Expressie en zuivering van Nuclease-vrije zuurstof Scavenger Protocatechuate 3, 4-dioxygenase

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Protocatechuate 3, 4-dioxygenase (PCD) kan enzymatisch vrij diatomaire zuurstof verwijderen uit een watersysteem met behulp van de substraat protocatechuïnezuur zuur (PCA). Dit protocol beschrijft de expressie, zuivering, en activiteit analyse van deze enzym voor het opruimen van zuurstof.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Messer, R. K., Lopez Jr., M. A., Senavirathne, G., Yoder, K. E. Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase. J. Vis. Exp. (153), e59599, doi:10.3791/59599 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Enkelvoudige molecuul (SM) microscopie wordt gebruikt in de studie van dynamische moleculaire interacties van de gelabelde biomoleules in real time. Echter, fluoroforen zijn gevoelig voor verlies van signaal via photobleaching door opgeloste zuurstof (O2). Om fotobleking te voorkomen en de levensduur van de te verlengen, worden zuurstof opruimings systemen (OSS) gebruikt om O2te verminderen. In de handel verkrijgbare OSS kan verontreinigd zijn door nucleasen die nucleïnezuren beschadigen of degraderen, waardoor de experimentele resultaten worden geïnterpreteerd. Hier gedetailleerd een protocol voor de expressie en zuivering van zeer actieve Pseudomonas putida protocatechuate-3, 4-dioxygenase (PCD) zonder detecteerbare Nuclease besmetting. PCD kan efficiënt verwijderen reactieve O2 soorten door omzetting van het substraat protocatechuïnezuur zuur (PCA) 3-Carboxy-CIS, CIS-muconic Acid. Deze methode kan worden gebruikt in elk watersysteem waarbij O2 een nadelige rol speelt bij het verzamelen van gegevens. Deze methode is effectief in het produceren van zeer actieve, Nuclease vrije PCD in vergelijking met commercieel beschikbare PCD.

Introduction

Single molecuul (SM) biofysica is een snel groeiend veld dat de manier waarop we naar biologische fenomenen kijken verandert. Dit veld heeft de unieke mogelijkheid om fundamentele wetten van de fysica en chemie te koppelen aan de biologie. Fluorescentiemicroscopie is een biofysische methode die SM-gevoeligheid kan bereiken. Fluorescentie wordt gebruikt om biomoleules te detecteren door ze te koppelen aan kleine organische fluor Foren of Quantum dots1. Deze moleculen kunnen fotonen uitzenden wanneer ze opgewonden worden door lasers voordat ze onomkeerbaar2fotobleaching. Fotobleaching treedt op wanneer de fluorescerende etiketten chemische schade ondergaan die hun vermogen om te prikkelen op de gewenste golflengte2,3vernietigt. De aanwezigheid van reactieve zuurstof soorten (Ros) in waterige buffer zijn een primaire oorzaak van photobleaching2,4. Bovendien kan Ros biomoleules beschadigen en leiden tot foutieve waarnemingen in SM-experimenten5,6. Om oxidatieve schade te voorkomen, kunnen zuurstof opruimings systemen (OSS) worden gebruikt3,7,8. Het glucose oxidase/catalase (GODCAT) systeem is efficiënt in het verwijderen van zuurstof8, maar het produceert potentieel schadelijke peroxiden als tussen producten. Deze kunnen schadelijk zijn voor biomoleules van belang in SM-studies.

Als alternatief, protocatechuate 3, 4 dioxygenase (PCD) zal efficiënt verwijderen O2 van een waterige oplossing met behulp van de substraat protocatechuïnezuur zuur (PCA)7,9. PCD is een metalloenzym dat nonheme ijzer gebruikt om PCA te coördineren en de catechol ringopening reactie te katalyseren met behulp van opgeloste O210. Deze One-Step reactie is een algemeen betere OSS voor het verbeteren van de stabiliteit in SM experimenten7. Helaas bevatten veel in de handel verkrijgbare OSS-enzymen, waaronder PCD, contaminerende nucleasen11. Deze verontreinigingen kunnen leiden tot de schade van op nucleïnezuur gebaseerde substraten die in SM-experimenten worden gebruikt. Dit werk zal verhelderden een op chromatografie gebaseerd zuiverings protocol voor het gebruik van recombinant PCD in SM-systemen. PCD kan breed worden toegepast op elk experiment waarbij ROS schadelijke substraten zijn die nodig zijn voor het verzamelen van gegevens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. induceren PCD expressie in E. coli

  1. Combineer 1 μL pVP91A-pcaHG-expressie plasmide (20 ng/μL, Figuur 1A) en 20 μl E. coli BL21 (in de handel verkrijgbare cellen van 20 μl, > 2 x 106 CFU/μg plasmide) in een buisje. Veeg de buis om te mengen. Plaats de buis op ijs 5 min.
  2. Plaats de transformatie bij 42 °C gedurende 30 sec. Vervolgens ijs 2 min.
  3. Voeg 80 μL Soc-media (Super optimale bouillon met van-onderdrukking: 2,5 mm KCl, 10 mm NaCl, 2% Tryptone, 0,5% gistextract, 10 mm MgSO4, 10 mm MgCl2, 20 mm glucose) toe. Schud bij 225 omwentelingen per min (rpm) 37 °C gedurende 1 uur.
  4. Plaat de transformatie reactie op LB amp agar (1L Luria Bouillon agar: 10 g NaCl, 10 g bacto-Tryptone, 5 g gistextract, 15 g agar, 50 μg/mL ampicillaire; 25 mL per 10 cm diameter petrischaaltje).
  5. Incueren van de plaat, deksel naar beneden, bij 37 ° c voor 16-18 h.
  6. Inoculeren 50 mL LB amp (1L LB: 10 g bacto-Tryptone, 10 g NaCl, 5 g gistextract, 50 μg/mL ampicilinus) in een erlenmeyer kolf van 250 mL met één kolonie. Inincuberen bij 37 °C voor 16-18 h schudden bij 225 rpm.
  7. Breng 20 mL cultuur over naar een 4 L kolf met 1 L LB amp. Schud bij 225 rpm bij 37 °C.
  8. Elke h meet de cultuur OD600 (optische dichtheid bij 600 nm). Naarmate de cultuur OD600 nadert 0,5, Verhoog de frequentie van metingen naar elke 15 min. De gewenste dichtheid van de cultuur is 0,5 OD600.
  9. Breng de kolf van 4L over in een bak ijs. Draai de kolf in het ijsbad om de cultuur temperatuur te verlagen.
    Opmerking: De tijd op ijs moet tot een minimum worden beperkt, zodat de cellen metabolisch actief blijven. Idealiter zullen de cellen op ijs minder dan 10 min.
  10. Succesvolle inductie van PCD kan worden waargenomen door denaturering natriumdodecylsulfaat Polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE) analyse. Oogst 1 mL van de niet-geïnduceerde cultuur in een buisje. Draai het monster 1 min bij 14.000 x g in een microfugebuis bij omgevingstemperatuur. Decanterende het supernatant.
    1. Solubiliseer de gepelleteerde cellen in 150 μL PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing).
    2. Voeg een gelijk volume van 2x laad kleurstof toe (1,2% SDS, 30% glycerol, 150 mm tris-HCl, pH 6,8, 0,0018% broomfenolblauw, 15% β-mercaptoethanol). Vortex het monster grondig mengen.
    3. Kook het monster 3 min en breng het over naar ijs. Het monster kan worden opgeslagen in een vriezer van-20 °C voor toekomstige analyse.
      Opmerking: PBS is in de handel verkrijgbaar met of zonder CaCl2 en MgCl2. Veel laboratoria zullen PBS hebben zonder CaCl2 en MgCl2 voor celkweek methoden. We hebben geen verschil gevonden met PBS met of zonder CaCl2 en MgCl2.
  11. Breng de kolf van 4 L over in een incubator bij 17 °C met 180 rpm schudden. Blijf elke 20 minuten de OD600 monitoren.
  12. Bij 0,7 OD600 Voeg Isopropyl-Beta-D-thiogalactopyranoside (iptg) toe aan 0,5 mm eindconcentratie (0,25 M voorraadoplossing) en 10 mg/L ammoniumijzer (II) sulfaat-hexahydraat (Fe (NH4)2(dus4)2, 10 mg/ml stockoplossing). PCD-genen Pcah en pcag worden geïnduceerd door de promotor T5 door toevoeging van iptg (Figuur 1A). Ijzersulfaat is gebonden door PCD en vereist voor katalytische activiteit door het coördineren van zuurstof tijdens het openen van de catechol.
  13. Schud de cultuur bij 180 rpm bij 17 °C gedurende 18 uur.
  14. Plaats de kweek kolf in ijs zoals in 1,2. Oogst 1 mL van de geïnduceerde cellen voor SDS-PAGE zoals in 1,3.
  15. Giet de bacteriecultuur op flessen die geschikt zijn voor centrifugeren. Een 1 L cultuur kan worden gecentrifugeerd in 4 250 mL conische bodem flessen. Pellet de cultuur bij 4 °C gedurende 20 minuten bij 3000 x g. Decante de supernatants. Verwijder bacterieel vloeibaar afval op de juiste manier.
  16. Pipet om de pellets te hervatten in 25 mL koude PBS (CaCl2 en MgCl2 zijn optioneel) per 1 L-cultuur.
  17. Breng de resuspensie over naar 50 mL conische buizen (1 50 mL Tube per 1 L cultuur). Pellet de cellen bij 3000 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Decaneer het supernatant en gooi het op de juiste manier weg.
  18. Respendeer de cellen in 10 mL lysisbuffer (300 mM NaCl, 50 mM tris-HCl, pH 7,5, 20 mM imidazol, 10% glycerol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptine en 87,1 μg/mL fenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)) door pipetteren. Vries de resuspensie met vloeibare stikstof in een Dewar kolf. Bewaar de monsterbuisjes in een vriezer van 80 °C. We hebben het gezuiverde PCD van pellets opgeslagen bij-80 °C gedurende één jaar zonder duidelijk verlies van activiteit.
  19. Vergelijk de niet-geïnduceerde en geïnduceerde cellen door SDS-PAGE.
    Opmerking: We hebben geen moeite met inductie van PCD heterodimer. We raden echter aan om de inductie te testen voordat u doorgaat met de zuivering in het geval dat een reagens onverwacht is verlopen.
    1. Montage platen voor SDS-PAGE (afmetingen: 7,3 cm x 8,3 cm x 0,75 mm dik). De stapel gel is 1,5 mL 6% poly acrylamide (6% acrylamide, 125 mM tris-HCl, pH 6,8, 0,1% SDS, 0,1% ammonium persulfate, 0,001% TEMED). De oplossend gel is 3,5 mL 12% poly acrylamide (12% acrylamide, 375 mM tris-HCl, pH 8,8, 0,1% SDS, 0,1% ammonium persulfate, 0,001% TEMED). Plaats een 10-put-kam aan de stapel slaag.
    2. Plaats 10 μL van niet-geïnduceerde en geïnduceerde bacteriële monsters. Plaats 4 μL voorgebeitst molecuulgewicht markers voor eiwitten (Figuur 1B).
    3. Elektroforese de gel bij 16,5 V/cm ongeveer 1 h. De broomfenolblauw moet de bodem van de gel bereiken.
    4. Plaats de gel in Coomassie Blue Stain (10% azijnzuur, 40% methanol, 0,1% Coomassie Blue Dye) in een plastic kuip. De vlek moet de gel volledig onderdompelen. Vlek bij omgevingstemperatuur gedurende 20 min. zachte rotatie tijdens het kleuren is optioneel.
    5. Vervang de oplossing doorlaat (10% azijnzuur, 40% methanol). Inincuberen bij omgevingstemperatuur met optionele zachte rotatie tot de eiwit banden goed zichtbaar zijn.
    6. Vervang de laat door gedeïoniseerd water. Onder de bacteriële eiwitten, de geïnduceerde PCD subeenheden moeten worden zichtbaar in de geïnduceerde cellen. Hexahistidine Tagged PCD subeenheid pcaH heeft een molecuulgewicht van 28,3 kDa en de pcaG-subeenheid is 22,4 kDa. Als de PCD subeenheden niet duidelijk, een nieuwe inductie afgeleid van een roman kolonie moet worden uitgevoerd.

2. nikkel-affiniteits chromatografie zuivering van PCD

  1. Ontdooien op ijs 1 50 mL buis van geïnduceerde cellen. Het kan 2-3 uur duren om het monster volledig te ontdooien.
  2. Houd de buis op ijs, sonificeren het monster met 30% amplitude gedurende 1 minuut, fietsen 1 s aan en uit. Gebruik een taps toelopende microtip (diameter 0,125 inches) sonicator. Het maximale vermogen is 400 W en de frequentie is 20 kHz en per 1 L kweek korrel.
  3. Na sonicatie, voeg lysozym toe aan 0,2 mg/ml eindconcentratie (10 mg/ml stockoplossing) en blijf 30 minuten op ijs bij 4 °c.
  4. Giet het bacteriële lysaat in een voorgekoelde polycarbonaat fles (afmetingen: 25 mm x 89 mm). De fles moet compatibel zijn met een vaste hoek ultracentrifuge rotor. Andere buizen en/of rotors mogen worden vervangen, maar de uiteindelijke zwaartekracht moet worden gehandhaafd.
  5. Centrifugeer gedurende 60 min bij 120.000 x g bij 4 °C. Cellulair puin zal een pellet vormen. Het supernatant kan geel lijken.
    1. De pellet kan worden opgenomen in volgende SDS-PAGE-analyse om de oplosbaarheid van PCD te bepalen (Figuur 1B). Solubiliseer de pellet door grondig in 10 ml PBS. Breng 150 μL over in een buis van 1,5 mL. Bereid het monster voor SDS-PAGE zoals in 1,3.
  6. Giet de supernatant in een koude 50 mL conische buis. Noteer het volume. Verontreiniging van het supernatant met bacterieel DNA kan een viskeuze monster opleveren. Het bacteriële genomische DNA kan de kolom stroom blokkeren. De ultracentrifugatie stap 2,2 moet worden herhaald om het bacteriële DNA te pellet. Een pellet uit deze tweede spin kan niet gemakkelijk zichtbaar zijn of transparant zijn.
  7. Maak 500 mL ni buffer A (300 mM NaCl, 50 mM tris-HCl, pH 7,5, en 10% glycerol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptine, en 87,1 μg/mL PMSF) en 500 mL ni buffer B (300 mM NaCl, 50 mM tris-HCl, pH 7,5, 10% glycerol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptine, en 87,1 μg/mL PMSF, 250 mM imidazol, pH 8,0). Passeren beide ni buffers door middel van 0,2 μm porie filters.
  8. Het monster, de buffers en het FPLC-systeem (Fast proteïne Liquid Chromatography) bevinden zich in een gekoelde ruimte bij 4 °C. Was pomp A met ni buffer A en pomp B met ni buffer B. was het systeem met 20 mM imidazol (8% ni buffer B, 92% ni buffer A) totdat de UV en geleidbaarheid stabiliseren. We routinematig stroom buffers bij 5 mL/min met een 1,0 MPa druk limiet. De stroomsnelheid en de druk grens moeten worden bepaald aan de hand van de specificaties van het gebruikte FPLC-instrument.
  9. Bereid een kolom voor met 1,5 mL nikkel-geladen hars (afmetingen: 110 mm lang x 5 mm). De hars bindende capaciteit is 50 mg/mL en kan 1 MPa druk verdragen. Een kolom kan vóór zuivering op 4 °C worden gegoten en opgeslagen.
    Opmerking: De grootte van de kolom kan proportioneel worden verhoogd om meer dan 1 50 mL buis van geïnduceerde cellen te ontvangen als er meer eiwitten nodig zijn. We geven de voorkeur aan een nieuwe kolom voor elke bereiding om ervoor te zorgen dat geen enkele eiwitten ons gewenste eiwit verontreinigen. Nikkel harsen kunnen echter volgens de instructies van de fabrikant worden gerecycled.
  10. Bevestig de kolom nikkel geladen hars aan de FPLC. Voer 20 mL van 92% ni buffer A en 8% ni buffer B (20 mM imidazol) bij 0,5 mL/min met een 0,5 MPa druk grens door de kolom om te equilibreren. In real-time moet de FPLC een280 (280 nm UV-extinctie) en geleidbaarheid meten. Als deze waarden niet zijn gestabiliseerd nadat 20 mL volume door de kolom is gepasseerd, stroom de buffers totdat ze zijn gestabiliseerd.
  11. Laad het monster in de kolom (~ 10 mL) bij 0,15 mL/min. Stel de druk limiet in op 0,5 MPa. Verzamel de stroom door.
  12. Was de kolom met 20 mL ni buffer bij 20 mM imidazol (92% ni buffer A en 8% ni buffer B). Bewaar de was in een tube van 50 mL voor analyse. Was de kolom met 15 mL 50% ni buffer A en 50% ni buffer B (125 mM imidazol). Verzamel de elutie in 19 fracties van 0,8 mL volume. Was de kolom met 15 mL 100% ni buffer B. Verzamel een extra 75 fracties van 0,2 mL. Sommige PCD heterodimer zal Elueer in de 50% ni buffer b Wash, maar de meerderheid van de heterodimer zal Elueer in de 100% ni buffer b Wash.
  13. Analyseer verzamelde fracties op 12% SDS-PAGE gels om de aanwezigheid van PCD te bevestigen. Voeg gelijke volumes van 2X laad kleurstof toe aan de stroom door, was en piek A280 fracties. Kook gedurende 3 min. Transfer naar Ice. Giet 2 12% SDS-PAGE gels (zoals in stap 1,7). Herhaal de gelmethode zoals beschreven in 1,7.

3. Nuclease activiteit assay

  1. Op basis van de SDS-PAGE-analyse identificeert u nikkel-affiniteits fracties die bijna zuivere PCD bevatten. Combineer 5 μL chromatografie Fractie en 500 ng 3 KB supercoiled plasmide pxba + in reactiebuffer (50 mM tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,1 mm DTT) met een eindvolume van 50 μL.
    1. Incuberen bij 37 °C gedurende 1 uur.
    2. Bevatten een negatieve controle (geen toegevoegde eiwitten) en een positieve controle (in de handel verkrijgbare PCD). Stop de reactie met 10 μL stop oplossing (150 mM EDTA, pH 8,0, 0,6% SDS, 18% glycerol, 0,15% oranje G).
    3. Monsters mogen in een diepvriezer van-20 °C worden bewaard om later te worden geanalyseerd. Elke supercoiled plasmide kan worden gebruikt in een Nuclease Assay, zolang de supercoiled en ontspannen cirkel reactieproducten kunnen worden opgelost door agarose gel elektroforese.
  2. Giet een 120 mL 1% agarose gel in 1X TAE ethidiumbromide buffer (40 mM tris-acetaat, 1 mM EDTA, 0,5 μg/mL ethidiumbromide bromide) in een gelgegoten (afmetingen: 15 x 10 cm). Gebruik een 15 goed kam (goed afmetingen: 5mm x 1,5 mm). Wanneer de gel is ingesteld, dompel deze dan onder in 1X TAE ethidiumbromide buffer.
  3. Analyseer 30 μL van de reacties door agarose gel. Elektroforese bij 10 V/cm bij omgevingstemperatuur gedurende ongeveer 1 uur. De oranje G kleurstof front moet aan het einde van de gel.
  4. Gebruik een fluorescentie scanner om onmiddellijk het Ethidiumbromide bromide-signaal van de gel te afbeelen. Als een 3 KB plasmide werd gebruikt, zal de langzaamste band ontspannen cirkels op ~ 3,5 KB, lineaire DNA zal lopen op 3 KB, en supercoiled plasmide zal de snelste mobiliteit op ~ 2 KB.
    1. Bereken het totale pixel volume van elke rijstrook met beeldanalyse software.
    2. Bepaal het pixel volume van de verschillende DNA-soorten, zoals supercoiled, lineair en verkreukeld cirkels. Gebruik deze waarden om het percentage van elke DNA-soort te bepalen. Bijvoorbeeld, verhoogde aanwezigheid van verkreukeld cirkels geassocieerd met een fractie in vergelijking met de negatieve controle geeft de aanwezigheid van Nuclease. Het pixel volume van verkreukeld cirkels in een baan wordt gedeeld door de pixelwaarde van totaal DNA. Bepaal een percentage door dit getal te vermenigvuldigen met 100.
  5. Combineer fracties van de tweede elutie piek die bijna zuivere PCD heterodimer bevatten op basis van SDS-PAGE analyse en minimale tot niet-detecteerbare Nuclease activiteit. Ons typisch gepoolde volume is ~ 2 mL.
  6. Laad het monster in een centrifugaalfilter eenheid met een 10 kDa moleculair gewicht cutoff. Centrifugeer in een swingende emmer centrifuge bij 4000 x g voor 40 min bij 4 °C. Als alternatief kan een 35 ° vaste hoekrotor worden gebruikt bij 7500 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
    1. Herhaal de centrifugeren tot het uiteindelijke retentaat volume 100-200 μL is.
    2. Keer de filtereenheid om en herstel de retentaat door centrifugeren bij 1000 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C.

4. grootte uitsluiting chromatografie zuivering van PCD

  1. Maak 250 mL grootte uitsluitings chromatografie (SEC) lopende buffer (100 mM NaCl, 50 mM tris-HCl, pH 7,5, 10% glycerol, 0,1 mM EDTA, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptine, en 87,1 μg/mL PMSF). Geef de buffer door een porie filter van 0,2 μm en bewaar deze bij 4 °C.
    Opmerking: Voer alle stappen uit in een gekoelde ruimte bij 4 °C. SEC zuivering is optioneel, maar het eiwit moet worden opgeslagen in SEC lopende buffer. Als SEC zuivering wordt weggelaten, de retentaat verzameld in 3.6.2. moet worden gedialyseerd tegen 1 L van SEC-buffer in 10 kDa MWCO-dialyse slang (met moleculair gewicht afgesneden) bij 4 °C 's nachts.
  2. Een gecrosskoppelde agarose-kolom (grootte uitsluitings chromatografie) (dimesies: 10 mm x 300 mm; 24 mL bedvolume; 25-500 μL monstervolume; 1,5 MPa druk limiet; 2 x 106 da uitsluitings grens; 1 tot 300 kDa scheiding) met SEC lopende Buffer bij 0,5 ml/min.
    Opmerking: Indien gewenst alternatieve grootte SEC kolommen kunnen worden gebruikt.
  3. Plaats de geconcentreerde fracties in een injectie kring met een volume van 200 μL. Laad het monster op 0,5 mL/min in de kolom. SEC-resolutie neemt toe met een kleiner laadvolume. Elute met 23 mL SEC lopende buffer en verzamel 94 fracties van 250 μL. De SEC chromatogram moet een enkele een280 piek dat is de PCD heterodimer oplossen. We vinden dat PCD kolom 8,9 ml. De elutie timing zal veranderen met alternatieve SEC kolommen.

5. PCA-oxidatie en Nuclease activiteit assays

  1. Reacties ter bepaling van zowel de oxidatie van PCA en Nuclease activiteit worden uitgevoerd in een 96-goed vlakke bodemplaat. Monteer reacties in een 96-put op ijs in een koude kamer van 4 °C om vroegtijdige katalyse te voorkomen. Combineer in een eindvolume van 50 μL: 130 mM NaCl, 50 mM tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 0,1 mm DTT, 5 mm PCA, 10 ng/ml supercoiled plasmide pxba + en 10 ΜL individuele PCD SEC fracties.
    Opmerking: De PCD SEC fracties moeten worden toegevoegd laatste en onmiddellijk voor de analyse als het eiwit zal beginnen met katalyse op het moment van toevoeging.
  2. PCD-oxidatie van PCA resulteert in een verminderde extinctie van PCA bij 290 nm (A290). Breng de 96 well plate over naar de plaathouder van een plaat lezer die is ingesteld op een inwendige temperatuur van 37 °C. Trek de plaathouder in het apparaat en meet een290 bij 20 s intervallen voor 1 uur. Laat het apparaat de plaat 5 s schudden voor elke meting.
  3. Na 1 uur de reacties beëindigen door toevoeging van 10 μL stop oplossing (150 mM EDTA, pH 8,0, 0,6% SDS, 18% glycerol, 0,15% oranje G).
  4. Voorbereiden, laden en uitvoeren van een agarose gel zoals in stap 3,2.
  5. Beeld en analyseer de agarose-gel zoals in stap 3,3.
  6. Selecteer fracties met de meeste PCA-oxidatie activiteit en geen waargenomen Nuclease besmetting voor langdurige opslag bij-80 °C. Meet de A280.
  7. Bereken de totale PCD-concentratie met behulp van de A280 en de extinctiecoëfficiënt (ε280) van 734.700 M-1cm-1.
  8. Snap bevriezen individuele fracties in vloeibare stikstof. Bewaren in een vriezer van 80 °C. U ook actieve, Nuclease vrije fracties combineren, aliquot, en bevriezen op dezelfde manier. Onze typische opbrengst is 1-2 mg PCD per L-cultuur. Typisch gebruik in een SM-experiment is 3 μg PCD. We hebben gebruikt PCD opgeslagen bij-80 °C voor maximaal 1 jaar zonder afname van de activiteit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In de handel verkrijgbare zuurstof Scavenger PCD is vaak verontreinigd met een DNA-Nuclease. Contaminerende Nuclease activiteit kan leiden tot valse resultaten in fluorescerende studies, met name studies die DNA analyseren of DNA interactie eiwitten. We hebben geconstateerd dat recombinant PCD, een heterodimer van hexahistidine gelabeld pcaH en pcaG, kan worden uitgedrukt in E. coli (Figuur 1). De heterodimer wordt eerst gezuiverd door nikkel-affiniteits chromatografie (Figuur 2). PCD wordt in 2 stappen van imidazol-concentraties in de Elat- Chromatografie fracties worden geanalyseerd door SDS-PAGE. Fracties van bijna zuivere PCD zijn geconcentreerd en verder gezuiverd door SEC (Figuur 3). SEC-fracties worden afzonderlijk geanalyseerd voor zowel PCA-oxidatie activiteit als Nuclease-activiteit (Figuur 4). Fracties die hoge oxidatie activiteit weergegeven en geen schijnbare Nuclease activiteit worden getest voor eiwitconcentratie en bewaard in een-80 °C vriezer voor experimenteel gebruik.

Figure 1
Figuur 1: inductie van PCD in E. coli. A) PVP91A-pcaHG wordt getoond met de subeenheden pcag (α) en hexahistidine-Tagged pcaH (β) PCD. B) representatieve SDS-page gel van PCD-inductie. Molecuulgewichten worden aan de linkerzijde aangegeven. De mobiliteitsmogelijkheden van 28,3 kDa hexahistidine-Tagged pcaH en 22,4 kDa pcaG zijn aan de rechterkant. Ongeïnduceerde e. coli (un), geïnduceerde e. coli (in), de pellet na E. coli lysis en ultracentrifugatie (P), de supernatant na ultracentrifugatie te worden geladen in een nikkel kolom (S), representatieve fractie volgende nikkel chromatografie (NI), en representatieve fractie na SEC (SE). Dit cijfer is gewijzigd van een vorige publicatie12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: nikkel-affiniteits chromatografie zuivering van PCD. A) chromatogram van nikkel-affiniteits CHROMATOGRAFIE van PCD. De A280 wordt blauw weergegeven en de procentuele concentratie van ni buffer B wordt in rood weergegeven. Het monster werd in een lage 20 mM imidazol-concentratie geladen. De flowthrough (FLW THR) toont de oplosbare bacteriële eiwitten die niet aan het nikkel hars binden. De kolom werd gewassen met 20 mL imidazol-buffer van 20 mM. Een tweede 15 mL wasbeurt werd uitgevoerd met 125 mM imidazol. Elutie van PCD werd uitgevoerd met 250 mM imidazol. Sommige PCD toegeschreven in de aanwezigheid van 125 mM imidazol, maar de meerderheid van het eiwit in 250 mM imidazol. B) representatieve SDS-page analyse van nikkel affiniteits fracties. De belasting, flowthrough (FLW THR), en eerste was toonde de succesvolle inductie van PCD, de oplosbare bacteriële eiwitten die niet binden de nikkel hars, en de minimale eiwitten waargenomen tijdens de eerste wassen, respectievelijk. Verschillende fracties in de tweede wassen en elutie stappen worden getoond. Fracties van de tweede Wash opgenomen PCD eiwit maar ook weergegeven detecteerbaar hoger molecuulgewicht contaminanten. Fracties van de elutie-stap bleken vrij van verontreinigingen te zijn. Moleculaire gewichten worden links weergegeven. De mobiliteit van pcaH en pcaG wordt rechts getoond. C) agaroom-gel van Nuclease assay. De nikkel-affiniteits kolom belasting, flowthrough, Wash en meerdere fracties zijn getest op Nuclease activiteit. Een negatieve controle (controle) is het plasmide zonder toegevoegde eiwitten. Een positieve controle (PCDa) is een in de handel verkrijgbare PCD waarvan bekend is dat ze verontreinigd zijn met een DNA-Nuclease. DNA-soorten worden rechts aangeduid als kleine fragmenten (SF), supercoiled (SC), lineair (ln), verkreukeld Circle (NC) en verkreukeld dimeer (ND). D) kwantificatie van de verschillende DNA-soorten die zijn waargenomen in de Nuclease test met agarose-gel. Het totale pixel volume van elke baan werd gemeten. Het pixel volume van elke DNA-soort werd bepaald en uitgedrukt als een percentage van het totale pixel volume in de rijstrook. De negatieve controle was 81,7% supercoiled met 14,4% verkreukeld cirkels. De positieve controle weergegeven een aanzienlijke toename van 46,0% verkreukeld cirkels. De belasting en flowthrough bevatte bacteriële nucleasen die de plasmide en contaminerende bacteriën DNA omgezet in kleine fragmenten. De eerste was op 20 mm imidazol bleek ook significante Nuclease activiteit te bevatten, resulterend in lineaire en verkreukeld cirkels. Fracties 4-7 van de tweede was op 125 mM imidazol ook weergegeven significante Nuclease activiteit (met name breuken 4 en 5 die waargenomen gelineariseerde plasmide). Fracties 29-38 uit de elutie stap leek meer vergelijkbaar met de negatieve controle. In dit voorbeeld werden fracties 29-38 gekozen om te worden gecombineerd, geconcentreerd en verder gezuiverd door SEC. Dit cijfer is gewijzigd van een vorige publicatie12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: SEC zuivering van PCD. A) chromatogram van SEC van PCD-fracties na nikkel-affiniteits chromatografie. De A280 wordt blauw weergegeven en elutie fracties zijn geïndiceerd. PCD eluteerde van SEC als een enkele schijnbare piek. B) representatieve SDS-page analyse van SEC-fracties 33-48. De belasting is de geconcentreerde PCD na nikkel-affiniteits zuivering. Breuken 33-48 span de schijnbare SEC piek. Er werden geen detecteerbare verontreinigingen waargenomen. C) agaroom-gel van Nuclease assay. De SEC-belasting en meerdere fracties zijn getest op Nuclease-activiteit. Een negatieve controle (controle) is het plasmide zonder toegevoegde eiwitten. Een positieve controle (PCDa) is een in de handel verkrijgbare PCD waarvan bekend is dat ze verontreinigd zijn met een DNA-Nuclease. DNA-soorten worden aan de linkerzijde aangeduid als supercoiled (SC), verkreukeld Circle (NC) en verkreukeld dimeer (ND). D) kwantificatie van de verschillende DNA-soorten die zijn waargenomen in de Nuclease test met agarose-gel. Het totale pixel volume van elke baan werd gemeten. Het pixel volume van elke DNA-soort werd bepaald en uitgedrukt als een percentage van het totale pixel volume in de rijstrook. De negatieve controle was 82,1% supercoiled met slechts 13,7% verkreukeld cirkels. De positieve controle weergegeven een aanzienlijke toename van 64,8% verkreukeld cirkels. De SEC belasting weergegeven geen schijnbare Nuclease activiteit als gevolg van verstandige keuze van fracties van de nikkel-affiniteits zuivering. Op dezelfde manier, breuken 33-48 verscheen vergelijkbaar met de negatieve controle. Bijvoorbeeld, breuk 36 was 82,5% supercoiled en 13,2% verkreukeld Circle. In dit voorbeeld werden fracties 36 en 37 gekozen om te worden gekwantificeerd, bevroren en gehouden in een-80 °C vriezer voor toekomstig experimenteel gebruik. Dit cijfer is gewijzigd van een vorige publicatie12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: PCA-oxidatie en Nuclease activiteit van PCD SEC fracties. PCA-oxidatie werd gemeten met een290. Als PCD geoxideerd de PCA-molecule, de A290 daalde. PCA-oxidatie werd elke 20 s gedurende 1 uur gemeten. Een negatieve controle zonder toegevoegde PCD fractie (blauwe lijn) toonde geen verandering in een290, wat aangeeft dat de PCA-molecule stabiel was. Gegevens uit drie representatieve SEC-fracties (36 in rood, 33 in oranje, 39 in geel) tonen aan dat gezuiverde PCD de A290verlaagde, wat duidt op OXIDATIE van PCA. Dit cijfer is gewijzigd van een vorige publicatie12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Zuurstof opruimings systemen worden vaak opgenomen in één molecuul fluorescentiemicroscopie om fotobleaching3,7,8te verminderen. Deze microscopie technieken worden vaak gebruikt om nucleïnezuren of eiwit interacties met nucleïnezuren te observeren1,13,14. Verontreiniging van OSSs met nucleasen kan leiden tot valse resultaten.

In de handel verkrijgbare OSSs, waaronder GODCAT en PCD, is aangetoond dat het significante Nuclease besmetting11bevat. Het is mogelijk om te kopen van PCD en gebruik SEC om de Nuclease verontreiniging11te verwijderen. De prijs van in de handel verkrijgbare PCD van één leverancier steeg echter 5 maal na de bekendmaking van die methode. Deze methode genereert een zeer actieve, Nuclease vrije PCD heterodimer en kan denkbaar worden uitgevoerd binnen 1 week. In onze ervaring is de hoeveelheid PCD gegenereerd door een 1 L-cultuur (1-2 mg) voldoende voor één jaar experimenten (3 μg/experiment) in een productief laboratorium met 2 fluorescerende beeldvormingssystemen.

Inductie efficiëntie is de sleutel tot het succes van deze methode. Als de PCD heterodimer niet efficiënt wordt geïnduceerd en duidelijk door SDS-PAGE, de zuivering zal mislukken. Twee alternatieve strategieën kunnen worden berecht. Eerste, poging tot inductie van een andere kolonie op de E. coli transformatie plaat. Ten tweede hebben we eerder succes gehad met BL21, maar een alternatieve E. coli -stam voor expressie, zoals BL21 plyss, kan worden berecht. Succes van de PCA-oxidatie test berust op minimale blootstelling van het substraat aan de PCD voordat de test wordt gestart. Het wordt ten zeerste aanbevolen om de 96 goed plaat reacties op ijs in een koude kamer te monteren en het eiwit monster onmiddellijk toe te voegen voordat de plaat aan de lezer wordt geladen.

Nikkel-affiniteits chromatografie kan voldoende zijn om fracties van zuivere PCD te identificeren zonder contaminerende Nuclease activiteit. In dit geval is het mogelijk om de SEC-zuivering te elimineren. De fracties van de nikkel chromatografie moeten echter worden gecombineerd en gedurende een nacht bij 4 °C worden gekozen in een lopende buffer van SEC. De aanwezige glycerol in de SEC-loop buffer is belangrijk voor opslag bij-80 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door NIH GM121284 en AI126742 to KEY.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 βME
30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 Bio-Rad 161-0156
Acetic acid, Glacial Certified ACS Fisherl Chemical A38C-212
Agar, Granulated BD Biosciences DF0145-17-0
AKTA FPLC System GE Healthcare Life Sciences AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore UFC201024 10 kDa MWCO
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma F-2262
Ammonium Persulfate (APS) Tablets Amresco K833-100TABS
Ampicillin Amresco 0339-25G
Bacto Tryptone BD Biosciences DF0123173
BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract VWR 90004-092
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) Sigma-Aldrich B6755-500G
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coomassie Brilliant Blue Amresco 0472-50G
Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate Bio-Rad 2240096EDU
DTT P212121 SV-DTT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML Sigma-Aldrich D8537-500ML PBS
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Granulated LB Broth Miller EMD Biosciences 1.10285.0500
Hi-Res Standard Agarose AGTC Bioproducts AG500D1
Imidazole Sigma-Aldrich I0250-250G
IPTG Goldbio I2481C25
Leupeptin Roche 11017128001
Lysozyme from Chicken Egg White Sigma-Aldrich L6876-1G
Magnesium Chloride Hexahydrate Amresco 0288-1KG
Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability Thermo Fisher ND-2000C
NaCl P212121 RP-S23020
Ni-NTA Superflow (100 ml) Qiagen 30430
Novagen BL21 Competent Cells EMD Millipore 69-449-3 SOC media included
Orange G Fisher Scientific 0-267
Pepstatin Gold Biotechnology P-020-25
PMSF Amresco 0754-25G
Protocatechuic acid Fisher Scientific ICN15642110 PCA
Sodium dodecyl sulfate P212121 CI-00270-1KG
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devises
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL Thermo Fisher Scientific 09-741-04
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL Thermo Fisher Scientific 09-741-02
Superose 12 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 17517301
TEMED Amresco 0761-25ML
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager GE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174, (6), 553-557 (1990).
  2. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90, (2), 448-454 (2014).
  3. Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
  4. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36, (2), 280-290 (2003).
  5. Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3, (1), 17-25 (2004).
  6. Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275, (3-6), 367-375 (1992).
  7. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, (5), 1826-1835 (2008).
  8. Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216, (1), 49-68 (1990).
  9. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, (14), 6132-6138 (2010).
  10. Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
  11. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12, (10), 901-902 (2015).
  12. Senavirathne, G., Lopez, M. A. Jr, Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
  13. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
  14. Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539, (7630), 583-587 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics