ביטוי וטיהור של Nuclease-מזבל החמצן חינם Protocatechuate 3, 4-דיחמצן

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Protocatechuate 3, 4-דיחמצן (PCD) ניתן להסיר בחינם חמצן diאטומית ממערכת מימית באמצעות המצע שלה protocatechuic חומצה (PCD). פרוטוקול זה מתאר את הביטוי, הטיהור וניתוח הפעילות של אנזים ניקוי החמצן.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Messer, R. K., Lopez Jr., M. A., Senavirathne, G., Yoder, K. E. Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase. J. Vis. Exp. (153), e59599, doi:10.3791/59599 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מיקרוסקופ אחד (SM) משמש במחקר של אינטראקציות מולקולריות דינמיות של fluorophore המסומנים בזמן אמת. עם זאת, fluorophores נוטים לאבד את האות דרך photobleaching לבנה על ידי חמצן מומס (O2). כדי למנוע הלבנת ולהאריך את תקופת החיים fluorophore מערכות ניקוי חמצן (OSS) מועסקים כדי להפחית O2. OSS זמין מסחרית יכול להיות מזוהם על ידי נוקלאוסים כי נזק או לבזות חומצות גרעין, פרשנות מייסדת של תוצאות ניסיוני. כאן אנו מפרטים פרוטוקול עבור הביטוי והטיהור של פסאודומונס מאוד פעיל protocatechuate-3, 4-diחמצון (pcd) ללא זיהום נוקלאז לזיהוי. PCD יכול באופן יעיל להסיר מינים מגיב O2 על ידי המרה של המצע protocatechuic חומצה (pcd) ל 3-קרבוxy-cis, cis-muconic חומצה. שיטה זו יכולה לשמש בכל מערכת ימית שבה O2 ממלאת תפקיד מזיק ברכישת נתונים. שיטה זו יעילה בהפקת פעיל מאוד, נוקלאז חינם pcd בהשוואה pcd זמין מסחרית.

Introduction

מולקולה יחידה (SM) ביופיזיקה היא שדה הצומח במהירות שינוי הדרך בה אנו מסתכלים על תופעות ביולוגיות. לשדה זה יש את היכולת הייחודית לקשר בין חוקי הפיסיקה והכימיה לביולוגיה. מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית היא אחת שיטה ביופיזית שיכולה להשיג רגישות SM. הקרינה הפלואורסצנטית משמש כדי לזהות biomolecules על ידי קישור אותם fluorophores אורגני קטן או נקודות הקוונטים1. מולקולות אלה יכול לפלוט פוטונים כאשר מתרגש על ידי לייזרים לפני הלבנת הלבנה2. הלבנה מתרחשת כאשר תוויות פלורסנט לעבור נזק כימי אשר הורס את היכולת שלהם להלהיב באורך הגל הרצוי2,3. הנוכחות של מינים חמצן תגובתי (ROS) במאגר מימית הם הגורם העיקרי של photobleaching לבנה2,4. בנוסף, רוס יכול לגרום נזק biomolecules ולהוביל תצפיות שגויות ב ניסויים SM5,6. כדי למנוע נזק חמצוני, מערכות ניקוי חמצן (OSS) ניתן להשתמש3,7,8. מערכת הגלוקוז אוקסידאז/קטלאז (GODCAT) יעילה בסילוק חמצן8, אך היא מייצרת הפרזות עשויות להזיק כintermediates. אלה עלולים להזיק לbiomolecules של עניין בלימודי SM.

לחילופין, protocatechuate 3, 4 diחמצון (pcd) ביעילות להסיר O2 מתוך פתרון מימית באמצעות המצע שלה protocatechuic חומצה (pcd)7,9. PCD הוא מטלואנזים המשתמשת בברזל nonheme כדי לתאם PCD ולזרז את תגובת הפתיחה catechol ring באמצעות מומס O210. זו תגובה צעד אחד מוצג להיות OSS הכולל טוב יותר לשיפור יציבות fluorophore ב ניסויים SM7. למרבה הצער, הרבה אנזימי OSS זמינים מסחרית, כולל PCD, מכילים נוקלאוסים מזהם11. מזהמים אלה יכולים לגרום לנזק של הגרעין מבוססי חומצות מצעים המשמשים בניסויים SM. עבודה זו להבהיר פרוטוקול טיהור מבוסס כרומטוגרפיה לשימוש PCD רקומביננטי במערכות SM. PCD ניתן להחיל באופן כללי על כל ניסוי שבו ROS הם מזיקים מצעים הדרושים עבור רכישת נתונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. לגרום PCD ביטוי E. coli

  1. שילוב 1 μL pVP91A-pcaHG ביטוי PCD ביטויים באמצע (20 ng/μL, איור 1A) ו 20 μl של E. coli BL21 (20מסחריתהתאים זמין, > 2 x 106 cfu/μg פלבאמצע) בצינור. קפיצי את הצינור כדי לערבב. . שים את השפופרת על קרח 5 דקות
  2. מניחים שינוי ב 42 ° c עבור 30 s. . ואז קרח 2 דקות
  3. הוסף 80 μL SOC מדיה (ציר אופטימלי במיוחד עם דיכוי catabolite: 2.5 mM KCl, 10 מ"מ הנאל, 2% טריטונים, 0.5% שמרים תמצית, 10 מ"מ MgSO4, 10 מ"מ Mgso2, 20 מ"מ גלוקוז). ללחוץ על 225 מהפכות לדקה (rpm) 37 ° צ' עבור 1 h.
  4. צלחת תגובת שינוי ליברות Amp אגר (1L לוריא ציר אגר: 10 g הנרוג, 10 גרם באקול-טריטונים, 5 גרם שמרים לחלץ, 15 g אגר, 50 μg/mL אמפיצילין; 25 מ ל לכל 10 ס מ בקוטר צלחת פטרי).
  5. מודקת את הצלחת, מכסה כלפי מטה, ב 37 ° c עבור 16-18 h.
  6. איחסן 50 mL ליברות Amp (1L LB: 10 גרם bacto-טריטונים, 10 גרם הנרוג, 5 גרם שמרים לחלץ, 50 μg/mL אמפיצילין) ב 250 mL Erlenmeyer בקבוקון עם מושבה אחת. מודטה ב 37 ° c עבור 16-18 h רועד ב 225 rpm.
  7. העברת 20 מ ל התרבות ל 4 ל בקבוקון עם מגבר L ליברות 1. ללחוץ על 225 סל"ד ב 37 ° c.
  8. כל h למדוד את התרבות OD600 (צפיפות אופטית ב 600 ננומטר). כתרבות OD600 מתקרב 0.5, להגדיל את תדירות המדידות כל 15 דקות. הצפיפות הרצויה של התרבות היא 0.5 OD600.
  9. להעביר את בקבוקון 4L לסל של קרח. מערבולת את הבקבוקון באמבט הקרח. כדי להקטין את טמפרטורת התרבות
    הערה: הזמן על הקרח צריך להישמר למינימום, כך התאים יישארו metabolically פעיל. באופן אידיאלי התאים יהיו על הקרח פחות מ 10 דקות.
  10. אינדוקציה מוצלחת של PCD ניתן לצפות על ידי הdodecyl סודיום נתרן פוליאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) ניתוח. קציר של 1 מ ל של התרבות הבלתי מושרה בצינור. לסובב את המדגם 1 דקות ב 14,000 x g ב microfuge בטמפרטורת הסביבה. . בסדר.
    1. מסיסות התאים הפלטד ב 150 μL PBS (פוספט מאגור מלוחים).
    2. להוסיף נפח שווה של צבע הטעינה 2X (1.2% SDS, 30% גליצרול, 150 mM טריס-HCl, pH 6.8, 0.0018% ברומאופנול כחול, 15% β-mercaptoethanol). מערבולת המדגם לערבב ביסודיות.
    3. מרתיחים את המדגם עבור 3 דקות ולהעביר לקרח. ניתן לאחסן את המדגם במקפיא של 20 ° c לניתוח עתידי.
      הערה: PBS זמין מסחרית עם או בלי CaCl2 ו MgCl2. מעבדות רבות יהיה PBS ללא CaCl2 ו MgCl2 עבור שיטות תרבות התא. לא מצאנו שום הבדל עם PBS עם או בלי CaCl2 ו MgCl2.
  11. העבר את 4 ל בקבוקון לחממה ב -17 ° c עם 180 סל ד לרעוד. המשך לעקוב אחר OD600 כל 20 דקות.
  12. ב 0.7 OD600 להוסיף איזופרופיל-Beta-D-thioגלאוסייד (iptg) כדי 0.5 mM הריכוז הסופי (0.25 M פתרון מניות) ו 10 מ"ג/L אמוניום ברזל (II) סולפט הקסהמיים (Fe4)2(כך4), 10מ"ג/mL פתרון המניה). בנוסף, התוצאה הנובעת מהיזם T5 בתוספת iptg (איור 1א). ברזל גופרתי מאוגד על ידי PCD ונדרש לפעילות קטליטית באמצעות תיאום חמצן במהלך catechol פתיחה.
  13. לנער את התרבות ב 180 סל ד ב 17 ° c עבור 18 h.
  14. הניחו את הבקבוקון של התרבות בקרח כמו ב-1.2. קציר 1 mL של התאים המושרה עבור SDS-עמוד כמו ב 1.3.
  15. יוצקים את התרבות החיידקית לבקבוקים המתאימים לצנטריפוגה. תרבות 1 L יכול להיות centrifuged ב 4 250 mL בקבוקים התחתון חרוט. מצנלת את התרבות ב-4 ° צ' במשך 20 דקות ב 3000 x g.. הסופר-על היפטר פסולת נוזלית חיידקית כראוי.
  16. Pipet להשעות מחדש את כדורי ב 25 mL קר PBS (CaCl2 ו MgCl2 הם אופציונליים) לכל תרבות אחת.
  17. העבר את ההשעיה ל 50 מ ל צינורות (1 50 ml). כדור התאים בשעה 3000 x g עבור 20 דקות ב 4 ° c. הענק את הסופרנט. והשלך אותו כראוי
  18. להשעות את התאים ב 10 מ ל של מאגר הליזה (300 מ"מ, 50 mM טריס-HCl, pH 7.5, 20 מ"מ סרפידול, 10% גליצרול, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin, ו-87.1 μg/mL פנילמתיל פלוליאיל פלואוריד (PMSF)) על ידי ליטוף הקפאת ההשעיה עם חנקן נוזלי בבקבוקון Dewar. אחסן את הצינורות לדוגמה במקפיא של 80 ° c. יש לנו לטהר את PCD מפני כדורי מאוחסן-80 ° c למשך שנה אחת ללא כל אובדן לכאורה של פעילות.
  19. השוואת התאים הבלתי המושרה והמושרה על ידי SDS-PAGE.
    הערה: לא היה לנו קושי עם אינדוקציה של PCD הטרודימר. עם זאת, אנו ממליצים לבדוק את האינדוקציה לפני שתמשיך בטיהור במקרה כל מגיב שתוקפו פג במפתיע.
    1. להרכיב צלחות עבור SDS-עמוד (מידות: 7.3 ס"מ x 8.3 ס"מ x 0.75 עובי מ"מ). ג'ל הערמה הוא 1.5 mL 6% פוליאקרילאמיד (6% אקרילאמיד, 125 mM טריס-HCl, pH 6.8, 0.1% SDS, 0.1% אמוניום פרסולפט, 0.001% TEMED). ג'ל הפתרון הוא 3.5 mL 12% פוליאקרילאמיד (12% אקרילאמיד, 375 mM טריס-HCl, pH 8.8, 0.1% SDS, 0.1% אמוניום פרסולפט, 0.001% TEMED). הכנס מסרק של 10 היטב לשכבת הערימה.
    2. טען 10 μL של דגימות בקטריאלי שאינן מושרה והמושרה. טען 4 μL של סמני משקל מולקולרי מקדים עבור חלבונים (איור 1B).
    3. הג הג ב 16.5 V/cm כ 1 h. כחול ברומרופנול צריך להגיע לתחתית הג.
    4. מניחים את ג'ל בכתם כחול Coomassie (10% חומצה אצטית, 40% מתנול, 0.1% הצבע הכחול כחול) באמבט פלסטיק. הכתם צריך לטבול את הג לחלוטין. כתם בטמפרטורת הסביבה עבור 20 דקות. סיבוב עדין בזמן הכתמים הוא אופציונלי.
    5. להחליף את הפתרון עם destain (10% חומצה אצטית, 40% מתנול). דגירה בטמפרטורת הסביבה עם סיבוב עדין אופציונלי עד להקות חלבונים גלויים בקלות.
    6. החליפו את הדכתם במים מפוהים. בין החלבונים חיידקי, המושרה PCD תת יחידות צריך להיות גלוי בתאים המושרה. הקסאחדידין מתויג pcd משנה למעלה pcd יש משקל מולקולרי של 28.3 kda ו-pcd יחידה יחידת הוא 22.4 kda. אם יחידות המשנה של PCD אינן ברורה, יש לבצע אינדוקציה חדשה שנגזר ממושבה הרומן.

2. כרומטוגרפיה של זיקה ניקל לטיהור של PCD

  1. הפשרת קרח 1 50 מ"ל שפופרת של תאים המושרה. זה יכול לקחת 2-3 h כדי להפשיר לחלוטין את המדגם.
  2. שמירה על הצינור על הקרח, sonicate את המדגם 30% משרעת עבור 1 דקות, רכיבה על אופניים 1 s וכיבוי. השתמש מיקרוטיפ מחודדות (קוטר 0.125 אינץ ') sonicator. הכוח המקסימלי הוא 400 W והתדר הוא 20 kHz ו-1 לאחד הגלולה התרבות.
  3. לאחר sonication, להוסיף ליזוזים 0.2 mg/ml הריכוז הסופי (10 מ"ג/ml פתרון מניות) ולשמור על קרח 30 דקות ב 4 ° c.
  4. יוצקים את החיידק החיידקי לתוך בקבוק פוליקרבונט טרום מקורר (מידות: 25 מ"מ x 89 מ"מ). הבקבוק צריך להיות תואם רוטור קבוע ultracentrifuge זווית. צינורות אחרים ו/או לבוש אחרים עשויים להיות מוחלף, אך כוח הכבידה הסופי צריך להישמר.
  5. צנטריפוגה עבור 60 דקות ב 120,000 x g ב 4 ° c. . שרידים סלולאריים יוצרים גלולה הסופרנטאנט עשוי להיראות צהוב.
    1. הגלולה ניתן לכלול בניתוח SDS הבאים כדי לקבוע את מסיסות של PCD (איור 1B). מסיסות הגלולה על ידי vortexing ב 10 מ ל PBS. העבר 150 μL לשפופרת 1.5 mL. הכן את הדוגמה עבור SDS-PAGE כמו ב-1.3.
  6. יוצקים את הסופרנטאנט לצינור הקרה של 50 מ"ל. שים לב לעוצמת הקול. זיהום של סופרנטאנט עם דנ א חיידקי עשוי להניב דגימה צמיגה. הדנ א של הגנומית החיידקי. יכול לחסום את זרימת העמודים השלב ה2.2 של הפעולה צריך לחזור על הגלולה לדנ א החיידקי. ייתכן שגלולה ממהדורה שניה זו לא תהיה גלויה או עשויה להיות שקופה.
  7. הפוך 500 mL Ni מאגר A (300 מ"מ הנאל, 50 mM טריס-HCl, pH 7.5, ו 10% גליצרול, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL ליופטין, ו-87.1 μg/mL PMSF) ו 500 mL Ni מאגר B (300 mM הנאקל, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10% גליצרול, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL ליופטין, ו-87.1 μg/mL PMSF, ב250 מילימטר, משנת pH 8.0). העבר שני מאגרי Ni באמצעות מסנני הנקבוביות 0.2 יקרומטר.
  8. הדוגמה, המאגרים ומערכת ה-FPLC (כרומטוגרפיה נוזלית מהירה בחלבון) נמצאים בחדר קירור ב-4 ° c. לשטוף משאבת A עם Ni מאגר A ו משאבה B עם Ni מאגר B. לשטוף את המערכת עם 20 מ"מ סרמדול (8% Ni מאגר B, 92% Ni מאגר A) עד UV ומוליכות ייצוב. אנו באופן קבוע להזרים מאגרים ב 5 מ ל/דקה עם מגבלת לחץ 1.0 MPa. את קצב הזרימה ואת מגבלת הלחץ צריך להיקבע על ידי המפרט של מכשיר FPLC בשימוש.
  9. הכן עמודה עם שרף מחויב ל-1.5 mL (מידות: 110 מ"מ אורך x 5 מ"מ). קיבולת הכריכה שרף הוא 50 mg/mL והוא יכול לסבול לחץ 1 MPa. ניתן לשפוך עמודה ולאחסנו ב-4 ° צ' לפני הטיהור.
    הערה: גודל העמודה עשוי להיות מוגבר באופן פרופורציונלי כדי להכיל יותר מ 1 50 מ"ל שפופרת של תאים המושרה אם יותר חלבון נדרש. אנו מעדיפים טור טרי עבור כל הכנה כדי להבטיח כי לא שרידי חלבונים לזהם החלבון הרצוי שלנו. עם זאת, שרפים ניקל עשוי להיות ממוחזרים על פי הוראות היצרן.
  10. חבר את העמודה של שרף טעונה ניקל ל-FPLC. הפעל 20 מ ל של 92% Ni מאגר A ו-8% Ni מאגר B (20 מ"מ הסרמידול) ב 0.5 mL/min עם מגבלת הלחץ של ממדי 0.5 באמצעות העמודה כדי להגביל. בזמן אמת FPLC צריך למדוד A280 (280 ננומטר לספיגת UV) כמו גם מוליכות. אם ערכים אלה לא התייצבו לאחר שעוצמת הקול של 20 mL עברה את העמודה, יש להזרים את המאגרים עד שיוצב.
  11. טען את המדגם לעמודה (~ 10 mL) ב 0.15 mL/min. הגדר את מגבלת הלחץ ל 0.5 MPa. לאסוף את הזרימה דרך.
  12. שטוף את העמודה עם 20 מ"ל Ni מאגר ב 20 מ"מ סרמדול (92% Ni מאגר A ו-8% Ni מאגר B). שמור את הכביסה בצינור 50 mL לניתוח. שטוף את העמודה עם 15 מ ל של 50% Ni מאגר A ו 50% Ni מאגר B (125 מ"מ הסרמאזול). לאסוף את הימנעות 19 שברים של 0.8 mL נפח. שטוף את העמודה עם 15 מ"ל 100% Ni מאגר B. לאסוף 75 שברים נוספים של 0.2 mL. חלק PCD הטרודימר יהיה elute בשנת 50% Ni מאגר B לשטוף, אבל רוב הטרודימר יהיה elute ב 100% Ni מאגר B לשטוף.
  13. ניתוח שברים שנאספו על 12% SDS-דף ג'לים כדי לאשר נוכחות של PCD. הוסף אמצעי אחסון שווים של צבע טעינה של 2X לזרימה דרך, שטוף והשיא280 שברים. מרתיחים עבור 3 דקות.. להעביר לקרח יוצקים 2 12% SDS-דף ג'לים (כמו בשלב 1.7). חזור על שיטת הג כפי שמתואר ב1.7.

3. שיטת הפעולה של nuclease

  1. בהתבסס על ניתוח ה-SDS-PAGE, זהה שברים של קירבת ניקל המכילים PCD כמעט טהור. שילוב 5 μL כרומטוגרפיה שבר ו 500 ng 3 kb המתפתל pXba בתוך מאגר התגובה (50 mM טריס-HCl, pH 7.5, 100 mM הנאקל, 5 מ"מ MgCl2, 0.1 MM dtt) עם נפח סופי של 50 μl.
    1. מודטה ב 37 ° c בשביל 1 h.
    2. כלול פקד שלילי (ללא חלבון מוסף) ופקד חיובי (PCD זמין מסחרית). להפסיק את התגובה עם 10 μL פתרון להפסיק (150 mM EDTA, pH 8.0, 0.6% SDS, 18% גליצרול, 0.15% כתום G).
    3. ניתן לשמור דוגמאות במקפיא של 20 ° c כדי לעבור ניתוח מאוחר יותר. ניתן להשתמש בכל הפלסטיות המתפתל בתוך שימוש בתנאי נוקלאז, כל עוד המוצרים המנופפים והרגועים של מעגלי העיגול עלולים להיפתר על ידי אלקטרופורזה בג ג'ל.
  2. יוצקים 120 mL 1% agarose ג'ל ב 1 x מאגר אתידיום טאי (40 mM Tris-אצטט, 1 מ"מ EDTA, 0.5 μg/mL אתידיום ברומיד) ב מיצוק ג'ל (מידות: 15 x 10 ס מ). השתמש מסרק 15 טוב (מידות טוב: 5mm x 1.5 מ"מ). כאשר הג מוגדר, לטבול אותו במאגר 1 x טאי אתידיום.
  3. לנתח 30 μL של תגובות על ידי ג ' התעורר ג'ל. החשמל בטמפרטורה של 10%/ס מ בטמפרטורת הסביבה כ-1 h. חזית הצבע של אורנג ' G צריכה להיות בסוף הג.
  4. השתמש בסורק הפלואורסצנטית כדי לדמות מיד את האות אתידיום ברומיד של ג'ל. אם שימש 3 ק ג פלמיד, הלהקה האיטית ביותר יהיה עיגולים רגועים ב ~ 3.5 kb, ה-DNA ליניארי יפעל ב 3 kb, ו מתפתל מפותל יהיה הניידות המהירה ביותר ~ 2 kb.
    1. חשב את נפח הפיקסלים הכולל של כל נתיב עם תוכנת ניתוח תמונה.
    2. לקבוע את עוצמת הפיקסל של מינים שונים DNA, כגון מתפתל, ליניארי, ופצע עיגולים. השתמש בערכים אלה כדי לקבוע את האחוז של כל מיני DNA. לדוגמה, נוכחות מוגברת של עיגולים בחתך המשויכים לשבר בהשוואה לפקד השלילי מציינת את הנוכחות של nuclease. נפח הפיקסלים של עיגולים שנגנב בנתיב מחולק בערך הפיקסל של דנ א מוחלט. קבע אחוזים על-ידי הכפלת מספר זה ב-100.
  5. לשלב שברים מפסגת המנוע השני המכילים כמעט טהורה pcd הטרודימר מבוסס על sds-העמוד ניתוח ויש להם מינימלי כדי לגילוי פעילות נוקלאז. נפח המאגר האופייני שלנו. הוא ~ 2 מ ל
  6. העמיסו את המדגם ליחידת מסנן צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי 10 kDa. צנטריפוגה ב צנטריפוגה מנופף דלי ב 4000 x g עבור 40 דקות ב 4 ° c. לחלופין, ניתן להשתמש ב-35 מעלות זווית קבועה ב-7500 x g עבור 20 דקות ב-4 ° c.
    1. חזור על הצנטריפוגה עד לעוצמת הקול הסופית היא 100-200 μL.
    2. הפוך את יחידת הסינון ושחזר את הרטיאנאט על-ידי צנטריפוגה ב-1000 x g עבור 2 דקות ב-4 ° c.

4. החרגת גודל כרומטוגרפיה טיהור של PCD

  1. להפוך 250 mL גודל הדרה כרומטוגרפיה (שניות) פועל מאגר (100 mM הנרוג, 50 mM טריס-HCl, pH 7.5, 10% גליצרול, 0.1 mM EDTA, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL ליופטין, ו-87.1 μg/mL PMSF). להעביר את המאגר באמצעות מסנן הנקבוביות 0.2 יקרומטר ולאחסן ב 4 ° c.
    הערה: בצע את כל השלבים בחדר קירור ב -4 ° c. טיהור SEC הוא אופציונלי, אך יש לאחסן את החלבון במאגר שפועל באמצעות SEC. אם משמיטים את הטיהור של SEC, הרטיט שנאסף ב3.6.2. צריך להיות דיאליזה נגד 1 L של מאגר SEC ב 10 kda mwco (משקל מולקולרי לחתוך) צינור דיאליזה ב 4 ° c הלילה.
  2. שיטה הכוללת עמודה מקושרת בין שניה (כרומטוגרפיה של אי-הכללה) (מידת כרומטוגרפית: 10 מ"מ x 300 מ"מ; 24 מיקרומטר במיטה; 25-500 μL לדוגמה אמצעי אחסון; 1.5 MPa מגבלת הלחץ; 2 x 106 דה מגבלת הכללה; 1 עד 300 הפרדת הדיסק) עם מאגר הפעלה 0.5 של sec בשעה
    הערה: אם ייתכן שנעשה שימוש בעמודות בגודל חלופי הרצוי.
  3. טען את השברים המרוכזים ללולאה של הזרקת אמצעי אחסון מ200 μL. טען את המדגם ב0.5 mL/min לעמודה. רזולוציית SEC גדלה עם נפח טעינה קטן יותר. Elute עם 23 מ"ל שניה פועל מאגר ולאסוף 94 שברים של 250 μL. כרומטוגרם SEC צריך לפתור יחיד A280 שיא כי הוא pcd הטרודימר. . מצאנו את הדיסק ה8.9 mL התזמון החומק ישתנה באמצעות עמודות חלופיות של SEC.

5. החמצון pca ופעילות נוקלאז

  1. התגובות לתוך היצע הן חמצון של pca ו נוקלאז הפעילות מתבצעים בלוח 96-ובכן שטוח למטה. להרכיב תגובות ב 96 צלחת באר על קרח בחדר 4 ° c הקרה כדי למנוע זרז מוקדמת. לשלב בכרך הסופי של 50 μL: 130 mM הנאליט, 50 mM טריס-HCl, pH 7.5, 5 מ"מ MgCl2, 0.1 MM dtt, 5 מ"מ pca, 10 Ng/mL סופר מתפתל pXba +, ו 10 μl של שברים בודדים PCA SEC.
    הערה: השברים PCD SEC יש להוסיף האחרון ומיד לפני ניתוח כמו חלבון יתחיל לזרז בזמן נוסף.
  2. החמצון PCD של PCD תוצאות ספיגה מופחתת של PCD ב 290 nm (A290). העבר את צלחת ה96 היטב למחזיק הצלחות של קורא צלחת להגדיר טמפרטורה פנימית של 37 ° c. למשוך את מחזיק הצלחת לתוך המכשיר ולמדוד A290 במרווחי זמן של 20 עבור 1 h. האם המכשיר לנער את צלחת 5 s לפני כל קריאה.
  3. אחרי 1 h, לסיים את התגובות על ידי הוספת 10 μL פתרון להפסיק (150 mM EDTA, pH 8.0, 0.6% SDS, 18% גליצרול, 0.15% כתום G).
  4. להכין, לטעון, ולהפעיל ג'ל שנוצר כמו בשלב 3.2.
  5. תמונה ולנתח את ג'ל agarose כמו בשלב 3.3.
  6. בחר שברים עם הפעילות החמצון ביותר pca ואין זיהום נוקלאז שנצפו לאחסון לטווח ארוך ב-80 ° c. . תמדוד אתה280
  7. חשב את הריכוז הכולל של PCD באמצעות A280 ומקדם ההשמדה (ε280) של 734,700 M-1ס מ-1.
  8. הצמד שברים בודדים הקפאה בחנקן נוזלי. חנות במקפיא. של 80 ° c לחלופין, לשלב פעיל, nuclease-שברים חינם, aliquot ו להקפיא באותו אופן. התשואה האופיינית שלנו היא 1-2 mg PCD לתרבות L. שימוש אופייני בניסוי SM הוא 3 μg PCD. השתמשנו ב-PCD המאוחסן ב-80 ° צ' עד 1 שנה ללא ירידה בפעילות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מסחרית זמין החמצן PCD הוא מזוהם לעתים קרובות עם nuclease DNA. פעילות מזהם נוקלאז עלולה להוביל לתוצאות מזויפות בלימודי פלורסנט, בעיקר מחקרים שניתוח dna או dna אינטראקציה חלבונים. מצאנו כי רקומביננטי PCD, הטרודימר של הקסאחדין מתויג למעלה ו-Pcd, ניתן להתבטא ב-E. coli (איור 1). הטרודימר מטוהר תחילה על ידי כרומטוגרפיה של זיקה ניקל (איור 2). PCD משתמט ב -2 שלבים של ריכוזי הפפירון. שברים בכרומטוגרפיה מנותח על ידי SDS-PAGE. שברים של PCD כמעט טהור מרוכזים ומטוהרים עוד יותר על ידי SEC (איור 3). שברים SEC מנותח בנפרד עבור פעילות חמצון pca ופעילות נוקלאז (איור 4). שברים המוצגים פעילות חמצון גבוהה ואין פעילות נוקלאז לכאורה הם מחפשים ריכוז חלבון ושמרו ב-80 ° c מקפיא לשימוש ניסיוני.

Figure 1
איור 1: אינדוקציה של PCD ב -E. coli. (א) PVP91A-pcaHG מוצג עם הקאג (α) והקססיסטידין-מתויג (β) pcd-יחידות משנה. (ב) נציג sds-ג'ל עמוד של pcd אינדוקציה. משקל מולקולרי מצוין בצד שמאל. הmobilities של 28.3 kDa הקסאחדין-מתויג למעלה ו 22.4 kDa הקאג נמצאים בצד ימין. בלתי מושרה e. coli (האו ם), המושרה e. coli (In), את הגלולה הבאה e. coli לליזה ו-Ultracentriפוגות (P), הסופרנטאנט לאחר לאחר הכול להיות טעון לעמודת ניקל (S), החלק המייצג בעקבות ניקל כרומטוגרפיה (Ni), ואת החלק המייצג איור זה השתנה מפרסום קודם של12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: כרומטוגרפיה של זיקה ניקל לטיהור של PCD. (א) כרומטוגרמה של ניקל של זיקה כרומטוגרפיה של pcd. The A280 מוצג בכחול את אחוז הריכוז של Ni מאגר B מוצג באדום. הדגימה נטענה בריכוז. נמוך של 20 מ"מ Flowthrough (Flw החוצה) מראה את החלבונים בקטריאלי מסיסים שלא לאגד את שרף ניקל. הטור נשטף עם 20 מ ל של. מאגר הסראזול של 20 מ"מ שטיפת מילימטר של 15 מ מ בוצעה עם 125 מ"מ. האלודיזציה של PCD בוצעה עם 250 מ"מ. מספר מסוים של PCD בנוכחות של סרפיאזול מ-125 מ"מ, אבל רוב החלבונים המריאו בשנת 250 מילימטר. (ב) נציג sds-ניתוח דפים של שברים בעלי זיקה ניקל. העומס, flowthrough (Flw), ושטיפת הראשון הראה את אינדוקציה מוצלחת של PCD, חלבונים חיידקיים מסיסים שלא לאגד את שרף ניקל, ואת חלבונים מינימליים נצפתה בכביסה הראשונה, בהתאמה. מספר שברים במהלך הכביסה השנייה ושלבי הימנעות מוצגים. שברים מתוך השטיפה השנייה כלל חלבון PCD אך מוצגים גם מזהמים מולקולריים גבוהים לזיהוי. שברים משלב הימנעות נראו ללא מזהמים. משקל מולקולרי מוצג בצד שמאל. משמאל לMobilities ולראש הקאג מוצגים מימין. (ג) העלה ג'ל לגבי הסדר של נוקלאז. הטעינה של העמודה הקרבה, flowthrough, לשטוף, ושברים מרובים נבדקו עבור פעילות נוקלאז. שליטה שלילית (בקרה) היא הפלסאמצע ללא חלבון נוסף. שליטה חיובית (PCDa) הוא pcd זמין מסחרית ידוע להיות מזוהם עם nuclease DNA. מינים DNA מצוינים על הזכות כמו שברי קטן (SF), סופר מתפתל (SC), ליניארי (LN), מעגל הפצע (NC), ו הפצע דיימר (ND). (ד) כימות של מינים DNA שונים שנצפו בתוך השיטת agcחכירה ג'ל. נפח הפיקסלים הכולל של כל נתיב נמדד. הנפח פיקסל של כל מיני DNA נקבע וביטא כאחוז של נפח הפיקסל הכולל בנתיב. השליטה השלילית הייתה 81.7%. מתפתל עם 14.4% מעגלי הפצע השליטה החיובית הציגה גידול משמעותי של 46.0% מעגלים הפצע. העומס ו flowthrough נוקלאוסיס חיידקי הכיל כי המירו את הפלביניים והזיהום DNA חיידקים לרסיסים קטנים. השטיפה הראשונה ב -20 מילימטר מהסרמאזול הופיעה גם כשהיא מכילה פעילות נוקלאז משמעותית, וכתוצאה מכך מעגלים לינאריים ומוכי פצע. שברים 4-7 מתוך השטיפה השנייה ב-125 מילימטר לאחר מכן הציגו גם פעילות נוקלאז משמעותית (במיוחד, שברים 4 ו-5 שהופקו שנצפו לינדמיד). שברים 29-38 משלב הימנעות הופיעו בדומה יותר לפקד השלילי. בדוגמה זו, שברים 29-38 נבחרו להיות משולבים, מרוכזים, ומטוהרים עוד יותר על ידי SEC. איור זה השתנה מפרסום קודם של12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: שניות לטיהור של PCD. (A) chromatogram של שניות של PCD שברים בעקבות כרומטוגרפיה של זיקה ניקל. ה-A280 מוצג בשברים כחולים ושברים שאינם מסומנים. האלבום הגיע מרשות השנייה כפסגה אחת לכאורה. (ב) נציג sds-ניתוח דף של שברים SEC 33-48. העומס הוא PCD מרוכז לאחר האהדה הקרבה ניקל. שברים 33-48 מחלקים את פסגת SEC הגלויה. אין להבחין במזהמים שנצפו. (ג) העלה ג'ל לגבי הסדר של נוקלאז. העומס של SEC ושברים מרובים נבדקו עבור פעילות נוקלאז. שליטה שלילית (בקרה) היא הפלסאמצע ללא חלבון נוסף. שליטה חיובית (PCDa) הוא pcd זמין מסחרית ידוע להיות מזוהם עם nuclease DNA. מינים DNA מצוינים בצד שמאל כמו סופר מתפתל (SC), מעגל פצע (NC), ופצע דיימר (ND). (ד) כימות של מינים DNA שונים שנצפו בתוך השיטת agcחכירה ג'ל. נפח הפיקסלים הכולל של כל נתיב נמדד. הנפח פיקסל של כל מיני DNA נקבע וביטא כאחוז של נפח הפיקסל הכולל בנתיב. השליטה השלילית הייתה 82.1% המתפתל באמצעות רק 13.7% מעגלים מוכי הפצע. השליטה החיובית הציגה גידול משמעותי של 64.8% מעגלים הפצע. העומס SEC לא הציג פעילות לכאורה נוקלאז בשל הבחירה הנכונה של שברים מתוך האהדה זיקה ניקל. באופן דומה, שברים 33-48 הופיעו בדומה לפקד השלילי. לדוגמה, שבר 36 היה 82.5% סופר המתפתל ו 13.2% פצע מעגל. בדוגמה זו, שברים 36 ו 37 נבחרו להיות כמותית, קפוא, ושמרו ב-80 ° c מקפיא לשימוש ניסיוני עתידי. איור זה השתנה מפרסום קודם של12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: חמצון pca ופעילות נוקלאז של שברים pca SEC. חמצון PCA נמדד על ידי A290. כמו PCD תחמוצת המולקולה PCD,290 A ירד. חמצון PCA נמדד כל 20 s עבור 1 h. שליטה שלילית עם שבר PCD לא נוסף (הקו הכחול) לא הראה שינוי ב A290, המציין את מולקולת pcd היה יציב. נתונים מתוך שלושה שברים נציג שניה (36 באדום, 33 בכתום, 39 בצהוב) להראות כי PCD מטוהרים מופחת A290, המציין חמצון של pcd. איור זה השתנה מפרסום קודם של12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מערכות ניקוי חמצן כלולים בדרך כלל במיקרוסקופ יחיד מיקרוסקופ פלואורסצנטית כדי להפחית את הלבנה3,7,8. טכניקות אלה מיקרוסקופיה משמשות לעתים קרובות כדי להתבונן חומצות גרעין או אינטראקציות חלבונים עם חומצות גרעין1,13,14. זיהום של OSSs עם הנוקלאוסים עלול להוביל לתוצאות מזויפות.

Osss זמין מסחרית, כולל godcat ו-pcd, הוכחו לכלול זיהום נוקלאז משמעותי11. ניתן לרכוש pcd ו להעסיק SEC כדי להסיר את זיהום נוקלאז11. עם זאת, המחיר של PCD זמין מסחרית מספק אחד גדל 5 קיפול לאחר הפרסום של שיטה זו. שיטה זו מייצרת פעיל מאוד, נוקלאז חינם pcd הטרודימר והוא יכול להתבצע תוך שבוע אחד. בניסיון שלנו, כמות PCD שנוצר על ידי התרבות 1 L (1-2 mg) מספיק עבור שנה אחת של ניסויים (3 μg/ניסוי) במעבדה יצרנית עם 2 מערכות הדמיה פלורסנט.

יעילות האינדוקציה היא המפתח להצלחת שיטה זו. אם PCD הטרודימר אינו מושרה ביעילות וברור על ידי SDS-PAGE, טיהור לא יצליח. ניתן לנסות שתי אסטרטגיות חלופיות. תחילה, ניסיון האינדוקציה של מושבה אחרת על הצלחת המרה E. coli . שנית, יש לנו הצלחה קודמת עם BL21, אבל מאמץ חלופי E. coli לביטוי, כגון BL21, יכול להישפט. הצלחה של שיטת חמצון PCA מסתמך על חשיפה מינימלית של המצע ל PCA לפני התחלת השיטת. מומלץ מאוד להרכיב את התגובות 96 צלחת הבאר על קרח בחדר קר ולהוסיף את דגימת חלבון מיד לפני טעינת הצלחת לקורא.

כרומטוגרפיה של זיקה ניקל עשוי להיות מספיק כדי לזהות שברים של pcd טהור ללא פעילות מזהם נוקלאז. במקרה זה, ניתן לבטל את הטיהור של SEC. עם זאת, יש לשלב את השברים בכרומטוגרפיה ולעשות שילוב של לילה ב -4 ° c ב-SEC במאגר. הנוכחות של גליצרול במאגר הריצה של SEC חשובה לאחסון ב-80 ° c.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי NIH GM121284 ו-AI126742 ל-KEY.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 βME
30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 Bio-Rad 161-0156
Acetic acid, Glacial Certified ACS Fisherl Chemical A38C-212
Agar, Granulated BD Biosciences DF0145-17-0
AKTA FPLC System GE Healthcare Life Sciences AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore UFC201024 10 kDa MWCO
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma F-2262
Ammonium Persulfate (APS) Tablets Amresco K833-100TABS
Ampicillin Amresco 0339-25G
Bacto Tryptone BD Biosciences DF0123173
BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract VWR 90004-092
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) Sigma-Aldrich B6755-500G
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coomassie Brilliant Blue Amresco 0472-50G
Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate Bio-Rad 2240096EDU
DTT P212121 SV-DTT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML Sigma-Aldrich D8537-500ML PBS
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Granulated LB Broth Miller EMD Biosciences 1.10285.0500
Hi-Res Standard Agarose AGTC Bioproducts AG500D1
Imidazole Sigma-Aldrich I0250-250G
IPTG Goldbio I2481C25
Leupeptin Roche 11017128001
Lysozyme from Chicken Egg White Sigma-Aldrich L6876-1G
Magnesium Chloride Hexahydrate Amresco 0288-1KG
Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability Thermo Fisher ND-2000C
NaCl P212121 RP-S23020
Ni-NTA Superflow (100 ml) Qiagen 30430
Novagen BL21 Competent Cells EMD Millipore 69-449-3 SOC media included
Orange G Fisher Scientific 0-267
Pepstatin Gold Biotechnology P-020-25
PMSF Amresco 0754-25G
Protocatechuic acid Fisher Scientific ICN15642110 PCA
Sodium dodecyl sulfate P212121 CI-00270-1KG
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devises
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL Thermo Fisher Scientific 09-741-04
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL Thermo Fisher Scientific 09-741-02
Superose 12 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 17517301
TEMED Amresco 0761-25ML
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager GE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174, (6), 553-557 (1990).
  2. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90, (2), 448-454 (2014).
  3. Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
  4. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36, (2), 280-290 (2003).
  5. Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3, (1), 17-25 (2004).
  6. Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275, (3-6), 367-375 (1992).
  7. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, (5), 1826-1835 (2008).
  8. Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216, (1), 49-68 (1990).
  9. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, (14), 6132-6138 (2010).
  10. Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
  11. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12, (10), 901-902 (2015).
  12. Senavirathne, G., Lopez, M. A. Jr, Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
  13. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
  14. Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539, (7630), 583-587 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics