다발성 경화증을 가진 개별을 위한 포괄적인 부검 프로그램

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Neuroscience
 

Summary

다발성 경화증은 치료법이없는 염증성 탈수성 질환입니다. 뇌 조직의 분석은 질병의 발병 기전을 이해하는 중요한 단서를 제공합니다. 여기에서 우리는 클리블랜드 클리닉에서 운영하는 독특한 신속한 부검 프로그램을 통해 수집 된 MS 뇌 조직의 방법론 및 하류 분석에 대해 논의합니다.

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Dutta, R., Mahajan, K. R., Nakamura, K., Ontaneda, D., Chen, J., Volsko, C., Dudman, J., Christie, E., Dunham, J., Fox, R. J., Trapp, B. D. Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (149), e59511, doi:10.3791/59511 (2019).

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Abstract

우리는 다발성 경화증 (MS)를 가진 개별을 위한 급속한 조직 기증 프로그램을 기술합니다 과학자와 기술자는 24/7, 365 일 1 년에 대기할 것을 요구합니다. 참가자는 뇌와 척수를 기증하는 데 동의합니다. 대부분의 환자는 MS 처리 및 연구를 위한 클리블랜드 진료소 멜렌 센터에 신경학자에 의해 선행되었습니다. 그들의 임상 과정과 신경 장애는 잘 특성화되어 있습니다. 죽음 직후, 바디는 3 T 자기 공명 화상 진찰 (MRI)에 의해 두뇌가 그(것)들에서 검사되는 MS 화상 진찰 센터로 수송됩니다. 시신은 부검실로 옮겨져 뇌와 척수를 제거합니다. 뇌는 두 개의 반구로 나뉩니다. 한 반구는 즉시 슬라이스 상자에 배치하고 대체 1cm 두께의 슬라이스는 이틀 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 고정되거나 드라이 아이스와 2 메틸 부탄에서 빠르게 얼어 붙습니다. 짧은 고정 된 뇌 조각은 동결 보존 용액에 저장되며 조직학적 분석 및 민감한 항원의 면역 세포 화학 적 검출에 사용됩니다. 냉동 슬라이스는 -80 °C에 저장되고 분자, 면역 세포 화학 및 현장에서 혼성화 / RNA 범위 연구에 사용됩니다. 다른 반구는 몇 달 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 배치, 슬라이스 상자에 배치, 3 T 자기 공명 (MR) 스캐너에서 다시 스캔하고 센티미터 두께의 조각으로 슬라이스. SITU MR 이미지(MRI)의 사후 처리는 MRI-병리학 상관 관계를 용이하게 하기 위해 1cm 두께의 뇌 슬라이스와 공동 으로 등록되어 있습니다. 모든 뇌 조각은 촬영되고 뇌 백색 물질 병변이 확인됩니다. 척수는 2cm 세그먼트로 절단됩니다. 대체 세그먼트는 4% 파라포름알데히드 또는 급속냉동에 고정된다. postmortem MS 조직의 급속한 조달은 MS 두뇌 및 척수 및 두뇌 MRI 이상의 병리학적인 상관관계의 병리학적 및 분자 분석을 허용합니다. 이 급속하게 가공된 사후 조직의 질 (일반적으로 죽음의 6 시간 안에) MS 연구에 중대한 가치이고 많은 고충격 발견 귀착되었습니다.

Introduction

질병을 연구하는 가장 좋은 방법 중 하나는 병에 걸린 조직 자체를 검사하는 것입니다. 이것은 중추 신경계 (CNS)의 질병을 공부하는 사람들에게 도전을 제시합니다. 병에 걸린 뇌와 척수의 생검은 극히 드물며 일반적으로 비정형 사례를 수반합니다. CNS 질병을 가진 개별을 위한 부검 비율은 최근에 극적으로 감소하고, 수행될 때, 수시로 조직의 급속한 조달을 제공하지 않습니다. 이러한 도전은 다발성 경화증 (MS)를 가진 개별에게서 조직을 수집에 집중된 몇몇을 포함하여 질병 중심의 두뇌 은행의 설치 귀착되었습니다. MS는 미엘린, 올리고엔드로시테스(미엘린 형성 세포), 뉴런 및 축삭을 파괴하는 중화민혈관의 염증 매개 질환입니다. MS 환자의 대다수는 결국 자연에서 퇴행성 가능성이 있는 점차적으로 진보적인 질병으로 발전하는 가변적인 복구를 가진 신경장애의 시합으로 시작하는이중 상이한 질병 과정이 1. 기증된 MS 두뇌의 대다수를 위해, 사후 처리 간격 (PMI) 죽음과 조직 처리 사이 24 h를 초과합니다. 이 조직은 MS 두뇌에 있는 병리학적인 변경에 관하여 귀중한 정보를 제공하더라도, 질병 병리생리학에 강력한 통찰력을 제공할 수 있는 더 진보된 분자 연구 결과적합하지 않습니다. 이것은 손상되지 않은 RNA를 요구하는 유전자 프로파일링 연구 결과를 위해 특히 케이스입니다.

위에서 설명한 한계를 극복하기 위해 MRI/병리학적 상관 관계를 허용하는 신속한 조직 기증 프로그램을 개발했습니다. 이 프로토콜은 현대 분자 연구에 적합한 잘 보존 된 조직을 제공하고 MS 뇌의 뇌 병리학 및 MRI 이상을 직접 비교할 수 있습니다. 클리블랜드 클리닉 다발성 경화증 조직 기증 프로그램은 20 년 이상 존재해 왔습니다. 이 급속한 조직 기증 프로그램은 MS 및 그밖 관련한 자기 면역 신경학상 조건을 가진 개별에게서 두뇌 그리고 척수를 조달합니다. 이 프로그램은 조직 처리를 위한 두뇌 및 척수의 제거에 선행된 죽음의 6 시간 안에 있는 situ MRI에서 장악하는 것을 목표로 합니다.

모집
기부금은 환자 (사전 동의)에서 직접 얻은 앤티 모템 동의를 통해 또는 사망 후 친척의 다음에서 얻어진다. 사전 동의된 환자는 전형적으로 클리블랜드, 오하이오에 있는 다발성 경화증 처리 및 연구를 위한 Mellen 센터에 임상 인구에서 확인됩니다. 급속한 조직 기증 프로그램에서 모집에 있는 특혜는 세로 연구 결과에서 따랐던 환자에게 주어지더라도, 센터에서 보인 모든 환자에게 열려 있습니다. 사망 전에 등록한 참가자는 사망 시 또는 사망이 임박한 것으로 생각될 때 가족 구성원 또는 의료 제공자에게 연구 팀에 연락할 수 있는 지침을 받습니다. 개인이 조직 기증 프로그램을 입력하는 두 번째 방법은 친척의 다음동의를 통해 사망시입니다. 오하이오 주는 오하이오 북동부 의 20 개 카운티에서 운영되는 LifeBanc라는 연방 정부가 위임 한 기관 조달 기관에 사망을 언급해야합니다. LifeBanc는 장기 기증을 위한 제외인 MS의 진단을 위한 모든 죽음을 스크린합니다. LifeBanc은 클리블랜드 클리닉에서 75 마일 반경 내에서 발생하는 MS의 관련 진단으로 모든 사망에 대한 MS 조직 기증 프로그램에서 수사관에게 알리기 위해 준비되었습니다. 다음 친척과 병원 직원은 조직 기증 프로그램 직원에 의해 연락을 받고 뇌및 척수 조직의 기증에 대한 동의를 얻습니다. LifeBanc을 통해 모집 앤티 모템과 사후 모템의 이 두 가지 방법은 연간 약 10-12 개의 뇌 기부를 초래합니다. LifeBanc에서 파생된 추천 수를 관리하기 위해 사망 연령 상한선을 조정합니다.

기부금 조달
이 프로그램은 조직 조달을위한 조직 기증 프로그램의 구성원에 의해 24 시간 범위, 365 일 년 을 필요로합니다. 중앙 조직 기증 알림 이메일 / 호출기 / 모바일 장치 텍스트 알림 시스템은 조직 기부를 포함하는 임상 팀에 의해 사용됩니다. LifeBanc은 조직 기증 프로그램을 위해 대기 직원에게 연락할 수 있는 번호를 제공합니다. 회원은 병원 제공자/친족(사전 동의) 또는 LifeBanc 및 기타 추천 출처에 의해 사망 사실을 통보받습니다. 첫째, 사망 시점과 조직 기증에 대한 타당성을 결정합니다. 죽음은 잠재적으로 가난한 품질의 조직귀착되는 조건에 대 한 스크리닝, 장기간된 pre-mortem 저산소증을 포함 하 여, 대규모 파괴적인 뇌 조직 (예를 들어, 큰 두 개 내 출혈, 광범위 한 bi-반 반 구 성 뇌졸중, 광범위 한 종양 장기간 인공호흡기 지원(>3일), 사망 전 혈관활성제(>3일) 장기간 사용. 의학 검사관이 죽음에 관여하는 경우에, 연구 신경학자는 의학 검사관의 책임을 손상시키지 않고 적시에 조직을 수신하는 쪽을 탐구하기 위하여 의학 검사관과 이야기할 수 있습니다. 실행 가능한 조직이 존재한다고 생각되면 서면 동의가 얻어지고 (사전 평가를 얻지 못하면) 신체 수송을 위한 준비가 이루어집니다. 이전에 계약된 사망자 운송 서비스는 클리블랜드 클리닉의 MRI 시설로 이동하기 위해 연락을 취합니다. 낮은 체온이 MRI 신호 특성의 변경과 관련이 있기 때문에 신체가 실온에 남아 있고 냉장에 배치되지 않도록주의를 기울입니다.

임상 이력
임상 병력은 MS의 진단에 대한 세부 사항을 포함, 증상의 발병, 사용 된 치료, 임상 및 파라 임상 테스트의 결과 (연상 잠재력, 뇌척수액 결과, 광학 일관성 단층 촬영), 다발성 경화증 기능성 복합 의료 기록(사용 가능한 경우)에서 수집되는 확장된 장애 상태 척도(EDSS; 실제 또는 추정), 다음 친척에 대한 직접 인터뷰. 전 모템 MRI도 수집됩니다.

Protocol

이 프로토콜은 클리블랜드 클리닉 기관 검토 위원회에 의해 승인되었으며 클리블랜드 클리닉 인간 연구 윤리위원회의 지침을 따릅니다.

1. 시투 MRI

  1. 기증자의 몸을 MRI 제품군으로 가져가MS 이미징 시설에서 2 시간 MRI 이미징 프로토콜을 수행합니다. 3 T 또는 7 T 이미저에서 MRI를 수행합니다.
    참고: 레거시 데이터의 대부분이 3T에서 수행되었지만 사용할 수 없는 경우 이미징이 7T로 수행되기 때문에 3T에 우선 순위가 부여됩니다. 지정된 코어 서열은 모든경우에 대해 수행된다 (표 1) 현재 연구 이익에 의존하는 추가 서열은 시간이 허용하는 경우 수행 (죽음 후 12 시간 미만 조직 고정을 달성하여 제한). 1은 코어 서열을 설명한다.

2. 부검

참고: 에 있는 situ MRI에 따라, 바디는 실험실 구성원에 의해 diener 및 조직 처리에 의해 두뇌와 척수 추출을 위한 morgue로 수송됩니다.

  1. 시체가 모그에 도착하기 전에 다음 단계를 수행합니다. 2시간 전에, 4% 파라포름알데히드(PFA)의 3L을 준비하고, 조직 보관을 위해 용기와 봉투를 라벨로 준비한다. 8% PFA의 3 L을 준비하고 8% PFA에 8% PFA의 1.5 L을 4% PFA로 희석한다. 나머지 8% PFA를 2일째동안 4°C에 놓습니다.
  2. 모르그로 여행하기 전에 2개의 이동식 쿨러를 드라이 아이스(큰 블록이 깨지고 작은 펠릿)로 50%까지 채우십시오.
  3. 모르그에서 스테인레스 스틸 용기를 2-메틸부탄과 드라이 아이스로 중간에 채우고 조직을 동결하기 위한 준비를 위해 뚜껑을 덮습니다.
  4. 무게와 한 번 디에이너에 의해 제거 된 뇌를 촬영합니다.
  5. 첨부된 듀라를 PFA로 채워진 용기에 놓습니다.
  6. 대뇌에서 소뇌와 뇌간을 분리하고 대뇌를 촬영합니다.
  7. 시신경, 치아, 요로를 식별하고 프로브와 핀셋을 사용하여 분리합니다. 메스로 구조를 절제하십시오.
    참고: 시신경의 한쪽의 말단 세그먼트는 식별을 위해 Higgins 잉크를 사용하여 표시됩니다.
  8. 대뇌 반구를 세로로 분리하고 각 반구를 개별적으로 촬영합니다.
  9. 왼쪽 반구의 기본 모터 피질(PMC)에 잉크를 넣고 다시 사진을 찍고 3.3L 용기에 넣고 긴 고정을 합니다. 뇌 고정의 시작 시간을 문서화합니다.
  10. 오른쪽 반구에 대한 PMC는 잉크로 또는 절제될 수 있습니다.
    1. 절제되는 경우, 먼저 커버 드 수막을 제거합니다.
    2. 잉크로 찍거나 절제된 PMC를 다시 촬영합니다.
    3. PMC를 절제하는 경우 6개의 동등한 크기의 섹션으로 잘라냅니다.
    4. 각 섹션의 로스트랄 측면을 잉크로 만듭니다.
    5. 짧은 고정을 위해 홀수 섹션을 PFA 채워진 컨테이너에 넣습니다.
    6. 균일한 수의 섹션을 스냅 동결하고 밀봉된 냉동고 백에 넣어 서늘한 #1 넣습니다.
  11. 오른쪽 반구 앞쪽을 1cm 두께의 관상 동맥 절편으로 뒤쪽으로 자른다.
    1. 총 이상(예: 절단 아티팩트, 출혈 및 병변)을 문서화합니다.
    2. 짧은 고정을 위해 PFA가 채워진 컨테이너에 홀수 섹션에 배치합니다.
    3. 짝수 구간을 스냅 동결하고 밀봉된 냉동고 가방에 넣습니다.
    4. 뇌 고정 시간의문서 끝 .
  12. 뇌간을 소뇌에서 분리하고 짧은 고정을 위해 PFA 충전 용기에 놓습니다.
    1. 분리 소뇌 반구세로.
    2. 각 반구를 4개의 똑같이 두꺼운 시상 섹션으로 자른다.
    3. 사진 내측 및 측면 보기.
    4. 왼쪽 소뇌 반구형 조각을 짧은 고정을 위해 PFA로 채워진 용기에 넣습니다.
    5. 오른쪽 소뇌 반구형 슬라이스를 스냅 동결하고 밀봉 된 냉동고 가방에 넣어 시원한 #1 넣습니다.
  13. 다이너에서 신경 뿌리가있는 척수를 얻습니다.
    1. 척수 경막미를 제거하고 PFA가 있는 용기에 듀라를 보관하십시오.
    2. 분리 왼쪽 및 오른쪽 전방 및 후방 신경 뿌리. 척수에서 절단된 왼쪽 전방 및 후방 신경 뿌리를 잘라내고 짧은 고정을 위해 PFA 충전 용기에 놓습니다.
    3. 척수에서 오른쪽 전방 및 후방 신경 뿌리를 자르고, 스냅 동결하고, 밀봉 된 냉동고 가방에 넣고, 시원한 #2 넣습니다.
    4. 척수의 20cm를 가장 많이 촬영합니다. 요추 확대 위치를 문서화합니다.
    5. 코드의 2cm 가로 부분을 절단하여 코달에서 로스트랄로 진행합니다.
    6. 각 컷 섹션의 로스트랄 측면을 잉크로 만듭니다.
    7. 짧은 고정을 위해 PFA가 채워진 컨테이너에 홀수 섹션에 배치합니다.
    8. 짝수 구간을 스냅 동결하고 밀봉된 냉동고 가방에 넣고 시원한 #2 넣습니다.
    9. 척수 고정 및 심각한 이상에 대한 시작 시간을 문서화합니다.
    10. 척수의 나머지 로스트랄 부분을 촬영합니다.
    11. 자궁 경부 확대의 위치를 문서화합니다. 나머지 척수에 대한 2.13.5-2.13.8 단계를 따르십시오.
  14. -80°C 냉동고에 라벨이 부착된 상자에 냉동 조직을 놓는 것을 따라. 고정 된 조직을 4 °C에서 보관하십시오.
  15. 24 시간 후 부검 후 (2 일째)에서 나머지 8 % PFA를 4 %로 희석시다.
  16. 4% PFA를 고정 용기에 담은 후 갓 희석한 4% PFA로 교체하십시오.
  17. 60 h 후 부검에서 글루타랄데히드, PFA, dH2O 및 소렌슨의 완충액에서 4 % PFA에서 2.5 % 글루타랄데히드의 용액을 준비합니다 (순차적으로 혼합하여 제조 : 0.2 M 인산염 완충액 pH 7.4, 폴리 비닐 피롤리돈 1 % w / v, 수크로로즈 30 % w / v, 에틸렌 30% v/v).
  18. 짧은 고정 용기에서 사용한 4% PFA를 제거합니다.
  19. 소렌슨의 완충액에서 조직을 헹구고 저온 보호 용액 (글리세롤 20 %, 0.4 M 소렌슨 완충액 20 %, dH2O에서 0.02 % 나트륨 아지드)에 놓습니다.
  20. 사진 짧은 고정 된 뇌 조각, 소뇌, 뇌간 및 모터 피질 (해당되는 경우).
  21. 메스 블레이드로 각 2cm 짧은 고정 척수 섹션에서 2mm 두께의 가로 부분을 잘라냅니다.
  22. 2 mL 번화가 바이알에 섹션을 놓고 4 % PFA에서 2.5 % 글루타랄데히드 용액으로 채웁니다.
  23. 나머지 부분을 원래 20 mL 번화 바이알로 되돌아갑니다. 소렌슨의 완충액으로 섹션을 헹구고 저온 보호 용액으로 교체하십시오.

3. 병리학

참고: 오른쪽 반구의 짧은 고정 슬라이스뿐만 아니라 긴 고정 왼쪽 반구 (몇 달 동안 4 % PFA에 배치) 중 30 μm 섹션으로 절단 (자유 부동이라고함) 또는 파라핀에 포함 및 12-14 μm 섹션으로 잘라 (라고도 함). 파라핀 내장). 이 단면도는 디아미노벤지딘 (DAB) 방법을 사용하여 면역 활동을 위한 탈수레화 병변 및 주요 조직 적합성 복합체 II (MHC-II)를 검출하기 위한 프로테올리피드 단백질(PLP)으로 일반적으로 처리됩니다. 이 프로토콜은 표준화되어 여러 간행물2,3,4,5,6,7,8,9에서 사용되었습니다. , 10개 , 11세 , 12.

  1. 자유 부동 (30 μm) DAB-아비딘 - 비오틴 복합체 (ABC) 조직 염색
    1. 저온 저장 용액에서 섹션을 제거하고 6 웰 플레이트로 섹션을 옮기고 1 x 인산 완충 식염수 pH 7.0 (PBS)의 2 mL에서 각각 5 분 동안 3 x를 씻습니다. 다음 우물로 잘 옮길 때 6웰 플레이트에서 사용 관리를 하여 조직을 찢어버리지 않도록 주의한다. 각 세척 및 배양 단계에서 6웰 플레이트를 셰이커에 놓고 티슈가 부드럽게 흔들릴 수 있도록 합니다.
      참고: 더 작은 부피와 더 큰 플레이트(즉, 12-및 24웰 플레이트)에서 배양된 조직 섹션은 표면 및 가장자리 찢어짐을 나타내는 경향이 있다.
    2. 약 30 mL의 10 mM 구연산완충 (pH 6.0)을 포함하는 유리 비커에서 마이크로 웨이브 섹션에 의해 항원 검색을 수행합니다. 2-3 분 동안 또는 구연산염 완충제가 끓기 시작할 때까지 페인트 브러시와 전자 레인지 섹션으로 조작하여 조직을 접지 마십시오. 단면이 실온(~20분)까지 식힙니다.
    3. 6웰 플레이트로 다시 섹션을 옮기고 PBS/0.3% 트리톤 X-100의 2 mL에서 각각 5분 동안 3x의 세척 섹션을 전송합니다. 3% H2O2/0.3% 트리톤 X-100/PBS의 2 mL에서 2 mL의 섹션을 실온에서 30분 동안 배양하여 내인성 과산화증을 차단합니다(RT).
    4. PBS/ 0.3% 트리톤 X-100의 2 mL에서 각각 5 분 동안 3 x 세척합니다. RT에서 1 시간 동안 3 % 일반 염소 혈청 / 0.3 % 트리톤 X-100 / 1x PBS의 2 mL의 블록 섹션.
    5. 1차 항체에서 1차 항체에서 밤새 5일(항체에 따라 다름)을 배양하여 염증(MHCII) 및 탈수초화(PLP)를 검출하기 위해 마이크로글리아 및 미엘린 에피토프를 4°C에서 검출하였다.
      참고: 이 단계 또는 후속 단계에서 배양할 때 섹션이 접히지 않도록 하십시오.
    6. 1x PBS의 2 mL에서 각각 5 분 동안 3 x 섹션을 세척하십시오. 그런 다음 이차 생체 측화 항체에서 섹션을 배양 (재료 참조) RT에서 1 시간 동안 아비딘 - 비오틴 복합체 (ABC) 용액을 다음 세척 단계 전에 약 45 분 동안 준비하여 ABC 복합체가 형성될 수 있도록합니다.
    7. 1x PBS의 2 mL에서 각각 5 분 동안 3 x 섹션을 세척하십시오. 그런 다음 RT에서 1 시간 동안 ABC에서 섹션을 배양합니다.
    8. 1 x PBS의 2 mL에서 각 5 분 동안 3 회 세척하십시오. H2O2 (DAB에서 30 % H2O 2의 1 : 500 희석)를 포함하는 여과 된 DAB (2 mL / well / 섹션)에서 배양 단면은 색상이 적절하게 발전 할 때까지 (~ 3-8 분).
    9. 1x PBS의 2 mL에서 각각 5 분 동안 3 x 섹션을 세척하십시오. 신호(선택 사항)를 향상시키기 위해 0.04% OsO 4(~30s)를 사용하여 osmicate합니다.
    10. 1x PBS에서 각각 5분 동안 3회 세척합니다. 개별적으로, 6 웰 플레이트에서 1x PBS로 가득 찬 작은 용기로 각 섹션을 옮기고 가능한 한 평평한 유리 슬라이드에 조직 섹션을 배치합니다.
    11. 조직 섹션이 가능한 한 평평하도록 하면서 PBS에서 슬라이드를 부드럽게 들어 올립니다. 두 개의 페인트 브러시를 사용하여 부드럽게 평평하게 하고 슬라이드에서 티슈를 펴고 종이 타월로 여분의 물을 두드려 냅니다. 글리세롤 (또는 동등한 장착 매체)로 티슈 섹션을 장착하고 뚜껑슬립을 명확한 매니큐어로 밀봉하십시오.

4. 파라핀 내장 반구형 섹션 : DAB 염색

  1. 파라핀을 60°C 오븐에서 5-10분 동안 녹입니다.
  2. 자일렌 3x를 각각 5분 동안 배양하여 절충면을 탈파라핀화합니다.
  3. 등급이 매겨진 에탄올에서 조직을 100%(각각 5분마다 2회), 95%(5분마다 2회), 70%(5분마다 2회), 50%(각각 5분마다 1회) 재수화합니다. PBS의 슬라이드를 덮습니다.
  4. 항원 10 mM 구연산 완충제 (pH 6.0)의 비커에서 슬라이드를 마이크로 웨이브하여 검색합니다.
  5. 1x PBS(각 5분당 3x)로 슬라이드를 실온으로 식힌 후 세척합니다. 3% H2O 2/1% 트리톤-X 100/PBS에서 조직을 30분 동안 배양하여 내인성 과산화증을 차단합니다.
  6. 1x PBS로 티슈를 각각 5분동안 3회 세척합니다. 1 시간 동안 PBS에서 6 % 정상 염소 혈청으로 조직을 차단하십시오.
  7. 1 차 항체의 섹션 (재료 참조)을 상온 (RT)에서 하룻밤 (최대 20 시간)에서 PBS로 배양합니다.
  8. 1x PBS에서 각각 5분 동안 3x세척합니다. 그런 다음 RT에서 1 시간 동안 PBS에서 해당 이차 항체 (재료 참조)에서 섹션을 배양합니다.
  9. 배양 시 다음 세척 단계 전에 약 45분 전에 ABC 용액을 준비합니다.
  10. 1x PBS에서 각각 5분 동안 3x 섹션을 세척한 다음 RT에서 1시간 동안 ABC에서 배양합니다.
  11. 1x PBS에서 각각 5분 동안 섹션 3을 세척합니다.
  12. H2O2(DAB에서 30% H2 O2의 1:500 희석)를 함유하는 DAB(0.45μm 필터 기공 크기)에서 배양단을 적절히 발전시킬 때까지(~3-8분).
  13. 1x PBS로 섹션(3x 5분)을 세척합니다. 신호를 향상시키기 위해 0.04 % 오스뮴 테트 옥사이드 (OsO4; 약 30 s)를 사용하여 osmicate.
  14. 1x PBS로 세척 섹션(3x 5분).
  15. 에탄올 50% (1x 5 분), 70 % (1 x 5 분), 95 % (2 x 5 분), 100 % (2 x 5 분), 100 % 자일렌 (1x 5 분)의 등급이 매겨진 시리즈에서 조직을 탈수. 자일렌이 증발하도록 허용합니다.
  16. 톨루엔 기반의 급속 건식 마운팅 매체로 섹션을 장착합니다. 산화제를 함유한 제제는 얼룩 표백을 방지하는 것이 좋습니다. 후속 보관을 위해 면도기로 슬라이드 가장자리에서 과도한 장착 매체를 제거합니다.

5. MRI/병리학 상관 관계

참고: 병리학과 MRI의 상관 관계를 위해, 우리는 먼저 슬라이스 슬롯을 나타내는 MRI 가시 마커와 조정 가능한 상자에 긴 고정 그대로 뇌 반구 (단계 2.9 위의 단계)의 ex vivo MRI를 수행합니다. 그런 다음 뇌를 슬라이스하고 1cm 슬라이스를 촬영하여 개별 뇌 조각에 대한 situ MRI의 공동 등록을 가능하게합니다. 그런 다음 MRI 유도 분석을 수행할 수 있으며, 관심 영역(ROI)이 MRI에서 조직 분석을 직접 식별합니다. 우리는 또한 조직 병리학 유도 분석을 수행할 수 있습니다., 어디 ROI 조직 (예를 들어, 백색 물질 병 변, 탈수 초 없이 백색 물질 등)에 다음 공동 지역화 된 MRI 측정을 특징으로(표1).

  1. MRI 기반 ROI 식별
    참고 :
    이전 연구에서, 우리는 백색 물질11,12,13,14,15 회색 물질16,17에서 ROI를 확인했습니다. 18. 아래의 예는 백색 물질 분석을 위한 것입니다.
    1. 세그먼트 T2 초강렬한 병변에 (단계 1.1에서) 처음에 자동 알고리즘에 의해 처리되고, 그 후 숙련된 사용자에 의해 수동으로 정정됩니다.
    2. T2 병변 내의 세그먼트 T1 저강렬한 병변은 주변 정상 나타나는 뇌 조직의 신호 강도의 80% 이하 또는 동일한 신호 강도를 가진 복셀로 나타난다.
    3. 80% 임계값을 가진 자화 전달 비율(MTR) 맵에서 저강도 영역을 분할합니다.
    4. 위의 세분화를 사용하여 세 가지 분류를 만듭니다: (a) T2 가중/FLAIR 스캔에 비정상이지만 T1 가중 또는 MTR 스캔에서 정상인 T2-전용 병변, (b) 모든 T2 가중치/FLAIR, T1 가중치 및 MTR 스캔에 비정상인 T2T1MTR 병변; (c) 모든 T2 가중치/FLAIR, T1 가중치 및 MTR 스캔에서 정상인 정상 나타나는 백색 물질(NAWM)입니다.
      참고: 당사의 슬라이스 선택은 동일한 슬라이스에 있는 세 가지 관심 지역 유형(T2 전용, T2T1MTR 및 NAWM)의 존재를 기반으로 합니다.
    5. 각 ROI에 대한 정규화된 강도를 계산하여 서로 다른 뇌와 다른 뇌 위치에서 발생하는 변동성을 최소화합니다.
  2. 뇌 슬라이스에 대한 시투 MRI의 공동 등록
    1. MRI에 민감한 마커의 네 행이 뇌를 슬라이스하기 위해 칼을 삽입 할 수있는 슬롯을 지역화 사용자 정의 슬라이스 상자에 고정 뇌 반구를 스캔합니다. 고정 된 뇌와 모든 마커를 덮는 1mm 등방성 해상도로 T1 가중치 3D MPRAGE 수집을 수행합니다.
      참고: 이것은 사후 고정 MRI에게 불리고 두뇌 조각에 있는 situ MRI의 공동 등록을 위한 중간 단계로만 이용됩니다.
    2. 스캔 직후, 1cm 떨어진 슬롯에서 뇌 반구를 슬라이스하여 약 15개의 슬라이스를 생성합니다.
    3. 전방과 후방 양쪽모두에서 뇌 슬라이스를 촬영합니다.
    4. 다음 단계로 뇌 슬라이스의 시투 MRI 및 사진을 공동 등록합니다.
      1. 사후 고정 및 시투 MPRAGE의 세분화의 경우, 강도 비 균일성에 대한 사후 고정 및 시투 MPRAGE MRI 를 모두 사전 처리합니다19.
        1. 사전 처리 된 후 고정 MPRAGE에서 뇌와 마커의 네 행을 분할합니다.
        2. 사후 고정 MRI(20)에해당하는 반구를 분할하여,21을 미리 처리된 곳에서 MPRAGE로 분류한다.
      2. FSL FLIRT22를사용하여 최대 12도자유도(affine registration)의 선형 등록 프로세스를 통해 일련의 선형 등록 프로세스를 통해 현면 및 사후 고정 MRI에서 추출된 뇌를 공동 등록합니다. 크기 조정 및 전단 구성 요소는 고정 수축의 영향을 고려합니다.
      3. 분할된 마커를 사용하여 최대 투영 강도의 합을 최소화하여 슬라이싱 평면의 법선 방향을 찾습니다. 이러한 재방향 각도는 이전 단계에서 얻은 변환 행렬에 통합됩니다.
      4. MRI 이미지를 사내 이미지 뷰어를 사용하여 고정 된 후방 뇌 조각의 사진과 시각적으로 일치하여 일반 벡터의 깊이와 방향을 변경할 수 있습니다. 뇌 슬라이스가 불완전하기 때문에 작은 수정이 필요합니다.
      5. 각 슬라이스에 대해 AFFINE 이미지 변환13을 적용하여 in situ MRI를 뇌 슬라이스의 사진과 동일한 슬라이스 위치로 변환합니다.

Representative Results

위에서 언급했듯이, 대뇌 반구의 거의 절반은 동결되어 DNA, RNA 또는 단백질을 사용하여 분자 연구에 사용할 수 있습니다. 역사적으로, 사후 뇌 조직을 이용한 연구는 전모 조건, 연령, 성별, 조직 pH, mRNA 무결성(RIN), 사후 경부(PMI), 진단 확실성, comorbidsubstance 사용 및 이전 약물 치료의 영향을 받는 것으로 나타났습니다. 상태23. 뇌 조직을 사용 하 여 연구에 따라, DNA와 단백질 RNA에 비해 더 적은 정도에 의해 영향을 나타납니다. 우리의 경험에 근거하여, RNA 격리 및 다운스트림 분석은, 그러나, 두뇌 조직의 pre-mortem 조건 및 사후 간격에 의해 가장 영향을 받는 것으로 나타났습니다. 그러므로 우리는 postmortem MS 조직을 사용하여 RNA 기지를 둔 분석을 수행하기 위해 따라야 할 조건의 몇몇을 토론합니다.

우리의 모든 연구에 대 한, 뇌부검에서 수집 된 후, 그것은 슬라이스 (1 cm 두께) 그리고 형태학 연구에 대 한 4% 파라 포름 알데히드에 고정 또는 생 화 확 적인 분석을 위해 신속 하 게 냉동. 모든 조직 블록은 전술한 바와 같이 PLP를 이용하여 면역염색에 의해 탈수분화하는 것을 특징으로 한다. 대표적인 분석 체계는 그림1에 나와 있습니다. 조직 절편은 백색 물질 병변의존재를 검사합니다 (도 1A). 선택된 영역은 면역 활성을 위해 염색된다(도1B)및 탈수분수화(도1C). 동결된 조직은 저온 극저온(도1D)에장착되고 냉동 30 μm 단면이 절단된다. 이것은 3-4 의 후속 단면도의 집합, 인접한 조직에서 분리, 및 DNA, RNA, 또는 단백질 격리를 위한 저장에 선행됩니다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 성공적으로 DNA24,25,RNA5,6,7,8,9 뿐만 아니라 단백질26을분리했습니다. MS 두뇌에서 RNA를 분석하는 연구 결과의 몇몇에서 중요한 사실 인정이 토론되는 동안, 여기 RNA postmortem MS 두뇌의 분석과 관련있는 문제점의 몇몇은입니다.

Figure 1
그림 1: mRNA 분석을 위한 샘플 수집. (A) 부검 조직이 분석을 위해 선택된다. 조직의 영역이 선택되고 조직의 일부가 절제됩니다. 모든 부위는 (B)MHC-II(주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 II HLA-DR CR3/43) 항체로 염색되어 염증 활성을 검출하고 (C) 프로테올리피드 단백질(PLP)을 사용하여 미엘린 상태를 결정한다. 미엘린 상태에 기초하여, 블록은 메스(D)에의해 득점된다. 단면(60 μm)은절단되고(E) 이전에 채점된 영역이 제거되고 튜브로 분리되고 라벨이 부착됩니다(F). PLP 및 MHC-II 얼룩은 조직의 적절한 수집을 보장하기 위해 매 5 섹션 마다 반복됩니다. 정상 나타나는 백색 물질 (NAWM)는 지적되고 백색 물질 병변 (WML)은 빨간색으로 윤곽이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

MS10의병변에축색 성 절제술 . 이 프로그램의 초기 과학적 초점은 탈수초 된 백색 물질 병변의 세포 성분의 특성화에 있었다. 국소화된 항원 중에는 비인산화 신경필라멘트(NFs)가 있었다. 대부분의 NF는 골수성 축색에 인산화되어 있습니다. 탈수화시, 축산은 탈환화된다. 우리는 탈수된 축색에서 비인산화 NFs의 예상된 발현을 검출했습니다. 급성 MS 병변에서, 이 탈수성 축색의 많은 것은 축색한 축색의근위 쪽 끝을 반영하는 축축한 환목 전구 (그림 2A)로 끝났습니다. 경시 된 축색은 인접한 정상 영역 10에 비해 급성 병변에서11,000 mm3을 초과합니다. 이 관측은 MS를 가진 개별에 있는 영원한 신경장애의 주요 원인으로 신경 변성을 특성화하는 쪽으로 필드를 이동한 MS 연구에 있는 패러다임 변화를 촉매하는 것을 도왔습니다.

Figure 2
그림 2: 염증성 탈수성 동안 축색 성 절제술. 축색성 절제술은 염증성 탈수성(A, 화살촉) 동안 발생하고 말단 축축한 난형 (A , 화살표)의 형성을 유도합니다. 정량화 (B) 때, transected 축색은 MS 병변에서 풍부하고 병변의 선동적인 활동과 상관관계가 있는 것처럼 보입니다. 패널 A는 트랩 등 에서 재현10 허가. 레드: 프로테올리피드 단백질, 녹색: 항인원성 신경필라멘트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

만성 MS 두뇌에 있는 remyelination3. REMYELINATION는 MS의 초기 단계에서 견고할 수 있습니다. 많은 만성 MS 병변은, 그러나, remyelinated 되지 않습니다. 우리는 oligodendrocyte 전구 세포의 존재 여부 (OPCs) 또는 새로운 oligodendrocytes의 생성은 만성 탈수성 백색 물질 병변의 remyelination를 제한합니다. OPC 밀도는 수시로 감소되는 동안, 그(것)들은 모든 만성탈수체병변3에서 존재했습니다. 새로 생성된 올리고엔드로시트는 또한 많은 만성 MS 병변에서 존재했다. Oligodendrocyte 프로세스와 관련되나, 탈수성 축삭을 근선화하지않았다(그림 3). 이 연구 결과는 OPC와 새로운 oligodendrocytes를 생성하는 그들의 기능이 만성 백색 물질 병변의 remyelination를 제한하지 않는다는 것을 표시합니다. 우리는 종종 영양 장애로 나타난 만성 탈수성 축삭이 새로 생산 된 올리고 엔드 로시테에 의해 remyelination에 수용되지 않았다는 것을 가설.

Figure 3
그림 3: 축삭과 관련된 사전 골수성 올리고드로시트의 공정. PLP 항체로 염색된 MS 병변의 공초점 현미경 사진(패널 A, B의빨간색) 및 신경필라멘트 항체(패널 A, B의 녹색)가 도시된다. 만성 MS 병변에서 심실 영역 (SVZ)에서 미리 myelinating oligodendrocyte (패널 A에서 빨간색) demyelined 축삭의 영역으로 확장 된 프로세스 (패널 A에서 녹색) 이러한 프로세스의 대부분은 (패널 A의 화살표) 더 높은 배율 (패널 B)에서 와 같이 축축주위에 나선형. 축척 막대는 20 μm (A) 및 5 μm (B)를 나타냅니다. 창 외 에서 복제3 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

MS6의미토콘드리아 기능 장애. 우리는 만성 MS 환자로부터 수득된 급속냉동 운동 피질에서 뉴런 유전자변화에 대한 편견 없는 검색을 수행하였다(그림 4A). 이 데이터 세트의 편견없는 검색은 MS에 있는 23개의 핵 부호화한 미토콘드리아 mRNAs에 있는 중요한 감소를 확인했습니다 (그림4B). 면역세포화학과 계종 혼성화를 이용한 자격 증명 연구는 이러한 유전자가 피질 투영 뉴런(그림4C)에서고도로 농축되었고 프로젝션 축세포로부터 분리된 미토콘드리아가 감소된 당해(glycolysis) 그림4D). 이 논문은 미토콘드리아 기능 장애에 초점을 촉매하고 MS의 축축한 변성에 주요 기여로 ATP 생산을 감소시켰습니다.

Figure 4
그림 4: MS 모터 피질에서 수행된 마이크로어레이 데이터 및 다운스트림 검증 기술. (a) 대조군(C1-C6) 및 SPMS(MS1-MS6) 모터 피질 샘플로부터 현저하게 변경된 전사체의 계층적 군집화는 질병 관련 유전자 발현 패턴을 별도로 지원한다. MS 모터 피질에서 감소된 전사체 중, 26개는 전자수송 사슬(B)에 속하였다. 미토콘드리아 복합체 I(NDUFA6) mRNA는 MS 모터 피질(CII)에서 뉴런(n=55-130)에서 감소하였고, 반면 PLP mRNA 밀도는 대조군(CIII)과 MS(CIV) 대뇌 피질 사이에서 유사하였다. 전자 수송 복합체 I 및 III의 활성은 MS 환자의 모터 피질로부터 미토콘드리아 농축 분획에서 감소하였다(n=3) (D). 허가하에 Dutta et al. 6에서 전재. 오류 막대는 SEM을 나타냅니다. CI-IV의 스케일 바는 25 μm. * p & 0.05 학생들의 t-test입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

MS 8에서 인지 기능장애의 병인. MS 환자의 40~60%는 인지 기능 저하와 집행 기능 저하를 가지고 있습니다. 우리는 MS에 있는 demyelination를 위한 일반적인 사이트로, 기억/학습의 기능적인 사이트인 해마를 확인했습니다. 우리는 다음에 myelinated 및 demyelinated 해마에 있는 신경 유전자 발현을 비교하고 기억/학습에 관련시킨 단백질을 인코딩하는 신경 mRNAs에 있는 중요한 감소를 찾아냈습니다. 우리는 선택 microRNAs가 탈수초해마에서 증가하고 이 microRNAs가 글루타메이트 수용체의 발현을 감소시킬 수 있다는 것을 입증해서 이 데이터를 확장했습니다. 우리는 설치류 모델에서 이러한 관찰을 재현하고 확장했습니다. 우리는 다음에 myelinated 및 demyelinated 해마에 있는 신경 유전자 발현을 비교하고 기억/학습에 관련시킨 신경 mRNA 인코딩 단백질에 있는 중요한 감소를 찾아냈습니다.

Figure 5
도 5: MS 해마에서 조직 수집, 조직학적 분석 및 유전자 발현 연구. 해마를 포함하는 뇌 조각은 부검(A) 동안 선택되고 해마 및 인접 부위는 추가 분석을 위해 제거(빨간 상자)된다. PLP에 대한 면역 염색은 모든 대조군(B)에서 미엘린의 보존을 나타내었으며 MS 해마(C)의 40%를 나타냈다. MS 해마(D)의 ~60%에서 광범위한 탈수구가 검출되었다. 대조군 해마(E, G, I)와 비교했을 때, HuR 면역조직화학에 의해 나타난 바와 같이, DEmyelinated MS 해마(F, H,J)의 CA1, CA3, 또는 CA4 영역에서 유의한 뉴런 손실이 검출되지 않았다. 미엘린(myelin basic protein(MBP), 그린 및 축세포(SMI32, 적색)에 대한 이중 표지면역형광은 대조군 해마에 비해 MS 탈수액이 있는 해마에서 축산(N)의 상대적 보존과 함께 미엘린(L)의 손실을 보였다( MBP, K; SMI32, M). mRNA 발현 수준의 이중 군집은 미엘린 상태(myelinated 및 탈수성) 및 위치(해마 대 모터 피질)(O)에 기초하여 개별 클러스터로 샘플을 배열하였다. 높은 mRNA 수준은 적색으로 표시되고 청색은 낮은 발현 수준을 나타낸다. 패널 C-O 는 허가와 함께 Dutta 등.8에서 적응. B-D: 2mm, E-J: 100 μm, K-N: 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

MRI 변경의 병리학적 상관 관계12. MRI는 MS 진단 및 치료에 대한 반응의 가치 지표이며 MS 질환 진행의 예측자이기도하지만 MRI 변화의 병리학적 상관 관계는 제대로 이해되지 않습니다. 우리의 사후 MRI 연구는 두 개의 MRI ROI에 초점을 맞추고있다. T1 저강도, T2 고강도 및 감소된 자화 전달 비(MTR)(T2T1MTR)의 조합을 가진 T2 하이퍼강렬한(T2 만) 및 ROI만이었던 대뇌 백색 물질 ROI. 대뇌 백색 물질 T2 전용 ROI의 약 45%가 골수염으로 비특이적 특성을 확인했습니다. 대조적으로, T2T1MTR ROI의 83%는 만성적으로 탈수되었고 블랙홀로 나타났습니다. T1 및 MTR 값은 반정량이며 T2T1MTR ROI에서 해당 값은 광범위하게 다릅니다. myelin의 손실이 이 MRI 변경에 유일한 기여자인 경우에, 그 때 값은 일정해야 합니다. 부어 있는 탈미엘린 축산은 T1 및 MTR 값모두와 상관관계가 있다.

Figure 6
그림 6: 자화 전달 비(MTR) 및 T1 명암비는 만성 MS 병변에서 Na+/K+ ATPase 양성 축의 백분율과 선형적으로 상관관계가 있습니다. Na+/K+ ATPase (녹색)에 대해 염색 된 만성 탈수레화 병변은 신경 필라멘트 (빨간색)에서 거의 100 % (A) ~ 0 (B)까지 다양했다. Na+/K+ ATPase가없는 많은 축사 직경 (B)이 증가했습니다. 만성-탈수초 된 MS 병변에서 Na+/ K+ ATPase 양성 축색의 백분율의 비교는 정량적 사후 MTR (p < 0.0001, C)및 T1 명암비 (p < 0.0006, D)와 상관 관계가 있습니다. 각 데이터 포인트는 단일 병변에서 이며 각각의 독특한 색상 기호 조합은 연구 된 뇌 중 하나를 나타냅니다. 스케일 바 = 5 μm. 영 외12에서 재현 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

퇴화와 무관한 신경변성11. 역사적으로, MS에 있는 신경 변성은 탈수성에서 유래하기 위하여 생각되었습니다. 그러나 뇌 영상 연구는 신경 변성과 탈수성등이 독립적인 사건일 수 있다는 가능성을 제기했습니다. 우리는 최근에 척수와 대뇌 피질의 탈수초가 있는 MS 환자의 소집단을 확인했습니다, 그러나 대뇌 백색 물질의. 우리는 mylocortical MS (MCMS)로 이 MS 특수형을 주조했습니다. MCMS 케이스는 대뇌 백색 물질 demyelination와 피질 신경 손실 사이 관계를 조사하는 플랫폼을 제공했습니다. 대조군 코르티칼에 비해, 피질 신경 손실은 전형적인 MS 코르티코에서 보다 MCMS cortices에서 상당히 컸다. 제어 뇌 조직은 클리블랜드 클리닉의 병리학 부에서 얻어졌습니다. 이 연구는 탈수초가없는 신경 변성을위한 첫 번째 병리학 적 증거를 제공합니다.

Figure 7
그림 7: 대뇌 백색 물질 탈수의 부재에서 신경 손실. 크레실 바이올렛-스테인드 코로나 반구형 절편은 전형적인 MS(A)를 갖는 것으로 분류된 개별로부터. 뉴런 밀도는 5개의 표지된 영역 각각에서 피질 층 III, V 및 VI에서 비교되었다. 60 μm 2(노란색)를 초과하는 영역을 가진 뉴런은 우수한 측두피질(B)으로부터대표적인 이미지로 도시된다. PLP및 탈수체병변의 분포(백색물질 탈수초화는 파란색으로 강조표시되고, 아편분수초는 분홍색으로 강조표시) 전형적인 MS(C) 및 골수피질 MS(D)를 가진 개인의 반구형 절편에서 )가 표시됩니다. 감소된 피질 신경 밀도 와 증가된 대뇌 백질 병변 부피 사이의 유의한 상관관계는 전형적인 MS에서 발견되었지만, 골수피질 MS(E)에서는 발견되지 않았다; 파선은 95% 신뢰 구간(CI)을 나타냅니다. IFG = 열등한 정면 자이러스. STG = 우수한 측두계 자이러스. INi = 열등한 인슐라. IN = 우수한 인슐라. CG = 자이러스를 cingulate. 트랩 등 에서 복제11 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

시퀀스 지속 시간 시퀀스 설명 시퀀스 사용
0:09 지역화 담당자 후속 시퀀스에 대한 지역화
9시 14분 3D 자화 준비 빠른 그라데이션 에코 (MPRAGE) 뇌 구조의 구조적 이미징 체적 추정
5시 14분 3D 유체 감쇠 반전 복구(FLAIR) 병변 식별 병변 세분화 체적 병변 병변 평가
2시 35분 2D T2 가중치 병변 식별 병변 세분화 체적 병변 병변 평가
5시 12분 자화 전달 프리 펄스를 이용한 3D 그라데이션 리콜 에코( MT-ON) 정상 출현 및 레시오날 조직에서 미엘린 함량의 의도적인 측정
5시 12분 자화 전달 프리 펄스가 없는 3D 그라데이션 리콜 에코( MT-OFF)
0:27 확산 텐서 이미징(DTI) 필드 매핑 뇌 조직의 무결성을 반영하는 것으로 생각 뇌 조직의 물 확산의 측정.
10시 27분 확산 텐서 이미징(DTI) 멀티 쉘
1:18 확산 텐서 이미징(DTI) 멀티 쉘
39:48:00 소계: 코어

표 1: 사후 이미징 프로토콜.

Discussion

우리는 MS를 가진 150명의 개별에게서 조직을 급속하게 조달하고 가공하기 위하여 이용된 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜의 중요한 특징은 조직을 활용하는 과학자도 프로토콜을 확립하고 조직 수집을 수행하는 것을 담당한다는 것입니다. 이것은 개별 연구 프로젝트의 과학적 요구를 충족시키는 유연성을 제공합니다. 이 프로토콜의 여러 측면은 유틸리티를 향상시킵니다. 환자는 일반적으로 그들의 많은 우리의 센터에 신경학자에 의해 선행되었기 때문에, 죽음의 앞에 잘 특성화됩니다. 중요한 단계는 다른 두뇌 은행에 비해 냉동 조직의 질을 증가 죽음 직후 조직 기증의 처리입니다. 이것은 조직학 및 면역 세포화학적 관측의 입증을 위해 필수적인 전사 및 번역 유전자 제품에 있는 변경을 기술하기에 있는 중대한 가치인 분자 연구 결과를 가능하게 합니다. 여러 사례에 걸쳐 형태학적/면역세포화학적 및 분자 데이터를 활용하면 결론의 신뢰성이 향상됩니다. 이것은 가장 대뇌 피질과 탈수근 해마의 신경 유전자 변화에 미토콘드리아 유전자 변화의 우리의 설명에 의해 설명된다. 새로운 유전자 프로파일링 프로토콜은 빠른 속도로 개발되고 있으며 우리 은행의 냉동 조직은 조직 및 단일 세포 분석을 위한 고품질 RNA를 제공해야 합니다.

우리의 프로토콜의 또 다른 가치있는 측면은 짧은 고정 뇌 조각입니다. 이 조직은 30 μm 두께의 자유 부동 섹션으로 절단됩니다. 이 단면도는 공초점 현미경 검사법을 사용하여 3차원으로 2개 이상의 항원을 분석하기 위해 이상적입니다. 좋은 예로는 만성 MS 병변의 영양 실조 축삭과 사전 골수성 올리고드로시트 프로세스의 상호 작용뿐만 아니라 transected 축삭 수축 전구에 대한 단일 축삭 연결의 식별이 포함됩니다. 이는 3D 이미지가 실현 불가능한 7μm 두께의 파라핀 섹션을 일상적으로 사용하는 것과는 대조적입니다. 파라핀 내장 된 조직은 몇 가지 질문, 특히 반구형 7 μm 두께의 섹션에서 신경 밀도의 정량화에 큰 가치를 가지고 있습니다. 따라서 당사의 조직 처리 프로토콜은 다양하며 고정 및 급속 냉동 조직을 보장할 수 있는 유연성을 제공합니다.

우리의 프로토콜의 또 다른 독특한 특징은 situ 뇌 MRI의 사후 분석입니다. 뇌 MRI는 MS 질병의 대체 할 수없는 바이오 마커입니다. 따라서 비정상적인 MRI 신호의 병리학적 상관 관계를 확립하는 것이 필수적입니다. 우리의 연구는 T2 만 T2와 T2T1MTR ROI가 수시로 myelinated 된다는 것을 것을을 확립했습니다. 이 발견은 myelinated와 탈수초 된 대뇌 백색 물질을 안정적으로 구별하는 보다 구체적인 이미징 양식의 필요성을 뒷받침합니다. MRI는 myelin의 검출을 위해 과민한 것처럼 보이지만, 우리의 연구 결과는 T1/T2/MTR의 조합조차 균수레를 확인하기 위한 특정이 아니라는 것을 보여줍니다. 우리의 사후 프로토콜은 myelinated 및 demyelinated 대뇌 백색 물질을 구별하는 새로운 화상 진찰 양식의 기능을 시험하기위한 이상적인 플랫폼을 제공합니다. MRI는 또한 우리의 번역 연구에서 MRI의 사용과 살아있는 환자에서 의 광범위한 임상 사용을 감안할 때, 임상 연습으로 기초 과학 결과의 번역을위한 이상적인 차량을 제공합니다.

단가 및 긴 고정 및 냉동 슬라이스를 절단하는 동안 다른 연구에 대한 여러 모드에서 조직을 처리하는 이점을 제공하지만,이 방법에는 몇 가지 제한사항이 있습니다. 구조의 전체를 평가하는 것은 인접 한 슬라이스에 다르게 처리 될 수 있기 때문에 제한 될 수 있습니다. 조직 은행의 큰 볼륨, 그러나, 샘플링을 개선하기 위해 여러 과목에 관심의 구조를 조사 할 수있는 능력을 제공합니다. 사후 조직을 활용하는 연구에 대한 또 다른 일반적인 제한은 단면이라는 것입니다. 변경 의 시기와 진행에 관한 결론은 이 맥락에서 해석되어야 합니다. MS를 가진 모든 환자에게 데이터의 일반화를 제한할 수 있는 그들의 조직을 기증하는 환자에게 선택 편향이 있을지도 모릅니다. 대부분의 기증자는 향상된 MS의 합병증때문에 정지하기 때문에, MS의 초기 단계에 있는 사람들에 이 환자에게서 사실 인정을 추정하는 것은 적절하지 않을 지도 모릅니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 비 MS 관련 조건 (즉, 급성 심근 경색, 약물 과다 복용, 자살)에서 사망 한 젊은 환자로부터 조직을 받았습니다. 우리의 프로토콜의 범위는 MS에 연루 된 다른 장기 (예를 들어, 위장 및 골수)의 샘플링을 포함하지 않습니다. 우리는 프로그램의 강점이 그 한계보다 훨씬 중요하다고 믿습니다.

Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

저자는 또한 크리스토퍼 넬슨 박사에게 편집의 도움을 주셔서 감사드립니다. 부검 프로그램은 BDT에 R35 교부금 NS097303에 의해 부분적으로 지원됩니다. RD의 실험실에서 일은 NINDS (NS096148)와 미국 국립 다발성 경화증 학회 (RG 5298)의 보조금에 의해 지원됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Biotinylated goat anti-mouse IgG Vector Laboratories BA-9200 1:500 dilution for hemispheric; 1:1,000 for 30µm free-floating.
RRID: AB_2336171
Biotinylated goat anti-rabbit IgG Vector Laboratories BA-1000 1:500 dilution.
Biotinylated goat anti-rat IgG Vector Laboratories BA-9400 1:500 dilution for hemispheric; 1:1,000 for 30µm free-floating.
RRID: AB_2336208
Glial fibrillary acid protein (GFAP) Dako Z0334 1:700 dilution for hemispheric.
RRID: AB_10013382
HuR, mouse IgG, 3A2 clone Santa Cruz SC-5261 1:500 for 30µm free floating.
RRID: AB_627770
Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43 Dako Mo746 1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30 µm free floating.
RRID: AB_2313661
Non-phosphorylated neurofilament (SMI32) Biolegend 801701 1:5,000 dilution for hemispheric; 1:2,500 for 30 µm free-floating.
RRID: AB_2564642
Phosphorylated neurofilament (SMI31) Biolegend 801601 1:5,000 dilution for hemispheric; 1:2,500 for 30 µm free-floating.
RRID: AB_2564641
Proteolipid protein (PLP) Gift from Wendy Macklin 1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available.
Reagents
125 mm filter paper Whatman 1452-125 For filtering PFA.
50% Glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320 Electron microscopy grade.
Cytoseal ThermoScientific 8310-16
Ethylene glycol Fisher Chemical BP230-4
Glycerol Sigma-Aldrich G7893 400 mL/2 L Cryoprotection solution.
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized Millipore-Sigma SLHV033RB
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 19200 Prills form.
Polyvinylpyrolidone (PVP-40) Fisher Chemical BP220-212
Sodium azide Fisher Chemical S227I 2 g/2 L Sorenson's buffer.
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S0876 98.8 g/2 L Sorenson's buffer.
Sodium phosphate mono basic monohydrate Sigma-Aldrich S9638 14.352 g/2 L Sorenson's buffer.
Sucrose Sigma-Aldrich PVP40-500G
VectaStain ABC Kit Vector Laboratories PK-6100 1:1,000 dilution of A and B.
RRID: AB_2336819
Waterproof drawing black ink Higgins 44201
Xylene Fisher Chemical X3S Histological grade.
Equipment
3T MRI Magnetom Prisma Siemens Healthineers
7T MRI Agilent 830AS Siemens Healthineers

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References

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