Nükleazsız Oksijen Çöpçü Protocatechuate 3,4-Dioksijenaz İfadesi ve Saflaştırma

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) enzimatik substrat protokatechuic asit kullanarak sulu bir sistemden serbest diatomik oksijen kaldırabilirsiniz (PCA). Bu protokol, bu oksijen atma enziminin ekspresyonu, saflaştırılması ve aktivite analizini açıklar.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Messer, R. K., Lopez Jr., M. A., Senavirathne, G., Yoder, K. E. Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase. J. Vis. Exp. (153), e59599, doi:10.3791/59599 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Tek moleküllü (SM) mikroskopi florofor etiketli biyomoleküllerin dinamik moleküler etkileşimlerinin gerçek zamanlı olarak incelenmesinde kullanılır. Ancak, floroforlar çözünmüş oksijen (O2)ile fotobeyazrlama yoluyla sinyal kaybına yatkındır. Fotobeyaztma önlemek ve florofor ömrünü uzatmak için, oksijen atma sistemleri (OSS) O2azaltmak için istihdam edilmektedir. Ticari olarak kullanılabilen OSS, nükleik asitlere zarar veren veya bozan nükleazlar tarafından kontamine olabilir, deneysel sonuçların şaşırtıcı yorumu. Burada, saptanabilir nükleaz kontaminasyonu olmayan son derece aktif Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioksijenaz (PCD) ifadesi ve saflaştırılması için bir protokol ayrıntılı. PCD verimli substrat protocatechuic asit dönüşüm tarafından reaktif O2 türler kaldırabilirsiniz (PCA) 3-karboksi-cis, cis-muconic asit. Bu yöntem, O2'nin veri toplamada zararlı bir rol oynadığı herhangi bir sulu sistemde kullanılabilir. Bu yöntem, ticari olarak mevcut PCD ile karşılaştırıldığında son derece aktif, çekirdeksiz PCD üretiminde etkilidir.

Introduction

Tek moleküllü (SM) biyofizik, biyolojik fenomenlere bakış ını değiştiren hızla büyüyen bir alandır. Bu alan, fiziğin ve kimyanın temel kanunlarını biyolojiye bağlama yeteneğine sahiptir. Floresan mikroskopi SM duyarlılığı elde edebilirsiniz bir biyofiziksel yöntemdir. Floresan küçük organik floropores veya kuantum nokta 1 onları bağlayarak biyomolekülleri tespit etmek içinkullanılır. Bu moleküller geri dönüşümsüz2fotobeyazlatma önce lazerler tarafından heyecanlı fotonlar yontabilir. Fotobeyazrlama floresan etiketler istenilen dalga boyu2,3de heyecanlandırmak için yeteneklerini yok kimyasal hasar geçmesi oluşur. Sulu tampon reaktif oksijen türlerinin varlığı (ROS) fotobeyazrlama birincilnedeni 2,4. Ayrıca, ROS biyomoleküllere zarar verebilir ve SM deneylerinde hatalı gözlemlere yol açabilir5,6. Oksidatif hasarı önlemek için oksijen atma sistemleri (OSS)3,7,8kullanılabilir. Glikoz oksidaz/ katalaz (GODCAT) sistemi oksijen kaldırma da etkilidir8, ama ara olarak potansiyel olarak zararlı peroksitler üretir. Bunlar SM çalışmalarında ilgi biyomoleküllere zarar verebilir.

Alternatif olarak, protocatechuate 3,4 dioksijenaz (PCD) verimli bir substrat protocatechuic asit kullanarak sulu bir çözelti O2 kaldıracak (PCA)7,9. PCD, PCA'yı koordine etmek ve çözünmüş O210kullanarak kateşol halka açma reaksiyonunu katalize etmek için hemesiz demir kullanan bir metalloenzimdir. Bu bir adım reaksiyonS deneyleri florofor stabilitesini artırmak için genel olarak daha iyi bir OSS olduğu gösterilmiştir7. Ne yazık ki, PCD de dahil olmak üzere birçok ticari OSS enzimleri, kontamine nükleaz lar içerir11. Bu kirleticiler, SM deneylerinde kullanılan nükleik asit bazlı yüzeylerin zarar görmesine yol açabilir. Bu çalışma, SM sistemlerinde rekombinant PCD kullanımı için kromatografi tabanlı bir arıtma protokolü açıklayacaktır. PCD, ROS'un veri toplama için gereken yüzeylere zarar kaynağı olduğu tüm denemelere genel olarak uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. E. coli PCD ifade neden

  1. Bir tüpte 1 μL pVP91A-pcaHG PCD ekspresyonu plazmid (20 ng/μL, Şekil 1A)ve 20 μL E.coli BL21 (20 μL ticari olarak kullanılabilen hücreler, > 2 x 106 cfu/μg plazmid) birleştirin. Karıştırmak için tüpü hafifçe çırpın. Tüpü buza 5 dk yerleştirin.
  2. Dönüşümü 30 s için 42 °C'ye yerleştirin. Sonra buz 2 dk.
  3. 80 μL SOC media ekleyin (katabolit baskılı süper optimal et suyu: 2,5 mM KCl, 10 mM NaCl, %2 tripton, %0.5 maya ekstresi, 10 mM MgSO4, 10 mM MgCl2, 20 mM glukoz). 1 saat için min (rpm) 37 °C başına 225 devirde çalkalayın.
  4. PLAKA LB Amp Agar üzerinde dönüşüm reaksiyonu (1L Luria Broth agar: 10 g NaCl, 10 g bacto-tripto, 5 g maya ekstresi, 15 g agar, 50 μg/mL ampillin; 25 mL 10 cm çapında petri çanak başına).
  5. Plakayı kuluçkaya yatırın, kapağı aşağı bakacak şekilde, 37 °C'de 16-18 saat boyunca.
  6. İnokül 50 mL LB Amp (1L LB: 10 g bacto-tripto, 10 g NaCl, 5 g maya ekstresi, 50 g/mL ampisilin) 250 mL Erlenmeyer şişesinde bir koloni ile. 37 °C'de 16-18 saat boyunca 225 rpm'de titreyerek kuluçkaya yat.
  7. 20 mL kültürünü 1 L LB Amp'li 4 L şişeye aktarın. 37 °C'de 225 rpm'de çalkalayın.
  8. Her h kültür OD600 (600 nm optik yoğunluğu) ölçmek. Kültür OD600 0,5'e yaklaştıkça, ölçüm lerin sıklığını her 15 dakikaya kadar artırın. Kültürün istenilen yoğunluğu 0.5 OD600'dür.
  9. 4L şişeyi bir buz kutusuna aktarın. Kültür sıcaklığını azaltmak için şişeyi buz banyosunda döndürün.
    Not: Hücrelerin metabolik olarak aktif kalması için buzdaki zaman minimumda tutulmalıdır. İdeal olarak hücreler 10 dakikadan daha az buz üzerinde olacaktır.
  10. Başarılı PCD indüksiyonu sodyum dodecyl sülfat poliakrilamid jel elektroforez (SDS-PAGE) analizi ile görülebilir. Bir tüp içinde uninduced kültür Hasat 1 mL. Numuneyi 1 dk 14.000 x g'de ortam sıcaklığında bir mikrofuge döndürün. Süpernatant'ı decant.
    1. 150 μL PBS (fosfat tamponlu salin) peletli hücreleri solubilize.
    2. Eşit hacimli 2X yükleme boyası (%1.2 SDS, %30 gliserol, 150 mM Tris-HCl, pH 6.8, %0.0018 bromofenol mavisi, %15 β-mercaptoetanol) ekleyin. Girdap örnek iyice karıştırmak için.
    3. 3 dk için kaynatın ve buz aktarın. Numune ileride analiz için -20 °C'lik bir dondurucuda saklanabilir.
      Not: PBS, CaCl2 ve MgCl2ile veya Olmadan ticari olarak kullanılabilir. Birçok laboratuvarda hücre kültürü yöntemleri için CaCl2 ve MgCl2 olmadan PBS olacaktır. Biz veya CaCl 2 ve MgCl2 olmadanPBS ile hiçbir fark bulduk.
  11. 4 L şişeyi 17 °C'de 180 rpm sallayarak bir kuvöze aktarın. Her 20 dakikada bir OD600'ü izlemeye devam edin.
  12. At 0.7 OD600 izopropil-beta-D-tiogalactopyranoside ekleyin (IPTG) 0.5 mM son konsantrasyon (0.25 M stok çözeltisi) ve 10 mg / L amonyum demir (II) sülfat heksahidrat (Fe(NH4)2(SO4)2, 10 mg /mL stok çözeltisi). PCD genleri pcaH ve pcaG IPTG eklenmesi ile T5 organizatörü indüklenir (Şekil 1A). Demir sülfat PCD ile bağlanır ve kateşol açılması sırasında oksijen koordine ederek katalitik aktivite için gereklidir.
  13. 180 rpm 17 °C'de 18 saat boyunca kültürü salla.
  14. 1.2 gibi buz içinde kültür şişesi yerleştirin. SDS-PAGE için indüklenen hücrelerin 1 mL'sini 1.3'te olduğu gibi hasat edin.
  15. Santrifüj için uygun şişelere bakteri kültürünü dökün. A 1 L kültür 4 250 mL konik alt şişesantrik olabilir. Pellet kültür 4 °C'de 20 dk için 3000 x g. Decant supernatants. Bakteriyel sıvı atıkları uygun şekilde atın.
  16. 1 L kültür başına 25 mL soğuk PBS (CaCl2 ve MgCl2 isteğe bağlıdır) peletleri askıya almak için pipet.
  17. Resuspension'ı 50 mL konik tüplere (1 L kültürde 1 50 mL tüp) aktarın. 4 °C'de 20 dk için 3000 x g'daki hücreleri peletleyin. Supernatant decant ve uygun şekilde atın.
  18. 10 mL lysis tampon (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 20 mM imidazol, %10 gliserol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin ve 87.1 μg/mL feniltilülfoniloride (Pt) borusu ile hücreleri yeniden askıya alın. Bir Dewar şişesinde sıvı nitrojen ile süspansiyon dondurun. Örnek tüpleri -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın. -80 °C'de saklanan peletlerden pcd'yi bir yıl boyunca arındık ve belirgin bir aktivite kaybı olmadı.
  19. SDS-PAGE tarafından indüklenmemiş ve indüklenen hücreleri karşılaştırın.
    Not: Biz PCD heterodimer indüksiyon ile herhangi bir zorluk vardı. Ancak, herhangi bir reaktifin beklenmedik bir şekilde süresidolduğunda saflaştırmaya devam etmeden önce tümevarımı test etmenizi öneririz.
    1. SDS-PAGE (boyutlar: 7,3 cm x 8,3 cm x 0,75 mm kalınlığında) için plakaları monte edin. İstifleme jeli 1.5 mL %6 poliakrilamid (%6 akrilamid, 125 mM Tris-HCl, pH 6.8, %0.1 SDS, %0.1 amonyum persülfat, %0.001 TEMED) dir. Çözücü jel 3.5 mL %12 poliakrilamid (%12 akrilamid, 375 mM Tris-HCl, pH 8.8, 0.1% SDS, %0.1 amonyum persülfat, %0.001 TEMED) İstifleme katmanına 10 kuyu tarak takın.
    2. 10 μL'lik indüklenmemiş ve indüklenen bakteri örnekleri yükleyin. Proteinler için 4 μL prestained moleküler ağırlık belirteçleri yükleyin (Şekil 1B).
    3. Jeli 16,5 V/cm'de yaklaşık 1 saat elektrofore edin. Bromofenol mavisi jelin dibine ulaşmalıdır.
    4. Jeli Plastik bir küvete Coomassie Blue lekeye (%10 asetik asit, %40 metanol, %0.1 Coomassie Blue boya) yerleştirin. Leke tamamen jel batırmak gerekir. 20 dk. Boyama sırasında hafif rotasyon için ortam sıcaklığında leke isteğe bağlıdır.
    5. Çözeltiyi destain (%10 asetik asit, %40 metanol) ile değiştirin. Protein bantları kolayca görünene kadar isteğe bağlı hafif rotasyon ile ortam sıcaklığında kuluçka.
    6. Destain'i deiyonize su ile değiştirin. Bakteriyel proteinler arasında indüklenen PCD alt birimleri indüklenen hücrelerde görülmelidir. Heksahistidin etiketli PCD alt birimi pcaH 28.3 kDa moleküler ağırlığa sahiptir ve pcaG alt birimi 22.4 kDa'dır. PCD alt birimleri belirgin değilse, yeni bir koloniden türetilen yeni bir indüksiyon yapılmalıdır.

2. PCD nikel afinite kromatografi saflaştırma

  1. Buz üzerinde çözülme bir 50 mL indüklenen hücrelerin tüp. Numunenin tamamen çözülmesi 2-3 saat sürebilir.
  2. Tüpü buzda tutmak, numuneyi 1 dk boyunca %30 genlikte sonicate, 1'leri açık ve kapalı bir şekilde bisiklete bindirin. Konik mikro uç (çapı 0,125 inç) sonicator kullanın. Maksimum güç 400 W ve frekans 20 kHz ve 1 L kültür pelet başına.
  3. Sonication sonra, 0.2 mg / mL son konsantrasyon (10 mg / ml stok çözeltisi) ve 4 ° C'de 30 dakika buz üzerinde tutmak için lysozyme ekleyin.
  4. Önceden soğutulmuş polikarbonat şişesine (boyutlar: 25 mm x 89 mm) bakteriyel lizatı dökün. Şişe sabit açılı ultracentrifuge rotor ile uyumlu olmalıdır. Diğer tüpler ve/veya rotorlar değiştirilebilir, ancak son yerçekimi kuvveti korunmalıdır.
  5. 4 °C'de 120.000 x g'de 60 dk santrifüj. Hücresel enkaz bir pelet oluşturacak. Süpernatant sarı görünebilir.
    1. Pelet, PCD'nin çözünürlüğünü belirlemek için sonraki SDS-PAGE analizine dahil edilebilir (Şekil 1B). 10 mL PBS girdap tarafından pelet solubilize. 150 μL'yi 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Örneği 1.3'te olduğu gibi SDS-PAGE için hazırlayın.
  6. Soğuk bir 50 mL konik tüp için supernatant dökün. Ses düzeyine dikkat edin. Süpernatantın bakteriyel DNA ile kontaminasyonu viskoz bir örnek verebilir. Bakteriyel genomik DNA kolon akışını engelleyebilir. Ultracentrifugation adım 2.2 bakteri DNA pelet için tekrarlanmalıdır. Bu ikinci dönüşten bir pelet kolayca görülemeyebilir veya saydam olabilir.
  7. 500 mL Ni Tampon A (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 ve %10 gliserol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin, ve 87.1 μg/mL PMSF) ve 500 mL Ni Tampon B (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, %10 gliserol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin ve 87.1 μg/mL PMSF, 250 mM imidazol, p.8H). Her iki Ni Tamponu da 0,2 m'lik gözenek filtrelerinden geçirin.
  8. Numune, tamponlar ve FPLC (hızlı protein sıvı kromatografisi) sistemi 4 °C'de buzdolabında bulunan bir odadadır. Yıkama pompası A Ni Tampon A ve Ni Tampon B ile B pompası. Uv ve iletkenlik stabilize kadar 20 mM imidazol (%8 Ni Tampon B, % 92 Ni Tampon A) ile sistemi yıkayın. 1,0 MPa basınç limiti ile düzenli olarak 5 mL/dk'da akış tamponları yapıyoruz. Akış hızı ve basınç limiti kullanılan FPLC cihazının özelliklerine göre belirlenmelidir.
  9. 1,5 mL nikel yüklü reçine (boyutlar: 110 mm uzunluğunda x 5 mm) içeren bir kolon hazırlayın. Reçine bağlama kapasitesi 50 mg/mL olup 1 MPa basıncı tolere edebilir. Arınmadan önce bir sütun 4 °C'de dökülebilir ve saklanabilir.
    Not: Daha fazla protein gerekirse, sütunun boyutu orantılı olarak indüklenen hücrelerin birden fazla 50 mL tüp karşılamak için artırılabilir. Biz artık proteinler in istenilen protein kontamine sağlamak için her hazırlık için taze bir sütun tercih ediyoruz. Ancak, nikel reçineler üreticinin talimatlarına göre geri dönüştürülebilir.
  10. Nikel yüklü reçine sütununu FPLC'ye takın. 20 mL%92 Ni Tampon A ve %8 Ni Tampon B (20 mM imidazol) 0,5 mL/dk'da 0,5 MPa basınç limiti ile kolon üzerinden dengeleyin. Gerçek zamanlı olarak FPLC A280 (280 nm UV absorbans) yanı sıra iletkenlik ölçmek gerekir. Bu değerler sütundan 20 mL'lik hacim geçtikten sonra sabitlenmediyse, arabellekleri stabilize olana kadar akar.
  11. Numuneyi 0,15 mL/dk.'da kolona (~10 mL) yükleyin. Basınç limitini 0,5 MPa olarak ayarlayın. Akışı toplayın.
  12. 20 mM imidazol (%92 Ni Tampon A ve %8 Ni Tampon B) kolonu 20 mL Ni Tampon ile yıkayın. Analiz için yıkamayı 50 mL'lik bir tüpte saklayın. Kolon %50 Ni Tampon A ve %50 Ni Tampon B (125 mM imidazol) ile 15 mL yıkayın. 0,8 mL hacminin 19 fraksiyonu halinde elüsasyon toplayın. Kolon %15 mL %100 Ni Tampon B ile yıkayın. Bazı PCD heterodimer% 50 Ni Tampon B yıkama da elute olacak, ama heterodimer çoğunluğu% 100 Ni Tampon B yıkama da elute olacaktır.
  13. PCD varlığını doğrulamak için% 12 SDS-PAGE jelleri üzerinde toplanan kesirler analiz. A280 kesirler üzerinden akış, yıkama ve tepe eşit hacimlerde 2X yükleme boya ekleyin. 3 dk. Buza aktarın. Pour iki% 12 SDS-PAGE jelleri (adım 1.7 gibi). 1.7'de açıklandığı gibi jel yöntemini tekrarlayın.

3. Nükleaz aktivitesi tsede

  1. SDS-PAGE analizine dayanarak, neredeyse saf PCD içeren nikel afinite fraksiyonlarını tanımlayın. Reaksiyon tamponunda (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.1 mM DTT) 50 μL son hacmi ile 500 ng 3 kb süpercoilli plazmid pXba+ birleştirin.
    1. 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
    2. Negatif kontrol (ilave protein yok) ve pozitif kontrol (ticari olarak kullanılabilen PCD) ekleyin. 10 μL stop çözeltisi (150 mM EDTA, pH 8.0, %0.6 SDS, %18 gliserol, %0.15 Portakal G) ile reaksiyonu durdurun.
    3. Numuneler daha sonra analiz edilsince -20 °C'lik bir dondurucuda saklanabilir. Supercoiled ve rahat daire reaksiyon ürünleri agarose jel elektroforez ile çözülebilir sürece herhangi bir supercoiled plazmid bir nükleaz tsay kullanılabilir.
  2. 1X TAE ethidium tamponuna (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA, 0.5 μg/mL ethidium bromür) 120 mL %1 agarose jel dökün ( boyutlar: 15 x 10 cm). 15 iyi tarak kullanın (iyi boyutlar: 5mm x 1,5 mm). Jel ayarlandığında, 1X TAE ethidium tampon batırın.
  3. Agarose jel ile reaksiyonların 30 μL analiz. Yaklaşık 1 saat ortam sıcaklığında 10 V/cm'de elektrofore. Turuncu G boya ön jel sonunda olmalıdır.
  4. Jelin ethidyum bromür sinyalini hemen görüntülemek için bir floresan tarayıcı kullanın. 3 kb plazmid kullanılırsa, en yavaş bant ~3,5 kb'de rahat daireler, lineer DNA 3 kb'de çalışacak ve supercoiled plazmid ~2 kb'de en hızlı hareketliliğe sahip olacaktır.
    1. Görüntü analizi yazılımı ile her şeridin toplam piksel hacmini hesaplayın.
    2. Süper kıvrılmış, doğrusal ve çentikli daireler gibi çeşitli DNA türlerinin piksel hacmini belirleyin. Her DNA türünün yüzdesini belirlemek için bu değerleri kullanın. Örneğin, negatif kontrolile karşılaştırıldığında bir kesir ile ilişkili çentikli dairelerin artan varlığı nükleaz varlığını gösterir. Bir şeritteki çentikli dairelerin piksel hacmi toplam DNA piksel değerine bölünür. Bu sayıyı 100 ile çarparak bir yüzde belirleyin.
  5. SDS-PAGE analizine dayalı olarak neredeyse saf PCD heterodimer içeren ve tespit edilemeyen nükleaz aktivitesine en az sahip olan ikinci elution zirvesinden kesirleri birleştirin. Bizim tipik havuzlu hacmi ~ 2 mL olduğunu.
  6. Numuneyi 10 kDa moleküler ağırlık kesme ile bir santrifüj filtre ünitesine yükleyin. 4 °C'de 40 dk için 4000 x g'de sallanan kova santrifüjde santrifüj. Alternatif olarak 4 °C'de 20 dk için 7500 x g'de 35° sabit açılı rotor kullanılabilir.
    1. Son retentat hacmi 100-200 μL olana kadar santrifüjtekrarlayın.
    2. Filtre ünitesini ters çevirin ve 4 °C'de 2 dk için 1000 x g'de santrifüj ile retentat'ı geri getirin.

4. PCD'nin boyut dışlama kromatografisi saflaştırması

  1. 250 mL boyutunda dışlama kromatografisi (SEC) çalışan tampon (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% gliserol, 0,1 mM EDTA, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin ve 87.1 μg/mL PMSF) yapın. Tamponu 0,2 m'lik gözenek filtresinden geçirin ve 4 °C'de saklayın.
    Not: Tüm adımları 4 °C'de buzdolabında bir odada gerçekleştirin. SEC arınması isteğe bağlıdır, ancak protein sec çalışan tampon depolanmalıdır. SEC arınma atlanırsa, retentate 3.6.2 toplanır. 10 kDa MWCO (molekül ağırlığı kesilmiş) diyaliz tüpünde bir gecede 1 L'lik SEC tamponuna karşı diyalize sayılmalı.
  2. Çapraz bağlı agarose SEC (boyut dışlama kromatografisi) sütunu (dimesions: 10 mm x 300 mm; 24 mL yatak hacmi; 25 - 500 μL numune hacmi; 1,5 MPa basınç sınırı; 2 x 106 Da dışlama sınırı; 1 ila 300 kDa ayırma) SEC Çalışan Tamponile 0,5 mL/dk.'da dengeleyin.
    Not: İstenirse alternatif boyutlu SEC sütunları kullanılabilir.
  3. Konsantre kesirleri 200 μL hacim enjeksiyon döngüsüne yükleyin. Numuneyi 0,5 mL/dk'da kolona yükleyin. SEC çözünürlüğü daha küçük yük hacmiyle artar. 23 mL SEC çalışan tampon ile elute ve 250 μL 94 fraksiyonları toplamak. SEC kromatogram pcd heterodimer tek bir A280 tepe çözmelidir. PCD'nin 8.9 mL'yi elediğini görüyoruz. Elüsasyon zamanlaması alternatif SEC sütunları ile değişecektir.

5. PCA oksidasyon ve nükleaz aktivitesi tahlilleri

  1. PCA'nın hem oksidasyonu hem de nükleaz aktivitesinin tetkiklerine verilen reaksiyonlar 96 kuyulu düz alt plakada gerçekleştirilir. Erken katalizi önlemek için 4 °C soğuk bir odada buz üzerinde 96 kuyu plaka reaksiyonları monte. 50 μL son hacmi nde birleştirin: 130 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 5 mM MgCl2, 0.1 mM DTT, 5 mM PCA, 10 ng/mL supercoiled plasmid pXba+, ve 10 μL bireysel PCD SEC fraksiyonları.
    Not: PCD SEC fraksiyonları son ve hemen analiz den önce protein eklenme sırasında kataliz başlayacak olarak eklenmelidir.
  2. PCA PCD oksidasyonu 290 nm (A290)PCA azaltılmış absorbasyon sonuçları. 96 kuyu plakasını, 37 °C'lik bir iç sıcaklığa ayarlı bir plaka okuyucunun plaka tutucusuna aktarın. Plaka tutucuyu aletin içine geri alın ve A290'ı 20 s aralıklarla 1 saat ölçün. Aletin her okumadan önce plakayı 5 s sallatsın.
  3. 1 saat sonra 10 μL stop çözeltisi (150 mM EDTA, pH 8.0, %0.6 SDS, %18 gliserol, %0.15 Portakal G) ekleyerek reaksiyonları sonlandırın.
  4. Hazırlamak, yüklemek ve adım 3.2 gibi bir agarose jel çalıştırın.
  5. Görüntü ve adım 3.3 gibi agarose jel analiz.
  6. -80 °C'de uzun süreli depolama için en fazla PCA oksidasyon aktivitesine ve gözlenen nükleaz kontaminasyonuna sahip fraksiyonları seçin. A280'iölçün.
  7. 734.700 M -1 cm-1'likyok olma katsayısı (ε280)a280 ve yok olma katsayısını kullanarak toplam PCD konsantrasyonu hesaplayın.
  8. Sıvı nitrojen de bireysel fraksiyonları tutturmak. -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın. Alternatif olarak, aktif, nükleaz içermeyen kesirleri birleştirin, aliquot, ve aynı şekilde dondurma. Bizim tipik verim L kültür başına 1-2 mg PCD olduğunu. Bir SM deneyinde tipik kullanım 3 μg PCD'dir. -80 °C'de depolanan PCD'yi 1 yıla kadar kullandık ve aktivitede azalma yok.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ticari olarak mevcut oksijen çöpçü PCD sık sık bir DNA nükleaz ile kontamine olduğunu. Nükleaz aktivitesinin kontamine floresan çalışmalarda sahte sonuçlara yol açabilir, özellikle DNA veya DNA etkileşimproteinleri analiz çalışmalar. Biz rekombinant PCD bulduk, heksahistid etiketli pcaH ve pcaG heterodimer, E. coli ifade edilebilir (Şekil 1). Heterodimer ilk olarak nikel afinite kromatografisi ile saflaştırılır (Şekil 2). PCD imidazol konsantrasyonlarının 2 adımda eluted olduğunu. Kromatografi fraksiyonları SDS-PAGE ile analiz edilir. Neredeyse saf PCD kesirleri konsantre ve daha fazla SEC tarafından saflaştırılmış(Şekil 3). SEC fraksiyonları hem PCA oksidasyon aktivitesi hem de nükleaz aktivitesi için ayrı ayrı analiz edilir(Şekil 4). Yüksek oksidasyon aktivitesi ve görünürnü kleaz aktivitesi olmayan fraksiyonlar protein konsantrasyonu için titreedilir ve deneysel kullanım için -80 °C'lik bir dondurucuda saklanır.

Figure 1
Şekil 1: E. coliPCD indüksiyonu . (A) pVP91A-pcaHG pcaG (α) ve heksahistidine etiketli pcaH (β) PCD alt birimleri ile gösterilir. (B) PCD indüksiyon temsilcisi SDS-PAGE jel. Moleküler ağırlıklar solda gösterilir. 28.3 kDa heksahistidine etiketli pcaH ve 22.4 kDa pcaG mobiliteleri sağdadır. Uninduced E. coli (Un), indüklenen E. coli (In), E. coli lysis ve ultracentrifugation aşağıdaki pelet (P), bir nikel sütun (S) yüklenecek ultracentrifugation aşağıdaki supernatant, nikel kromatografisi (Ni) aşağıdaki temsili fraksiyonu ve SEC (SE) aşağıdaki temsili fraksiyonu. Bu rakam önceki biryayın12değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: PCD'nin nikel afinite kromatografisi saflaştırılması. (A) PCD nikel afinite kromatografisi kromatografisi. A280 mavi ve Ni Tampon B yüzde konsantrasyonu kırmızı gösterilir gösterilir. Örnek düşük 20 mM imidazol konsantrasyonuna yüklendi. Akış (Flw Thr) nikel reçine bağlanmadı çözünür bakteriproteinleri gösterir. Kolon 20 mM imidazol tampon 20 mL ile yıkandı. 125 mM imidazol ile ikinci 15 mL yıkama yapıldı. PCD elüsasyonu 250 mM imidazol ile yapıldı. Bazı PCD 125 mM imidazol varlığında eluted, ancak proteinçoğunluğu 250 mM imidazol eluted. (B) Nikel afinite fraksiyonlarının Temsilci SDS-PAGE analizi. Yük, akış (Flw Thr) ve ilk yıkama PCD başarılı indüksiyon gösterdi, nikel reçine bağlamadı çözünür bakteriyel proteinler, ve minimal proteinler ilk yıkama sırasında gözlenen, sırasıyla. İkinci yıkama ve elüsyon adımları boyunca çeşitli kesirler gösterilir. İkinci yıkamak kesirleri PCD protein dahil ama aynı zamanda tespit edilebilir yüksek molekül ağırlığı kirleticiler görüntülenir. Elüsyon adımındaki kesirler kirletici madde içermez. Moleküler ağırlıklar solda gösterilir. PcaH ve pcaG mobiliteleri sağda gösterilir. (C) Nükleaz tsay Agarose jel. Nikel afinite sütun yükü, akış, yıkama ve birden fazla fraksiyonnü nükleaz aktivitesi için test edildi. Negatif kontrol (kontrol) ilave protein olmadan plazmid olduğunu. Pozitif kontrol (PCDa),DNA çekirdeği ile kontamine olduğu bilinen ticari olarak kullanılabilen bir PCD'dir. DNA türleri sağda küçük parçalar (SF), supercoiled (SC), lineer (LN), çentikli daire (NC) ve çentikli dimer (ND) olarak gösterilir. (D) Agarose jel nükleaz testinde gözlenen çeşitli DNA türlerinin nicelikselliği. Her şeridin toplam piksel hacmi ölçüldü. Her DNA türünün piksel hacmi belirlendi ve şeritteki toplam piksel hacminin yüzdesi olarak ifade edildi. Negatif kontrol % 81.7 ile % 14.4 çentikli daireler ile supercoiled oldu. Pozitif kontrol% 46.0 çentikli daireler önemli bir artış gösterdi. Yük ve akış, plazmidi ve kirletici bakteri DNA'sını küçük parçalara dönüştüren bakteriyel nükleazlar içeriyordu. 20 mM imidazoldeki ilk yıkamada da belirgin nükleaz aktivitesi içerdiği ortaya çıktı, bu da doğrusal ve çentikli dairelerle sonuçlandı. 125 mM imidazoldeki ikinci yıkamadan 4-7 kesirler de önemli nükleaz aktivitesi (özellikle, gözlenen doğrusallaştırılmış plazmid oluşturan 4 ve 5 kesirleri) göstermiştir. Elüsyon adımından 29-38 kesirler negatif kontrole daha çok benzer göründü. Bu örnekte, 29-38 kesirler sec tarafından birleştirilmesi, konsantre edilmesi ve daha da arındırılması için seçilmiştir. Bu rakam önceki biryayın12değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: PCD SEC arıtma. (A) Nikel afinite kromatografisi sonrası PCD fraksiyonlarının SEC kromatogramı. A280 mavi renkte gösterilir ve elüsasyon fraksiyonları gösterilir. PCD, SEC'den tek bir zirve olarak ayrıldı. (B) SEC kesirlerinin Temsilci SDS-PAGE analizi 33-48. Yük, nikel afinite arınmasını takiben konsantre PCD'dir. Kesirler 33-48 görünür SEC tepe yayılan. Tespit edilebilir kirletici madde gözlenmedi. (C) Nükleaz tsay Agarose jel. SEC yükü ve birden fazla fraksiyonnü nükleaz aktivitesi için test edildi. Negatif kontrol (kontrol) ilave protein olmadan plazmid olduğunu. Pozitif kontrol (PCDa),DNA çekirdeği ile kontamine olduğu bilinen ticari olarak kullanılabilen bir PCD'dir. DNA türleri solda supercoiled (SC), çentikli daire (NC) ve çentikli dimer (ND) olarak gösterilir. (D) Agarose jel nükleaz testinde gözlenen çeşitli DNA türlerinin nicelikselliği. Her şeridin toplam piksel hacmi ölçüldü. Her DNA türünün piksel hacmi belirlendi ve şeritteki toplam piksel hacminin yüzdesi olarak ifade edildi. Negatif kontrol sadece% 13.7 çentikli daireler ile supercoiled% 82.1 oldu. Pozitif kontrol% 64.8 çentikli daireler önemli bir artış gösterdi. SEC yükü nikel afinite saflaştırma kesirlerin akıllıca seçim nedeniyle belirgin nükleaz aktivitesi gösterdi. Benzer şekilde, kesirler 33-48 negatif kontrol benzer çıktı. Örneğin, kesir 36% 82.5 supercoiled ve% 13.2 çentikli daire oldu. Bu örnekte, 36 ve 37 kesirler sayısallaştırılmış, dondurulmuş ve ileride deneysel kullanım için -80 °C'lik bir dondurucuda tutulmak üzere seçilmiştir. Bu rakam önceki biryayın12değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: PCD SEC fraksiyonlarının PCA oksidasyonu ve nükleaz aktivitesi. PCA oksidasyonu A290ile ölçüldü. PCD PCA molekülünü oksitledikçe A290 azaldı. PCA oksidasyonu her 20 s'de 1 saat ölçüldü. PcD fraksiyonu (mavi çizgi) eklenmeden negatif kontrol, PCA molekülünün kararlı olduğunu gösteren A290'dabir değişiklik göstermedi. Üç temsili SEC fraksiyonlarından elde edilen veriler (36 kırmızı, 33 turuncu, 39 sarı) saflaştırılmış PCD'nin A290'ıazalttığını ve PCA'nın oksidasyonunu gösterdiğini göstermektedir. Bu rakam önceki biryayın12değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Oksijen atma sistemleri genellikle tek moleküllü floresan mikroskobu nda fotobeyaztma azaltmak için3,7,8dahildir. Bu mikroskopteknikleri genellikle nükleik asitler veya nükleik asitler 1 ,13,14ile protein etkileşimleri gözlemlemek için kullanılır. OSS'lerin nükleazlarla kirlenmesi sahte sonuçlara yol açabilir.

GODCAT ve PCD de dahil olmak üzere ticari olarak kullanılabilen OSS'lerin önemli nükleaz kontaminasyonu içerdiği gösterilmiştir11. Bu PCD satın almak ve nükleaz kirletici 11 kaldırmak için SEC istihdammümkündür. Ancak, bir satıcıdan ticari olarak sunulan PCD fiyatı bu yöntemin yayınlanmasından sonra 5 kat arttı. Bu yöntem son derece aktif, nükleaz içermeyen PCD heterodimer üretir ve 1 hafta içinde yapılabilir. Deneyimlerimize göre, 1 L kültürü (1-2 mg) tarafından üretilen PCD miktarı, 2 floresan görüntüleme sistemi ile verimli bir laboratuvarda bir yıllık deneyler (3 μg/experiment) için yeterlidir.

İndüksiyon verimliliği bu yöntemin başarısının anahtarıdır. PCD heterodimer verimli bir şekilde indüklenen ve SDS-PAGE tarafından belirgin değilse, arıtma başarısız olacaktır. İki alternatif strateji denenebilir. İlk olarak, E. coli dönüşüm plakası üzerinde farklı bir koloniden indüksiyon girişimi. İkinci olarak, BL21 ile daha önce başarılı olduk, ancak BL21 pLysS gibi ifade için alternatif bir E. coli zorlanması denenebilir. PCA oksidasyon tsay başarısı, teşhire başlamadan önce substratın PCD'ye minimum şekilde maruz kalmasına dayanır. 96 kuyu plaka reaksiyonlarını soğuk bir odada buz üzerinde biraraya getirmeniz ve plakayı okuyucuya yüklemeden hemen önce protein örneğini eklemeniz önerilir.

Nikel afinite kromatografisi, kontamine nükleaz aktivitesi olmayan saf PCD fraksiyonlarını belirlemek için yeterli olabilir. Bu durumda, Sec arınma ortadan kaldırmak mümkündür. Ancak nikel kromatografi fraksiyonları biraraya getirilmeli ve bir gecede 4 °C'de SEC çalışan tamponda diyalize edilmelidir. Sec çalışan tampon mevcut gliserol -80 °C depolama için önemlidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma NIH GM121284 ve AI126742 tarafından KEY'e desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 βME
30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 Bio-Rad 161-0156
Acetic acid, Glacial Certified ACS Fisherl Chemical A38C-212
Agar, Granulated BD Biosciences DF0145-17-0
AKTA FPLC System GE Healthcare Life Sciences AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore UFC201024 10 kDa MWCO
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma F-2262
Ammonium Persulfate (APS) Tablets Amresco K833-100TABS
Ampicillin Amresco 0339-25G
Bacto Tryptone BD Biosciences DF0123173
BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract VWR 90004-092
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) Sigma-Aldrich B6755-500G
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coomassie Brilliant Blue Amresco 0472-50G
Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate Bio-Rad 2240096EDU
DTT P212121 SV-DTT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML Sigma-Aldrich D8537-500ML PBS
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Granulated LB Broth Miller EMD Biosciences 1.10285.0500
Hi-Res Standard Agarose AGTC Bioproducts AG500D1
Imidazole Sigma-Aldrich I0250-250G
IPTG Goldbio I2481C25
Leupeptin Roche 11017128001
Lysozyme from Chicken Egg White Sigma-Aldrich L6876-1G
Magnesium Chloride Hexahydrate Amresco 0288-1KG
Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability Thermo Fisher ND-2000C
NaCl P212121 RP-S23020
Ni-NTA Superflow (100 ml) Qiagen 30430
Novagen BL21 Competent Cells EMD Millipore 69-449-3 SOC media included
Orange G Fisher Scientific 0-267
Pepstatin Gold Biotechnology P-020-25
PMSF Amresco 0754-25G
Protocatechuic acid Fisher Scientific ICN15642110 PCA
Sodium dodecyl sulfate P212121 CI-00270-1KG
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devises
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL Thermo Fisher Scientific 09-741-04
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL Thermo Fisher Scientific 09-741-02
Superose 12 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 17517301
TEMED Amresco 0761-25ML
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager GE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174, (6), 553-557 (1990).
  2. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90, (2), 448-454 (2014).
  3. Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
  4. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36, (2), 280-290 (2003).
  5. Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3, (1), 17-25 (2004).
  6. Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275, (3-6), 367-375 (1992).
  7. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, (5), 1826-1835 (2008).
  8. Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216, (1), 49-68 (1990).
  9. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, (14), 6132-6138 (2010).
  10. Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
  11. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12, (10), 901-902 (2015).
  12. Senavirathne, G., Lopez, M. A. Jr, Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
  13. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
  14. Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539, (7630), 583-587 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics