Expression und Reinigung von Nuklease-freier Sauerstofffänger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Biochemistry

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Summary

Protocatechuate 3,4-Dioxygenase (PCD) kann mit seinem Substrat Protocatechuic Säure (PCA) enzymatisch freien diatomischen Sauerstoff aus einem wässrigen System entfernen. Dieses Protokoll beschreibt die Expressions-, Reinigungs- und Aktivitätsanalyse dieses Sauerstoff-Aufräumenzyms.

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Messer, R. K., Lopez Jr., M. A., Senavirathne, G., Yoder, K. E. Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase. J. Vis. Exp. (153), e59599, doi:10.3791/59599 (2019).

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Abstract

Die Einzelmolekülmikroskopie (SM) wird bei der Untersuchung dynamischer molekularer Wechselwirkungen von Fluorophor-markierten Biomolekülen in Echtzeit eingesetzt. Fluorophore sind jedoch anfällig für Signalverluste durch Photobleichung durch gelösten Sauerstoff (O2). Um Photobleichungen zu verhindern und die Lebensdauer des Fluorophors zu verlängern, werden Sauerstoff-Aufräumsysteme (OSS) eingesetzt, um O2zu reduzieren. Kommerziell erhältliche OSS können durch Nukleasen kontaminiert sein, die Nukleinsäuren schädigen oder abbauen, was die Interpretation experimenteller Ergebnisse verwirrend. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Expression und Reinigung von hochaktiven Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) ohne nachweisbare Nukleasekontamination. PCD kann reaktiveO2-Arten effizient entfernen, indem das Substrat Protocatechuinsäure (PCA) in 3-Carboxy-cis,cis-Muconinsäure umgestellt wird. Diese Methode kann in jedem wässrigen System verwendet werden, bei dem O2 eine nachteilige Rolle bei der Datenerfassung spielt. Diese Methode ist effektiv bei der Herstellung hochaktiver, nukleasefreier PCD im Vergleich zu handelsüblichen PCD.

Introduction

Die Biophysik von Einzelmolekülen (SM) ist ein schnell wachsendes Feld, das die Art und Weise verändert, wie wir biologische Phänomene betrachten. Dieses Feld hat die einzigartige Fähigkeit, grundlegende Gesetze der Physik und Chemie mit der Biologie zu verknüpfen. Fluoreszenzmikroskopie ist eine biophysikalische Methode, die SM-Empfindlichkeit erreichen kann. Fluoreszenz wird verwendet, um Biomoleküle zu erkennen, indem sie mit kleinen organischen Fluorophoren oder Quantenpunkten1verbunden werden. Diese Moleküle können Photonen emittieren, wenn sie durch Laservor dem ireversibel photobleichen2. Photobleaching tritt auf, wenn die fluoreszierenden Etiketten chemischen Schäden unterzogen werden, die ihre Fähigkeit zerstören, bei der gewünschten Wellenlänge2,3zu erregen. Das Vorhandensein von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in wässrigen Puffer sind eine primäre Ursache für Photobleichmittel2,4. Darüber hinaus kann ROS Biomoleküle schädigen und zu fehlerhaften Beobachtungen in SM-Experimenten5,6führen. Zur Vorbeugung von oxidativen Schäden können Sauerstoffräumsysteme (OSS) verwendet werden3,7,8. Das Glukoseoxidase/Kataalase-System (GODCAT) ist effizient bei der Entfernung von Sauerstoff8, produziert aber potenziell schädliche Peroxide als Zwischenprodukte. Diese können Biomoleküle namto schädigen, die in SM-Studien von Interesse sind.

Alternativ wird Protocatechuat 3,4 Dioxygenase (PCD)o2 effizient aus einer wässrigen Lösung mit seinem Substrat Protocatechuic Säure (PCA)7,9entfernen. PCD ist ein Metalloenzym, das Nicht-Häm-Eisen verwendet, um PCA zu koordinieren und die Katechol-Ringöffnungsreaktion mit gelöstem O210zu katalysieren. Diese einstufige Reaktion zeigt sich als insgesamt besseres OSS zur Verbesserung der Fluorophorstabilität in SM-Experimenten7. Leider enthalten viele kommerziell erhältliche OSS-Enzyme, einschließlich PCD, kontaminierende Nukleasen11. Diese Verunreinigungen können zur Schädigung von Substraten auf Nukleinsäurebasis führen, die in SM-Experimenten verwendet werden. Diese Arbeit wird ein chromatographiebasiertes Reinigungsprotokoll für den Einsatz rekombinanter PCD in SM-Systemen aufklären. PCD kann in jedem Experiment, bei dem ROS schädliche Substrate für die Datenerfassung benötigt werden, weit verbreitet werden.

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Protocol

1. Induzieren PcD-Expression in E. coli

  1. Kombinieren Sie 1 l pVP91A-pcaHG PCD-Expressionsplasmid (20 ng/l, Abbildung 1A) und 20 l E.coli BL21 (20 l kommerziell erhältliche Zellen, > 2 x 106 cfu/g Plasmid) in einer Röhre. Streichen Sie das Rohr zu mischen. Legen Sie die Röhre auf Eis 5 min.
  2. Transformation bei 42 °C für 30 s platzieren. Dann Eis 2 min.
  3. Fügen Sie 80 L SOC-Medien hinzu (super optimale Brühe mit Katabolitenrepression: 2,5 mM KCl, 10 mM NaCl, 2% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 10 mM MgSO4, 10 mM MgCl2, 20 mM Glukose). Schütteln Sie bei 225 Umdrehungen pro Min(rpm) 37 °C für 1 h.
  4. Die Transformationsreaktion auf LB Amp Agar (1L Luria Broth agar: 10 g NaCl, 10 g Bacto-Trypton, 5 g Hefeextrakt, 15 g Agar, 50 g/ml Ampicillin; 25 ml pro 10 cm Durchmesser Petrischale) verfestigen.
  5. Inkubieren Sie die Platte, Deckel nach unten, bei 37 °C für 16-18 h.
  6. 50 ml LB Amp (1L LB: 10 g Bacto-Trypton, 10 g NaCl, 5 g Hefeextrakt, 50 g/ml Ampicillin) in einem 250 ml Erlenmeyerkolben mit einer Kolonie impfen lassen. Bei 37 °C für 16-18 h Schütteln bei 225 Rpm inkubieren.
  7. 20 ml Kultur auf einen 4 L Kolben mit 1 L LB Amp übertragen. Bei 225 Umdrehungen bei 37 °C schütteln.
  8. Jeder h misst die Kultur OD600 (optische Dichte bei 600 nm). Wenn sich die Kultur OD600 0,5 nähert, erhöhen Sie die Häufigkeit der Messungen auf alle 15 min. Die gewünschte Dichte der Kultur ist 0.5 OD600.
  9. Den 4L-Kolben in einen Mülleimer mit Eis übertragen. Wirbeln Sie den Kolben im Eisbad, um die Kulturtemperatur zu reduzieren.
    Hinweis: Die Zeit auf dem Eis sollte so lange auf ein Minimum reduziert werden, damit die Zellen metabolisch aktiv bleiben. Idealerweise werden die Zellen auf Eis weniger als 10 min sein.
  10. Eine erfolgreiche Induktion der PCD kann durch Denaturing der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) beobachtet werden. Ernte 1 ml der nicht induzierten Kultur in einer Röhre. Drehen Sie die Probe 1 min bei 14.000 x g in einer Mikrofuge bei Umgebungstemperatur. Dekant den Überstand.
    1. Lösliche Die Pelletzellen in 150 L PBS (Phosphat gepufferte Saline).
    2. Fügen Sie ein gleiches Volumen von 2X Ladefarbstoff (1,2% SDS, 30% Glycerin, 150 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,0018% Bromphenolblau, 15% Wirbeln Sie die Probe gründlich zu mischen.
    3. Die Probe 3 min kochen und auf Eis übertragen. Die Probe kann für die zukünftige Analyse in einem -20 °C-Gefrierschrank gelagert werden.
      Hinweis: PBS ist mit oder ohne CaCl2 und MgCl2im Handel erhältlich. Viele Laboratorien werden PBS ohne CaCl2 und MgCl2 für Zellkulturmethoden haben. Wir haben keinen Unterschied zu PBS mit oder ohne CaCl2 und MgCl2gefunden.
  11. Den 4-Liter-Kolben bei 17 °C mit 180 U/min Schütteln in einen Inkubator überführen. Fahren Sie alle 20 min mit der Überwachung der OD600 fort.
  12. Bei 0,7 OD600 Isopropyl-Beta-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) auf 0,5 mM Endkonzentration (0,25 M Stammlösung) und 10 mg/L Ammoniumeisen (II) Sulfathexahydrat (Fe(NH4)2(SO4)2, 10 mg/ml Stammlösung) hinzufügen. Die PCD-Gene pcaH und pcaG werden durch Zugabe von IPTG aus dem T5-Promotor induziert (Abbildung 1A). Eisenerzsulfat wird durch PCD gebunden und für die katalytische Aktivität durch Koordination von Sauerstoff während der Katecholöffnung benötigt.
  13. Schütteln Sie die Kultur bei 180 Rpm bei 17 °C für 18 h.
  14. Legen Sie den Kulturkolben wie in 1.2 in Eis. Ernte 1 ml der induzierten Zellen für SDS-PAGE wie in 1.3.
  15. Gießen Sie die Bakterienkultur in Flaschen, die für die Zentrifugation geeignet sind. Eine 1 L-Kultur kann in 4 250 ml konischen Bodenflaschen zentrifugiert werden. Pellet die Kultur bei 4 °C für 20 min bei 3000 x g. Decant die Überräube. Bakterielle flüssige Abfälle entsprechend entsorgen.
  16. Pipetten, um die Pellets in 25 ml kalten PBS (CaCl2 und MgCl2 sind optional) pro 1 L Kultur wieder auszusetzen.
  17. Übertragen Sie die Resuspension auf 50 ml konische Röhren (1 50 ml Rohr pro 1 L Kultur). Pellet die Zellen bei 3000 x g für 20 min bei 4 °C. Den Überstand dekantiert und entsprechend entsorgen.
  18. Die Zellen in 10 ml Lysepuffer (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM Imidazol, 10 % Glycerin, 800 ng/mL Pepstatin, 1 g/ml Leupeptin und 87,1 g/mL Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)) durch Pipet. Einfrieren der Resuspension mit flüssigem Stickstoff in einem Dewar-Kolben. Bewahren Sie die Probenröhrchen in einem Gefrierschrank von -80 °C auf. Wir haben PCD aus Pellets gereinigt, die ein Jahr lang bei -80 °C gelagert werden, ohne dass ein offensichtlicher Aktivitätsverlust zu verzeichnen ist.
  19. Vergleichen Sie die nicht induzierten und induzierten Zellen mit SDS-PAGE.
    Hinweis: Wir hatten keine Schwierigkeiten mit der Induktion von PCD-Heterodimer. Wir empfehlen jedoch, die Induktion zu testen, bevor Sie mit der Reinigung fortfahren, falls ein Reagenz unerwartet abgelaufen ist.
    1. Montageplatten für SDS-PAGE (Maße: 7,3 cm x 8,3 cm x 0,75 mm dick). Das Stapelgel besteht aus 1,5 ml 6% Polyacrylamid (6% Acrylamid, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,1% SDS, 0,1% Ammoniumpersulfat, 0,001% TEMED). Das auflösende Gel besteht aus 3,5 ml 12% Polyacrylamid (12% Acrylamid, 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% SDS, 0,1% Ammoniumpersulfat, 0,001% TEMED). Legen Sie einen 10 Gutkamm in die Stapelschicht ein.
    2. Laden Sie 10 l nicht induzierte und induzierte bakterielle Proben. Last 4 l vorgefärbter Molekulargewichtsmarker für Proteine (Abbildung 1B).
    3. Elektrophorese das Gel bei 16,5 V/cm ca. 1 h. Das Bromphenolblau sollte den Boden des Gels erreichen.
    4. Legen Sie das Gel in Coomassie Blue Fleck (10% Essigsäure, 40% Methanol, 0.1% Coomassie Blue Farbstoff) in eine Kunststoffwanne. Der Fleck sollte das Gel vollständig eintauchen. Färbung bei Umgebungstemperatur für 20 min. Sanfte Rotation während der Färbung ist optional.
    5. Ersetzen Sie die Lösung durch Destain (10% Essigsäure, 40% Methanol). Inkubieren Sie bei Umgebungstemperatur mit optional sanfter Rotation, bis Proteinbänder gut sichtbar sind.
    6. Ersetzen Sie das Destain durch entionisiertes Wasser. Unter den bakteriellen Proteinen sollten die induzierten PCD-Untereinheiten in den induzierten Zellen sichtbar sein. Hexahistidin mit PCD-Untereinheit pcaH hat ein Molekulargewicht von 28,3 kDa und die PcaG-Untereinheit 22,4 kDa. Wenn die PCD-Untereinheiten nicht ersichtlich sind, sollte eine neue Induktion durchgeführt werden, die von einer neuen Kolonie abgeleitet wurde.

2. Nickel Affinitätschromatographie Reinigung der PCD

  1. Tauen Sie auf Eis eine 50 ml Tube von induzierten Zellen. Es kann 2-3 h dauern, um die Probe vollständig aufzutauen.
  2. Halten Sie die Röhre auf Eis, beschallen Sie die Probe bei 30% Amplitude für 1 min, Radfahren 1 s ein- und ausschalten. Verwenden Sie einen verjüngten Mikrospitzenbeschalltoner (Durchmesser 0,125 Zoll). Die maximale Leistung beträgt 400 W und die Frequenz beträgt 20 kHz und pro 1 L Kulturpellet.
  3. Nach der Beschallung Lysozym auf 0,2 mg/ml Endkonzentration (10 mg/ml Stammlösung) geben und 30 min bei 4 °C auf Eis halten.
  4. Gießen Sie das bakterielle Lysat in eine vorgekühlte Polycarbonatflasche (Maße: 25 mm x 89 mm). Die Flasche sollte mit einem Ultrazentrifuge-Rotor mit festem Winkel kompatibel sein. Andere Rohre und/oder Rotoren können ersetzt werden, aber die endgültige Gravitationskraft sollte beibehalten werden.
  5. Zentrifuge für 60 min bei 120.000 x g bei 4 °C. Zelluläre Trümmer bilden ein Pellet. Der Überstand kann gelb erscheinen.
    1. Das Pellet kann in die nachfolgende SDS-PAGE-Analyse einbezogen werden, um die Löslichkeit von PCD zu bestimmen (Abbildung 1B). Solubilisieren Sie das Pellet durch Wirbeln in 10 ml PBS. Übertragen Sie 150 l in ein 1,5 ml Rohr. Bereiten Sie das Beispiel für SDS-PAGE wie in 1.3 vor.
  6. Gießen Sie den Überstand auf ein kaltes 50 ml kegelförmiges Rohr. Beachten Sie die Lautstärke. Eine Kontamination des Überstandes mit bakterieller DNA kann zu einer zähflüssigen Probe führen. Die bakterielle genomische DNA könnte den Säulenfluss blockieren. Der Ultrazentrifugationsschritt 2.2 sollte wiederholt werden, um die bakterielle DNA zu pellet. Ein Pellet aus dieser zweiten Drehung ist möglicherweise nicht leicht sichtbar oder transparent.
  7. Machen Sie 500 ml Ni Puffer A (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 10% Glycerin, 800 ng/mL Pepstatin, 1 g/mL Leupeptin und 87,1 g/ml PMSF) und 500 mL Ni Puffer B (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% Glycerin, 800 ng/ml Pepstatin, 1 g/ml Leupeptin und 87,1 g/ml PMSF, 250 mM Imidazol, pH 8,0). Passieren Sie beide Ni-Puffer durch 0,2 m Porenfilter.
  8. Die Probe, die Puffer und das FPLC-System (Fast Protein Liquid Chromatography) befinden sich bei 4 °C in einem Kühlraum. Waschpumpe A mit Ni-Puffer A und Pumpe B mit Ni-Puffer B. Waschen Sie das System mit 20 mM Imidazol (8% Ni-Puffer B, 92% Ni-Puffer A), bis sich UV und Leitfähigkeit stabilisieren. Wir fließen routinemäßig Puffer bei 5 ml/min mit einer Druckgrenze von 1,0 MPa. Die Durchfluss- und Druckgrenze sollte durch die Spezifikationen des verwendeten FPLC-Instruments bestimmt werden.
  9. Bereiten Sie eine Säule mit 1,5 ml Nickel-aufgeladenem Harz (Maße: 110 mm lang x 5 mm) vor. Die Harzbindungskapazität beträgt 50 mg/ml und verträgt 1 MPa-Druck. Eine Säule kann vor der Reinigung bei 4 °C gegossen und gelagert werden.
    Hinweis: Die Größe der Säule kann proportional erhöht werden, um mehr als eine 50 ml Tube induzierter Zellen aufzunehmen, wenn mehr Protein benötigt wird. Wir bevorzugen für jede Zubereitung eine frische Säule, um sicherzustellen, dass keine Restproteine unser gewünschtes Protein kontaminieren. Nickelharze können jedoch gemäß den Anweisungen des Herstellers recycelt werden.
  10. Befestigen Sie die Spalte aus Nickel-geladenem Harz am FPLC. Führen Sie 20 ml 92% Ni Puffer A und 8% Ni Puffer B (20 mM Imidazol) bei 0,5 ml/min mit einer Druckgrenze von 0,5 MPa durch die Säule, um sich auszubalancieren. In Echtzeit sollte der FPLC A280 (280 nm UV-Absorption) sowie Leitfähigkeit messen. Wenn sich diese Werte nicht stabilisiert haben, nachdem das Volumen von 20 ml durch die Spalte geleitet wurde, fließen Sie die Puffer, bis sie sich stabilisiert haben.
  11. Laden Sie die Probe mit 0,15 ml/min in die Kolonne (ca. 10 ml). Stellen Sie die Druckgrenze auf 0,5 MPa ein. Sammeln Sie den Durchfluss durch.
  12. Waschen Sie die Säule mit 20 ml Ni-Puffer bei 20 mM Imidazol (92% Ni-Puffer A und 8% Ni-Puffer B). Bewahren Sie die Wäsche zur Analyse in einem 50 ml Rohr auf. Waschen Sie die Säule mit 15 ml 50% Ni Puffer A und 50% Ni Puffer B (125 mM Imidazol). Sammeln Sie die Elution in 19 Fraktionen von 0,8 ml Volumen. Waschen Sie die Säule mit 15 ml 100% Ni Puffer B. Sammeln Sie weitere 75 Fraktionen von 0,2 ml. Einige PCD-Heterodimer werden in der 50% Ni Buffer B-Waschanlage ausgegart sein, aber die Mehrheit des Heterodimers wird in der 100% Ni Buffer B-Waschanlage ausgegart sein.
  13. Analysieren Sie gesammelte Brüche auf 12% SDS-PAGE Gele, um das Vorhandensein von PCD zu bestätigen. Fügen Sie dem Durchfluss, dem Waschen und der Spitze A280 Brüche gleiche Volumina von 2X-Ladefarbstoff hinzu. Kochen Sie für 3 min. Transfer auf Eis. Gießen Sie zwei 12% SDS-PAGE Gele (wie in Schritt 1.7). Wiederholen Sie die Gelmethode wie unter 1.7 beschrieben.

3. Nuklease-Aktivität assay

  1. Identifizieren Sie auf Basis der SDS-PAGE-Analyse Nickelaffinitätsfraktionen, die nahezu reine PCD enthalten. Kombinieren Sie 5 l Chromatographiefraktion und 500 ng 3 kb supercoiled plasmid pXba+ im Reaktionspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,1 mM DTT) mit einem Endvolumen von 50 l.
    1. Bei 37 °C für 1 h inkubieren.
    2. Fügen Sie eine negative Kontrolle (kein zusätzliches Protein) und eine positive Kontrolle (kommerziell erhältliche PCD) ein. Stoppen Sie die Reaktion mit einer Stop-Lösung von 10 l (150 mM EDTA, pH 8,0, 0,6 % SDS, 18 % Glycerin, 0,15 % Orange G).
    3. Die Proben können in einem -20 °C-Gefrierschrank aufbewahrt werden, der später analysiert werden kann. Jedes übergewickelte Plasmid kann in einem Nuklease-Assay verwendet werden, solange die übergewickelten und entspannten Kreisreaktionsprodukte durch Agarose-Gel-Elektrophorese gelöst werden können.
  2. Gießen Sie ein 120 ml 1% Agarose-Gel in 1X TAE-Ethidium-Puffer (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA, 0,5 g/ml Ethidiumbromid) in einem Gelguss (Maße: 15 x 10 cm). Verwenden Sie einen 15 Brunnenkamm (Gutabmessungen: 5mm x 1.5 mm). Wenn das Gel gesetzt ist, tauchen Sie es in 1X TAE ethidium Puffer ein.
  3. Analysieren Sie 30 l der Reaktionen mit Agarose-Gel. Elektrophorese bei 10 V/cm bei Umgebungstemperatur ca. 1 h. Die Orange G Farbstofffront sollte am Ende des Gels sein.
  4. Verwenden Sie einen Fluoreszenzscanner, um das Ethidiumbromidsignal des Gels sofort abzubilden. Wenn ein 3 kb Plasmid verwendet wurde, wird das langsamste Band bei 3,5 kb entspannt, lineare DNA läuft bei 3 kb, und supercoiled Plasmid hat die schnellste Beweglichkeit bei 2 kb.
    1. Berechnen Sie das gesamte Pixelvolumen jeder Spur mit Bildanalysesoftware.
    2. Bestimmen Sie das Pixelvolumen der verschiedenen DNA-Arten, z. B. übergewickelte, lineare und genickte Kreise. Verwenden Sie diese Werte, um den Prozentsatz jeder DNA-Art zu bestimmen. Beispielsweise zeigt ein erhöhtes Vorhandensein von Nick-Kreisen, die mit einem Bruch im Vergleich zur negativen Kontrolle verbunden sind, das Vorhandensein von Nuklease an. Das Pixelvolumen der geknickten Kreise in einer Lane wird durch den Pixelwert der gesamten DNA dividiert. Bestimmen Sie einen Prozentsatz, indem Sie diese Zahl mit 100 multiplizieren.
  5. Kombinieren Sie Brüche aus dem zweiten Elutionspeak, die fast reine PCD-Heterodimer auf Basis der SDS-PAGE-Analyse enthalten und minimale bis nicht nachweisbare Nuklease-Aktivität haben. Unser typisches gepooltes Volumen beträgt 2 ml.
  6. Laden Sie die Probe in eine Zentrifugalfiltereinheit mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 10 kDa. Zentrifuge in einer schwingenden Eimerzentrifuge bei 4000 x g für 40 min bei 4 °C. Alternativ kann ein 35°-Festwinkelrotor bei 7500 x g für 20 min bei 4 °C verwendet werden.
    1. Wiederholen Sie die Zentrifugation, bis das endgültige Retentatvolumen 100-200 l beträgt.
    2. Invertieren Sie die Filtereinheit und stellen Sie das Retentat durch Zentrifugation bei 1000 x g für 2 min bei 4 °C wieder her.

4. Größenausschluss Chromatographie Reinigung der PCD

  1. Machen Sie 250 ml Größenausschlusschromatographie (SEC) Laufpuffer (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% Glycerin, 0,1 mM EDTA, 800 ng/mL Pepstatin, 1 g/ml Leupeptin und 87,1 g/ml PMSF). Den Puffer durch einen 0,2 m Porenfilter passieren und bei 4 °C lagern.
    Hinweis: Führen Sie alle Schritte in einem Kühlraum bei 4 °C aus. Die SEC-Reinigung ist optional, aber das Protein sollte im SEC-Laufpuffer gespeichert werden. Wenn die SEC-Reinigung weggelassen wird, wird das in 3.6.2 gesammelte Retentat. sollte gegen 1 L SEC-Puffer in 10 kDa MWCO (Molekulargewicht abgeschnitten) Dialyseschläuche bei 4 °C über Nacht dialyziert werden.
  2. Equilibrate eine vernetzte Agarose SEC (Größenausschlusschromatographie) Spalte (Dimesionen: 10 mm x 300 mm; 24 ml Bettvolumen; 25 - 500 l Probenvolumen; 1,5 MPa Druckgrenze; 2 x 106 Da Ausschlussgrenze; 1 bis 300 kDa Trennung) mit SEC Laufpuffer bei 0,5 ml/min.
    Hinweis: Bei gewünschter alternativer Größe können SEC-Spalten verwendet werden.
  3. Laden Sie die konzentrierten Fraktionen auf eine 200-L-Volumeninjektionsschleife. Laden Sie die Probe mit 0,5 ml/min in die Spalte. Die SEC-Auflösung steigt mit einem geringeren Lastvolumen. Elute mit 23 ml SEC-Laufpuffer und sammeln 94 Brüche von 250 l. Das SEC-Chromatogramm sollte einen einzelnen A280-Peak auflösen, der der PCD-Heterodimer ist. Wir stellen fest, dass PCD 8,9 ml elutiert. Das Elutionszeitzeitpunkt ändert sich mit alternativen SEC-Spalten.

5. PCA-Oxidations- und Nuklease-Aktivitäts-Assays

  1. Reaktionen auf assay sowohl Oxidation von PCA und Nuklease-Aktivität werden in einer 96-well-Flachbodenplatte durchgeführt. Montage Reaktionen in einer 96-Wellplatte auf Eis in einem 4 °C Kalten Raum, um eine vorzeitige Katalyse zu verhindern. Kombinieren Sie in einem Endvolumen von 50 l: 130 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 0,1 mM DTT, 5 mM PCA, 10 ng/mL supercoiled Plasmid pXba+ und 10 l der einzelnen PCD SEC-Fraktionen.
    Hinweis: Die PCD SEC-Fraktionen sollten zuletzt und unmittelbar vor der Analyse hinzugefügt werden, da das Protein zum Zeitpunkt der Zugabe mit der Katalyse beginnt.
  2. Die PCD-Oxidation von PCA führt zu einer reduzierten Absorption von PCA bei 290 nm (A290). Übertragen Sie die 96-Wellplatte auf den Plattenhalter eines Plattenlesers, der auf eine Innentemperatur von 37 °C eingestellt ist. Ziehen Sie den Plattenhalter in das Instrument ein und messen Sie A290 in 20 s Intervallen für 1 h. Lassen Sie das Instrument die Platte 5 s vor jeder Lesung schütteln.
  3. Beenden Sie die Reaktionen nach 1 h, indem Sie eine Stop-Lösung von 10 l (150 mM EDTA, pH 8,0, 0,6 % SDS, 18 % Glycerin, 0,15 % Orange G) hinzufügen.
  4. Vorbereiten, Laden und Ausführen eines Agarose-Gels wie in Schritt 3.2.
  5. Bild und analysieren Sie das Agarose-Gel wie in Schritt 3.3.
  6. Wählen Sie Fraktionen mit der meisten PCA-Oxidationsaktivität und keine beobachtete Nukleasekontamination für die Langzeitlagerung bei -80 °C. Messen Sie die A280.
  7. Berechnen Sie die gesamte PCD-Konzentration mit dem A280 und dem Aussterbekoeffizienten(280) von 734.700 M-1cm-1.
  8. Fangen Sie einzelne Fraktionen in flüssigem Stickstoff ein. In einem Gefrierschrank von -80 °C aufbewahren. Alternativ können Sie aktive, nukleasefreie Fraktionen auf die gleiche Weise kombinieren und einfrieren. Unsere typische Ausbeute beträgt 1-2 mg PCD pro L-Kultur. Typische Verwendung in einem SM-Experiment ist 3 g PCD. Wir haben PCD bei -80 °C für bis zu 1 Jahr gespeichert, ohne Abnahme der Aktivität.

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Representative Results

Kommerziell erhältliche Sauerstofffänger-PCD ist häufig mit einer DNA-Nuklease kontaminiert. Die Kontaminierende Nukleaseaktivität könnte zu falschen Ergebnissen in fluoreszierenden Studien führen, insbesondere in Studien, die DNA- oder DNA-interagierende Proteine analysieren. Wir haben herausgefunden, dass rekombinante PCD, ein Heterodimer von Hexahistidin mit phäzidierten PcaH und pcaG, in E. coli exprimiert werden kann (Abbildung 1). Der Heterodimer wird zunächst durch Nickelaffinitätschromatographie gereinigt (Abbildung 2). PCD wird in 2 Schritten der Imidazol-Konzentrationen eluiert. Chromatographiefraktionen werden von SDS-PAGE analysiert. Bruchteile von nahezu reiner PCD werden durch SEC konzentriert und weiter gereinigt (Abbildung 3). DIE SEC-Fraktionen werden individuell auf die PCA-Oxidationsaktivität und die Nukleaseaktivität analysiert (Abbildung 4). Brüche, die eine hohe Oxidationsaktivität und keine offensichtliche Nukleaseaktivität aufwiesen, werden auf Proteinkonzentration untersucht und in einem -80 °C Gefrierschrank für den experimentellen Einsatz aufbewahrt.

Figure 1
Abbildung 1: Induktion von PCD in E. coli. (A) pVP91A-pcaHG wird mit den PCD-Untereinheiten pcaG () und Hexahistidin gezeigt. (B) Repräsentatives SDS-PAGE Gel der PCD-Induktion. Molekulargewichte sind auf der linken Seite angegeben. Die Mobilitäten von 28,3 kDa hexahistidine-getaggtpcaH und 22.4 kDa pcaG sind auf der rechten Seite. Uninduzierte E. coli (Un), induzierte E. coli (In), das Pellet nach E. coli Lyse und Ultrazentrifugation (P), der Überstand nach der Ultrazentrifugation, der in eine Nickelsäule (S) geladen werden soll, repräsentative Fraktion nach Nickelchromatographie (Ni) und repräsentative Fraktion nach SEC (SE). Diese Zahl wurde gegenüber einer früheren Veröffentlichung12geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Nickel-Affinitätschromatographie-Reinigung von PCD. (A) Chromatogramm der Nickelaffinitätschromatographie der PCD. Der A280 ist blau und die Prozentuale Konzentration von Ni Puffer B rot dargestellt. Die Probe wurde in einer niedrigen Imidazolkonzentration von 20 mM geladen. Der Durchfluss (Flw Thr) zeigt die löslichen bakteriellen Proteine, die nicht an das Nickelharz gebunden sind. Die Säule wurde mit 20 ml 20 ml Imidazolpuffer gewaschen. Eine zweite 15 ml-Waschanlage wurde mit 125 mM Imidazol durchgeführt. Die Elution der PCD wurde mit 250 mM Imidazol durchgeführt. Einige PCD eluiert in Gegenwart von 125 mM Imidazol, aber die Mehrheit des Proteins eluiert in 250 mM Imidazol. (B) Repräsentative SDS-PAGE-Analyse von Nickelaffinitätsfraktionen. Die Last, der Durchfluss (Flw Thr) und die erste Wäsche zeigten die erfolgreiche Induktion von PCD, den löslichen bakteriellen Proteinen, die das Nickelharz nicht bindeten, und den minimalen Proteinen, die während der ersten Wäsche beobachtet wurden. Mehrere Fraktionen in den zweiten Wasch- und Elutionsschritten werden angezeigt. Die Fraktionen aus der zweiten Wäsche enthielten PCD-Protein, zeigten aber auch nachweisbare Verunreinigungen mit höherem Molekulargewicht. Brüche aus dem Elutionsschritt schienen frei von Verunreinigungen zu sein. Molekulargewichte werden auf der linken Seite angezeigt. Auf der rechten Seite sind die Mobilitäten von pcaH und pcaG dargestellt. (C) Agarose-Gel des Nuklease-Assays. Die Nickelaffinitätsspaltenlast, durchfließen, waschen und mehrere Fraktionen wurden auf Nukleaseaktivität getestet. Eine negative Kontrolle (Kontrolle) ist das Plasmid ohne zugesetztes Protein. Eine Positivkontrolle (PCDa) ist eine handelsübliche PCD, die bekanntermaßen mit einer DNA-Nuklease kontaminiert ist. DNA-Arten werden auf der rechten Seite als kleine Fragmente (SF), Supercoiled (SC), linear (LN), Nicked Circle (NC) und Nicked Dimer (ND) angezeigt. (D) Quantifizierung der verschiedenen DNA-Arten, die im Agarose-Gel-Nuklease-Assay beobachtet wurden. Das gesamte Pixelvolumen jeder Spur wurde gemessen. Das Pixelvolumen jeder DNA-Art wurde bestimmt und als Prozentsatz des gesamten Pixelvolumens in der Spur ausgedrückt. Die Negativkontrolle war 81,7% übercoiled mit 14,4% nicked circles. Die Positivkontrolle zeigte einen deutlichen Anstieg von 46,0% nicked circles. Die Last und der Durchfluss enthielten bakterielle Nukleasen, die das Plasmid und die Kontaminierung der Bakterien-DNA in kleine Fragmente umwandelten. Die erste Wäsche bei 20 mM Imidazol schien ebenfalls eine signifikante Nukleaseaktivität zu enthalten, was zu linearen und genicken den Kreisen führte. Die Fraktionen 4-7 aus der zweiten Waschanlage bei 125 mM Imidazol zeigten ebenfalls eine signifikante Nukleaseaktivität (insbesondere die Fraktionen 4 und 5, die ein beobachtetes linearisiertes Plasmid erzeugten). Die Fraktionen 29-38 aus dem Elutionsschritt erschienen der Negativkontrolle ähnlicher. In diesem Beispiel wurden die Brüche 29-38 ausgewählt, um von der SEC kombiniert, konzentriert und weiter gereinigt zu werden. Diese Zahl wurde gegenüber einer früheren Veröffentlichung12geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: SEC-Reinigung der PCD. (A) Chromatogramm der SEC von PCD-Fraktionen nach Nickelaffinitätschromatographie. Der A280 ist blau und Elutionsfraktionen sind angegeben. PCD eluiert von SEC als eine einzige scheinbare Spitze. (B) Repräsentative SDS-PAGE-Analyse der SEC-Fraktionen 33-48. Die Last ist die konzentrierte PCD nach Nickelaffinitätsreinigung. Die Brüche 33-48 überspannen den scheinbaren SEC-Peak. Es wurden keine nachweisbaren Verunreinigungen beobachtet. (C) Agarose-Gel des Nuklease-Assays. Die SEC-Last und mehrere Fraktionen wurden auf Nuklease-Aktivität getestet. Eine negative Kontrolle (Kontrolle) ist das Plasmid ohne zugesetztes Protein. Eine Positivkontrolle (PCDa) ist eine handelsübliche PCD, die bekanntermaßen mit einer DNA-Nuklease kontaminiert ist. DNA-Arten werden auf der linken Seite als supercoiled (SC), nicked circle (NC) und nicked dimer (ND) angezeigt. (D) Quantifizierung der verschiedenen DNA-Arten, die im Agarose-Gel-Nuklease-Assay beobachtet wurden. Das gesamte Pixelvolumen jeder Spur wurde gemessen. Das Pixelvolumen jeder DNA-Art wurde bestimmt und als Prozentsatz des gesamten Pixelvolumens in der Spur ausgedrückt. Die Negativkontrolle war 82,1% übercoiled mit nur 13,7% nicked circles. Die Positivkontrolle zeigte einen deutlichen Anstieg von 64,8% nicked circles. Die SEC-Last zeigte keine offensichtliche Nukleaseaktivität aufgrund der vernünftigen Wahl der Fraktionen aus der Nickelaffinitätsreinigung. In ähnlicher Weise erschienen die Fraktionen 33-48 ähnlich wie die Negative Kontrolle. Zum Beispiel war Fraktion 36 82,5% übercoiled und 13.2% nicked circle. In diesem Beispiel wurden die Fraktionen 36 und 37 ausgewählt, um quantifiziert, eingefroren und in einem Gefrierschrank von -80 °C für den späteren experimentellen Einsatz aufbewahrt zu werden. Diese Zahl wurde gegenüber einer früheren Veröffentlichung12geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: PCA-Oxidations- und Nukleaseaktivität von PCD SEC-Fraktionen. Die PCA-Oxidation wurde mit A290gemessen. Als PCD das PCA-Molekül oxidierte, verringerte sich der A290. Die PCA-Oxidation wurde alle 20 s für 1 h gemessen. Eine negative Kontrolle ohne zusätzliche PCD-Fraktion (blaue Linie) zeigte keine Änderung in A290, was darauf hindeutet, dass das PCA-Molekül stabil war. Daten von drei repräsentativen SEC-Fraktionen (36 in rot, 33 in Orange, 39 in Gelb) zeigen, dass gereinigte PCD die A290reduzierte, was auf eine Oxidation von PCA hindeutet. Diese Zahl wurde gegenüber einer früheren Veröffentlichung12geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Sauerstoff-Aufräumsysteme sind üblicherweise in einzelmolekülfluoreszenzmikroskopische Fluoreszenzmikroskopie enthalten, um Photobleichmittel zu reduzieren3,7,8. Diese Mikroskopie-Techniken werden oft verwendet, um Nukleinsäuren oder Protein-Wechselwirkungen mit Nukleinsäuren1,13,14zu beobachten. Die Kontamination von OSS mit Nukleasen kann zu falschen Ergebnissen führen.

Kommerziell erhältliche OSS, einschließlich GODCAT und PCD, enthalten nachweislich eine signifikante Nukleasekontamination11. Es ist möglich, PCD zu kaufen und SEC zu beschäftigen, um den Nuklease-Kontaminanten11zu entfernen. Der Preis für handelsübliche PCD eines Herstellers erhöhte sich jedoch nach der Veröffentlichung dieser Methode um das Fünffache. Diese Methode erzeugt einen hochaktiven, nukleasefreien PCD-Heterodimer und kann möglicherweise innerhalb von 1 Woche durchgeführt werden. Nach unserer Erfahrung ist die Menge an PCD, die durch eine 1-L-Kultur (1-2 mg) erzeugt wird, ausreichend für ein Jahr Experimente (3 g/Experiment) in einem produktiven Labor mit 2 fluoreszierenden Bildgebungssystemen.

Die Induktionseffizienz ist der Schlüssel zum Erfolg dieser Methode. Wenn der PCD-Heterodimer nicht effizient induziert und durch SDS-PAGE sichtbar wird, ist die Reinigung erfolglos. Zwei alternative Strategien können ausprobiert werden. Versuchen Sie zunächst, eine andere Kolonie auf der E. coli-Transformationsplatte zu induktionieren. Zweitens hatten wir bereits Erfolge mit BL21, aber ein alternativer E. coli-Stamm zur Expression, wie BL21 pLysS, kann versucht werden. Der Erfolg des PCA-Oxidationstestes hängt von einer minimalen Exposition des Substrats gegenüber der PCD ab, bevor der Test gestartet wird. Es wird dringend empfohlen, die 96 Well-Plattenreaktionen auf Eis in einem kalten Raum zusammenzusetzen und die Proteinprobe unmittelbar vor dem Laden der Platte in den Lesegerät einzutragen.

Die Nickelaffinitätschromatographie kann ausreichen, um Bruchteile reiner PCD ohne kontaminierende Nukleaseaktivität zu identifizieren. In diesem Fall ist es möglich, die SEC-Reinigung zu eliminieren. Die Nickelchromatographiefraktionen sollten jedoch über Nacht bei 4 °C im SEC-Laufpuffer kombiniert und dialysiert werden. Das im SEC-Laufpuffer vorhandene Glycerin ist wichtig für die Lagerung bei -80 °C.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von NIH GM121284 und AI126742 an KEY unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 βME
30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 Bio-Rad 161-0156
Acetic acid, Glacial Certified ACS Fisherl Chemical A38C-212
Agar, Granulated BD Biosciences DF0145-17-0
AKTA FPLC System GE Healthcare Life Sciences AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore UFC201024 10 kDa MWCO
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma F-2262
Ammonium Persulfate (APS) Tablets Amresco K833-100TABS
Ampicillin Amresco 0339-25G
Bacto Tryptone BD Biosciences DF0123173
BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract VWR 90004-092
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) Sigma-Aldrich B6755-500G
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coomassie Brilliant Blue Amresco 0472-50G
Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate Bio-Rad 2240096EDU
DTT P212121 SV-DTT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML Sigma-Aldrich D8537-500ML PBS
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Granulated LB Broth Miller EMD Biosciences 1.10285.0500
Hi-Res Standard Agarose AGTC Bioproducts AG500D1
Imidazole Sigma-Aldrich I0250-250G
IPTG Goldbio I2481C25
Leupeptin Roche 11017128001
Lysozyme from Chicken Egg White Sigma-Aldrich L6876-1G
Magnesium Chloride Hexahydrate Amresco 0288-1KG
Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability Thermo Fisher ND-2000C
NaCl P212121 RP-S23020
Ni-NTA Superflow (100 ml) Qiagen 30430
Novagen BL21 Competent Cells EMD Millipore 69-449-3 SOC media included
Orange G Fisher Scientific 0-267
Pepstatin Gold Biotechnology P-020-25
PMSF Amresco 0754-25G
Protocatechuic acid Fisher Scientific ICN15642110 PCA
Sodium dodecyl sulfate P212121 CI-00270-1KG
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devises
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL Thermo Fisher Scientific 09-741-04
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL Thermo Fisher Scientific 09-741-02
Superose 12 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 17517301
TEMED Amresco 0761-25ML
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager GE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086

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References

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