) styrer udtryk for syntetiske transskription faktor LhG4, som er translationally sammenvoksede til ligand bindende domæne af rotte glukokortikoid receptor (GR) og derved forhindrer, i mangel af Dex, den nukleare translokation. Linjen effektor havne en transcriptional kassette drevet af en pOp element og en TATA boks med en minimal 35S -promotor. Krydset med en driver linje og ved Dex induktion, binder GR-LhG4 til pOp-type elementer i reporter kassette og dem i modulet effektor inducerende transskription af mTurquoise2 og effektor. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Induceret driver linjer i rod, stængel og SAM. A) Dex-induceret driver linje pSCR >>SP-mTurquoise2-HDEL (spiret i 50 µM Dex) i rod og mock behandling. FUGLESKRÆMSEL promoter (pSCR) medierer udtryk i endodermis, cortex/endodermis indledende (CEI) og inaktiv center (QC). Celler er Counter farves med propidium Iodid (PI). Skalere barer = 20 µm. B) Dex-induceret driver linje pSMXL5 >>SP-mTurquoise2-HDEL (dyppet i en 50 µM Dex løsning og visualiseres efter 3 dage) i i stilken og mock behandling. SMXL5 promoter (pSMXL5) medierer udtryk i cambium stamcelle domæne og phloem prækursorer. Celler er Counter farves med propidium Iodid (PI). Skalere barer = 100 µm. C) Dex-induceret driver linje pCLV3 >>SP-mTurquoise2-HDEL (10 µM, 48 h) i SAM. CLAVATA3 promoter (pCLV3) medierer udtryk i domænet stamceller. Billeder i bunden viser XZ- og YZ cross sektioner, Dex-induceret og mock behandlet, henholdsvis. Celler er Counter farves med propidium Iodid (PI). Skalere barer = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Ekstrauterin lignification i stivelse kappe af stilken. A) ekstrauterin lignification er set fem dage efter Dex induktion af linjen driver pSCR >> VND7-VP16 i stænglen. FUGLESKRÆMSEL promoter (pSCR) medierer udtryk i stivelse kappe celler i stilken. Venstre billede viser fletning af PI kanal og lyse felt, højre billede viser kun PI kanal. B) mock kontrol viser ingen signal i en stivelse kappe celler. Celler er Counter farves med propidium Iodid (PI). Skalere barer = 100 µm. PI Fluorescens er falsk-farvede i grøn mens grønkorn auto Fluorescens er røde i alle billeder. Hvid pilespidser pege på stivelse kappe celler. Venstre billede viser fletning af PI kanal og lyse felt, højre billede viser kun PI kanal.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Modul 5' udhæng anvendes typisk til 3' udhæng
A ACCT promotor AACA
B AACA N-terminale tag GGCT
C GGCT Kodende sekvens TCAG
D TCAG C-terminale tag CTGC
E CTGC Terminator ACTA
F ACTA modstand kassette GTAT

Tabel 1: Udhæng anvendes til primer design

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi de nødvendige skridt til at generere og anvende en alsidig og omfattende toolkit for inducerbar, celle type specifikke trans-aktivering. Passage linjer transporterer effektor kassetter under for pOp med driver linjer kontrol giver mulighed for at studere effekterne mis udtryk i F1 generation, muliggør en hurtig vurdering af genetiske undertrykkelse af netbårne i en lang række celletyper. Alternativt, effektor konstruktioner kan bruges til at omdanne driver linjer, eller ved at tilpasse kloning strategi, driver og effektor konstruktion kan også kombineres på en T-DNA. Ansøgninger om dette system spænder fra rumligt og tidsligt kontrollerede mis udtryk undersøgelser til domæne-specifikke knock-down eller gen redigering og celletype specifikke komplementering.

Ingen af de procedurer, der beskrives her bør udgøre en udfordring for labs udstyret til generel molekylærbiologiske teknikker. LhG4 udtryk system er blevet grundigt testet og sikrer ikke-utætte og tuneable udtryk, der kan køres til høje niveauer8, selv om vi advarer at det dynamiske område af inducer koncentration empirisk bør fastsættes for hver driver og effektor linje kombination kombinerer denne gennemprøvede system med modulære GreenGate kloning tilbyder en hurtig og enkel måde at agere udtryk i enhver celletype, som en bestemt promotor er tilgængelige. Vi har bemærket, at rekombination arrangementer kan forekomme under forstærkning af plasmider, der indeholder gentagne sekvenser af pOp-type promotor. Disse resultere ofte i at have færre gentagelser af OP-sekvens, som kan vurderes ved PCR. Endelige konstruktioner bør altid bekræftes ved sequencing i Escherichia coli og Agrobacterium tumefaciens. Dog blev lejlighedsvis rekombination begivenheder kun påvist i E. coli.

Begrænse anvendelsen af denne teknik er således tid til at skabe transgene planter.  Det er af afgørende betydning at teste for gene silencing, startende i T2 generation og kun bevare stabile linjer. For at minimere chancen for silencing, anbefaler vi at indsamle frø kun formen ikke-induceret planter.

Den teknik beskrevet her er gratis til andre trans-aktivering systemer21,22, da det giver en omfattende ressource og kombinerer væv specificitet med inducerbar udtryk. En eventuel fremtidig udvikling af denne metode er indarbejdelse af flere celle typespecifikke initiativtagere til drev GR-LhG4, for eksempel i væv uden for de vigtigste ildens. Vedrørende effektorer er en spændende mulige ekspansion tilpasning af højeffektive gen redaktion værktøj at tillader celle typespecifikke banke outs23.

Driver linjerne er beskrevet i Schürholz et al. 20188 er tilgængelig fra NASC (http://arabidopsis.info/), DNA konstruktioner beskrevet i Lampropoulos et al., 20132 og Schürholz et al., 20188 fås fra Addgene (https://www.addgene.org/).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Arbejde i vores laboratorier er understøttet af tyske Research Foundation (DFG) tilskud WO 1660/6-1 (til S.W.) og GR 2104/4-1 (til T.G.) og SFB1101 (til T.G. og J.U.L) og ved et europæisk forskningsråd samlegodsspeditøren giver (PLANTSTEMS 647148) til T.G.  S.W. understøttes gennem Emmy Noether Fellowship af DFG gennem Grant WO 1660/2.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin Carl Roth GmbH + Co. KG K029.1
ATP Sigma-Aldrich A9187
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919
Column purification Qiagen QIAquick PCR Purification Kit (250)
Culture chamber for imaging Sarstedt AG & Co. KG 1-well tissue culture chamber, on cover glass II
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4903
DMSO Fisher Scientific, UK D139-1
Eco31I Thermo Fisher Scientific FD0294
injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) Sterican, Braun
Kanamycin Carl Roth GmbH + Co. KG T832.2
Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv Leica, Wetzlar, Germany
MS medium Duchefa, Haarlem, Netherlands M0221.0050
Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x  1.1 NA water immersion objective Nikon, Minato, Tokyo, Japan
Petri dish 35/10 mm Greiner Bio-One GmbH, Germany 627102
Petri dish 60/150 mm Greiner Bio-One GmbH, Germany 628102
Petri dish 120/120/17 Greiner Bio-One GmbH, Germany 688102
Plant agar Duchefa, Haarlem, Netherlands P1001
Plasmid extraction Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit
Propidium iodide (PI) Sigma-Aldrich P4170
Razorblade Classic, Wilkinson Sword GmbH 7005115E
Reaction tubes Sarstedt AG & Co. KG 72.690.001
Silwet L-77 Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany
Spectinomycin AppliChem GmbH 3834.001
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific NanoDrop 2000c
Sucrose Carl Roth GmbH + Co. KG 4621.1
Sulfadiazine Sigma-Aldrich S6387
Tetracycline AppliChem GmbH 2228.0025
T4 Ligase 5 U/µl Thermo Fisher Scientific EL0011
T4 Ligase 30 U/µl Thermo Fisher Scientific EL0013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45, (4), 651-683 (2006).
  2. Lampropoulos, A., et al. GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8, (12), e83043 (2013).
  3. Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3, (1), 91-101 (2005).
  4. Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41, (6), 899-918 (2005).
  5. Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, (1), 376-381 (1998).
  6. Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41, (6), 919-935 (2005).
  7. Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3, (8), 278-280 (1993).
  8. Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178, (1), 40-53 (2018).
  9. Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19, (16), 1855-1860 (2005).
  10. Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86, (3), 423-433 (1996).
  11. Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127, (3), 595-603 (2000).
  12. Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42, (6), 819-832 (2000).
  13. Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1, (2), 641-646 (2006).
  14. Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40, (Database issue), D1211-D1215 (2012).
  15. GABI KAT. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine. Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018).
  16. Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8, (1), e53489 (2013).
  17. Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27, (8), 1241-1247 (2017).
  18. Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283, (5409), 1911-1914 (1999).
  19. Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350, (6257), 198-203 (2015).
  20. Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153, (3), 906-914 (2010).
  21. Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).
  22. Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11, (3), 605-612 (1997).
  23. Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics