Espressione e purificazione di Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Diossigenasi

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Protocatechuate 3,4-diossigenasi (PCD) può rimuovere ezimaticamente l'ossigeno diatomico libero da un sistema acquoso utilizzando il suo acido protocatechuico del substrato (PCA). Questo protocollo descrive l'espressione, la purificazione e l'analisi dell'attività di questo enzima di scavenging dell'ossigeno.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Messer, R. K., Lopez Jr., M. A., Senavirathne, G., Yoder, K. E. Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase. J. Vis. Exp. (153), e59599, doi:10.3791/59599 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

La microscopia a singola molecola (SM) viene utilizzata nello studio delle interazioni molecolari dinamiche delle biomolecole con etichetta fluoroforo in tempo reale. Tuttavia, i fluorofori sono inclini alla perdita di segnale tramite fotosbiancamento mediante ossigeno disciolto (O2). Per prevenire il fotosbiancamento ed estendere la durata del fluoroforo, vengono impiegati sistemi di scavenging dell'ossigeno (OSS) per ridurre O2. L'OSS commercialmente disponibile può essere contaminato da nucleasi che danneggiano o degradano gli acidi nucleici, confondendo l'interpretazione dei risultati sperimentali. Qui abbiamo dettagliato un protocollo per l'espressione e la purificazione di Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-diossigenasi (PCD) senza contaminazione da nuclease rilevabile. La PCD può rimuovere in modo efficiente le specie reattive di O2 mediante la conversione dell'acido protocatechuic del substrato (PCA) in 3 carboxy-cis, acido cis-muconico. Questo metodo può essere utilizzato in qualsiasi sistema acquoso in cui O2 svolge un ruolo dannoso nell'acquisizione dei dati. Questo metodo è efficace nella produzione di PCD altamente attivo e privo di nuclesi o meno rispetto al PCD disponibile in commercio.

Introduction

La biofisica a singola molecola (SM) è un campo in rapida crescita che cambia il modo in cui guardiamo ai fenomeni biologici. Questo campo ha la capacità unica di collegare le leggi fondamentali della fisica e della chimica alla biologia. La microscopia a fluorescenza è un metodo biofisico che può raggiungere la sensibilità SM. La fluorescenza viene utilizzata per rilevare le biomolecole collegandole a piccoli fluorofori organici o punti quantici1. Queste molecole possono emettere fotoni quando sono eccitate dai laser prima del fotosbiancamento irreversibilmente2. Il fotosbiancamento si verifica quando le etichette fluorescenti subiscono danni chimici che distruggono la loro capacità di eccitare alla lunghezza d'onda desiderata2,3. La presenza di specie reattive dell'ossigeno (ROS) in tamponanti acquosi sono una causa primaria di fotosbiancamento2,4. Inoltre, ROS può danneggiare le biomolecole e portare a osservazioni errate negli esperimenti SM5,6. Per prevenire danni ossidativi, i sistemi di scavenging dell'ossigeno (OSS) possono essere utilizzati3,7,8. Il sistema di ossidasi/catalasi di glucosio (GODCAT) è efficiente nella rimozione dell'ossigeno8, ma produce come intermedi. Questi possono essere dannosi per le biomolecole di interesse negli studi SM.

In alternativa, protocatechuate 3,4 diossigenasi (PCD) rimuoverà in modo efficiente O2 da una soluzione acquosa utilizzando il suo acido protocatechuic substrato (PCA)7,9. PCD è un metalloenze che utilizza ferro nonheme per coordinare PCA e catalizzare la reazione di apertura dell'anello catechol utilizzando disciolto O210. Questa reazione in un solo passo è indicata per essere un OSS nel complesso migliore per migliorare la stabilità del fluoroforo negli esperimenti SM7. Sfortunatamente, molti enzimi OSS disponibili in commercio, tra cui PCD, contengono nucleasi contaminati11. Questi contaminanti possono portare al danno dei substrati a base di acido nucleico utilizzati negli esperimenti SM. Questo lavoro chiarirà un protocollo di purificazione basato sulla cromatografia per l'uso di PCD ricombinanti nei sistemi SM. La PCD può essere ampiamente applicata a qualsiasi esperimento in cui i ROS danneggiano i substrati necessari per l'acquisizione dei dati.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Indurre l'espressione PCD in E. coli

  1. Unire 1 pVP91A-pcaHG di espressione PCD espressione pVP91A-pcaHG espressione plasmid (20 ng/l, Figura 1A) e 20 L di E.coli BL21 (20 cellule disponibili in commercio, > 2 x 106 cfu / plaspilofo) in un tubo. Scorrere il tubo per mescolare. Posizionare il tubo sul ghiaccio 5 min.
  2. Collocare la trasformazione a 42 gradi centigradi per 30 s. Poi ghiaccio 2 min.
  3. Aggiungere 80 supporti SOC (brodo super ottimale con repressione del gatto: 2,5 mM KCl, 10 mM NaCl, 2% tryptone, 0,5% di estratto di lievito, 10 mM MgSO4, 10 mM MgCl2, 20 mm di glucosio). Agitare a 225 giri al min (rpm) 37 gradi centigradi per 1 h.
  4. Piastra la reazione di trasformazione su LB Amp Agar (1L Luria Broth agar: 10 g NaCl, 10 g di bacptone, 5 g di estratto di lievito, 15 g di agar, 50 g/mL di ampicillina; 25 mL per 10 cm di diametro piatto petri).
  5. Incubare la piastra, coperchio rivolto verso il basso, a 37 gradi centigradi per 16-18 h.
  6. Inoculare 50 mL LB Amp (1L LB: 10 g bacptone bacptone, 10 g NaCl, 5 g di estratto di lievito, 50 g/mL di ampicillina) in un fiaschetare Erlenmeyer da 250 ml con una colonia. Incubare a 37oC per 16-18 h agitazione a 225 giri/min.
  7. Trasferire 20 mL di coltura a un pallone da 4 L con 1 LB Amp. Agitare a 225 giri/min a 37 gradi centigradi.
  8. Ogni h misura la coltura OD600 (densità ottica a 600 nm). Poiché la coltura OD600 si avvicina a 0,5, aumentare la frequenza delle misurazioni ogni 15 min. La densità desiderata della coltura è 0,5 OD600.
  9. Trasferire il pallone 4L in un bidone di ghiaccio. Swirl il pallone nel bagno di ghiaccio per ridurre la temperatura di coltura.
    Nota:< Il tempo sul ghiaccio deve essere ridotto al minimo in modo che le cellule rimangano metabolicamente attive. Idealmente le cellule saranno sul ghiaccio meno di 10 min.
  10. L'induzione di PCD può essere osservata con successo mediante l'analisi denatura del solfato di sodio solfato polyacrilmide gel elettroforresi (SDS-PAGE). Raccogliere 1 mL della coltura indotta in un tubo. Girare il campione 1 min a 14.000 x g in un microfuge a temperatura ambiente. Decant il super-natante.
    1. Solubilizzare le cellule pellettate in PBS 150 (salina tamponata da fosfato).
    2. Aggiungere un volume uguale di 2X colorante di carico (1,2% SDS, 30% glicerolo, 150 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,0018% blu bromofenolo, 15% -mercaptoetanolo). Vorticare il campione per mescolare accuratamente.
    3. Far bollire il campione per 3 min e trasferirlo nel ghiaccio. Il campione può essere conservato in un congelatore a -20 gradi centigradi per analisi future.
      Nota:< PBS è disponibile in commercio con o senza CaCl2 e MgCl2. Molti laboratori avranno PBS senza CaCl2 e MgCl2 per i metodi di coltura cellulare. Non abbiamo trovato alcuna differenza con PBS con o senza CaCl2 e MgCl2.
  11. Trasferire il pallone da 4 L in un'incubatrice a 17 gradi centigradi con 180 giri di /M. Continuare a monitorare l'OD600 ogni 20 min.
  12. A 0.7 OD600 aggiungere isopropili-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) a 0,5 mm di concentrazione finale (0,25 M soluzione stock) e 10 mg/L ferro di ammonio (II) solfato esaidrato (Fe(NH4)2(So4)2, 10 mg/mL soluzione stock). I geni PCD pcaH e pcaG sono indotti dal promotore T5 con l'aggiunta di IPTG (Figura 1A). Il solfato di ferro è vincolato da PCD e richiesto per l'attività catalitica coordinando l'ossigeno durante l'apertura del catechole.
  13. Agitare la coltura a 180 giri/min a 17 gradi centigradi per 18 ore.
  14. Posizionare il pallone di coltura nel ghiaccio come in 1.2. Raccogliere 1 mL delle cellule indotte per SDS-PAGE come in 1.3.
  15. Versare la coltura batterica in bottiglie adatte alla centrifugazione. Una coltura da 1 L può essere centrifugata in 4 bottiglie di fondo conico da 250 mL. Pellet la coltura a 4 gradi centigradi per 20 min a 3000 x g. Decant i supernatanti. Smaltire i rifiuti liquidi batterici in modo appropriato.
  16. Pipet per risospendere i pellet in 25 mL freddo PBS (CaCl2 e MgCl2 sono opzionali) per 1 l coltura.
  17. Trasferire la sospensione a tubi conici da 50 mL (1 tubo da 50 mL per 1 coltura L). Pellere le cellule a 3000 x g per 20 min a 4 gradi centigradi. Decant il super-natante e disporre in modo appropriato.
  18. Risospendere le cellule in 10 mL di buffer di lisi (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM imidazolo, 10 % glicerolo, 800 ng/mL Pepstatin, 1 G/mL Leupeptin, e 87,1 g/mL di fluoride di fenilmethlfonyl (PMSF)) mediante pipetta. Congelare la sospensione con azoto liquido in una fiaschetta Dewar. Conservare i tubi campione in un congelatore da -80 gradi centigradi. Abbiamo purificato il PCD dai pellet immagazzinati a -80 gradi centigradi per un anno senza alcuna perdita apparente di attività.
  19. Confrontare le cellule non indotte e indotte da SDS-PAGE.
    Nota:< Non abbiamo avuto difficoltà con l'induzione di eterodimero PCD. Tuttavia, si consiglia di testare l'induzione prima di continuare con la purificazione nel caso in cui un reagente è scaduto in modo imprevisto.
    1. Assemblare piastre per SDS-PAGE (dimensioni: 7,3 cm x 8,3 cm x 0,75 mm di spessore). Il gel impilabile è 1,5 mL 6% poliacrilamide (6% acrilammide, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,1% SDS, 0.1% persulato di ammonio, 0.001% TEMED). Il gel di risoluzione è 3,5 mL 12% poliacrilammide (12% acrilammide, 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% SDS, 0.1% persulato di ammonio, 0.001% TEMED). Inserire un pettine di 10 pozzetto nello strato di impilamento.
    2. Caricare 10 - L di campioni batterici indotti e indotti. Caricare 4 - L di marcatori di peso molecolare prestained per le proteine (Figura 1B).
    3. Elettroforizzare il gel a 16,5 V/cm circa 1 h. Il blu bromofenolo dovrebbe raggiungere il fondo del gel.
    4. Mettere il gel in macchie blu Coomassie (10% di acido acetico, 40% metanolo, 0.1% Coomassie Blue colorante) in una vasca di plastica. La macchia dovrebbe immergere completamente il gel. La macchia a temperatura ambiente per 20 min. La rotazione delicata durante la colorazione è facoltativa.
    5. Sostituire la soluzione con destain (10% di acido acetico, 40% metanolo). Incubare a temperatura ambiente con rotazione delicata opzionale fino a quando le bande proteiche sono prontamente visibili.
    6. Sostituire la destain con acqua deionizzata. Tra le proteine batteriche, le sottounità PCD indotte dovrebbero essere visibili nelle cellule indotte. La sottounità PCD con etichetta esaracena pcaH ha un peso molecolare di 28,3 kDa e la sottounità pcaG è 22,4 kDa. Se le sottounità PCD non sono evidenti, deve essere eseguita una nuova induzione derivata da una nuova colonia.

2. Purificazione cromatografia affinità Nickel di PCD

  1. Scongelare sul ghiaccio un tubo di 50 mL di cellule indotte. Potrebbe essere necessario 2-3 h per scongelare completamente il campione.
  2. Mantenere il tubo sul ghiaccio, sonicare il campione al 30% di ampiezza per 1 min, ciclismo 1 s on e off. Utilizzare un microtip rassomato (diametro 0.125 pollici) sonicatore. La potenza massima è 400 W e la frequenza è di 20 kHz e per pellet di coltura 1 L.
  3. Dopo la sonicazione, aggiungere lysozyme a 0,2 mg/mL di concentrazione finale (soluzione di stock 10 mg/ml) e tenere sul ghiaccio per 30 min a 4 gradi centigradi.
  4. Versare il lisato batterico in una bottiglia di policarbonato pre-raffreddato (dimensioni: 25 mm x 89 mm). La bottiglia deve essere compatibile con un rotore a ultracentrica ad angolo fisso. Altri tubi e/o rotori possono essere sostituiti, ma la forza di graviazione finale deve essere mantenuta.
  5. Centrifuga per 60 min a 120.000 x g a 4 gradi centigradi. I detriti cellulari formeranno un pellet. Il super-nato può apparire giallo.
    1. Il pellet può essere incluso nella successiva analisi SDS-PAGE per determinare la solubilità della PCD (Figura 1B). Solubilizzare il pellet vortice in PBS da 10 mL. Trasferire 150 l su un tubo da 1,5 mL. Preparare l'esempio per SDS-PAGE come in 1.3.
  6. Versare il supernatante in un tubo conico freddo da 50 mL. Prendere nota del volume. La contaminazione del super-natore con DNA batterico può produrre un campione viscoso. Il DNA genomico batterico potrebbe bloccare il flusso della colonna. La fase di ultracentrifuga 2.2 deve essere ripetuta per pelletare il DNA batterico. Un pellet di questa seconda rotazione potrebbe non essere facilmente visibile o trasparente.
  7. 500 mL Ni Buffer A (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 e 10% glicerol, 800 ng/mL Pepstatin, 1g/mL Leupeptin, 87,1 g/mL PMSF) e 500 mL Ni Buffer B (300 mL 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% glicerolo, 800 ng/mL Pepstatin, 1 G/mL Leupeptin, e 87,1 g/mL PMSF, 250 mM imidazole, pH 8.0). Passare entrambi i buffer Ni attraverso i filtri pori da 0,2 m.
  8. Il campione, i tamponi e il sistema FPLC (fast protein liquid chromatoography) si trovano in una stanza refrigerata a 4 gradi centigradi. Pompa di lavaggio A con Ni Buffer A e pompa B con Ni Buffer B. Lavare il sistema con 20 mM imidazole (8% Ni Buffer B, 92% Ni Buffer A) fino a quando i raggi UV e conduttività si stabilizzano. Scorrono regolarmente buffer a 5 mL/min con un limite di pressione di 1,0 MPa. La portata e il limite di pressione devono essere determinati dalle specifiche dello strumento FPLC utilizzato.
  9. Preparare una colonna con resina carica di nichel da 1,5 mL (dimensioni: 110 mm di lunghezza x 5 mm). La capacità di legatura della resina è di 50 mg/mL e può tollerare una pressione di 1 MPa. Una colonna può essere versata e conservata a 4 gradi centigradi prima della purificazione.
    Nota:< La dimensione della colonna può essere aumentata proporzionalmente per ospitare più di un tubo da 50 mL di cellule indotte se sono necessarie più proteine. Preferiamo una colonna fresca per ogni preparazione per garantire che nessuna proteina residua contamina la nostra proteina desiderata. Tuttavia, le resine di nichel possono essere riciclate secondo le istruzioni del produttore.
  10. Collegare la colonna di resina carica di nichel all'FPLC. Eseguire 20 mL di 92% Ni Buffer A e 8% Ni Buffer B (20 mM imidazole) a 0,5 mL/min con un limite di pressione di 0,5 MPa attraverso la colonna per. In tempo reale l'FPLC dovrebbe misurare un280 (280 nm di assorbimento UV) e la conduttività. Se questi valori non sono stabilizzati dopo 20 mL volume è passato attraverso la colonna, flusso i buffer fino a quando non si sono stabilizzati.
  11. Caricare il campione nella colonna (10 mL) a 0,15 mL/min. Impostare il limite di pressione su 0,5 MPa. Raccogliere il flusso attraverso.
  12. Lavare la colonna con 20 mL Ni Buffer a 20 mM imidazole (92% Ni Buffer A e 8% Ni Buffer B). Conservare il lavaggio in un tubo da 50 mL per l'analisi. Lavare la colonna con 15 mL del 50% Ni Buffer A e 50% Ni Buffer B (125 mM imidazole). Raccogliere l'eluizione in 19 frazioni di volume di 0,8 mL. Lavare la colonna con 15 mL 100% Ni Buffer B. Raccogliere altre 75 frazioni di 0,2 mL. Alcuni eterodimeri PCD si eluirà nel 50% Ni Buffer B lavaggio, ma la maggior parte dell'eterodimero sarà eluito nel 100% Ni Buffer B lavaggio.
  13. Analizza le frazioni raccolte sui gel 12% SDS-PAGE per confermare la presenza di PCD. Aggiungere volumi uguali di tinture di carico 2X al flusso attraverso, lavaggio e picco A280 frazioni. Far bollire per 3 min. Trasferire nel ghiaccio. Versare due gel 12% SDS-PAGE (come nel passaggio 1.7). Ripetere il metodo del gel come descritto in 1.7.

3. Saggio sull'attività nuclease

  1. Basato sull'analisi SDS-PAGE, identificare le frazioni di affinità del nichel che contengono PCD quasi puro. Combinare 5 frazioni di cromatografia n. 5 e 500 ng 3 kb di plasmid supercoiled pXba in buffer di reazione (50 mMM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,1 mM DTT) con un volume finale di 50 .
    1. Incubare a 37 gradi centigradi per 1 ora.
    2. Includere un controllo negativo (nessuna proteina aggiunta) e un controllo positivo (PCD disponibile in commercio). Fermare la reazione con una soluzione di arresto di 10 mM (150 mM EDTA, pH 8.0, 0,6% SDS, 18% glicerolo, 0.15% Orange G).
    3. I campioni possono essere conservati in un congelatore -20 gradi centigradi per essere analizzati in un secondo momento. Qualsiasi plasmide supercoiled può essere utilizzato in un saggio di nuclesito, purché i prodotti di reazione aciclori e rilassati possano essere risolti dall'elettroforesi del gel di agarose.
  2. Versare un gel di agarose da 120 mL in 1X tampone di etidio TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA, bromuro di etidio da 120 g/mL) in un getto di gel (dimensioni: 15 x 10 cm). Utilizzare un pettine 15 pozzo (dimensioni del pozzo: 5mm x 1,5 mm). Quando il gel è impostato, immergerlo nel buffer di ethidium 1X TAE.
  3. Analizzare 30 l delle reazioni da gel di agarose. Elettroforese a 10 V/cm a temperatura ambiente per circa 1 h. Il colorante Orange G dovrebbe essere alla fine del gel.
  4. Utilizzare uno scanner a fluorescenza per visualizzare immediatamente il segnale di bromuro di etidio del gel. Se è stato utilizzato un plasmide a 3 kb, la banda più lenta sarà cerchi rilassati a 3,5 kb, il DNA lineare verrà eseguito a 3 kb, e il plasmide supercoiled avrà la mobilità più veloce a 2 kb.
    1. Calcola il volume totale dei pixel di ogni corsia con il software di analisi delle immagini.
    2. Determinare il volume dei pixel delle varie specie di DNA, come cerchi supercoiled, lineare e nicked. Utilizzare questi valori per determinare la percentuale di ogni specie di DNA. Ad esempio, una maggiore presenza di cerchi nicked associati a una frazione rispetto al controllo negativo indica la presenza di nuclease. Il volume in pixel dei cerchi nicked in una corsia è diviso per il valore in pixel del DNA totale. Determinare una percentuale moltiplicando questo numero per 100.
  5. Combina le frazioni del secondo picco di eluizione che contengono un eterodimero PCD quasi puro basato sull'analisi SDS-PAGE e hanno un'attività nuclease minima o non rilevabile. Il nostro volume tipico in pool è di 2 mL.
  6. Caricare il campione in un'unità filtrante centrifuga con un taglio del peso molecolare di 10 kDa. Centrifuga in un secchio oscillante centrifuga a 4000 x g per 40 min a 4 gradi centigradi. In alternativa, è possibile utilizzare un rotore ad angolo fisso di 35 gradi a 7500 x g per 20 min a 4 gradi centigradi.
    1. Ripetere la centrifuga fino a quando il volume retentato finale è 100-200 L.
    2. Invertire l'unità di filtro e recuperare la retentate con centrifugazione a 1000 x g per 2 min a 4 gradi centigradi.

4. Purificazione cromatografica esclusione dimensioni del PCD

  1. Crea cromatografia ad esclusione di dimensione 250 mL (SEC) buffer in esecuzione (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% glicerol, 0,1 mM EDTA, 800 ng/mL Pepstatin, 1 g/mL Leupeptin e 87,1g/mL PMF). Passare il buffer attraverso un filtro poro di 0,2 m e conservarlo a 4 gradi centigradi.
    Nota:< Eseguire tutti i passaggi in una stanza refrigerata a 4 gradi centigradi. La purificazione SEC è facoltativa, ma la proteina deve essere conservata nel buffer di corsa SEC. Se la purificazione SEC viene omessa, la retentazione raccolta nella versione 3.6.2. dovrebbe essere dialyzed contro 1 L di buffer SEC in 10 kDa MWCO (peso molecolare tagliato) tubi di dialisi a 4 gradi durante la notte.
  2. una colonna equilibrate SEC (cromatografia ad agarose agarose) incrociata (cromatografia ad esclusione delle dimensioni) (dimesions: 10 mm x 300 mm; volume del letto da 24 mL; 25 - 500 : limite di pressione di 1,5 MPa; limite di pressione 1,5 MPa; limite di esclusione 2 x106 Da; 1 a 300 kDa separazione) con buffer scorrevole SEC a 0,5 mL/min.
    Nota:< Se si desiderano possono essere utilizzate colonne SEC di dimensioni alternative.
  3. Caricare le frazioni concentrate in un ciclo di iniezione di volume di 200.L. Caricare il campione a 0,5 mL/min nella colonna. La risoluzione SEC aumenta con un volume di carico inferiore. Elute con buffer da corsa SEC da 23 mL e raccogliere 94 frazioni di 250 l. Il cromatogramma SEC dovrebbe risolvere un singolo picco A280 che è l'eterodimero PCD. Troviamo che PCD eluis 8.9 mL. La tempistica di eluizione cambierà con colonne SEC alternative.

5. Saggi di ossidazione e attività nuclease PCA

  1. Le reazioni al saggio sia sull'ossidazione di PCA che sull'attività nucleata vengono eseguite in una piastra piatta-inferiore di 96 benfiati. Assemblare le reazioni in una piastra di 96 pozzetto sul ghiaccio in una cella fredda di 4 gradi centigradi per prevenire la catalisi prematura. Combinare in un volume finale di 50 m: 130 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 0,1 mM DTT, 5 mM PCA, 10 ng/mL di plasmide supercoiled pXba e 10 frazioni di asseS singoli PCD.
    Nota:< Le frazioni PCD SEC devono essere aggiunte per ultime e immediatamente prima dell'analisi, poiché la proteina inizierà la catalisi al momento dell'addizione.
  2. L'ossidazione PCD di PCA comporta una ridotta assorbimento di PCA a 290 nm (A290). Trasferire la piastra 96 bene al supporto piastra di un lettore di piastra impostato ad una temperatura interna di 37 gradi centigradi. Ritirare il supporto della piastra nello strumento e misurare A290 a intervalli di 20 s per 1 h. Chiedi allo strumento di scuotere il piatto 5 s prima di ogni lettura.
  3. Dopo 1 h, terminare le reazioni aggiungendo una soluzione di arresto di 10 mM (150 mMEd, pH 8.0, 0.6% SDS, 18% glicerolo, 0.15% Orange G).
  4. Preparare, caricare ed eseguire un gel di agarose come nel passaggio 3.2.
  5. Immagine e analisi del gel di agarose come al punto 3.3.
  6. Selezionare le frazioni con la maggior attività di ossidazione PCA e nessuna contaminazione da nucleasi osservata per lo stoccaggio a lungo termine a -80 gradi centigradi. Misurare l'A280.
  7. Calcolare la concentrazione totale di PCD utilizzando l'A280 e il coefficiente di estinzione(280) di 734.700 M-1cm-1.
  8. Snap congelare singole frazioni in azoto liquido. Conservare in un congelatore a -80 gradi centigradi. In alternativa, combinare frazioni attive, prive di nuclesi, aliquote e congelare nello stesso modo. Il nostro rendimento tipico è 1-2 mg di PCD per cultura L. L'uso tipico in un esperimento SM è di 3 g di PCD. Abbiamo usato PCD immagazzinato a -80 gradi centigradi per un massimo di 1 anno senza alcuna diminuzione dell'attività.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La PCD per scavenger di ossigeno disponibile in commercio è spesso contaminata da una nucleasi di DNA. La contaminazione dell'attività nuclease potrebbe portare a risultati spuri negli studi fluorescenti, in particolare gli studi che analizzano le proteine che interagiscono con il DNA o il DNA. Abbiamo scoperto che il PCD ricombinante, un eterodimero dell'esaracena etichettata pcaH e pcaG, può essere espresso in E. coli (Figura 1). L'eterodimero viene prima purificato dalla cromatografia dell'affinità del nichel (Figura 2). PCD è eluito in 2 fasi di concentrazioni di imidazolo. Le frazioni di cromatografia vengono analizzate da SDS-PAGE. Le frazioni di PCD quasi puro sono concentrate e ulteriormente purificate dalla SEC (Figura 3). Le frazioni SEC vengono analizzate singolarmente sia per l'attività di ossidazione PCA che per l'attività nuclease (Figura 4). Le frazioni che hanno mostrato un'elevata attività di ossidazione e nessuna apparente attività di nucleasi vengono svolte per la concentrazione di proteine e conservate in un congelatore a -80 gradi centigradi per uso sperimentale.

Figure 1
Figura 1: Induzione di PCD in E. coli. (A) pVP91A-pcaHG viene mostrato con le sottounità pcaG (z) e pcAH con tag esahisatidi. (B) Gel rappresentante SDS-PAGE di induzione PCD. I pesi molecolari sono indicati a sinistra. Le mobilitazioni di 28.3 kDa pcaH con etichetta esadecimale e 22.4 kDa pcaG sono sulla destra. E. coli (Un) indotto, indotto E. coli (In), il pellet dopo E. coli lisi e ultracentrifugation (P), il supernatore dopo l'ultracentrifugadatura da caricare in una colonna di nichel (S), frazione rappresentativa dopo la cromatrigrafia del nichel (Ni), e la frazione rappresentativa dopo SEC (SE). Questa cifra è stata modificata da una precedente pubblicazione12. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Purificazione della cromatografia dell'affinità Nickel del PCD. (A) Cromatogramma della cromatografia di affinità nickel del PCD. L'A280 viene visualizzato in blu e la concentrazione percentuale di Ni Buffer B viene visualizzata in rosso. Il campione è stato caricato in una bassa concentrazione di imidazole di 20 mM. Il flusso (Flw Thr) mostra le proteine batteriche solubili che non si legano alla resina di nichel. La colonna è stata lavata con 20 mL di 20 mM di buffer imidazole. Un secondo lavaggio da 15 mL è stato eseguito con 125 mM di imidazole. L'elutzione di PCD è stata eseguita con 250 mM di imidazole. Alcuni PCD eluito in presenza di 125 mM imidazole, ma la maggior parte della proteina eluito in 250 mM imidazole. (B) Analisi rappresentativa SDS-PAGE delle frazioni di affinità del nichel. Il carico, il flusso (Flw Thr) e il primo lavaggio hanno mostrato la corretta induzione di PCD, le proteine batteriche solubili che non legavano la resina di nichel e le proteine minime osservate durante il primo lavaggio, rispettivamente. Vengono mostrate diverse frazioni durante il secondo lavaggio e passaggi di eluizione. Le frazioni del secondo lavaggio includevano proteine PCD, ma mostravano anche contaminanti di peso molecolare superiore rilevabili. Frazioni dal gradino di eluizione sembravano essere prive di contaminanti. I pesi molecolari sono mostrati a sinistra. Le mobilitazioni di pcaH e pcaG sono mostrate a destra. (C) Gel di agarose di anamante. Il carico della colonna di affinità nickel, il flusso, il lavaggio e le frazioni multiple sono stati testati per l'attività nuclease. Un controllo negativo (controllo) è il plasmide senza proteine aggiunte. Un controllo positivo (PCDa) è una PCD disponibile in commercio nota per essere contaminata da una nucleasi di DNA. Le specie di DNA sono indicate a destra come piccoli frammenti (SF), supercoiled (SC), lineare (LN), cerchio nicked (NC) e dimero nicked (ND). (D) Quantitazione delle varie specie di DNA osservate nel saggio di nucleasi gel agarose. È stato misurato il volume totale dei pixel di ogni corsia. Il volume di pixel di ogni specie di DNA è stato determinato ed espresso come percentuale del volume totale dei pixel nella corsia. Il controllo negativo è stato 81,7% supercoiled con 14.4% cerchi nicked. Il controllo positivo ha mostrato un aumento significativo del 46,0% cerchi nicked. Il carico e il flusso contenevano nucleasi batteriche che convertivano il plasmide e contaminavano il DNA dei batteri in piccoli frammenti. Il primo lavaggio a 20 mM di imidazolo sembrava anche contenere una significativa attività nuclease, con conseguente cerchi lineari e nicked. Le frazioni 4-7 del secondo lavaggio a 125 mM di imidazole hanno mostrato anche un'significativa attività di nucleasi (in particolare, le frazioni 4 e 5 che hanno generato il plasmide linearizzato osservato). Le frazioni 29-38 della fase di eluizione sembravano più simili al controllo negativo. In questo esempio, le frazioni 29-38 sono state scelte per essere combinate, concentrate e ulteriormente purificate dalla SEC. Questa cifra è stata modificata da una precedente pubblicazione12. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: purificazione SEC del PCD. (A) Cromatogramma della SEC delle frazioni PCD dopo cromatografia di affinità del nichel. L'A280 è mostrato in blu e le frazioni di eluizione sono indicate. PCD eluito dalla SEC come un singolo picco apparente. (B) Rappresentante SDS-PAGE analisi delle frazioni SEC 33-48. Il carico è il PCD concentrato dopo la purificazione dell'affinità del nichel. Le frazioni 33-48 coprono l'apparente picco SEC. Non sono stati osservati contaminanti rilevabili. (C) Gel di agarose di anamante. Il carico SEC e le frazioni multiple sono stati testati per l'attività di nucleato. Un controllo negativo (controllo) è il plasmide senza proteine aggiunte. Un controllo positivo (PCDa) è una PCD disponibile in commercio nota per essere contaminata da una nucleasi di DNA. Le specie di DNA sono indicate a sinistra come supercoiled (SC), nicked circle (NC) e nicked dimer (ND). (D) Quantitazione delle varie specie di DNA osservate nel saggio di nucleasi gel agarose. È stato misurato il volume totale dei pixel di ogni corsia. Il volume di pixel di ogni specie di DNA è stato determinato ed espresso come percentuale del volume totale dei pixel nella corsia. Il controllo negativo è stato 82.1% supercoiled con solo 13.7% cerchi nicked. Il controllo positivo ha mostrato un aumento significativo del 64,8% cerchi nicked. Il carico SEC non mostrava alcuna apparente attività nuclease a causa della scelta giudiziosa delle frazioni dalla purificazione dell'affinità del nichel. Allo stesso modo, le frazioni 33-48 sembravano simili al controllo negativo. Ad esempio, la frazione 36 era supercoiled dell'82,5% e il 13,2% del cerchio intaccato. In questo esempio, le frazioni 36 e 37 sono state scelte per essere quantificate, congelate e conservate in un congelatore a -80 gradi per un futuro uso sperimentale. Questa cifra è stata modificata da una precedente pubblicazione12. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: attività di ossidazione e nuclea siclesi delle frazioni PCD SEC. L'ossidazione PCA è stata misurata da A290. Come PCD ossidato la molecola PCA, l'A290 è diminuito. L'ossidazione PCA è stata misurata ogni 20 s per 1 h. Un controllo negativo senza frazione PCD aggiunta (linea blu) non ha mostrato alcuna variazione in A290, che indica che la molecola PCA era stabile. I dati provenienti da tre frazioni SEC rappresentative (36 in rosso, 33 in arancione, 39 in giallo) mostrano che il PCD purificato ha ridotto la A290,indicando l'ossidazione di PCA. Questa cifra è stata modificata da una precedente pubblicazione12. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I sistemi di scavenging dell'ossigeno sono comunemente inclusi nella microscopia a fluorescenza a singola molecola per ridurre il fotosbiancamento3,7,8. Queste tecniche di microscopia sono spesso utilizzate per osservare gli acidi nucleici o le interazioni proteiche con gli acidinucleici1,13,14. La contaminazione di OSS con nucleasi può portare a risultati spuri.

Gli OSS disponibili in commercio, tra cui GODCAT e PCD, hanno dimostrato di includere una significativa contaminazione da nucleasi11. È possibile acquistare PCD e impiegare SEC per rimuovere il contaminante nuclease11. Tuttavia, il prezzo della PCD disponibile in commercio da un fornitore è aumentato di 5 volte a seguito della pubblicazione di tale metodo. Questo metodo genera un eterodimero PCD senza nuclesio altamente attivo e può essere eseguito entro 1 settimana. Secondo la nostra esperienza, la quantità di PCD generata da una coltura da 1 L (1-2 mg) è sufficiente per un anno di esperimenti (3 g/esperimento) in un laboratorio produttivo con 2 sistemi di imaging fluorescente.

L'efficienza di introduzione è la chiave per il successo di questo metodo. Se l'eterodimero PCD non è indotto in modo efficiente e evidente da SDS-PAGE, la purificazione non avrà successo. Due strategie alternative possono essere provate. In primo luogo, tentare l'induzione da una colonia diversa sulla piastra di trasformazione E. coli. In secondo luogo, abbiamo avuto un precedente successo con BL21, ma un ceppo alternativo E. coli per l'espressione, come BL21 pLysS, può essere provato. Il successo del saggio di ossidazione PCA si basa sull'esposizione minima del substrato al PCD prima di iniziare il saggio. Si raccomanda vivamente di assemblare le reazioni della piastra 96 sul ghiaccio in una stanza fredda e aggiungere il campione proteico immediatamente prima di caricare la piastra al lettore.

La cromatografia dell'affinità del nichel può essere sufficiente per identificare le frazioni di PCD puro senza attività di nucleale contaminanti. In questo caso, è possibile eliminare la purificazione SEC. Tuttavia, le frazioni di cromatografia del nichel devono essere combinate e dialyzed durante la notte a 4 gradi centigradi nel buffer in esecuzione SEC. Il glicerolo presente nel buffer di esecuzione SEC è importante per l'archiviazione a -80 gradi centigradi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato da NIH GM121284 e AI126742 a KEY.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 βME
30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 Bio-Rad 161-0156
Acetic acid, Glacial Certified ACS Fisherl Chemical A38C-212
Agar, Granulated BD Biosciences DF0145-17-0
AKTA FPLC System GE Healthcare Life Sciences AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore UFC201024 10 kDa MWCO
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma F-2262
Ammonium Persulfate (APS) Tablets Amresco K833-100TABS
Ampicillin Amresco 0339-25G
Bacto Tryptone BD Biosciences DF0123173
BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract VWR 90004-092
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) Sigma-Aldrich B6755-500G
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coomassie Brilliant Blue Amresco 0472-50G
Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate Bio-Rad 2240096EDU
DTT P212121 SV-DTT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML Sigma-Aldrich D8537-500ML PBS
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Granulated LB Broth Miller EMD Biosciences 1.10285.0500
Hi-Res Standard Agarose AGTC Bioproducts AG500D1
Imidazole Sigma-Aldrich I0250-250G
IPTG Goldbio I2481C25
Leupeptin Roche 11017128001
Lysozyme from Chicken Egg White Sigma-Aldrich L6876-1G
Magnesium Chloride Hexahydrate Amresco 0288-1KG
Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability Thermo Fisher ND-2000C
NaCl P212121 RP-S23020
Ni-NTA Superflow (100 ml) Qiagen 30430
Novagen BL21 Competent Cells EMD Millipore 69-449-3 SOC media included
Orange G Fisher Scientific 0-267
Pepstatin Gold Biotechnology P-020-25
PMSF Amresco 0754-25G
Protocatechuic acid Fisher Scientific ICN15642110 PCA
Sodium dodecyl sulfate P212121 CI-00270-1KG
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devises
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL Thermo Fisher Scientific 09-741-04
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL Thermo Fisher Scientific 09-741-02
Superose 12 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 17517301
TEMED Amresco 0761-25ML
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager GE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174, (6), 553-557 (1990).
  2. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90, (2), 448-454 (2014).
  3. Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
  4. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36, (2), 280-290 (2003).
  5. Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3, (1), 17-25 (2004).
  6. Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275, (3-6), 367-375 (1992).
  7. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, (5), 1826-1835 (2008).
  8. Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216, (1), 49-68 (1990).
  9. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, (14), 6132-6138 (2010).
  10. Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
  11. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12, (10), 901-902 (2015).
  12. Senavirathne, G., Lopez, M. A. Jr, Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
  13. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
  14. Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539, (7630), 583-587 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics