Multipl skleroz bireyler için kapsamlı otopsi programı

* These authors contributed equally
Neuroscience
 

Summary

Multipl skleroz tedavisi olmayan inflamatuar demyelleştirilme bir hastalıktır. Beyin dokusunun analizi, hastalığın patogenezini anlamak için önemli ipuçları sağlar. Burada Cleveland Clinic operasyonunda benzersiz bir hızlı otopsi programı ile toplanan MS beyin dokusu metodolojisi ve aşağı analiz tartışmak.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Dutta, R., Mahajan, K. R., Nakamura, K., Ontaneda, D., Chen, J., Volsko, C., Dudman, J., Christie, E., Dunham, J., Fox, R. J., Trapp, B. D. Comprehensive Autopsy Program for Individuals with Multiple Sclerosis. J. Vis. Exp. (149), e59511, doi:10.3791/59511 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Biz multipl skleroz ile bireyler için hızlı bir doku bağış programı açıklamak (MS) bilim adamları ve teknisyenler On-Call 24/7 olmak gerektirir, 365 gün bir yıl. Katılımcılar beyin ve omuriliği bağışlamayı onaylıyor. Çoğu hastada Bayan tedavi ve araştırma için Cleveland Clinic Mellen merkezi 'nde nörolog izledi. Klinik kursları ve nörolojik özürlü iyi karakterize edilmiştir. Ölümden kısa bir süre sonra, vücut, beynin situ içinde 3 T manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ile taranabileceği MS Imaging Center 'a taşınır. Vücut sonra otopsi odasına aktarılır, beyin ve omurilik kaldırılır nerede. Beyin iki yarımküreler ayrılmıştır. Bir yarımküre hemen Dilimleme kutusuna yerleştirilir ve alternatif 1 cm kalınlığında dilimler ya iki gün için% 4 civarında formaldehite sabit veya hızla kuru buz ve 2-metilbutan dondurulmuş. Kısa sabit Beyin dilimleri, bir ağoprezervasyon çözümünde saklanır ve hassas antijenlerin histolojik analizleri ve immünositozokimyasal olarak algılanması için kullanılır. Frozen dilimleri-80 °C ' de saklanır ve moleküler, immünosittokimyasal ve in situ hybridization/RNA kapsam çalışmalarında kullanılır. Diğer Yarımküre birkaç ay boyunca% 4 civarında formaldehite yerleştirilir, Dilimleme kutusuna yerleştirilen, 3 T manyetik rezonans (Mr) tarayıcı yeniden taranan ve santimetrelik kalın dilimleri içine dilimlenmiş. Postmortem In situ MR görüntüleri (MRIs) MRI-patoloji korelasyonlar kolaylaştırmak için 1 cm-kalın Beyin dilimleri ile ortak kayıtlı. Tüm Beyin dilimleri fotoğraflanmış ve beyin beyaz madde lezyonları tanımlanır. Omurilik 2 cm segmentlerinde kesilir. Alternatif segmentler% 4 civarında formaldehite veya hızla donmuş olarak sabitlenir. Postmortem MS dokularının hızlı tedariki, MS beyin ve spinal tellerin patolojik ve moleküler analizlerini ve beyin MRG anomalilerinin patolojik korelasyonlarını sağlar. Bu hızla işlenmiş postmortem dokularının kalitesi (genellikle 6 ölüm h içinde) MS araştırma için büyük değer ve birçok yüksek etkili keşifler sonuçlandı.

Introduction

Bir hastalığı incelemek için en iyi yollarından biri hastalıklı doku kendisini incelemek için. Bu, merkezi sinir sistemi (CNS) hastalıkları çalışma olanlar için zorluklar sunar. Hastalıklı beyin ve Omurilik biyopsisi son derece nadirdir ve genellikle atipik vakalar içerir. CNS hastalıkları olan bireyler için otopsi oranları son yıllarda dramatik bir şekilde azaldı, ve yapıldığında, genellikle dokuların hızlı tedarik sağlamaz. Bu zorluklar, multipl skleroz (MS) olan bireylerden doku toplama üzerine odaklanan birkaç dahil olmak üzere hastalık merkezli beyin bankalarının kurulması ile sonuçlandı. MS, miyelin, oligodendrosit (miyelin şekillendirme hücreleri), nöronlar ve akonlar yok eden CNS bir inflamatuar-aracılı hastalıktır. MS hastalarının çoğunluğu, sonunda doğal olarak nörodejeneratif olan bir kademeli-Progressive hastalığa dönüşen değişken iyileşme ile nörolojik özürlülük nöbetleri ile başlayan bir iki-fazik hastalık kursuna sahiptir1. Bağışlanan MS beyinleri çoğunluğu için, ölüm ve doku işleme arasında postmortem aralıkları (PMı) 24 h aşıyor. Bu dokularda MS beynin patolojik değişiklikleriyle ilgili değerli bilgiler sağlanırken, hastalık patofizyolojisine güçlü Öngörüler sağlayan daha gelişmiş moleküler çalışmalar için uygun değildir. Bu özellikle gen profilleme çalışmaları için durum, hangi sağlam RNA gerektirir.

Yukarıda tartışılan sınırlamaları aşmak için, MRG/patolojik korelasyonlar sağlayan hızlı bir doku bağış programı geliştirdik. Bu protokol modern Moleküler çalışmalar için uygun iyi korunmuş dokular sağlar ve MS beynin beyin patolojisinin ve MRG anomalilerinin doğrudan karşılaştırılması sağlar. Cleveland Clinic multipl skleroz doku bağış programı 20 yılı aşkın süredir varlığını ele aldı. Bu hızlı doku bağış programı, MS ve diğer ilişkili otoimmün nörolojik koşullar ile bireylerden beyin ve spinal kabloları sağlar. Program, ölüm 6 h içinde situ MRI elde etmeyi amaçlamaktadır, doku işleme için beyin ve omurilik kaldırılması takip.

Işe alım
Bağışlar, doğrudan hastalarımdan (önceden kabul edilen) veya ölümden sonra akrabalarından elde edilen ante-mortem onayı yoluyla elde edilir. Önceden onaylı hastalar genellikle Cleveland, Ohio multipl skleroz tedavi ve araştırma Mellen merkezi 'nde klinik nüfus tanımlanır. Uzunlamasına araştırma çalışmalarında takip edilen hastalara hızlı doku bağış programında işe alma tercihi verilse de, merkezde görülen tüm hastalara açıktır. Ölüm öncesinde kayıt katılımcılar aile üyeleri veya bakım sağlayıcıları için araştırma ekibi, ya ölüm sırasında ya da ölüm yakın olduğu düşünülmektedir zaman iletişim için talimatlar verilir. Bireylerin doku bağış programına girmek için ikinci yöntem akrabası tarafından onay yoluyla ölüm zamanında. Ohio Devlet ölümlerin bir federasyona görevlendirilir gerektirir organ alımı organizasyon LifeBanc adlı, hangi faaliyet 20 Kuzeydoğu Ohio ilçeleri. LifeBanc, organ bağış için bir dışlama olan MS tanısı için tüm ölümler ekranlar. Düzenlemeleri LifeBanc MS doku bağış programı Bayan bir ilişkili tanı ile tüm ölümler için dedektifler bildirmek için yapılan bir 75-mil yarıçapı Cleveland Clinic içinde ortaya çıkan. Sonraki akrabaları ve hastane personeli daha sonra doku bağış programı personeli ile temas ve onay beyin ve omurilik dokularının bağış için elde edilir. İstihdam Ante bu iki yöntem-mortem ve post-mortem LifeBanc yoluyla yılda yaklaşık 10-12 beyin bağış sonucu. Ayarları lifebanc gelen tavsiyeleri sayısını yönetmek için ölüm üst yaş sınırına yapılır.

Bağış temini
Program, doku temini için doku Bağış programının üyeleri tarafından yılda 365 gün 24 saat kapsama alanı gerektirir. Merkezi bir doku bağış bildirim e-postası/çağrı cihazı/mobil cihaz metin bildirim sistemi doku bağışları kapsayan klinik takım tarafından kullanılır. LifeBanc, doku bağış programı için çağrı yapan personele başvuracak sayılar sağlamaktadır. Üyeleri hastane sağlayıcıları tarafından ölüm bildirilir/akrabası (ön-RIZALI) veya LifeBanc ve diğer yönlendirme kaynakları tarafından. İlk olarak, ölüm zamanı ve doku bağış fizibilite belirlenmesi yapılır. Ölümler daha sonra potansiyel olarak düşük kaliteli doku neden koşullar için ekran, uzun süreli ön mortem hipoksi dahil, büyük yıkıcı beyin dokusu (örn., büyük intrakranial kanama, geniş bi-hemherik vuruş, geniş tümör Yük), uzun süreli ventilatör desteği (> 3 gün) ve ölümden önce vazoaktif ajanların (> 3 gün) uzun süreli kullanımı. Bir tıbbi tetkikçi bir ölüme dahil olduğunda, çalışma nörolog tıbbi tetkikçi sorumluluğunu ödün vermeden zamanında dokulara almak için bir yol keşfetmek için tıbbi muayene ile konuşabilir. Eğer uygun doku mevcut hissedilecektir, o zaman yazılı onay elde edilir (önceden mortem elde değilse) ve preparatlar vücut taşıma için yapılır. Daha önce sözleşmeli bir entedent ulaşım hizmeti daha sonra Cleveland Clinic MRI tesislerinden ulaşım için temasa geçti. Vücudun oda sıcaklığında kalması ve soğutmaya yerleştirilmemiş olması, düşük vücut sıcaklıklarının MRG sinyal özellikteki değişikliklerle ilişkilendirildiğinden emin olmak için bakım alınır.

Klinik Tarih
Klinik Tarih, MS tanısı, semptomların başlangıcı, kullanılan tedaviler, klinik ve para-Klinik testlerin sonuçları (uyarılmış potansiyeller, beyin omurilik sıvıları sonuçları, optik kostence tomografi), multipl skleroz fonksiyonel kompozit ve genişletilmiş özürlülük durum ölçeği (EDSS; gerçek veya tahmini), hangi tıbbi kayıt (mevcut) toplanan ve akrabası sonraki doğrudan röportaj. Önceden mortem MRI da toplanır.

Protocol

Bu protokol Cleveland Clinic kurumsal Inceleme Kurulu tarafından onaylandı ve Cleveland Clinic insan Araştırmaları Etik Komitesinin kurallarını takip ediyor.

1. situ MRI içinde

  1. Donör vücudu MRG süitine götürün ve MS Imaging Facility 'de 2 h MRG görüntüleme Protokolü gerçekleştirin. 3 T veya 7 T görüntüleştirici üzerinde MRI gerçekleştirin.
    Not: Eski verilerin çoğunluğu 3 T 'de gerçekleştirildiği için 3T 'ye öncelik verilir, ancak mevcut olmadığında görüntüleme 7T ile gerçekleştirilir. Belirtilen temel dizileri tüm durumlarda (Tablo 1) ve geçerli araştırma çıkarları üzerinde bağlı ek dizileri gerçekleştirilir zaman izin verirse gerçekleştirilir (daha az doku fiks elde ederek kısıtlı 12 ölüm sonra h). Tablo 1 çekirdek sıraları açıklar.

2. otopsi

Not: In situ MRG takipte, vücut beyin ve omurilik ekstraksiyonu için morga laboratuvar üyeleri tarafından bir Diener ve doku işleme tarafından taşınır.

  1. Morgda ceset gelmeden önce aşağıdaki adımları gerçekleştirin. İki saat önce, doku depolama için 3 L% 4 civarında formaldehite (PFA) ve etiket konteynerleri ve çantalar hazırlayın. Hazırlamak 3 L 8% PFA ve seyreltik 1,5 L% 8 PFA için 4% PFA. 2. gün için kalan% 8 PFA 'yı 4 °C ' de yerleştirin.
  2. Morgda seyahat etmeden önce, 2 adet seyahat soğutucular, Kuru buz (uygun ve küçük Pellet için kırık büyük bloklar) ile% 50 kapasiteli doldurun.
  3. Morgda, 2-metilbutan ve kuru buzla yarım paslanmaz çelik konteynırı doldurun ve dokuyu dondurmak için hazırlanırken bir kapak ile kapak yapın.
  4. Tartmak ve bir kez Diener tarafından kaldırıldı beyin fotoğraf.
  5. PFA ile dolu bir kap içinde herhangi bir bağlı dura yerleştirin.
  6. Serebellum ve beyinli Serebrum ayırın ve Serebrum fotoğraf.
  7. Optik sinirler, chiasm ve yolları tanımlamak ve bir prob ve cımbız kullanarak ayrı. Yapıyı bir neşter ile yeniden RESECT.
    Not: Optik sinirin bir tarafındaki distal segment kimlik için Higgins mürekkep kullanılarak işaretlenir.
  8. Serebral hemisferleri uzunlamasına ayırın ve her Yarımküre bireysel olarak fotoğraf çekin.
  9. Mürekkep birincil motor korteks (PMC) sol Yarımküre için, yeniden fotoğraf, ve uzun sabitleme için bir 3,3 L kap içine yerleştirin. Beyin fikreme için başlangıç saatini belgeleyin.
  10. Sağ Yarımküre için PMC Mürekkeplenmiş veya eksiz olabilir.
    1. Eğer eksiz, önce kaplama meningler çıkarın.
    2. Reked veya eksiz PMC yeniden fotoğraf.
    3. PMC eksiz ise, 6 eşit boyutlu bölümlere ayrılır.
    4. Mürekkep her bölümün rostral yönü.
    5. Kısa sabitleme için PFA dolgulu kapsayıcılara tek numaralı bölümler yerleştirin.
    6. Daha soğuk #1 içine mühürlü dondurucu torbalarda hatta numaralı bölümler ve yer Snap-Freeze.
  11. 1 cm-kalın koronal bölümlere posterior Sağ Yarımküre anterior keser.
    1. Brüt anormallikleri belgeleyin (örn. kesme artifakı, kanama ve lezyonlar).
    2. Kısa sabitleme için PFA ile doldurulmuş kapsayıcılara tek numaralı bölümler yerleştirin.
    3. Hatta numaralı bölümler ve kapalı dondurucu torbalarda yer Snap-Freeze.
    4. Beyin sabitleme süresi belge sonu.
  12. Beyin sapını beyinden ayırın ve kısa sabitleme için PFA dolgulu bir kabın içine koyun.
    1. Uzunlamasına ayrı serebellar hemerler.
    2. Her Yarımküre 4 eşit kalın sagittal bölümlere kesin.
    3. Fotoğraf medial ve lateral görünümler.
    4. Sol serebellar hemherik dilimleri kısa sabitleme için PFA ile dolu bir kap içine yerleştirin.
    5. Yapış-Freeze sağ serebellar hemherik dilimleri ve soğutucu #1 içine mühürlü dondurucu torbalarda yer.
  13. Omurilik Diener sinir kökleri ile elde.
    1. Omurilik Dura mater çıkarın ve PFA ile bir konteyner dura saklayın.
    2. Ayrı sol ve sağ anterior ve posterior sinir kökleri. Kısa sabitleme için PFA dolu bir kap içinde omurilik ve yer kesilmiş sol anterior ve posterior sinir kökleri kes.
    3. Omurilik sağ anterior ve posterior sinir kökleri kes, Snap-Freeze, mühürlü dondurucu torbalar yer, ve daha sonra soğutucunun #2 yer.
    4. Omurilik en 20 cm-caudal fotoğraf. Lomber genişlemenin yerini belgeleyin.
    5. Kordonun 2 cm enine bölümlerini, kaudal 'dan rostral 'a çekin.
    6. Mürekkep her kesim bölümünün rostral yönü.
    7. Kısa sabitleme için PFA ile doldurulmuş kapsayıcılara tek numaralı bölümler yerleştirin.
    8. Hatta numaralı bölümleri Snap-Freeze, mühürlü dondurucu torbalar içine yerleştirin ve daha sonra soğutucu #2 yerleştirin.
    9. Omurilik fikreme ve brüt anomaliler için başlangıç saatini belgeleyin.
    10. Omuriliğin kalan rostral kısmını fotoğraf.
    11. Servikal genişlemenin konumunu belgeleyin. Kalan omurilik için 2.13.5-2.13.8 adımlarını izleyin.
  14. Morga sonra dondurulmuş doku etiketli kutularda-80 °C dondurucular. Sabit dokusu 4 °C ' de saklayın.
  15. 24 saat sonrası otopside (2. gün) kalan% 8 PFA 'yı% 4 oranında seyreltir.
  16. % 4 PFA 'yı, yeni seyreltilmiş% 4 PFA ile sabitleme kaplarında değiştirin.
  17. At 60 h otopsi sonrası hazırlamak% 2,5 glutaraldehit% 4 PFA glutaraldehit, PFA, DH2O ve Sorenson tampon (sırayla karıştırma ile hazırlanmış: 0,2 M fosfat tampon pH 7,4, polyvinylpyrolidone 1% w/v, sakaroz 30% w/v, ve etilen glikol % 30 v/v).
  18. Kısa sabitleme kaplarında kullanılan% 4 PFA kaldırın.
  19. Sorenson tampon içinde doku durulayın ve kriyokoruma çözeltisi içine yerleştirin (gliserol 20%, 0,4 M Sorenson arabelleği% 20, ve 0,02% dH2O) sodyum azid.
  20. Fotoğraf kısa sabit Beyin dilimleri, Serebellum, beyin sapı ve motor korteks (varsa).
  21. Her 2 cm kısa sabit omurilik bölümünden bir neşter bıçağı 2 mm kalınlığında enine bölümleri kesti.
  22. Bölümleri 2 mL scintıtasyon şişeleri içine yerleştirin ve% 4 PFA% 2,5 glutaraldehit çözeltisi ile doldurun.
  23. Kalan bölümü orijinal 20 mL scintilasyon şişeye geri dönün. Sorenson tampon ile durulayın ve kriyokoruma çözeltisi ile değiştirin.

3. patoloji

Not: Sağ Yarımküre kısa sabit dilimleri yanı sıra uzun sabit sol Yarımküre (birkaç ay için% 4 PFA yerleştirilir) ya 30 μm bölümlere (serbest yüzen olarak adlandırılır) kesilmiş veya parafin gömülü ve 12 – 14 μm bölümler olarak kesilmiş (olarak adlandırılır Parafin-katıştırılmış). Bu bölümler genellikle diaminobenzidin (DAB) yöntemini kullanarak bağışıklık aktivitesi için demyelasyon lezyonları ve büyük histouyumluluk kompleksi II (MHC-II) tespiti için proteolipid protein (PLP) ile işlenir. Bu protokoller standardize edilmiş ve birkaç yayınlarda kullanılan2,3,4,5,6,7,8,9 , 10 ' dan fazla , 11 ' i , 12' ye kadar.

  1. Serbest yüzen (30 μm) DAB-avidin-biotin Complex (ABC) doku boyama
    1. Cryostorage çözümünden bölümleri çıkarın, altı-kuyu plakasına transfer bölümleri, ve her biri için 3x yıkayın 5 dakika her 2 mL 1x fosfat tamponlu tuz pH 7,0 (PBS). Altı-iyi plaka kullanımı bakım doku gözyaşı değil bir sonraki iyi transfer zaman. Her yıkama ve inkübasyon adımında, altı-kuyu plakasını bir shaker üzerine yerleştirin ve dokuyu yavaşça sallamak için izin verin.
      Not: Küçük hacimlerde ve daha büyük plaklarda (örneğin, 12-ve 24-kuyu plakaları) inkübe edilen doku bölümleri yüzey ve kenar yırtılma eğilimi gösterir.
    2. Yaklaşık 30 ml 10 mm sitrat tamponu (pH 6,0) içeren bir cam kabı 'da mikrosallama bölümlerinde antijen alımı gerçekleştirin. Doku fırça ve mikrodalga bölümleri ile manipüle ederek dokulara katlanmadığından emin olmak için 2 – 3 dakika veya sitrat tampon gelene kadar kaynatma başlar. Bölümlerin oda sıcaklığına (~ 20 dakika) soğumasını bekleyin.
    3. Bölümleri geri altı-kuyu plaka ve 2 mL PBS/0.3% Triton X-100 her biri 5 dakika için 3x yıkama bölümleri aktarın. Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca 2 mL 3% H2O2/0,3% Triton X-100/PBS 'de bölümler inküpasyon ile endojen peroksidazlar engelleyin.
    4. 2 mL PBS/0.3% Triton X-100 olarak her biri için 3x 5 dk yıkama bölümleri. 2 mL% 3 normal keçi serumu/% 0.3 Triton X-100/1x PBS 'de 1 saat RT 'de blok bölümleri.
    5. 4 °C ' de inflamasyon (MHCıı) ve demyelasyon (PLP) ( malzeme tablosunabakın) tespit etmek için mikroglia ve miyelin epitellere karşı yönlendirilmiş primer antikorlarda (antikor bağlı olarak) bir gecede 5 güne kadar kesimleri inkük.
      Not: Bu adımda veya sonraki adımlarda, bu bölümlerde lekenin boşluğunu alan alanlara yol açacak şekilde inhale edildiğinde bölümlerin katlanmadığından emin olun.
    6. 2 mL 1x PBS 'de her biri için 3x 5 dk yıkama bölümleri. Daha sonra ikincil biyotinlenmiş antikorlar bölümler inkübasyon ( malzeme tablosunabakın) için 1 saat RT. kuluçk sırasında avidın-biotin Complex (ABC) çözümü hazırlayın kabaca 45 bir sonraki yıkama adımına önce ABC kompleksleri oluşturmak için izin ver.
    7. 2 mL 1x PBS 'de her biri için 3x 5 dk yıkama bölümleri. Ardından, ABC 'deki bölümleri RT 'de 1 saat boyunca inkük.
    8. 2 mL 1x PBS 'de 5 dakika boyunca üç kez yıkama bölümleri. Renk yeterince gelişinceye kadar (~ 3 – 8 dak) H2o2 (1:500 seyreltme, DAB 'de% 30 h2o2 ) içeren süzülmüş DAB 'deki (2 ml/kuyu/kesit) bölümleri inküat.
    9. 2 mL 1x PBS 'de her biri için 3x 5 dk yıkama bölümleri. Sinyali geliştirmek için (opsiyonel), 0,04% OsO4 (~ 30 s) kullanarak osmisat.
    10. 1x PBS 'de her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkama bölümleri. Bireysel olarak, altı-kuyu plakasının her bölümünü 1x PBS dolu küçük bir konteynere aktarın ve doku bölümünü mümkün olduğunca düz bir cam slaytta konumlandırın.
    11. Doku bölümünün mümkün olduğunca düz olmasını sağlayarak slaytı PBS 'den yavaşça kaldırın. İki boya fırçaları kullanarak, yavaşça düzleştirmek ve slayt üzerinde doku yukarı streç ve kağıt havlu ile aşırı su uzağa DAB. Gliserol (veya eşdeğer bir montaj ortamı) ile doku bölümleri mount ve şeffaf oje ile lamel magazini mühür.

4. parafin-gömülü Hemherik bölümler: DAB boyama

  1. 60 °C ' de 5 – 10 dk. fırın içinde slaytlardan parafin eritilir.
  2. Her biri 5 dakika boyunca ksilon 3x 'de inkükleştirerek bölümleri de-paraffinize etme.
  3. % 100 (5 dk için 2x),% 95 (5 dk için 2x),% 70 (5 dk için 2x) ve% 50 (5 dk için 1x) olarak dereceli etanol içinde rehidrat dokusu. PBS 'de kapak slaytlar.
  4. 10 mm sitrat tampon (pH 6,0) bir kabı içinde mikrosallama slaytlar tarafından Antigen almak.
  5. Bir kez oda sıcaklığında soğutulur 1x PBS (3x 5 dk her) için yıkayın slaytlar. 30 dakika boyunca% 3 H2O2/1% Triton-X 100/PBS 'de doku inküpasyon ile endojen peroksidazlar engelleyin.
  6. Her biri 5 dakika boyunca üç kez 1x PBS 'de yıkama dokusu. 1 saat boyunca PBS 'de% 6 normal keçi serumu ile blok dokusu.
  7. Ana antikor kısımlarında ( malzeme tablosunabakın), Oda SıCAKLıĞıNDA (RT) gece (maks. 20 h) PBS 'de yer alan bölümler.
  8. 1x PBS 'de her biri için 3x 5 dakika yıkama bölümleri. Ardından, RT 'de 1 h için PBS 'de ilgili ikincil antikor ( malzeme tablosunabakın) bölümlerinde kulkarın.
  9. ABC çözeltisi hazırlamak kabaca 45 min önce bir sonraki yıkama adımını inkübasyon sırasında.
  10. Her biri 1x PBS 'de 5 dakika için 3x 'yi yıkayın ve ardından RT 'de 1 h için ABC 'de inküye yapın.
  11. Her biri 1x PBS 'de 5 dakika boyunca 3 adet yıkayın.
  12. Renk yeterli (~ 3-8 dk) gelişene kadar, filtre (0,45 μm filtre gözenek boyutunda) DAB ile H2o2 (1:500 seyreltme 30% H2o2 DAB) içerir.
  13. 1x PBS 'de yıkama bölümleri (3x 5 dk). Sinyali artırmak için,% 0,04 osmiyum tetrokid (OsO4; yaklaşık 30 s) kullanarak osmisat.
  14. 1x PBS 'de yıkama bölümleri (3x 5dk).
  15. Etanol% 50 (1x 5min), 70% (1x 5min),% 95 (2x 5min),% 100 (2x 5 dak) ve% 100 Ksilin (1x 5min) dereceli bir dizi içinde kurutulmuş doku. Ksilenler Buharlık izin verin.
  16. Toluen tabanlı hızlı kuru montaj ortamına sahip montaj bölümleri. Anti-oksidanlar içeren formülasyonlar leke ağartma önlemek için tavsiye edilir. Sonraki depolama alanı için bir jilet ile fazla montaj ortamını slayt kenarlarından çıkarın.

5. MRG/patoloji korelasyonlar

Not: Patoloji ile MRG ilişkilendirmesi için, önce uzun sabit bozulmamış beyin Yarımküre ex vivo MRI gerçekleştirmek (yukarıdaki adım 2,9) MRI-görünür işaretçileri ile ayarlanabilir bir kutu Dilimleme yuvaları gösteren. Sonra beyin dilim ve fotoğraf 1 cm dilimleri bireysel Beyin dilimleri için situ MRI ortak kayıt sağlamak için. Daha sonra, doğrudan doku analizleri için MRG 'de ilgi bölgelerinin (Roıs) tanımlanabileceği MRG destekli analizler gerçekleştirebiliriz. Ayrıca, ROIs 'in dokuda (örn. beyaz madde lezyonları, demyelasyon olmaksızın beyaz madde vb.) belirlendiği ve daha sonra ortak lokalize MRG önlemleri (Tablo 1) ile karakterize histopatolojik güdümlü analizler de gerçekleştirebiliriz.

  1. MRG tabanlı ROIs tanımlaması
    Not:
    önceki çalışmalarda, biz beyaz madde11,12,13,14,15 ve gri madde16,17Rois tespit ettik, 18. Aşağıdaki örnek beyaz madde analizi içindir.
    1. Segment T2 hiper yoğun lezyonlar in situ MRI (adım 1,1), başlangıçta otomatik bir algoritma tarafından işlenen ve sonra el ile deneyimli kullanıcılar tarafından düzeltilmiş.
    2. T2 lezyonlarında, çevreleyen normal görünen beyin dokusunun sinyal yoğunluğunun% 80 ' ine eşit veya daha az bir sinyal yoğunluğuna sahip voxels olarak segment T1 hypoin, lezyonlar.
    3. Magnetizasyon transfer oranı (MTR) haritalarında segment hypoin,% 80 eşik ile haritalar.
    4. Yukarıdaki segmentler kullanılarak üç sınıflandırmalar oluşturun: (a) T2 ağırlıklı/FLAIR taramalarında anormal olan ancak T1 ağırlıklı veya MTR taramalarında normal olan T2-sadece lezyonlar, (b) tüm T2 ağırlıklı/FLAIR, T1 ağırlıklı ve MTR taramalarında anormal olan T2T1MTR lezyonlar; ve (c) T2 ağırlıklı/FLAIR, T1 ağırlıklı ve MTR taramaları üzerinde normal olan normal görünen beyaz madde (NAWM).
      Not: Dilimler seçimimiz, aynı dilimleri üzerinde üç bölge-of-faiz türlerinin (T2-sadece, T2T1MTR ve NAWM) varlığını temel alır.
    5. Farklı beyinleri ve farklı beyin yerlerinden kaynaklanan değişkenliği en aza indirmek için her YG için normalleştirilmiş yoğunlukları hesaplayın.
  2. Beyin dilimleri için situ MRI 'nın ortak Tescili
    1. Bir bıçak beyin dilim eklenebilir yuvaları yerelleştirmek MRI duyarlı işaretçileri dört satır ile özel bir dilimleme kutusunda sabit beyin Yarımküre tarayın. Sabit beyin ve tüm işaretçileri kapsayan 1 mm izotropik çözünürlüğe sahip T1 ağırlıklı 3D MPRAGE edinme gerçekleştirin.
      Not: Bu, post-Fixation MRI olarak adlandırılır ve sadece beyin dilimleri için in situ MRI ortak kayıt için bir ara adım olarak kullanılır.
    2. Hemen taradıktan sonra, yaklaşık 15 dilim ile sonuçlanan 1 cm ayrı bulunan yuvalarda beyin Yarımküre dilim.
    3. Hem anterior hem de arka tarafta Beyin dilimleri fotoğraf.
    4. İn situ MRI ve beyin dilimleri fotoğrafları aşağıdaki adımlarla birlikte kaydettirin.
      1. Sonrası-sabitleme ve situ MPRAGE segmentasyon için, ön işlem hem sonrası-sabitleme ve situ MPRAGE MRIs yoğunluğu olmayan tekdüzelik için19.
        1. Önceden işlenmiş post-fiktasyon MPRAGE gelen işaretçilerin dört satır ve beyin segment.
        2. Segment, post-Fixation MRG20,21 önceden işlenmiş situ mprage karşılık gelen.
      2. FSL FLIRT22' ye kadar 12 derece özgürlüğe (affine kayıt) kadar bir dizi doğrusal kayıt süreci aracılığıyla beyin ayıklanan situ ve post-Fixation MRI 'lerinin ortak kaydını yapın. Ölçekleme ve kesme bileşenleri, sabitleme küçülme efekti için hesap.
      3. Segmentlenmiş işaretçileri kullanarak maksimum öngörülen yoğunluklar toplamını minimize ederek Dilimleme düzleminin normal yönünü bulun. Bu yeniden oryantasyon açıları önceki adımdan elde edilen dönüşüm matrisine eklenmiştir.
      4. Normal vektörler derinliği ve yönünü değiştirmek için izin veren bir in-House görüntü Görüntüleyici kullanarak sabit posterior Beyin dilimleri fotoğrafları görsel olarak MRI görüntüleri maç. Beyin Dilimleme kusurlu olduğu için küçük değişiklikler gereklidir.
      5. Uygulama AFFıNE görüntü dönüşümü13 her dilim için Beyin dilimleri fotoğrafları olarak aynı Dilimleme konumları içinde situ MRI dönüştürmek için.

Representative Results

Yukarıda belirtildiği gibi, serebral yarımkülü neredeyse yarısı dondurulmuş ve DNA, RNA veya protein kullanarak moleküler çalışmalar için kullanılabilir. Tarihsel olarak, postmortem beyin dokularının kullanarak çalışmalar öncesi mortem koşulları, yaş, cinsiyet, doku pH, mRNA bütünlüğü (RIN), postmortem aralığı (PMı), tanı kesinlik, komorbidmadde kullanımı ve önceki ilaç tedavisi etkilendiği gösterilmiştir durumu23. Beyin dokularını kullanan çalışmalara dayanarak, DNA ve protein RNA ile karşılaştırıldığında daha az ölçüde etkilenir görünüyor. Deneyimimize dayanarak, RNA yalıtım ve akış analizi, ancak, en önceden mortem koşulları ve beyin dokusunun postmortem aralığı etkilenir bulunmuştur. Bu nedenle, postmortem MS dokuları kullanılarak RNA bazlı analiz yapmak için takip edilecek koşulların bazılarını tartışırız.

Tüm çalışmalarımız için, beyin otopside toplandıktan sonra, (1 cm kalınlığında) dilimlenir ve daha sonra morfolojik çalışmalar için% 4 civarında formaldehite veya biyokimyasal analizler için hızla dondurulmuş. Tüm doku blokları, yukarıda açıklandığı gibi PLP kullanarak immünostasyon ile demyelleme için karakterize edilir. Şekil 1' de temsili bir analiz şeması gösterilir. Doku bölümleri beyaz madde lezyonlarının varlığı için incelenir (Şekil 1a). Seçilmiş bölgeler bağışıklık aktivitesi (Şekil 1B) ve demyelasyon (Şekil 1C) için lekelenecektir. Dondurulmuş doku kriyostat üzerine monte edilir (Şekil 1D) ve dondurulmuş 30 μm bölümler kesilir. Bu, 3-4 Sonraki bölümler, bitişik dokulardan ayırma ve DNA, RNA veya protein yalıtımı için depolama koleksiyonu tarafından izlenir. Bu protokolü kullanarak, DNA24,25, RNA5,6,7,8,9 yanı sıra proteinleri26başarıyla izole ettik. MS beyinden RNA analiz çalışmalarda bazı önemli bulgular tartışılmaktadır iken, burada RNA postmortem MS beyin analizi ile ilgili bazı konularda.

Figure 1
Şekil 1: mRNA Analizi Için Örnek koleksiyon. (A) analiz için otopsi dokusu seçilir. Doku alanları seçilir ve dokuların bir kısmı eksize edilir. Tüm bölümler (B) MHC-II (majör histouyumluluk kompleksi (MHC) Sınıf II HLA-Dr CR3/43) antikor ile iltihaplı aktivite ve (C) proteolipid proteini (PLP), yayınlanan protokolleri kullanarak miyelin durumunu tespit etmek için lekelenir. Miyelin durumuna dayanarak, blok bir neşter (D) ile puanlanır. Bölümler (60 μm) kesilmiş (E) ve daha önce puanlanmış alanlar kaldırılır, tüplerde ayrılır ve (F) etiketli. PLP ve MHC-II lekeleri, uygun doku koleksiyonunu sağlamak için her 5 bölümden sonra tekrarlanır. Normal görünen beyaz madde (NAWM) belirtilmiştir ve beyaz madde lezyonları (WML) kırmızı olarak özetlenmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

MS10lezyonlarında axonal transeksiyon. Bu programın ilk bilimsel odağı, demyelinli beyaz madde lezyonlarının hücresel bileşenlerinin karakterizasyonu üzerine kurulmuştur. Lokalize antijenler arasında fosforlu olmayan neurofilamiler (NFs) bulunuyordu. Çoğu NFs miyelinli Akon fosforilated. Demyelasyon üzerine, akons dephosphorylated vardır. Demyelinli akonların fosforlu olmayan NFs 'nin beklenen ifadesini tespit ettik. Akut MS lezyonlarında, bu demyelik aksonların çoğu, kesildi aksonların proksimal uçları yansıtan akaks geri çekme ampuller (Şekil 2a) olarak sona erdi. Transected akons, bitişik normal bölgelere göre akut lezyonlarda 11.000 mm3 ' ü aşıyor10. Bu gözlemler MS araştırmalarında bir paradigma vardiya katalizör yardımcı oldu, Bayan bireylerde kalıcı nörolojik özürlülük önemli nedeni olarak nörodejenerasyon karakterize doğru alan taşındı.

Figure 2
Şekil 2: enflamatuar demyelasyon sırasında axonal transeksiyon. Akal transeksiyon inflamatuar demyelasyon sırasında oluşur (a, ok uçları) ve terminalin akonal ovoidlerin oluşumu Indükler (a, oklar). Niceleyilmiş (B), kesildi akons MS lezyonları bol ve lezyonun inflamatuar aktivite ile ilişkilendirilmesi gibi görünüyor. Panel A, Trapp ve al.10 ' dan izin ile çoğaltılmıştır. Kırmızı: proteolipid protein, yeşil: Anti nonfosforilated Neurofilament. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Kronık MS beyninde Remyelination3. Remyelination MS erken aşamalarında sağlam olabilir. Ancak birçok kronik MS lezyonu remyelinated değildir. Oligodendrosit progenitör hücrelerinin (OPCS) veya yeni oligodendrosit jenerasyonunun varlığı, kronik demyelik beyaz madde lezyonlarının remyelasyon limitleri olup olmadığını araştırdık. OPC yoğunluğu sıklıkla azalırken, kronik-demyelinli lezyonlar3' te bulundular. Birçok kronik MS lezyonunda yeni oluşturulan oligodendrositler de mevcut. Oligodendrocyte süreçleri ile ilişkili, ancak demyelinli akons myelinate değil (Şekil 3). Bu çalışmalar, OPCS ve yeni oligodendrositler üretmek için yeteneklerini kronik beyaz madde lezyonlarının remiyelinasyon sınırlandırmak değildir gösterir. Genellikle distrofik olarak ortaya çıkan kronik-demyelik akonların, yeni üretilen oligodendtrositler tarafından remyelasyon için alıcı olmadığını hipotez ettik.

Figure 3
Şekil 3: akonlar ile ilişkili ön myelinating oligodendrosit süreçleri. MS lezyonlar PLP antikorları ile lekelenmiş Konfokal MİKROGRAFİ ( a, bpanellerde kırmızı) ve Neurofilament antikorlar (a, b panellerde yeşil) gösterilir. Subventriküler bölgede (SVZ) bir ön myelinating oligodendrosit (kırmızı panel a) Kronik MS lezyonunda demyelinli akons (panel a 'da yeşil) bölgeye genişletilmiş süreçler. Bu süreçlerin birçoğu (Panel A 'da oklar), daha yüksek büyütme (panel B) olarak gösterildiği gibi, akons etrafında kaplanmış. Ölçek çubukları 20 μm (A) ve 5 μm (B) temsil eder. Chang ve al.3 ' ten izin ile çoğaltılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

MS6mitokondriyal disfonksiyon. Kronik MS hastalarından elde edilen hızlı dondurulmuş motor korteksinde nöronal gen değişimleri için tarafsız bir arama yaptık (Şekil 4A). Bu veri kümesinin tarafsız bir şekilde aranmaları, MS 'de 23 nükleer kodlu mitokondriyal MRN 'de önemli oranda azalma belirledi (Şekil 4b). İmmunoocytochemistry ve situ hibridizasyon kullanarak credentialing çalışmaları bu genler son derece kortikal projeksiyon nöronlar (Şekil 4c) zenginleştirilmiştir ve projeksiyon akonlardan izole mitokondri azaltılmış glikoliz göstermek göstermiştir ( Şekil 4d). Bu kağıt, mitokondriyal disfonksiyon üzerine odaklanmış ve MS 'de akal dejenerasyonuna büyük bir katkı olarak ATP üretimini azalttı.

Figure 4
Şekil 4: MS Motor korteks 'de gerçekleştirilen microarray veri ve akış doğrulama teknikleri. (A) kontrol (C1-C6) ve SPMs (MS1-MS6) motor korteks örneklerinden önemli ölçüde değiştirilmiş transkriptler hiyerarşik kümeleme, ayrı olarak hastalık ile ilgili gen ifade desenleri destekler. MS Motor korteks azalan transkriptler arasında, yirmi altı elektron taşıma zinciri (B) aitti. Mitokondriyal kompleks ı (NDUFA6) mRNA (n = 55-130), MS Motor korteks (CII) içinde kontrol (CI) Ile karşılaştırıldığında, PLP mRNA yoğunlukları kontrol (cııı) ve MS (CIV) serebral korteks arasında benzerdi. Elektronik taşıma kompleksinin etkinliği ı ve III, MS hastalarının motor korteklerinden mitokondriyal zenginleştirilmiş fraksiyonları azaltıldı (n = 3) (D). Dutta ve ark.6 ' dan izin ile yeniden yazdırılır. Hata çubukları SEM temsil eder; CI-IV ölçek çubuğu 25 μm ' dir. * p < 0,05 öğrencilerin t-testi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

MS8bilişsel fonksiyon bozukluğu patogenezi. 40 MS hastaların% 60 ' i bilişsel düşüş ve düşük yürütme fonksiyonuna sahiptir. Biz MS demyelasyon için ortak bir site olarak, bellek/öğrenme işlevsel bir site olan hipokampus, tespit. Biz daha sonra miyelinli ve demyelinli hipokampi içinde nöronal gen ifadesi karşılaştırıldığında ve bellek/öğrenme dahil nöronal mRNAs kodlama proteinlerde önemli azalma bulundu. Bu verileri, seçme microRNAs 'ın demyelinli hipokampus içinde arttığını ve bu microRNAs 'ın glutamat reseptörlerinin ifadesini azaltabilir olduğunu göstererek genişlettik. Bu gözlemleri kemirgen modellerinde çoğaltdık ve genişlettik. Biz daha sonra miyelinli ve demyelinli hipokampi içinde nöronal gen ifadesi karşılaştırıldığında ve bellek/öğrenme dahil nöronal mRNA kodlama proteinlerinde önemli indirimleri bulundu.

Figure 5
Şekil 5: MS Hippocampus 'Ta doku toplama, histolojik analiz ve gen ifadesi çalışmaları. Hippocampus içeren Beyin dilimleri otopsi sırasında seçilir (A) ve hipoampus ve bitişik bölge (kırmızı kutu) daha fazla analiz için kaldırılır. PLP için immünostasyon tüm kontrolde miyelin korunması gösterdi (B) ve 40 ms hipokampi (C). MS Hippocampi 'nin (D)% 60 ' inde geniş demyelasyon tespit edildi. Kontrol Hippocampi (E, G, ı) ile karşılaştırıldığında, HuR immunohistokimya tarafından gösterildiği gibi Demyelinli MS hipokampi (F, H, J), CA1, CA3 veya CA4 bölgelerinde önemli nöronal kayıp saptanmadı. Miyelin (miyelin temel proteini (MBP), yeşil) ve akons (SMI32, kırmızı) için çift etiketleme immünofloresan, MS demyelinli hipokampus 'un kontrol hipokampus ile karşılaştırıldığında akkalların (N) göreceli olarak korunması ile miyelin kaybını (L) gösterdi ( MBP, K; SMI32, M). MRNA ifade düzeylerinin çift Kümelemesi, numuneleri miyelin durumuna (myelinated ve demelinli) ve konumu (hipokampus vs. motor korteks) (O) temelinde ayrık kümelere yerleştiriyor. Yüksek mRNA seviyeleri kırmızı ve mavi ile gösterilir düşük ifade seviyeleri gösterir. Panel C-O Dutta ve al.8 ' den uyarlanmıştır. B-D: 2 mm, E-J: 100 μm, K-N: 50 μm. bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen buraya tıklayın .

MRG değişikliklerinin patolojik ilişkilendirmesiyle12. MRI, MS tanısı ve tedaviye yanıt değerli bir göstergesidir ve aynı zamanda MS hastalığı ilerlemesinin bir öngörü ise, MRG değişikliklerinin patolojik ilişkilendirimleri kötü anlaşılabilir. Postmortem MRI çalışmalarımız iki MRG ROIs 'e odaklanmıştır. T1 hypointensity, T2 hiperyoğunluk ve azaltılmış magnetizasyon transfer oranı (T2T1MTR) ile sadece T2 hiperintenat (T2) ve ROIs olan serebral beyaz madde ROIs. Yaklaşık% 45 serebral beyaz madde T2-sadece ROIs myelinated, onların non-spesifik doğası teyit edildi. Buna karşılık, T2T1MTR ROIs 'in% 83 ' si kronik olarak demyelikle ve kara delikler olarak ortaya çıkmıştır. T1 ve MTR değerleri yarı niceliksel olup, değerleri T2T1MTR ROIs 'te geniş çeşitliliğe sahiptir. Eğer miyelin kaybı bu MRI değişikliklerine tek katkı ise, değerler sabit olmalıdır. T1 ve MTR değerleri ile ilişkili şişmiş demyelinli akons.

Figure 6
Şekil 6: Magnetizasyon transfer oranları (MTR) ve T1 kontrast oranları, kronik MS lezyonlarında na+/K+ ATPase-Positive akons yüzdesi ile ilişkili olarak doğrusal olarak ilişkilidir. Kronik-na+/K+ ATPase (yeşil) için lekelenmiş demyelinli lezyonlar Neurofilament (kırmızı) Içinde yaklaşık% 100 (A) 'asıfır (B) arasında değişmektedir. Na+/K+ ATPase olmayan birçok akons çapları artırdı (B). Niceliksel postmortem MTR (p < 0,0001, C) ve T1 kontrast oranları (p < 0,0006, D) ile ilişkili kronik-demyelli MS lezyonlarında na+/k+ ATPase pozitif akons yüzdesi karşılaştırılması. Her veri noktası tek bir lezyon ve her benzersiz renk sembolü kombinasyonu incelenmiştir beynin birini gösterir. Ölçekler çubukları = 5 μm. genç ve al.12 ' den çoğaltılabilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Demyelinasyona bağımsız nörodejenerasyon11. Tarihsel olarak, MS nörodejenerasyon demyelasyon sonucu düşünülmektedir. Ancak beyin görüntüleme çalışmaları, nörodejenerasyon ve demyelinasyonun bağımsız olaylar olabileceğini ortaya çıkar. Geçenlerde omurilik ve serebral korteks demyelasyon var MS hastalarının bir alt nüfus tespit, ama serebral beyaz madde değil. Bu MS alt tipini myelokortikal MS (MCMS) olarak icat ettik. MCMS vakaları, serebral beyaz madde demyelizasyon ve kortikal nöronal kayıp arasındaki ilişkiyi araştırmak için bir platform sağladı. Kontrol korsinleri ile karşılaştırıldığında, kortikal nöronal kayıp tipik MS korsinleri daha MCMS korsinleri önemli ölçüde büyüktür. Kontrol beyin dokusu Cleveland Clinic patoloji bölümünden elde edildi. Bu çalışmada, demyelasyon yokluğunda nörodejenerasyon için ilk patolojik kanıtlar sağlanır.

Figure 7
Şekil 7: serebral beyaz madde demyelizasyon yokluğunda nöronal kayıp. Tipik MS (a) olarak sınıflandırılmış bir bireyin bir kreil menekşe-lekeli koronal hemherik bölümü. Beş etiketli alanların her birinde kortikal katmanlar III, V ve VI 'de nöronal yoğunluklar karşılaştırıldı. 60 μm ' den büyük bir alana sahip nöronlar2 (sarı) üstün temporal korteks (B) temsili bir resimde gösterilir. PLP için etiketleme ve demyelinli lezyonların dağılımı (beyaz madde demyelasyon mavi renkte vurgulanır; Subpial demyelasyon pembe olarak vurgulanır) tipik MS (C) ve myelokortikal MS (D) bireylerden gelen hemferik bölümlerde ) gösterilir. Tipik MS 'de düşük kortikal nöronal yoğunluk ve artmış serebral beyaz madde lezyonu hacmi arasında önemli bir korelasyon bulunmuştur, ancak myelokortikal MS (E); kesikli çizgiler% 95 güven aralığını (CI) gösterir. IFG = inferior ön gyrus. STG = üstün temporal gyrus. Inı = inferior sula. INS = üstün sula. CG = singulat gyrus. Trapp ve al.11 ' den izin ile çoğaltılmıştır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Sıra süresi Sıra açıklaması Sıra kullanımı
0:09 Yerelleştiriciye Sonraki diziler için yerelleştirme
9:14 3D Magnetization hızlı degrade yankı hazırlanmış (MPRAGE) Beyin yapıların yapısal görüntüleme Volumetrik tahmini
5:14 3D sıvı zayıflatılmış inversiyon kurtarma (FLıT) Lezyon tanımlaması lezyon segmentasyon Volumetrik lezyon değerlendirmesi
2:35 2D T2 ağırlıklı Lezyon tanımlaması lezyon segmentasyon Volumetrik lezyon değerlendirmesi
5:12 3D gradyan-magnetizasyon transfer pre-Pulse ile yankı geri çağırdı, (MT-ON) Normal görünen ve Lezyonel dokuda miyelin içeriğinin sözde ölçüsü
5:12 3D degrade-magnetizasyon transfer pre-Pulse olmadan yankı geri çağırdı, (MT-OFF)
0:27 Difüzyon tensor görüntüleme (DTı) alan haritalama Beyin dokusunda su difüzyon ölçüsü beyin dokusu bütünlüğünü yansıtmak için düşünce.
10:27 Difüzyon tensor görüntüleme (DTı) Multi-Shell
1:18 Difüzyon tensor görüntüleme (DTı) Multi-Shell
39:48:00 ALT TOPLAM: ÇEKIRDEK

Tablo 1: postmortem görüntüleme protokolü.

Discussion

Biz hızlı bir şekilde elde etmek için kullanılan bir protokol açıklamak ve MS ile 150 ' den fazla bireylerin doku süreci. Bu protokolün önemli bir özelliği, doku kullanan bilim adamlarının da protokol kurulması ve doku koleksiyonunu gerçekleştirmekte sorumlu olmasıdır. Bu, bireysel araştırma projelerinin bilimsel ihtiyaçlarını karşılamak için esneklik sağlar. Bu protokolün çeşitli yönleri, yardımcı programını geliştirir. Hastalar genellikle ölümden önce iyi karakterize edilir, birçoğu bizim merkezimizde nörolog tarafından takip edilmiştir. Kritik bir adım, diğer bazı beyin bankalarına kıyasla dondurulmuş dokusunun kalitesini artıran, ölümden hemen sonra doku bağışlarının işlenmesi. Bu, histolojik ve immünosittokimyasal gözlemlerin ispatı için gerekli olan transkripsiyon ve translasyonel gen ürünlerinde yapılan değişikliklerin tanımlanması konusunda büyük değer veren Moleküler çalışmalar sağlar. Birden fazla olguda morfolojik/immünositokimyasal ve moleküler verilerden yararlanarak sonuçların güvenilirliğini arttırır. Bu en iyi serebral korteks mitokondriyal gen değişiklikleri ve demiyeli hipokampi nöronal gen değişiklikleri bizim açıklama tarafından gösterilmiştir. Yeni gen profil protokolleri hızlı bir hızda geliştirilmiştir ve bankanızın dondurulmuş dokusu, doku ve tek hücreli analizler için yüksek kaliteli RNA sağlamalıdır.

Protokolün bir başka değerli yönü kısa sabit Beyin dilimleri. Bu dokular 30 μm kalınlığında, serbest yüzen bölümler halinde kesilir. Bu bölümler üç boyutta iki veya daha fazla antijenleri analiz etmek için Konfokal mikroskobik kullanmak için idealdir. İyi örnekler, kronik MS lezyonlarında distrofik akons ile ön myelinating oligodendtrosit süreçlerinin etkileşimi, hem de kesildi akgen retraksiyon ampuller tek akal bağlantıların tanımlanması. Bu, 3D görüntülerin uygulanabilir olmadığı 7 μm kalınlığında parafin bölümlerinin rutin kullanımına tersine kullanılır. Parafin-gömülü dokularda bazı sorular için büyük değer vardır, özellikle hemherik 7 μm-kalın bölümlerde nöronal yoğunluklarının ölçülmesini. Bu nedenle doku işleme protokollerimiz çeşitlidir ve sabit ve hızlı dondurulmuş dokulara garanti vermek için esneklik sağlar.

Protokolün bir başka benzersiz özelliği postmortem içinde situ beyin MRG olduğunu. Brain MRIs MS hastalığının bir yer değiştirebilen biyomarker vardır. Bu nedenle, anormal MRG sinyallerinin patolojik ilişkilendirlerini kurmak esastır. Çalışmalarımız, T2 sadece ve T2T1MTR ROIs 'in genellikle myelinated olduğunu tespit etmiştir. Bu bulgu, miyelinli ve demyelinli serebral beyaz maddeyi güvenilir bir şekilde ayırt eden daha spesifik görüntüleme modalitelerinin ihtiyacını desteklemektedir. MRI, miyelin algılanması için hassas görünüyor, ancak çalışmalarımız, T1/T2/MTR kombinasyonunun bile myelasyon tespiti için özel olmadığını gösteriyor. Postmortem protokollerimiz, yeni görüntüleme modalitelerinin miyelinli ve demyelinli serebral beyaz maddeyi ayırt etme yeteneğini test etmek için ideal bir platform sunar. MRI, translasyonel araştırmalarımızda MRI kullanımı ve yaşayan hastalarda yaygın klinik kullanımı göz önüne alındığında, temel bilim sonuçlarının klinik uygulamaya çevirisi için ideal bir araç sağlar.

Kısa ve uzun sabit yanı sıra dondurulmuş dilimleri kesme sırasında farklı çalışmalar için birden fazla modda doku işleme için bir avantaj sunuyor, bu yöntem ile bazı sınırlamalar vardır. Bir yapının tamamını değerlendirmek, bölümler bitişik dilimler üzerinde farklı şekilde işlenebilir gibi sınırlı olabilir. Doku bankasının büyük hacmi, ancak, örnekleme geliştirmek için birden fazla konuda ilgi bir yapısını araştırmak için yeteneği sunuyor. Postmortem dokular kullanan çalışmalar için başka bir genel sınırlama onlar çapraz-kesit olmasıdır. Değişikliklerin zamanlamaya ve ilerlemesine ilişkin sonuçlar bu bağlamda yorumlanması gerekir. Onların dokularını bağışlayan hastalar için bir seçim önyargı olabilir, hangi MS ile tüm hastalara veri genelleştirme sınırlandırabilir. Çoğu bağış Gelişmiş MS komplikasyonlarından ölmek beri, bu hasta MS önceki aşamalarında bu hastalarda bulgularını elde etmek için uygun olmayabilir. Yine de, MS ile ilgili olmayan durumlardan (Yani akut miyokard infarktüsü, ilaç aşırı doz, intihar) ölen genç hastalarda dokuları aldık. Protokolün kapsamı, MS 'de bulunan diğer organların (örneğin gastrointestinal ve kemik iliği) örneklemesini içermez. Biz programın güçlü büyük ölçüde sınırlamaları ağır tartmak inanıyoruz.

Disclosures

Yazarlar hiç bir ilgi çatışması bildirmiyor.

Acknowledgments

Yazarlar da Dr Christopher Nelson editoryal yardım için teşekkür etmek istiyorum. Otopsi programı kısmen R35 hibe NS097303 BDT tarafından desteklenmektedir. RD laboratuarında çalışma, NINDS (NS096148) ve ulusal multipl skleroz Derneği, ABD (RG 5298) ' den hibe tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
Biotinylated goat anti-mouse IgG Vector Laboratories BA-9200 1:500 dilution for hemispheric; 1:1,000 for 30µm free-floating.
RRID: AB_2336171
Biotinylated goat anti-rabbit IgG Vector Laboratories BA-1000 1:500 dilution.
Biotinylated goat anti-rat IgG Vector Laboratories BA-9400 1:500 dilution for hemispheric; 1:1,000 for 30µm free-floating.
RRID: AB_2336208
Glial fibrillary acid protein (GFAP) Dako Z0334 1:700 dilution for hemispheric.
RRID: AB_10013382
HuR, mouse IgG, 3A2 clone Santa Cruz SC-5261 1:500 for 30µm free floating.
RRID: AB_627770
Major histocompatibility complex (MHC) class II HLA-DR CR3/43 Dako Mo746 1:250 dilution for hemispheric; 1:500 for 30 µm free floating.
RRID: AB_2313661
Non-phosphorylated neurofilament (SMI32) Biolegend 801701 1:5,000 dilution for hemispheric; 1:2,500 for 30 µm free-floating.
RRID: AB_2564642
Phosphorylated neurofilament (SMI31) Biolegend 801601 1:5,000 dilution for hemispheric; 1:2,500 for 30 µm free-floating.
RRID: AB_2564641
Proteolipid protein (PLP) Gift from Wendy Macklin 1:250 dilution for IHC; alternative anti-PLP antibodies commercially available.
Reagents
125 mm filter paper Whatman 1452-125 For filtering PFA.
50% Glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16320 Electron microscopy grade.
Cytoseal ThermoScientific 8310-16
Ethylene glycol Fisher Chemical BP230-4
Glycerol Sigma-Aldrich G7893 400 mL/2 L Cryoprotection solution.
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized Millipore-Sigma SLHV033RB
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 19200 Prills form.
Polyvinylpyrolidone (PVP-40) Fisher Chemical BP220-212
Sodium azide Fisher Chemical S227I 2 g/2 L Sorenson's buffer.
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S0876 98.8 g/2 L Sorenson's buffer.
Sodium phosphate mono basic monohydrate Sigma-Aldrich S9638 14.352 g/2 L Sorenson's buffer.
Sucrose Sigma-Aldrich PVP40-500G
VectaStain ABC Kit Vector Laboratories PK-6100 1:1,000 dilution of A and B.
RRID: AB_2336819
Waterproof drawing black ink Higgins 44201
Xylene Fisher Chemical X3S Histological grade.
Equipment
3T MRI Magnetom Prisma Siemens Healthineers
7T MRI Agilent 830AS Siemens Healthineers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trapp, B. D., Nave, K. A. Multiple sclerosis: an immune or neurodegenerative disorder? Annual Review of Neuroscience. 31, 247-269 (2008).
  2. Chang, A., Nishiyama, A., Peterson, J., Prineas, J., Trapp, B. D. NG2-positive oligodendrocyte progenitor cells in adult human brain and multiple sclerosis lesions. Journal of Neuroscience. 20, 6404-6412 (2000).
  3. Chang, A., Tourtellotte, W. W., Rudick, R., Trapp, B. D. Premyelinating oligodendrocytes in chronic lesions of multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 346, 165-173 (2002).
  4. Chang, A., et al. Neurogenesis in the chronic lesions of multiple sclerosis. Brain. 131, 2366-2375 (2008).
  5. Chang, A., et al. Cortical remyelination: A new target for repair therapies in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 72, 918-926 (2012).
  6. Dutta, R., et al. Mitochondrial dysfunction as a cause of axonal degeneration in multiple sclerosis patients. Annals of Neurology. 59, 478-489 (2006).
  7. Dutta, R., et al. Activation of the ciliary neurotrophic factor (CNTF) signalling pathway in cortical neurons of multiple sclerosis patients. Brain. 130, 2566-2576 (2007).
  8. Dutta, R., et al. Demyelination causes synaptic alterations in hippocampi from multiple sclerosis patients. Annals of Neurology. 69, 445-454 (2011).
  9. Dutta, R., et al. Hippocampal demyelination and memory dysfunction are associated with increased levels of the neuronal microRNA miR-124 and reduced AMPA receptors. Annals of Neurology. 73, 637-645 (2013).
  10. Trapp, B. D., et al. Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 338, 278-285 (1998).
  11. Trapp, B. D., et al. Cortical neuronal densities and cerebral white matter demyelination in multiple sclerosis: a retrospective study. Lancet Neurology. 17, 870-884 (2018).
  12. Young, E. A., et al. Imaging correlates of decreased axonal Na+/K+ ATPase in chronic multiple sclerosis lesions. Annals of Neurology. 63, 428-435 (2008).
  13. Fisher, E., et al. Imaging correlates of axonal swelling in chronic multiple sclerosis brains. Annals of Neurology. 62, 219-228 (2007).
  14. Moll, N. M., et al. Imaging correlates of leukocyte accumulation and CXCR4/CXCL12 in multiple sclerosis. Archieves of Neurology. 66, 44-53 (2009).
  15. Moll, N. M., et al. Multiple sclerosis normal-appearing white matter: pathology-imaging correlations. Annals of Neurology. 70, 764-773 (2011).
  16. Nakamura, K., Chen, J. T., Ontaneda, D., Fox, R. J., Trapp, B. D. T1-/T2-weighted ratio differs in demyelinated cortex in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 82, 635-639 (2017).
  17. Chen, J. T., et al. Clinically feasible MTR is sensitive to cortical demyelination in MS. Neurology. 80, 246-252 (2013).
  18. Nakamura, K., Fox, R., Fisher, E. CLADA: cortical longitudinal atrophy detection algorithm. Neuroimage. 54, 278-289 (2011).
  19. Sled, J. G., Zijdenbos, A. P., Evans, A. C. A nonparametric method for automatic correction of intensity nonuniformity in MRI data. IEEE Transactions of Medical imaging. 17, 87-97 (1998).
  20. Fisher, E., Cothren, J. R. M., Tkach, J. A., Masaryk, T. J., Cornhill, J. F. Knowledge-based 3D segmentation of the brain in MR images for quantitative multiple sclerosis lesion tracking. Proc. SPIE 3034, Medical Imaging. 19-25 (1997).
  21. Avants, B. B., Epstein, C. L., Grossman, M., Gee, J. C. Symmetric diffeomorphic image registration with cross-correlation: evaluating automated labeling of elderly and neurodegenerative brain. Medical Image Analysis. 12, 26-41 (2008).
  22. Jenkinson, M., Bannister, P., Brady, M., Smith, S. Improved optimization for the robust and accurate linear registration and motion correction of brain images. Neuroimage. 17, 825-841 (2002).
  23. Lewis, D. A. The human brain revisited: opportunities and challenges in postmortem studies of psychiatric disorders. Neuropsychopharmacology. 26, 143-154 (2002).
  24. Chomyk, A. M., et al. DNA methylation in demyelinated multiple sclerosis hippocampus. Scientific Reports. 7, 8696 (2017).
  25. Huynh, J. L., et al. Epigenome-wide differences in pathology-free regions of multiple sclerosis brains. Nature Neuroscience. (2014).
  26. Ishii, A., et al. Human myelin proteome and comparative analysis with mouse myelin. Proceedings of the National Academy of Sciences. U. S. A. 106, 14605-14610 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics