Expressão e purificação do protocatechuato de oxigênio sem nuclease 3,4-Dioxigenase

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Protocatechuato 3,4-dioxygenase (PCD) pode enzimática remover o oxigênio diatômico livre de um sistema aquoso usando seu ácido protocatechuic substrato (PCA). Este protocolo descreve a expressão, purificação e análise de atividade desta enzima de limpeza de oxigênio.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Messer, R. K., Lopez Jr., M. A., Senavirathne, G., Yoder, K. E. Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase. J. Vis. Exp. (153), e59599, doi:10.3791/59599 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

A microscopia de molécula única (SM) é usada no estudo de interações moleculares dinâmicas de biomoléculas rotuladas por fluorofóforos em tempo real. No entanto, os fluorofônicos são propensos à perda de sinal através do fotobranqueamento por oxigênio dissolvido (O2). Para evitar o reclareamento e estender a vida fluorofônica, os sistemas de limpeza de oxigênio (OSS) são empregados para reduzir O2. OsS comercialmente disponíveis podem ser contaminados por nucleases que danificam ou degradam os ácidos nucleicos, confundindo a interpretação dos resultados experimentais. Aqui detalhamos um protocolo para a expressão e purificação de pseudomonas altamente ativas putida protocatechuato-3,4-dioxigenase (PCD) sem contaminação por nuclease detectável. Pcd pode remover eficientemente reativo O2 espécies através da conversão do ácido protocatecogênico substrato (PCA) para 3-carboxy-cis, ácido cis-muconic. Este método pode ser usado em qualquer sistema aquoso onde O2 desempenha um papel prejudicial na aquisição de dados. Este método é eficaz na produção de PCD altamente ativo, livre de nuclease em comparação com PCD comercialmente disponível.

Introduction

A biofísica de molécula única (SM) é um campo em rápido crescimento mudando a forma como olhamos para fenômenos biológicos. Este campo tem a capacidade única de ligar as leis fundamentais da física e da química à biologia. A microscopia da fluorescência é um método biofísico que pode alcançar a sensibilidade do SM. Fluorescência é usada para detectar biomoléculas, ligando-os a pequenos fluorofônicos orgânicos ou pontos quânticos1. Estas moléculas podem emitir fótons quando excitados por lasers antes do photobleaching irreversivelmente2. Photobleaching ocorre quando os rótulos fluorescentes sofrem danos químicos que destrói sua capacidade de excitar no comprimento de onda desejado2,3. A presença de espécies reativas de oxigênio (ROS) em tampão aquoso são uma das principais causas de fotobranqueamento2,4. Além disso, o ROS pode danificar biomoléculas e levar a observações errôneas nos experimentos sm5,6. Para evitar danos oxidativos, os sistemas de limpeza de oxigênio (OSS) podem ser usados3,7,8. O sistema de oxidase/catalase de glicose (GODCAT) é eficiente na remoção de oxigênio8,mas produz peróxidos potencialmente prejudiciais como intermediários. Estes podem ser prejudiciais para biomoléculas de interesse em estudos de SM.

Alternativamente, o protocatechuato 3,4 dioxygenase (PCD) removerá eficientemente O2 de uma solução aquosa usando seu ácido protocatechuic substrato (PCA)7,9. PCD é uma metalloenzima que usa ferro autónomos para coordenar PCA e catalisar a reação de abertura do anel catechol usando dissolvido O210. Esta reação de um passo é mostrado para ser um oss global melhor para melhorar a estabilidade do fluorofóbico em experimentos SM7. Infelizmente, muitas enzimas oss comercialmente disponíveis, incluindo PCD, contêm nucleases contaminantes11. Esses contaminantes podem levar ao dano de substratos à base de ácido nucleico usados em experimentos com SM. Este trabalho irá elucidar um protocolo de purificação à base de cromatografia para o uso de PCD recombinante em sistemas de SM. Pcd pode ser amplamente aplicado a qualquer experimento onde ROS estão prejudicando os substratos necessários para a aquisição de dados.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Induzir a expressão pcd em E. coli

  1. Combine 1 μL pVP91A-pcaHG PCD expressão plasmid (20 ng/μL, Figura 1A)e 20 μL de E.coli BL21 (20 μL células comercialmente disponíveis, > 2 x 106 cfu/μg plasmid) em um tubo. Agite o tubo para misturar. Coloque o tubo no gelo 5 min.
  2. Coloque a transformação em 42 °C para 30 s. Em seguida, gelo 2 min.
  3. Adicionar 80 μL SOC media (super caldo ideal com repressão catabolite: 2,5 mM KCl, 10 mM NaCl, 2% tryptone, extrato de levedura de 0,5%, 10 mM MgSO4, 10 mM MgCl2, 20 mM glicose). Agite a 225 revoluções por min (rpm) 37 °C por 1 h.
  4. Placa a reação de transformação em LB Amp Agar (1L Luria Caldo ágar: 10 g NaCl, 10 g bacto-tripptone, 5 g de extrato de levedura, 15 g de ágar, 50 μg/mL ampicilina; 25 mL por 10 cm de diâmetro placa de Petri).
  5. Incubar a placa, tampa virada para baixo, em 37 °C para 16-18 h.
  6. Inoculate 50 mL LB Amp (1L LB: 10 g bacto-tripptone, 10 g NaCl, extrato de fermento 5g, 50 μg/mL ampicilina) em um frasco de 250 mL Erlenmeyer com uma colônia. Incubar a 37 °C para 16-18 h tremendo em 225 rpm.
  7. Transfira a cultura de 20 mL para um frasco 4 L com 1 L LB Amp. Agite a 225 rpm a 37 °C.
  8. Cada h mede a cultura OD600 (densidade óptica em 600 nm). À medida que a cultura OD600 se aproxima de 0,5, aumentar a freqüência de medições para cada 15 min. A densidade desejada da cultura é de 0,5 OD600.
  9. Transfira o frasco 4L para uma caixa de gelo. Agite o frasco no banho de gelo para reduzir a temperatura da cultura.
    Nota: O tempo no gelo deve ser mantido a um mínimo de modo que as pilhas permaneçam metabolicamente ativas. Idealmente, as células estarão no gelo menos de 10 min.
  10. A indução bem-sucedida da PCD pode ser observada desnatando a análise do sulacril de poliacrilde gel de poliacrilúfo (SDS-PAGE) de sódio. Colheita 1 mL da cultura não induzida em um tubo. Gire a amostra 1 min a 14.000 x g em uma microfúgio a temperatura ambiente. Decantar o supernatant.
    1. Solubilize as células pelleted em 150 μL PBS (soro lógico tampão de fosfato).
    2. Adicione um volume igual de tine de carregamento 2X (1,2% SDS, 30% glicerol, 150 mM Tris-HCl, pH 6.8, 0.0018% bromehenol azul, 15% β-mercaptoethanol). Vortex a amostra para misturar completamente.
    3. Ferva a amostra por 3 min e transfira para o gelo. A amostra pode ser armazenada em um freezer -20 °C para análise futura.
      Nota: PBS está disponível comercialmente com ou sem CaCl2 e MgCl2. Muitos laboratórios terão PBS sem CaCl2 e MgCl2 para métodos de cultura celular. Nós não encontramos nenhuma diferença com PBS com ou sem CaCl2 e MgCl2.
  11. Transfira o frasco 4 L para uma incubadora a 17 °C com 180 rpm tremendo. Continue monitorando o OD600 a cada 20 min.
  12. Em 0,7 OD600 adicionar isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) para 0,5 mM concentração final (0,25 M solução de estoque) e 10 mg / L ferro amônio (II) hexahidrato de sulfato (Fe (NH4)2(SO4)2, 10 mg / mL solução de ações). Os genes PCD pcaH e pcaG são induzidos pelo promotor T5 pela adição do IPTG (Figura 1A). O sulfato de ferro é encadernado pela PCD e necessário para a atividade catalítica coordenando o oxigênio durante a abertura do catechol.
  13. Agite a cultura a 180 rpm a 17 °C por 18 h.
  14. Coloque o frasco de cultura no gelo como em 1,2. Colheita 1 mL das células induzidas para SDS-PAGE como em 1,3.
  15. Despeje a cultura bacteriana para garrafas apropriadas para centrífuga. Uma cultura de 1 L pode ser centrífuga em 4 garrafas de fundo cônico sacásmicos mL. Pelota a cultura em 4 °C para 20 min em 3000 x g. Decant os supernatants. Descarte de resíduos líquidos bacterianos adequadamente.
  16. Pipet para resuspender as pelotas em 25 mL FRIO PBS (CaCl2 e MgCl2 são opcionais) por 1 L cultura.
  17. Transfira a resuspensão para tubos cônicos de 50 mL (tubo de 1 50 mL por cultura 1 L). Pelotas as células a 3000 x g por 20 min a 4 °C. Decantar o supernatant e dispor adequadamente.
  18. Resuspender as células em 10 mL de ltampão de lse (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 20 mM imidazole, 10% glicerol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin, e 87.1 μg/mL fenilmethylsulfonyl fluoreto (PMSF)) por pipetting. Congele a resuspensão com nitrogênio líquido em um frasco de Dewar. Guarde os tubos de amostra em um freezer de -80 °C. Nós purificamos PCD de pelotas armazenadas a -80 °C por um ano sem aparente perda de atividade.
  19. Compare as células não induzidas e induzidas por SDS-PAGE.
    Nota: Nós não tivemos nenhuma dificuldade com a indução do heterodimer do PCD. No entanto, recomendamos testar a indução antes de continuar com a purificação no caso de qualquer reagente ter expirado inesperadamente.
    1. Monte placas para SDS-PAGE (dimensões: 7,3 cm x 8,3 cm x 0,75 mm de espessura). O gel de empilhamento é de 1,5 mL 6% de poliacrilamida (6% de acrilamida, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,1% SDS, 0,1% de persulfato de amônio, 0,001% TEMED). O gel de resolução é de 3,5 mL 12% de poliacrilamida (12% de acrilamida, 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% SDS, 0,1% de persulfato de amônio, 0,001% TEMED). Insira um pente de 10 poços na camada de empilhamento.
    2. Carga 10 μL de amostras bacterianas não induzidas e induzidas. Carga 4 μL de marcadores de peso molecular prestaminado para proteínas (Figura 1B).
    3. Eletroforrese o gel em 16,5 V / cm aproximadamente 1 h. O bromehenol azul deve chegar ao fundo do gel.
    4. Coloque o gel em coomassie mancha azul (10% de ácido acético, 40% metanol, 0,1% coomassie corante azul) em uma banheira de plástico. A mancha deve mergulhar completamente o gel. Mancha na temperatura ambiente para 20 min. A rotação delicada durante a coloração é opcional.
    5. Substitua a solução por destain (ácido acético de 10%, 40% metanol). Incubar a temperatura ambiente com rotação suave opcional até que as bandas de proteína são facilmente visíveis.
    6. Substitua o destain por água desionizada. Entre as proteínas bacterianas, as subunidades induzidas por PCD devem ser visíveis nas células induzidas. Hexahistidina marcado PCD subunidade pcaH tem um peso molecular de 28,3 kDa e a subunidade pcag é de 22,4 kDa. Se as subunidades pcd não são aparentes, uma nova indução derivada de uma nova colônia deve ser realizada.

2. Purificação de cromatografia de afinidade de níquel de PCD

  1. Descongele no gelo um tubo de 50 mL de células induzidas. Pode levar 2-3 h para descongelar completamente a amostra.
  2. Mantendo o tubo no gelo, sonicate a amostra em 30% de amplitude para 1 min, ciclismo 1 s dentro e fora. Use um microtip cônico (diâmetro 0.125 polegadas) sonicator. A potência máxima é de 400 W e a frequência é de 20 kHz e por 1 L de pelota cultural.
  3. Após a sonorização, adicione o lysozyme a 0,2 mg/mL concentração final (10 mg/ml de solução de estoque) e mantenha o gelo por 30 min a 4 °C.
  4. Despeje o lisato bacteriano em uma garrafa de policarbonato pré-refrigerada (dimensões: 25 mm x 89 mm). A garrafa deve ser compatível com um rotor de ultracentrífuga de ângulo fixo. Outros tubos e/ou rotores podem ser substituídos, mas a força de gravitação final deve ser mantida.
  5. Centrífuga por 60 min a 120.000 x g a 4 °C. Os detritos celulares formarão uma pelota. O supernatant pode parecer amarelo.
    1. A pelota pode ser incluída na análise sds-PAGE subsequente para determinar a solubilidade do PCD(Figura 1B). Solubilize a pelota vórtice em 10 mL PBS. Transfira 150 μL para um tubo de 1,5 mL. Prepare a amostra para SDS-PAGE como em 1,3.
  6. Despeje o supernatant a um tubo cônico frio de 50 mL. Observe o volume. A contaminação do supernatant com ADN bacteriano pode render uma amostra viscosa. O DNA genômico bacteriano pode bloquear o fluxo da coluna. A etapa ultracentrifugation 2.2 deve ser repetida para pelota o ADN bacteriano. Uma pelota desta segunda rotação não pode ser facilmente visível ou pode ser transparente.
  7. Faça 500 mL Ni Buffer A (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 e 10% glicerol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin e 87.1 μg/mL PMSF) e 500 mL Ni Buffer B (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10% glicerol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin, e 87.1 μg/mL PMSF, 250 mM imidazole, pH 8.0). Passe ambos os Buffers Ni através de filtros de poros de 0,2 μm.
  8. A amostra, amortecedores e o sistema FPLC (cromatografia líquida de proteína rápida) estão em uma sala refrigerada a 4 °C. Lave a bomba A com O Amortecedor A e a bomba B com o Ni Buffer B. Lave o sistema com 20 mM imidazole (8% Ni Buffer B, 92% Ni Buffer A) até que o UV e a condutividade se estabilizem. Nós rotineiramente fluxo tampões em 5 mL/min com um limite de pressão de 1,0 MPa. A taxa de fluxo e o limite de pressão devem ser determinados pelas especificações do instrumento FPLC utilizado.
  9. Prepare uma coluna com resina de níquel de 1,5 mL (dimensões: 110 mm de comprimento x 5 mm). A capacidade de ligação com resina é de 50 mg/mL e pode tolerar a pressão de 1 MPa. Uma coluna pode ser derramada e armazenada a 4 °C antes da purificação.
    Nota: O tamanho da coluna pode ser proporcionalmente aumentado para acomodar mais de um tubo de 50 mL de células induzidas se for necessária mais proteína. Preferimos uma coluna fresca para cada preparação para garantir que nenhuma proteína residual contaminar a nossa proteína desejada. No entanto, as resinas de níquel podem ser recicladas de acordo com as instruções do fabricante.
  10. Anexe a coluna de resina carregada de níquel ao FPLC. Executar 20 mL de 92% Ni Buffer A e 8% Ni Buffer B (20 mM imidazole) a 0,5 mL/min com um limite de pressão de 0,5 MPa através da coluna para equilibrar. Em tempo real, o FPLC deve medir A280 (280 nm uv absorção), bem como a condutividade. Se esses valores não se estabilizarem após o volume de 20 mL ter passado pela coluna, flua os buffers até que se estabilizem.
  11. Carregue a amostra na coluna (~10 mL) a 0,15 mL/min. Defina o limite de pressão para 0,5 MPa. Colete o fluxo.
  12. Lave a coluna com 20 mL Ni Buffer a 20 mM imidazole (92% Ni Buffer A e 8% Ni Buffer B). Mantenha a lavagem em um tubo de 50 mL para análise. Lave a coluna com 15 mL de 50% Ni Buffer A e 50% Ni Buffer B (125 mM imidazole). Colete a elução em 19 frações de volume de 0,8 mL. Lave a coluna com 15 mL 100% Ni Buffer B. Colete um adicional de 75 frações de 0,2 mL. Algum heterodimer pcd vai elute na lavagem 50% Ni Buffer B, mas a maioria do heterodimer vai elute na lavagem 100% Ni Buffer B.
  13. Analise frações coletadas em géis sds-PAGE de 12% para confirmar a presença de PCD. Adicione volumes iguais de tingelo de carregamento 2X ao fluxo através, lave e pico A280 frações. Ferva por 3 min. Transferência para o gelo. Despeje dois 12% sds-page géis (como no passo 1.7). Repita o método do gel como descrito em 1.7.

3. Ensaio de atividade de nuclease

  1. Com base na análise SDS-PAGE, identifique frações de afinidade de níquel que contenham PCD quase puro. Combine 5 μL chromatography fraction and 500 ng 3 kb supercoiled plasmid pXba+ in reaction buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.1 mM DTT) com um volume final de 50 μL.
    1. Incubar a 37 °C para 1 h.
    2. Inclua um controle negativo (sem proteína adicional) e um controle positivo (PCD disponível comercialmente). Pare a reação com a solução de parada de 10 μL (150 mM EDTA, pH 8.0, 0,6% SDS, 18% glicerol, 0,15% Orange G).
    3. As amostras podem ser mantidas em um congelador -20°C a ser analisado mais tarde. Qualquer plasmídeo supercoiled pode ser usado em um ensaio nuclease, desde que os produtos de reação círculo supercoiled e relaxado pode ser resolvido por eletroforese de gel agarose.
  2. Despeje um 120 mL 1% de agarose gel em 1X TAE ethidium buffer (40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA, 0,5 μg/mL ethidium brometo) em um molde de gel (dimensões: 15 x 10 cm). Use um pente de 15 poços (dimensões de poço: 5mm x 1,5 mm). Quando o gel se ajustou, mergulhe-o no tampão do etidium de 1X TAE.
  3. Analise 30 μL das reações por gel agarose. Eletroforrese a 10 V/cm a temperatura ambiente por aproximadamente 1 h. A frente de corantes Orange G deve ser no final do gel.
  4. Use um scanner de fluorescência para imagem imediata do sinal de brometo de etídio do gel. Se um plasmid de 3 kb foi usado, a faixa mais lenta será círculos relaxados em ~ 3,5 kb, DNA linear será executado em 3 kb, e plasmid supercoiled terá a mobilidade mais rápida em ~ 2 kb.
    1. Calcule o volume total de pixels de cada pista com software de análise de imagem.
    2. Determine o volume de pixels das várias espécies de DNA, como círculos supercoiled, lineares e cortados. Use esses valores para determinar a porcentagem de cada espécie de DNA. Por exemplo, o aumento da presença de círculos cortados associados a uma fração em comparação com o controle negativo indica a presença de nuclease. O volume de pixels de círculos cortados em uma pista é dividido pelo valor pixel do DNA total. Determine uma porcentagem multiplicando esse número em 100.
  5. Combine frações do segundo pico de elução que contêm heterodemer PCD quase puro com base na análise SDS-PAGE e têm atividade de nuclease mínima a indetectável. Nosso volume combinado típico é ~2 mL.
  6. Carregue a amostra em uma unidade de filtro centrífuga com um corte de peso molecular de 10 kDa. Centrífuga em uma centrífuga balançando balde em 4000 x g por 40 min em 4 °C. Alternativamente, um rotor de ângulo fixo de 35° pode ser usado a 7500 x g por 20 min a 4 °C.
    1. Repita a centrífugação até que o volume final retentate é 100-200 μL.
    2. Inverta a unidade de filtro e recupere o retentato por centrífuga a 1000 x g por 2 min a 4 °C.

4. Purificação de cromatografia de exclusão de tamanho da PCD

  1. Faça 250 cromatografia de tamanho mL (SEC) em execução buffer (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10% glicerol, 0.1 mM EDTA, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin, e 87.1 μg/mL PMSF). Passe o buffer através de um filtro de poros de 0,2 μm e guarde a 4 °C.
    Nota: Executar todas as etapas em uma sala refrigerada em 4 °C. A purificação da SEC é opcional, mas a proteína deve ser armazenada no tampão de execução da SEC. Se a purificação da SEC for omitida, o retentato coletado em 3,6,2. deve ser dilacerada contra 1 L de buffer SEC em 10 kDa MWCO (peso molecular cortado) tubos de diálise em 4 °C durante a noite.
  2. Equilibre uma coluna de agarose SEC (cromatografia de exclusão de tamanho) (dimesions: 10 mm x 300 mm; 24 mL bed volume; 25 - 500 μL sample volume; 1.5 MPa pressure limit; 2 x 106 Da exclusion limit; 1 to 300 kDa separation) with SEC Running Buffer at 0.5 mL/min.
    Nota: Se desejações colunas de tamanho alternativo SEC podem ser usadas.
  3. Carregue as frações concentradas em um ciclo de injeção de volume de 200 μL. Carregue a amostra a 0,5 mL/min na coluna. A resolução da SEC aumenta com menor volume de carga. Elute com 23 mL SEC executando buffer e coletar 94 frações de 250 μL. O cromatograma sec deve resolver um único pico A280 que é o heterodimer PCD. Descobrimos que o PCD elutes 8,9 mL. O tempo de elução mudará com colunas alternativas da SEC.

5. Oxidação pca e nuclease atividade ensaios

  1. As reações ao ensaio tanto da oxidação da PCA quanto da atividade nuclease são realizadas em uma placa de fundo plano de 96 poços. Monte reações em uma placa de 96 poços no gelo em uma sala fria de 4 °C para evitar a catálise prematura. Combine em um volume final de 50 μL: 130 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2,0.1 mM DTT, 5 mM PCA, 10 ng/mL supercoiled plasmid pXba+, e 10 μL de frações individuais pcd SEC.
    Nota: As frações PCD SEC devem ser adicionadas por último e imediatamente antes da análise, pois a proteína começará a catalisada no momento da adição.
  2. A oxidação de PCD da PCA resulta em absorção reduzida de PCA a 290 nm (A290). Transfira a placa de 96 poços para o suporte da placa de um leitor de placa definido para uma temperatura interna de 37 °C. Retraia o suporte da placa no instrumento e mede A290 em intervalos de 20 s para 1 h. Tenha o instrumento agitar a placa 5 s antes de cada leitura.
  3. Após 1 h, encerre as reações adicionando a solução de parada de 10 μL (150 mM EDTA, pH 8.0, 0,6% SDS, 18% glicerol, 0,15% Orange G).
  4. Prepare, carregue e execute um gel agarose como no passo 3.2.
  5. Imagem e analisar o gel agarose como na etapa 3.3.
  6. Selecione frações com maior atividade de oxidação de PcA e nenhuma contaminação por nuclease observada para armazenamento a longo prazo a -80 °C. Medir o A280.
  7. Calcule a concentração total de PCD usando o A280 e o coeficiente de extinção (ε280)de 734.700 M-1cm-1.
  8. Snap congelar frações individuais em nitrogênio líquido. Guarde em um freezer de -80°C. Alternativamente, combinar infrações ativas, livres de nuclease, alíquota, e congelar da mesma forma. Nosso rendimento típico é 1-2 mg PCD por cultura L. O uso típico em um experimento sm é de 3 μg PCD. Usamos PCD armazenado a -80 °C por até 1 ano sem diminuição na atividade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Pcd de scavenger de oxigênio comercialmente disponível é freqüentemente contaminado com uma nuclease de DNA. Contaminar a atividade da nuclease pode levar a resultados espúrios em estudos fluorescentes, particularmente estudos que analisam proteínas interagindo com DNA ou DNA. Descobrimos que pcd recombinante, um heterodimer de hexahistidina marcado pcaH e pcaG, pode ser expressa em E. coli (Figura 1). O heterodimero é primeiro purificado pela cromatografia de afinidade de níquel (Figura 2). Pcd é eluted em 2 etapas de concentrações de imidazol. As frações de cromatografia são analisadas pela SDS-PAGE. Frações de PCD quase puro estão concentrados e ainda mais purificado pela SEC (Figura 3). As frações da SEC são analisadas individualmente tanto para a atividade de oxidação de PCA quanto para a atividade de nuclease (Figura 4). Frações que apresentaram alta atividade de oxidação e nenhuma atividade de nuclease aparente são abobadas para concentração de proteínas e mantidas em um freezer -80 °C para uso experimental.

Figure 1
Figura 1: Indução de PCD em E. coli. (A) pVP91A-pcaHG é mostrado com as subunidades pcaG (α) e hexahistidina-etiquetadas pcaH (β). (B) Gel SDS-PAGE representativo da indução pcd. Os pesos moleculares são indicados à esquerda. As mobilidades de 28,3 kDa hexahistidina-etiquetado pcaH e 22,4 kDa pcaG estão à direita. E. coli (Un), induzida E. coli (In), a pelota seguinte E. coli lysis e ultracentrifugation (P), o supernatant seguinte ultracentrifugation a ser carregado a uma coluna do níquel (S), fração representativa que segue chromatography do níquel (Ni), e fração representativa que segue O SEGUNDO (SE). Este número foi modificado a partir de uma publicação anterior12. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2: Purificação da cromatografia de afinidade de níquel da PCD. (A) Cromatograma de cromatografia de afinidade de níquel da PCD. O A280 é mostrado em azul e a concentração percentual de Ni Buffer B é mostrada em vermelho. A amostra foi carregada em uma baixa concentração de imidazol de 20 mM. O fluxo (Flw Thr) mostra as proteínas bacterianas solúveis que não se ligam à resina de níquel. A coluna foi lavada com 20 mL de 20 mM imidazole buffer. Uma segunda lavagem de 15 mL foi realizada com 125 mM imidazole. A elução de PCD foi realizada com 250 mM imidazole. Alguns PCD têm a presença de 125 mM imidazol, mas a maioria da proteína lutou em 250 mM imidazole. (B) Análise representativa da SDS-PAGE das frações de afinidade de níquel. A carga, o fluxo (Flw Thr) e a primeira lavagem mostraram a indução bem sucedida do PCD, as proteínas bacterianas solúveis que não ligaram a resina de níquel e as proteínas mínimas observadas durante a primeira lavagem, respectivamente. Várias frações ao longo das segundas etapas de lavagem e elução são mostradas. Frações da segunda lavagem incluíam proteína PCD, mas também exibiam contaminantes detectáveis de maior peso molecular. Frações do passo de elução pareciam estar livres de contaminantes. Os pesos moleculares são mostrados à esquerda. As mobilidades do PCAH e do pcaG são mostradas à direita. (C) Gel agarose de ensaio nuclease. A carga da coluna da afinidade do níquel, o fluxo, a lavagem, e as frações múltiplas foram testadas para a atividade do nuclease. Um controle negativo (controle) é o plasmídeo sem proteína adicionada. Um controle positivo (PCDa)é um PCD comercialmente disponível conhecido por estar contaminado com uma nuclease de DNA. As espécies de DNA são indicadas à direita como pequenos fragmentos (SF), supercoiled (SC), linear (LN), círculo cortado (NC) e dimer cortado (ND). (D) Quantidade das várias espécies de DNA observadas no ensaio nuclease de gel agarose. O volume total de pixels de cada pista foi medido. O volume de pixels de cada espécie de DNA foi determinado e expresso como uma porcentagem do volume total de pixels na pista. O controle negativo foi de 81,7% supercoiado com 14,4% de círculos cortados. O controle positivo apresentou um aumento significativo de 46,0% dos círculos cortados. A carga e o fluxo através continham nucleases bacterianas que converteram o plasmídeo e contaminando o DNA de bactérias em pequenos fragmentos. A primeira lavagem em 20 mM imidazoltambém também parecia conter atividade de nuclease significativa, resultando em círculos lineares e cortados. Frações 4-7 da segunda lavagem em 125 mM imidazole também apresentaram atividade nuclease significativa (particularmente, frações 4 e 5 que geraram plasmídeo linearizado observado). Frações 29-38 da etapa de elução parecia mais semelhante ao controle negativo. Neste exemplo, as frações 29-38 foram escolhidas para serem combinadas, concentradas e purificadas pela SEC. Este número foi modificado a partir de uma publicação anterior12. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3: PURIFICAção sec de PCD. (A) Cromatograma da SEC de frações pcd após cromatografia de afinidade de níquel. O A280 é mostrado em frações azuis e de elução são indicadas. PCD eluted da SEC como um único pico aparente. (B) Análise representativa da SDS-PAGE das frações da SEC 33-48. A carga é o PCD concentrado após a purificação da afinidade de níquel. Frações 33-48 abrangem o pico aparente sec. Não foram observados contaminantes detectáveis. (C) Gel agarose de ensaio nuclease. A carga sec e várias frações foram testadas para atividade de nuclease. Um controle negativo (controle) é o plasmídeo sem proteína adicionada. Um controle positivo (PCDa)é um PCD comercialmente disponível conhecido por estar contaminado com uma nuclease de DNA. As espécies de DNA são indicadas à esquerda como supercoiled (SC), círculo cortado (NC), e dimer cortado (ND). (D) Quantidade das várias espécies de DNA observadas no ensaio nuclease de gel agarose. O volume total de pixels de cada pista foi medido. O volume de pixels de cada espécie de DNA foi determinado e expresso como uma porcentagem do volume total de pixels na pista. O controle negativo foi de 82,1% supercoiado com apenas 13,7% de círculos cortados. O controle positivo apresentou um aumento significativo de 64,8% dos círculos cortados. A carga da SEC não apresentou nenhuma atividade de nuclease aparente devido à escolha criteriosa de frações da purificação da afinidade de níquel. Da mesma forma, frações 33-48 parecia semelhante ao controle negativo. Por exemplo, a fração 36 foi 82,5% supercoiada e 13,2% de círculo cortado. Neste exemplo, as frações 36 e 37 foram escolhidas para serem quantificadas, congeladas e mantidas em um congelador -80°C para uso experimental futuro. Este número foi modificado a partir de uma publicação anterior12. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 4
Figura 4: Oxidação pca e atividade de nuclease de frações PCD SEC. A oxidação do PCA foi medida por A290. Como PCD oxidado a molécula pca, o A290 diminuiu. A oxidação do PCA foi medida a cada 20 s por 1 h. Um controle negativo sem fração pcd adicionada (linha azul) não mostrou nenhuma mudança em A290,indicando que a molécula pca foi estável. Dados de três frações representativas da SEC (36 em vermelho, 33 em laranja, 39 em amarelo) mostram que o PCD purificado reduziu o A290,indicando oxidação da PcA. Este número foi modificado a partir de uma publicação anterior12. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sistemas de limpeza de oxigênio são comumente incluídos na microscopia de fluorescência de molécula única para reduzir o fotobranqueamento3,7,8. Essas técnicas de microscopia são freqüentemente usadas para observar ácidos nucleicos ou interações proteicas com ácidos nucleicos1,13,14. A contaminação dos SEs com nucleases pode levar a resultados espúrios.

Osss comercialmente disponíveis, incluindo GODCAT e PCD, foram mostrados para incluir contaminação significativa do nuclease11. É possível comprar PCD e empregar sec para remover o contaminante nuclease11. No entanto, o preço do PCD disponível comercialmente de um fornecedor aumentou 5 vezes após a publicação desse método. Este método gera um heterodemer PCD altamente ativo, livre de nuclease e pode concebivelmente ser realizado dentro de 1 semana. Em nossa experiência, a quantidade de PCD gerada por uma cultura 1 L (1-2 mg) é suficiente para um ano de experimentos (3 μg/experimento) em um laboratório produtivo com 2 sistemas de imagem fluorescente.

A eficiência da indução é fundamental para o sucesso deste método. Se o heterodimer pcd não é eficientemente induzido e aparente por SDS-PAGE, a purificação será vencida. Duas estratégias alternativas podem ser tentadas. Primeiro, tente a indução de uma colônia diferente na placa de transformação E. coli. Em segundo lugar, tivemos sucesso anterior com BL21, mas uma cepa alternativa de E. coli para expressão, como bl21 plyss, pode ser tentada. O sucesso do ensaio de oxidação da PcA depende da exposição mínima do substrato ao PCD antes de iniciar o ensaio. É altamente recomendado para montar as reações placa 96 bem no gelo em uma sala fria e adicionar a amostra de proteína imediatamente antes de carregar a placa para o leitor.

A cromatografia de afinidade de níquel pode ser suficiente para identificar frações de PCD pura sem atividade de nuclease contaminante. Neste caso, é possível eliminar a purificação da SEC. No entanto, as frações de cromatografia de níquel devem ser combinadas e dizadas durante a noite a 4 °C no buffer de execução da SEC. O glicerol presente na SEC executando buffer é importante para o armazenamento em -80 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo NIH GM121284 e AI126742 para key.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 βME
30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 Bio-Rad 161-0156
Acetic acid, Glacial Certified ACS Fisherl Chemical A38C-212
Agar, Granulated BD Biosciences DF0145-17-0
AKTA FPLC System GE Healthcare Life Sciences AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore UFC201024 10 kDa MWCO
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma F-2262
Ammonium Persulfate (APS) Tablets Amresco K833-100TABS
Ampicillin Amresco 0339-25G
Bacto Tryptone BD Biosciences DF0123173
BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract VWR 90004-092
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) Sigma-Aldrich B6755-500G
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coomassie Brilliant Blue Amresco 0472-50G
Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate Bio-Rad 2240096EDU
DTT P212121 SV-DTT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML Sigma-Aldrich D8537-500ML PBS
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Granulated LB Broth Miller EMD Biosciences 1.10285.0500
Hi-Res Standard Agarose AGTC Bioproducts AG500D1
Imidazole Sigma-Aldrich I0250-250G
IPTG Goldbio I2481C25
Leupeptin Roche 11017128001
Lysozyme from Chicken Egg White Sigma-Aldrich L6876-1G
Magnesium Chloride Hexahydrate Amresco 0288-1KG
Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability Thermo Fisher ND-2000C
NaCl P212121 RP-S23020
Ni-NTA Superflow (100 ml) Qiagen 30430
Novagen BL21 Competent Cells EMD Millipore 69-449-3 SOC media included
Orange G Fisher Scientific 0-267
Pepstatin Gold Biotechnology P-020-25
PMSF Amresco 0754-25G
Protocatechuic acid Fisher Scientific ICN15642110 PCA
Sodium dodecyl sulfate P212121 CI-00270-1KG
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devises
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL Thermo Fisher Scientific 09-741-04
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL Thermo Fisher Scientific 09-741-02
Superose 12 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 17517301
TEMED Amresco 0761-25ML
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager GE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174, (6), 553-557 (1990).
  2. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90, (2), 448-454 (2014).
  3. Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
  4. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36, (2), 280-290 (2003).
  5. Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3, (1), 17-25 (2004).
  6. Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275, (3-6), 367-375 (1992).
  7. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, (5), 1826-1835 (2008).
  8. Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216, (1), 49-68 (1990).
  9. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, (14), 6132-6138 (2010).
  10. Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
  11. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12, (10), 901-902 (2015).
  12. Senavirathne, G., Lopez, M. A. Jr, Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
  13. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
  14. Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539, (7630), 583-587 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics