解冻、培养和冷冻保存的嗜酸性粒细胞

Developmental Biology
 

Summary

食子细胞系是基础和生物医学研究的重要试剂。本文提供了解冻, 亚培养, 冷冻保存常用的嗜食子细胞系, 以协助研究人员将这些试剂的使用纳入他们的研究。

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Luhur, A., Klueg, K. M., Roberts, J., Zelhof, A. C. Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines. J. Vis. Exp. (146), e59459, doi:10.3791/59459 (2019).

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Abstract

目前有160多种不同的嗜酸性粒细胞系由嗜食虫体基因组学资源中心 (dgrc) 分布。有了基因组工程, 新细胞系的数量有望增加。DGRC 的目的是让研究人员熟悉如何使用嗜酸性粒细胞系作为一种实验工具来补充和推动他们的研究议程。提供了处理具有明显特征的各种嗜酸性粒细胞系的程序, 包括解冻、培养和冷冻保存细胞系的协议。重要的是, 该出版物展示了与食子细胞系合作所需的最佳做法, 以最大限度地减少来自不定微生物或其他细胞系的污染风险。熟悉这些程序的研究人员将能够深入研究使用嗜酸性粒细胞的许多应用, 包括生物化学、细胞生物学和功能基因组学。

Introduction

果蝇培养细胞的使用补充体内的苍蝇遗传分析, 并作为一个主要的调查工具, 以解决许多基本的生物学问题1,2,3嗜酸性粒细胞系提供了独特的同质细胞群, 这些细胞来自不同的组织来源, 具有不同的遗传背景。细胞系适用于许多应用, 包括转基因基因表达、基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学、高通量 RNA 干扰 (RNAi) 屏幕、细胞生物学和显微镜。重要的是,使用嗜食虫细胞培养有助于描述已知刺激的直接时间反应。此外,嗜食细胞培养是适合 crispr-cas9 基因组编辑, 使它相对容易创建新的细胞系与特定的基因组修改4,5, 6,7

德诺菲拉基因组学资源中心 (DGRC) 是控核细胞系的存储库和分发中心。DGRC 的目标之一是协助研究界成员使用戈德罗巴细胞培养资源。本文介绍了处理食子细胞系的基本协议。它补充了现有资源, 帮助研究人员对处理果蝇细胞培养物感到满意, 并在实验128、9中达到一定程度的独立性 ,10

最常用的嗜食细胞系有: 施耐德系列11、kc16712、三石/宫克想象盘和中枢神经系统 (cns) 线13、14、milner 实验室图像盘系15、成人卵巢细胞系1617和 ras 线18 (表 1)。施耐德和 Kc167 系是用于生物化学、重组转基因基因表达和反向基因筛选的通用细胞系。三石/宫克实验室 (ML) 系来源于幼虫想象盘或中枢神经系统 (CNS), 对神经分泌、转录调控和 RNA 处理等相关研究都很有用。米尔纳 (CME) 圆盘线对于研究信号转导具有重要意义。从突变的成人卵巢中提取的 fGS/OSS 开放源码软件细胞系仍然是研究非编码小 rna 生物学在生殖细胞维持和分化中的影响的重要试剂 1719.最后, Ras 系是独特的, 因为这些是从外代表达 Ras 癌基因的胚胎中提取的细胞系。它们具有肌肉前体细胞的转录特征, 并表达活性 piRNA 机制20。最近的评论文章和书籍章节涵盖了这些流行的细胞系的应用, 更详细的信息2,3,9

所有这些细胞系都可以亚培养和冷冻。对于如何维持和准备冷冻保存, 对每个细胞系有轻微但重要的不同要求。例如, 不同的细胞系需要不同的培养基和补充剂 (表 1)。这些线在表面粘附特性、形态 (图 1图 2)、基因型和加倍时间 (表 2) 方面也各不相同。我们提出了基本的协议, 并强调了处理各种广泛使用的嗜酸性粒细胞系的独特差异。

Protocol

1. 解冻和再生冷冻食人鱼细胞系

  1. 用70% 的乙醇擦拭工作表面, 对引擎盖进行消毒。将适当介质 (表 1) 的5毫升分配到25厘米的 2 t型烧瓶 (t-25) 中。
  2. 从液体 n2 或干冰中取出冰/冰 。用70% 乙醇擦拭冷冻瓶, 小心地松开和解开。
  3. 使用巴斯德移液器, 从 T-25 瓶中提取1毫升室温 (RT) 介质。慢慢地将培养基加入冷冻瓶中, 轻轻混合, 解冻冷冻细胞, 确保细胞悬浮液不会溢出。
  4. 将解冻细胞悬浮液的整个体积从氨口转移到 T-25 瓶中。重复此操作, 以确保细胞悬浮液已完全转移。
  5. 将烧瓶放在25°c 的孵化器中, 使细胞沉淀和粘附至少 2小时. 在显微镜下检查细胞, 以确保大多数细胞已在生长的表面上沉淀。轻轻取出旧介质, 更换5毫升的新鲜介质。将烧瓶送回孵化器。
  6. 第二天, 轻轻取出旧介质, 更换5毫升新鲜介质。将培养物送回孵化器。

2. 解冻和恢复冷冻食环素细胞系 (替代)

  1. 在无菌引擎盖中, 用 RT 介质1毫升重新悬浮冷冻颗粒, 解冻细胞。将所有解冻的细胞悬浮液转移到15毫升的锥形管中。
  2. 以 1, 000 x离心细胞 5分钟, 取出上清液, 并在5毫升的新鲜培养基中重新悬浮细胞颗粒。
  3. 将细胞悬浮液的整个体积转移到 T-25 瓶中, 在25°c 时孵育培养。
  4. 1至2小时后, 检查显微镜下的细胞, 以确保大多数细胞已经在生长的表面上定居。第二天, 用5毫升的新鲜培养基取代旧媒体, 将养殖恢复到孵化器。

3. 在100毫米培养板中培养半粘细胞

  1. 用70% 乙醇擦拭引擎盖消毒。将用于进罩的无菌材料, 包括介质瓶、移液器、移液器辅助设备和培养板。
  2. 在显微镜下检查培养物的形态和融合。在培养中寻找微生物污染的明显迹象。根据培养的特点确定细胞是否准备传入: 细胞密度和加倍时间, 包括最后一次亚培养。
  3. 如果培养物出现高度融合 (图 1), 则确定细胞密度。在无菌罩中, 通过将介质从板上移液到10毫升并在细胞上分配, 将细胞从生长的表面移出。重复几次, 确保不产生泡沫, 直到生长的表面变得清晰。使用血细胞计或自动粒子计数器确定细胞密度 (第5节,图 3)。如果细胞密度在 5 x 10 6 和 1 x 10 7 细胞之间, 则对细胞进行亚培养。
    请注意:不要将五亲菌细胞系亚培养到 1 x10 6细胞密度以下的细胞密度。
  4. 使用适当的培养基将细胞悬浮液稀释, 使其最终播种浓度至少达到 1 x10 6 细胞
    1. 对于常规的传代和维护, 在新的培养基中的预确定的培养基中添加适当体积的细胞悬浮液, 以达到所需的种子细胞密度。
    2. 为了扩大培养, 将所有细胞悬浮液转移到一个大烧瓶中。用适当的培养基将细胞悬浮液稀释到所需的细胞密度。将稀释后的细胞悬浮液的等量分配到新的板材上。这种方法最大限度地减少了板间细胞密度的变化。
  5. 用运算符首字母、日期、拆分比、播种细胞密度、细胞系标识符、介质、段落编号和抗生素等任何介质添加的介质覆盖和标记板。
  6. 将盘子放入塑料容器中, 然后将容器返回到孵化器。
    注: 表 3列出了常用于培养五食细胞系的培养容器和相关的工作体积。

4. 在100毫米培养板中去除生长的粘连细胞

  1. 将所有培养基从盘子中转移到新的无菌烧瓶中。保存介质。
  2. 在盘子中慢慢加入0.05% 的胰蛋白酶 edta 1 毫升, 冲洗细胞。轻轻旋转, 以确保胰蛋白酶溶液覆盖整个生长表面。放弃胰蛋白酶溶液。
  3. 在板材中轻轻加入1毫升0.05% 的胰蛋白酶 edta。在25°c 下将板材孵化 3-10分钟, 同时监测细胞层分离和从生长表面滑落的可见迹象。
  4. 在板材中添加9毫升保存的介质, 以阻止胰蛋白酶活性。将细胞悬浮液混合在一起, 分离细胞团块。一旦所有的细胞都被移出, 生长的表面就会很清楚。
    请注意:使用胰蛋白酶等消化酶有助于通过强烈粘附细胞系。胰蛋白酶是一种通常来自猪胰腺的蛋白酶的混合物, 在不同的纯度等级上可以买到。

5. 使用 Neubauer 单元计数幻灯片进行手动单元计数

  1. 用70% 的酒精擦拭表面, 准备血细胞仪滑块和覆盖片。
  2. 将细胞悬浮液混合, 并将细胞悬浮液的15Μl 分配到血细胞仪的沟槽边缘 (图 3A), 以填充血细胞仪的第一腔。填充血细胞仪的第二腔。细胞悬浮液将通过毛细管作用被吸引到计数室。
  3. 使用10倍显微镜目标, 对平行线约束的网格中间1毫米2区域内的细胞进行计数 (图 3c,d)。若要避免重复计数, 请对覆盖顶部和左侧边界的单元格进行计数, 但不计算跨越 200μm2平方的右侧和底部边界的单元格。计数在100-200 细胞之间。用第二室重复计数。
  4. 计算两个计数的平均值, 并根据以下公式确定细胞密度: 细胞密度 (Cells/ml) = 平均细胞计数 (n1 + n 2/2) x10 4.
    请注意:细胞活力表示为活细胞占总细胞的百分比。要确定细胞活力, 请将细胞悬浮液与等量的色氨酸蓝混合 (0.4%)在手动或自动计数单元之前的解决方案。活细胞不会吸收染料, 而死细胞将被染成蓝色。

6.嗜铬细胞系的冷冻保存

  1. 检查培养物是否健康形态、生长和没有污染。收获从日志中到后期生长阶段的培养物 (步骤3.3 或第4节)。对于许多五食细胞系, 大约在 4 x10 6细胞之间, 到 8 x 10 6 细胞之间.
  2. 将整个细胞悬浮液转移到15毫升或50毫升锥形管中。以 1, 000 x离心5分钟收集细胞, 并丢弃上清液。
  3. 将细胞颗粒重新装入冷冻介质 (表 4) 中, 最终细胞密度至少为 4 x 107 细胞
  4. 将适当数量的低温保护剂二甲基亚硫醚 (DMSO) 滴入细胞悬浮液中, 使最终的 DMSO 浓度为10%。轻轻混合细胞悬浮液。
  5. 小心地将细胞悬浮液的0.5 毫升放入预先标记的冷冻细胞的等价物中 (~ 2x 10 7 细胞)。将颗粒放入充满异丙醇的冷冻容器中 (图 4 a)。将冷冻容器在夜间-80°c 的冰柜中转移, 使冷冻机的温度缓慢下降 (-1°C/min) 到冰柜温度。
  6. 取出冷冻的冰生物, 并迅速将其连接到藤条上 (图 4b)。将含有冰体的藤条插入罐中 (图 4C)。或者, 将冷冻冷冻物放入预冷冷冻箱中 (图 4d)。将冷冻冷冻剂储存在 n2 冰柜的液相中 (图 4e,f)。
    请注意:当使用含有 DMSO 的冷冻介质时, RT 的延迟时间长达 30分钟, 这对细胞并不有害。

Representative Results

快速解冻冷冻嗜酸性粒细胞并将其培养成细胞密度, 使其恢复生长阶段是很重要的。如果遵守冷冻保存和解冻的程序, T-25 瓶中的细胞密度将至少等于 4x10 6 Cellss\ml 。解冻后一至两个小时, 大多数嗜酸性粒细胞系将开始附着在生长的表面。在大多数细胞在解冻后两小时内没有附着在生长表面的情况下, 建议在改变培养基前连夜孵育细胞。

亚培养的目标是保持细胞在生长曲线的健康指数逻辑阶段。亚培养的标准取决于可见的微生物污染缺乏、细胞密度以及是否需要建立定期的维护计划。重要的是要首先评估细胞的健康状况, 并确定在冻结之前没有不定基污染物。大多数细菌和真菌污染物都很容易通过目视检查检测。受污染的培养物可以通过介质浊度的增加来识别。在显微镜下, 污染物可能会出现作为细菌棒, 球菌, 发芽酵母细胞或链状真菌菌丝。其他污染源, 如非细胞原体支原体, 无法从视觉上检测到, 可以通过基于 pcr 的检测21进行例行检测。

可以直观地确定细胞系的融合 (图 1)。快速生长的细胞系很早就到达汇合处, 需要定期传代。这样的线最多每周培养两次。相反, 缓慢生长的细胞至少每两周或更长时间被传代一次。然而, 这些细胞每周都需要给新鲜的媒体喂食。这是为了防止媒体枯竭, 稀释细胞中的代谢废物。来自不同组织来源的细胞系在形态 (图 2)、粘附特性、介质要求 (表 1) 和加倍时间 (表 2) 上有所不同。表 5,表 6,表 7表 8列出了各种嗜酸性粒细胞培养培养基的配方。

细胞计数可确保准确的播种密度和可预测的亚培养常规。对于定量实验, 细胞计数是必不可少的。细胞计数可以使用血细胞计 (图 3 a) 或自动粒子计数器 (图 3A)。如果使用自动计数器, 请按照制造商的说明进行操作。使用血细胞仪手动计数细胞是经济和容易的。计算包含在 Neubauer 中间网格中的细胞数量, 并计算细胞密度;例如, n = 214个单元, 导致细胞密度为 2.14 x10 6 Cells/mL Ml (图 3d)。

从两个100毫米板的细胞悬浮液, 每个含有10毫升的细胞悬浮液在 4 x10 6 细胞/胶体/胶体被收集并重新悬浮在2毫升的冷冻介质中, 以达到 4 x 10 细胞/毫升的密度。每个冷冻冷冻冷冻细胞悬浮液含有 2 x 10 7 细胞.这将产生一个区域性 4 x10 6 Cells/mL 时, 解冻根据协议部分1。

Figure 1
图 1:三种不同的代表性图像德罗菲拉不同融合和细胞密度的细胞系.(A) s2-dgrc 培养在 1 x10 6 cells ml。(A ')S2-dgrc 培养在 4.5 x10 6 细胞/毫升。(B) mla-bg2-1/2 培养在 2 x10 6 cellss ml。(B ')ML-BG2-1/2 培养在 8 x10 6 细胞/细胞中, 细胞正在打桩和聚集作为病灶。(C) 1 x 10 6 cellsl 的开放源码软件培养.(C ')4 x 106 CELLS/ML 的 oss 培养。悬浮中的细胞不会在同一焦平面上捕获。刻度栏 = 100μm. 请点击这里查看此图的较大版本. 

Figure 2
图 2: 八个不同的食子细胞系的代表性图像.(A) 圆形胚胎衍生 s2-dgrc。(B) 圆形胚胎衍生的 Kc167. (c) 圆形幼虫 cns 衍生的 ml-bg2-1/2。(D) 圆形幼虫纺锤形 ml-bg3-伤。(E) Cme l1 是一种从幼虫腿图像盘中提取的细胞系, 较小, 具有圆形形态。(F) oss 是一种来源于成人卵巢的细胞系, 显示纺锤形形态。(G) 纺锤形的 Rasv12细胞系表示激活的 ras。(H) rasv12; wtsrnai ( Wrr1), 一种表达激活的 ras 和双链 rna 的细胞系, 其靶向肿瘤抑制(wts), 显示出上皮特征。刻度栏 = 50μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 细胞密度可以使用血细胞计手动计数, 也可以自动使用自动粒子计数器计数.(A) 有两个腔的血细胞仪。(B) 显示单元格计数输出的自动单元计数器。(C) 在10倍目标下查看的改进的 neubauer 细胞计数网格。由 0.1 mm3中心网格 (红色 dashd 线正方形) 绑定的计数单元格。(D) 血细胞仪上充满细胞进行计数的中央网格。刻度杆 = 1 毫米 (C);0.2 毫米 (D)。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 冷冻保存设备.(A) 冷冻容器将壶固定在直立的位置, 以便缓慢冻结。(B) 用于固定冷冻小管的金属棒。(C) 用于盛拿藤条的罐。(D) 塑料冷冻箱 (冷冻盒)。(E) 将多个罐插入液体n2储罐中的罐。(F) 液体n2储罐。请点击这里查看此图的较大版本.

细胞应变 媒体 坚持 胰蛋白酶
施耐德线 M3 + BPYE + 10% 胎儿小牛血清 (FCS), pH 值6。6 半粘附性
(S2R+, S2-drsc, S2-dgrc, Sg4)11
施耐德的介质+ + 10% fcs
Kc 线路 (Kc167、Kc7E10)21、22 M3 + BPYE + 5% FCS, pH 6。6 半粘附性
Hyclone-ccm3, pH 值6。2
成像盘和中枢神经系统线 (ml 线)13, 14 M3 + BPYE + 10% FCS, pH 6。6 半粘附性
10μgml 胰岛素
Milner 成像盘线 (Cme-线)15 M3 + 2% FCS 半粘附性
5μgml 胰岛素
2.5% 苍蝇提取物
fGS/OSS /oss 16 M3 + 10% FCS, pH 值6。8 粘 附 *
10μgml 胰岛素
1 mgmlc5h8kno4  
0.5 MGML KHCO3 
0.6 mgml 谷胱甘肽
10% 苍蝇提取物
拉斯V12线18 M3 + BPYE + 10% FCS, pH 6。6 粘 附 是的

表 1:各种特性和介质的要求德罗菲拉细胞系.不同的半粘附施耐德线分离株, 包括 S2R+、S2-dhophila RNAi 筛选中心 (DRSC)、S2-dr神诺菲拉基因组学资源中心 (DGRC) 和 Sg4, 它们是在 M3 培养基 + 中培养时通常使用的细胞系, 可产生强烈的增殖Bactopetone 酵母提取物 (BPYE) 补充10% 的胎儿小牛血清 (FCS)。或者, 施耐德的介质 (pH 值 6.7-6.8) 通常用于 M3+BPYE。Kc 线在 M3 + BPYE (5% FCS) 或无血清 CCM3 介质中扩散。ML 想象盘和中枢神经系统 (CNS) 系需要补充胰岛素才能增殖。米尔纳图像盘线需要胰岛素和苍蝇提取物补充。坚持 fGS/OSS-oss 细胞系需要胰岛素, 较高浓度的苍蝇提取物以及谷胱甘肽的生长。坚持 RasV12线在 M3 + BPYE (10% fcs) 中生长良好。胰蛋白酶被用来从生长表面排出粘附细胞系。

细胞系 (库存 #) 基因 双倍时间 (h) * 组织来源
S2R+ (150) 奥雷雷 39 晚期胚胎
S2-D委 (6) 奥雷雷 23 晚期胚胎
S2-DRSC (181) 奥雷雷 46 晚期胚胎
Kc167 (1) 埃塞 22 6-12小时胚胎
ML-BG2-C2 (53) y v f mal 48 3 . 3 例幼虫中枢神经系统
ML-BG3-C2 (68) y v f mal 104 3 . 3 例幼虫中枢神经系统
Ml-dmd8 (92) y v f mal 66 3个幼虫翼圆盘
CME W1 cl8 ++ (151) 奥雷雷 46 3个幼虫翼圆盘
CME L1 (156) 奥雷雷 47 第3例幼虫腿盘
OSS (190) 巴姆德86 45 成人巴姆突变体卵巢
拉斯V12线 UAS-GFP;P(UAS-Ras85D.V12)/P(Act5C-GAL4)17bFO1 41-65 胚胎

表 2:广泛使用的基因型、加倍时间和组织来源德罗菲拉细胞系.介绍了常用细胞系的组织基因型、来源和种群翻倍时间。双倍的时间取决于推荐介质在25°c 时的增长。

文化船 介质容量 (毫升)
12.5 厘米2 t 型烧瓶 2。5
25厘米2 t 型烧瓶 5
75厘米2 t 型烧瓶 15
35毫米板 1
60毫米板 4个
100毫米板 10
384孔板 * 0.04/井
96孔板 * 0. 内井
48孔板 * 0./井
24孔板 * 0.5/井
12孔板 1.0/井
6孔板 2.0/井

表 3: 养殖船只和建议的媒体量.不同大小的培养容器可用于培养亲神菌细胞。建议每艘船采用适当的介质卷 (mL)。用石蜡膜密封含有小于 0.5 mL 细胞悬浮液的多井板, 以减少因蒸发而造成的介质损失。

体积
M3 + BPEE, pH 6。6 70毫升
热灭活 FCS 20毫升
无菌过滤 DMSO * 10毫升

表 4: 制备100毫升冷冻介质 (m3 + BPYE、20% FCS、10% dmso) 的配方.根据需要准备冷冻介质, 避免长时间储存含有 DMSO 的冷冻介质。

M3 + BPYE 介质
实德与桑的 M3 23 1瓶
KHCO3 0.5 克
选择酵母提取物 1.0 克
Bactop酮 2.5 克
无菌纯净水 1000毫升

表 5:M3 + BPYE 组织培养基1升制备配方.将 pH 值调整为6.6。通过0.22μm 的过滤器通过介质进行消毒。

FGS/OSS 的基本 M3 介质
屏蔽和 Sang M3 1瓶
KHCO3 0.5 克
C5h8kno4   1.0 克
无菌纯净水 1, 000 毫升

表 6:Fgssw/oss m3 基介质1升配方.将 pH 值调整为6.8。通过0.22μm 的过滤器通过介质进行消毒。

Hyclone-ccm3
CCM3 粉末 28.6 克
纳赫科3 0.35 克
10 N NaOH 2.5 毫升
Ccl2 0.5 克
无菌纯净水 1, 000 毫升

表 7:透明质-ccm3 组织培养基1升配方.将 pH 值调整为6.2。通过0.22μm 的过滤器通过介质进行消毒。

M3 + BPEE + 10% FCS 宫克圆盘和中枢神经系统线中等 Milner 光盘线中等 fGS/OSS/oss 完整介质
M3 + BPEE, pH 6。6 90毫升 90毫升 - -
热灭活 FCS * 10毫升 10毫升 2毫升 10毫升
胰岛素 (10 Mg/ml) - 100μl 50μl 100μl
苍蝇提取物 - - 2.5 毫升 10毫升
谷胱甘肽 (60 Mg/ml) - - 1毫升
M3, pH 6。6 - - 97.5 毫升 -
fGS/OSS/oss M3, pH 6。8 - - 79毫升

表 8:各种普通的100毫升的制备配方德罗菲拉细胞培养培养基.在56°c 下培养 FCS 1小时, 每5分钟摇晃一次, 使补体蛋白失活。

Discussion

果蝇细胞培养物是基于细胞的高通量屏幕的主要试剂。它们的使用还补充了体内的基因研究, 提供了适合生物化学的同质细胞群, 在注射到苍蝇体内之前对转基因结构进行了快速检测, 细胞生物学, 显微镜和最近的体细胞遗传通过基因组编辑1,2,3, 8,9,10进行操作.

冷冻嗜酸性粒细胞的活力和恢复对剧烈波动敏感, 即使在低温下也是如此。DGRC 将冷冻细胞系储存在n2 (-196°c) 的液相中, 并将其运输到干冰 (-705°c) 中。在干冰中运输的冷冻小管不应转移回 n2 液体或- 80°c 的冷冻冷冻室储存。相反, 冷冻细胞应解冻, 抵达后尽快以高细胞密度重新播种 (协议第1节), 并为预定目的进行培养 (协议第3节)。如果细胞系没有立即用于实验, 细胞系应该被冷冻保存 (协议第6节), 直到它们准备好使用。

一些细胞系, 如 MLA-BG2-1/2 和 Ras 系, 需要几天的时间才能从从冷冻保存状态中恢复的影响中恢复。在解冻后的头几天, 大量的细胞碎片伴随着这些细胞系。如果不受干扰, 细胞就会恢复和增殖。DGRC 的许多戈罗迪拉细胞系已被改造为在基于 m3 的培养基22中生长。对于从解冻的影响中恢复缓慢的细胞系来说, 使用有条件的媒体可能是有用的。有条件的培养基可能含有细胞分泌到培养基中的生长因子, 这可能会鼓励细胞解冻后的恢复和增殖。

细胞系通常遵循陈规定型的生长曲线, 包括滞后阶段、指数阶段、高原阶段和恶化阶段。许多嗜铬细胞系在生长的逻辑阶段增殖, 当它们在25°c 的密度在 1 x 10 6 和 1 x 10 7 细胞之间时。细胞系的传代是至关重要的, 这样它们总是处于指数增长阶段。

培养物的融合, 以百分比表示, 描述细胞所覆盖的生长表面积。细胞系的细胞融合取决于其细胞形状和大小。不同的细胞系具有不同的形态和粘附特性。因此, 大约相似的汇合处的不同细胞系可能具有截然不同的细胞密度 (图 1)。培养融合可能不是通过果蝇细胞培养理想指标, 因为果蝇细胞系继续增殖, 要么在生长表面形成后, 将彼此堆积如山作为病灶, 要么在悬浮状态下。(图 1)。然而, 有特定细胞系经验的用户可能经常使用汇合作为何时亚培养的快速视觉指南。

虽然可以在19-25°c 的环境 RT 上生长嗜德维拉线, 但不建议这样做, 因为环境温度波动可能会影响增殖速度。建议使用专用的25°c 孵化器。果蝇细胞培养的孵化器不需要促进co2气体交换, 因为果蝇细胞培养基不使用 co2 进行缓冲.培养细胞系的孵化器内的湿度是在钢板中培养细胞时不可忽视的一个重要因素。根据孵化器的类型和工作环境的不同, 可能需要在孵化器内放置无菌水烧杯。为了最大限度地减少介质蒸发, 请使用密闭的 t 烧瓶或将培养板存放在密封的塑料容器中, 同时将其存放在孵化器内。

重要的是要制定一个时间表, 为嗜酸性粒细胞系的亚培养。为了估计增长率和显示器的一致性, 可以方便地亚培养在一个均匀的几何比例 (分裂比例 1: 2, 1: 4, 1:2)。例如, 在 8 x10 6 cellss\ Ml 的 Kc167 细胞的 10 ml 融合板可以按1:8 的比例分裂, 以达到 1 x10 6 cellsll 的播种密度 (1.25 毫升的细胞悬浮液稀释成 8.75 ml 的新鲜介质)。在72小时内, Kc167 培养物预计将扩散到 8 x10 6 cellsls·ml 的密度, 因为它的翻倍时间为24小时。因此, 分裂率被确定为促进一个方便的亚培养例程, 每周最多两次, 确保细胞总是在其指数日志阶段的生长培养。这样就有了一个定期的细胞亚培养时间表, 这样融合的时间既不是太短, 也不是太长。如果融合时间太短, 细胞在较低的细胞密度 (较高的分裂比) 下培养。同样, 如果达到融合的时间太长, 细胞在较高的细胞密度 (较低的分裂比) 下培养。需要注意的是, 大多数嗜酸性粒细胞系对低细胞密度 (lt;1 x10细胞细胞) 非常敏感, 在这些细胞中, 细胞几乎不增殖, 最终可能死亡。

嗜酸性粒细胞系在生长特征和形态上各不相同。因此, 可能需要以不同的方式处理具有不同属性的细胞系。大多数嗜酸性粒细胞系都是半粘附的。在细胞密度较低的情况下, 它们对生长表面的粘附力更强, 当培养物融合时, 细胞就会变得不那么粘附, 很容易分离。这种细胞粘附力的逐渐变化促进了最广泛使用的戈德罗斯拉细胞系 (施耐德、kc 系、图像盘和中枢神经系统) 的容易亚培养, 因为它允许操作人员简单地在细胞单层上分配介质将其移出当培养致密时, 从生长表面。对于表面粘附的线, 如女性胚系茎-卵巢体细胞鞘 (fgssoss) 和 Ras 系, 必须在胰蛋白酶中孵育细胞, 时间较短, 以帮助细胞脱离生长表面。

大多数嗜食细胞系的培养基添加包括胎儿小牛血清 (fcs)。胰岛素和成人苍蝇提取物 (FEX) 是一些特定的线路所必需的。FEX 包含对特定幼虫想象体线和成体卵巢细胞系的生长至关重要的未定义成分。DGRC 准备并提供来自1周龄的俄勒冈州-r-moentcode 苍蝇 (RRID:BDSC_25211) 的成人 FEX, 价格为 2.5 mL 和10毫升。DGRC 还在其网站上提供了小规模 FEX 准备的说明 < http://dgrc.bio.indiana.edu/include/file/additions_to_medium.pdf >。然而, FEX 的准备工作非常耗时, 需要大量的成年苍蝇。

对嗜食子细胞系的冷冻保存节省了时间, 并为维持不立即使用的细胞系提供了试剂。低温保存是通过在含有低温保护剂 DMSO 的介质中将细胞 (-1°cp/min) 冷冻到-80°c 来实现的。缓慢冷却步骤是成功冷冻保存的关键。在-80°c 的冰柜中, 将细胞的安培以-1°cmmin 的速度冷却, 当放置在一个装满异丙醇的冷冻容器中时。从25°c 环境温度开始, 在压子中的温度需要高达2小时才能达到-80°c。建议让小管在一夜之间冻结。

然后, 冷冻的小泡必须迅速转移到氮气的液相中, 以便长期储存。在环境温度下, 低温恒温器将在约10°cmin 时快速再加热, 在-50°c 23 时, 其活力将受到影响。为了保持快速传输, 以小批量处理小管, 以最大限度地减少暴露在环境温度下。或者, 将冷冻冰液放在干冰上, 同时准备将其转移到液体n2.如果没有液氮, 细胞可能会储存在-80°c 的冰柜中, 尽管随着时间的推移有明显恶化的危险。

细胞密度对于成功的冷冻保存和随后细胞系的恢复至关重要。一般情况下, 一旦有过量的细胞出现, 就应该冻结新的细胞系, 以产生最初的冷冻 (1-3 个小管)。一旦细胞系得到进一步稳定的培养, 应创建10-20 个小管的冷冻库存。然后, 该股票被解冻, 以检查其冷冻后细胞的恢复和活力, 之后它被传播进行实验, 或更换股票时, 冷冻股票壶的数量下降到5。最后, 重要的是要验证解冻的细胞是否保留其亲本种群的特征, 因为已知细胞系会进化3,24.

总之, 本文通过提供有关果蝇细胞系基本处理的各种方面、最佳做法和视听协议的基本信息, 为研究果蝇细胞培养物提供了入门知识。这种可获得的资源旨在顺利简化与培养的嗜酸性粒细胞合作的介绍, 并补充任何研究实验室的现有培训指南。

Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢国家卫生研究院 (NIH P40OD010949 奖) 和研究界利用在 DGRC 策划的各种d. insogaster Dname/vector/细胞资源。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm tissue culture plates Corning  430167 Subculturing
25 cm2 T-flask Corning  430168 Subculturing
35HC Liquid Nitrogen Storage Tank Taylor-Wharton 35HCB-11M Cryopreservation
Automated Cell counter BIO-RAD TC20 Counting
Bactopeptone BD BioSciences 211677 Medium additions
Counting Slides BIO-RAD 145-0011 Counting
Cryovial 1 mL Greiner  123263 Cryopreservation
DMSO Sigma Aldrich D5879 Cryopreservation
Freezing Box Nalgene 5029-0909 Cryopreservation
Freezing Container Fisher Scientific 15-350-50 Cryopreservation
Hematocytometer Fisher Scientific #0267110 Counting
Human Insulin Millipore Sigma I9278 Medium additions
Hyclone CCM3 media GE Healthcare Life Sciences SH30061.03 Medium
Hyclone Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences SH30070.03 Medium additions
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate Millipore Sigma G1149 Medium additions
L-Glutathione reduced Millipore Sigma G6013 Medium additions
Potassium Bicarbonate Millipore Sigma 237205 Medium additions
Select Yeast Extract  Millipore Sigma Y1000 Medium additions
Shields and Sang's M3 Insect medium Millipore Sigma S8398 Medium
Trpsin-EDTA (0.05 %), phenol red  ThermoFisher Scientific 25300054 Subculturing
Trypan Blue (0.4%) BIO-RAD 145-0013 Counting

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