Uttryck och rening av Nukleasfri syre avskiljare Protocatechuat 3, 4-dioxygenas

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Protocatechuat 3, 4-dioxygenase (PCD) kan enzymatiskt avlägsna fritt diatomärt syre från ett vattensystem med hjälp av dess substrat protocatechuic Acid (PCA). Detta protokoll beskriver uttrycket, renings-och aktivitets analysen av detta enzym för syre rensning.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Messer, R. K., Lopez Jr., M. A., Senavirathne, G., Yoder, K. E. Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase. J. Vis. Exp. (153), e59599, doi:10.3791/59599 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Single molekyl (SM) mikroskopi används i studiet av dynamiska molekylära interaktioner av fluorophore märkta biomolekyler i realtid. Fluoroforer är dock utsatta för förlust av signal via foto blekning genom upplöst syre (O2). För att förhindra foto blekning och förlänga fluorofores livstid används syre rensnings system (OSS) för att minska O2. Kommersiellt tillgängliga OSS kan vara förorenade av nukleaser som skadar eller försämrar nukleinsyror, confounding tolkning av experimentella resultat. Här specificerar vi ett protokoll för uttryck och rening av mycket aktiva Pseudomonas putida protocatechuate-3, 4-dioxygenase (PCD) utan påvisbara nukleasförorening. PCD kan effektivt avlägsna reaktiva O2 arter genom omvandling av substratet protocatechuic Acid (PCA) till 3-karboxy-CIS, CIS-mukonsyra. Denna metod kan användas i alla vattensystem där O2 spelar en skadlig roll i datainsamling. Denna metod är effektiv i att producera mycket aktiva, Nuclease gratis PCD i jämförelse med kommersiellt tillgänglig PCD.

Introduction

En enda molekyl (SM) biofysik är ett snabbt växande område som förändrar hur vi ser på biologiska fenomen. Detta område har den unika förmågan att koppla grundläggande fysikens lagar och kemi till biologi. Fluorescens-mikroskopi är en biofysisk metod som kan uppnå SM-känslighet. Fluorescens används för att detektera biomolekyler genom att länka dem till små organiska fluorofomedel eller kvantprickar1. Dessa molekyler kan avge fotoner när upphetsad av lasrar innan photoblekning oåterkalleligt2. Photoblekning uppstår när fluorescerande etiketter genomgår kemisk skada som förstör deras förmåga att excitera vid önskad våglängd2,3. Förekomst av reaktiva syreradikaler (ros) i vattenbuffert är en primär orsak till foto blekning2,4. Dessutom kan ros skada biomolekyler och leda till felaktiga observationer i SM-experiment5,6. För att förhindra oxidativ skada kan syre rensnings system (oss) användas3,7,8. Glukos oxidas/catalase (GODCAT) systemet är effektivt på att ta bort syre8, men det producerar potentiellt skadliga peroxider som intermediärer. Dessa kan vara skadliga för biomolekyler av intresse för SM-studier.

Alternativt, protocatechuate 3, 4 dioxygenas (PCD) kommer effektivt att ta bort O2 från en vattenlösning med hjälp av dess substrat protocatechuic syra (PCA)7,9. PCD är ett metalloenzym som använder höjare järn för att samordna PCA och katalysera katekol ring öppnings reaktionen med hjälp av upplöst O210. Detta ett steg reaktion visar sig vara en övergripande bättre OSS för att förbättra fluorophore stabilitet i SM experiment7. Tyvärr innehåller många kommersiellt tillgängliga OSS-enzymer, inklusive PCD, kontaminerande nukleaser11. Dessa föroreningar kan leda till skador av nukleinsyra-baserade substrat som används i SM experiment. Detta arbete kommer att belysa ett kromatografibaserat renings protokoll för användning av rekombinant PCD i SM-system. PCD kan tillämpas i stor utsträckning på alla experiment där ROS är skadliga substrat som behövs för datainsamling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. inducera PCD-uttryck i E. coli

  1. Kombinera 1 μL pVP91A-pcaHG PCD uttryck plasmid (20 ng/μL, figur 1A) och 20 μl av E. coli BL21 (20 μl kommersiellt tillgängliga celler, > 2 x 106 CFU/μg plasmid) i ett rör. Svep röret för att blanda. Placera röret på is 5 min.
  2. Förlägga omformningen på 42 ° c för 30 s. Sedan Ice 2 min.
  3. Tillsätt 80 μL SOC-media (Super optimal buljong med katabolit förtryck: 2,5 mM KCl, 10 mM NaCl, 2% Tryptone, 0,5% jästextrakt, 10 mM MgSO4, 10 mm mgcl2, 20 mm glukos). Skaka vid 225 varv per min (rpm) 37 ° c för 1 h.
  4. Platta omvandlings reaktionen på LB amp agar (1L Luria buljong agar: 10 g NaCl, 10 g Bacto-Tryptone, 5 g jästextrakt, 15 g agar, 50 μg/mL ampicillin; 25 mL per 10 cm diameter petriskål).
  5. Inkubera plattan, locket vänd nedåt, vid 37 ° c för 16-18 h.
  6. Inokulera 50 mL LB amp (1L LB: 10 g Bacto-Tryptone, 10 g NaCl, 5 g jästextrakt, 50 μg/mL ampicillin) i en 250 mL Erlenmeyerkolv med en koloni. Inkubera vid 37 ° c för 16-18 h skakning vid 225 RPM.
  7. Överför 20 mL kultur till en 4 L kolv med 1 L LB amp. Skaka vid 225 rpm vid 37 ° c.
  8. Varje h mäter kulturen OD600 (optisk densitet vid 600 Nm). Som kulturen OD600 närmar sig 0,5, öka frekvensen av mätningar till var 15 min. Den önskade tätheten av kulturen är 0,5 OD600.
  9. Överför 4L-kolven till en isburk. Snurra kolven i isbadet för att minska odlings temperaturen.
    Anmärkning: Tiden på isen bör hållas till ett minimum så att cellerna förblir metaboliskt aktiva. Helst cellerna kommer att vara på is mindre än 10 min.
  10. Framgångsrik induktion av PCD kan observeras genom denaturering natriumdodecylsulfat polyakrylamid gel elektrofores (SDS-PAGE) analys. Skörda 1 mL av den icke-inducerad kulturen i ett rör. Snurra provet 1 min vid 14 000 x g i en mikrofugrör vid omgivningstemperatur. Dekanera supernatanten.
    1. Solubilisera pelleterade celler i 150 μL PBS (fosfatbuffrad saltlösning).
    2. Tillsätt en lika stor volym på 2X laddnings färg (1,2% SDS, 30% glycerol, 150 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,0018% bromfenolblått, 15% β-merkaptoetanol). Vortexblanda provet så att det blandas grundligt.
    3. Koka provet i 3 min och överför till is. Provet kan förvaras i a-20 ° c frys för framtida analys.
      Anmärkning: PBS är kommersiellt tillgänglig med eller utan CaCl2 och mgcl2. Många laboratorier kommer att ha PBS utan CaCl2 och mgcl2 för cell odlingsmetoder. Vi har inte funnit någon skillnad med PBS med eller utan CaCl2 och mgcl2.
  11. Överför 4 L-kolven till en inkubator vid 17 ° c med 180 rpm skakning. Fortsätt att övervaka OD600 var 20 min.
  12. Vid 0,7 OD600 tillsätt isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) till 0,5 mm slutlig koncentration (0,25 M stamlösning) och 10 mg/L ammoniumjärn (II) sulfat hexahydrat (FE (NH4)2(so4)2, 10 mg/ml stamlösning). PCD-gener Pcah och pcag induceras från T5-promotorn genom tillsats av IPTG (figur 1A). Järnsulfat binds av PCD och krävs för katalytisk aktivitet genom att samordna syre under katekolöppningen.
  13. Skaka kulturen vid 180 rpm vid 17 ° c i 18 h.
  14. Placera odlings kol ven i is som i 1,2. Skörda 1 mL av de inducerade cellerna för SDS-PAGE som i 1,3.
  15. Häll bakteriekulturen i flaskor som lämpar sig för centrifugering. En 1 L kultur kan centrifugeras i 4 250 mL koniska botten flaskor. Pellets kulturen vid 4 ° c i 20 min vid 3000 x g. Dekanera supernatants. Kassera bakterie flytande avfall på lämpligt sätt.
  16. Pipet att Omsuspendera pellets i 25 mL kall PBS (CaCl2 och mgcl2 är valfria) per 1 L kultur.
  17. Överför resuspension till 50 mL koniska rör (1 50 mL tub per 1 L kultur). Pelleten cellerna vid 3000 x g i 20 min vid 4 ° c. Dekantera supernatanten och kassera på lämpligt sätt.
  18. Omsuspendera cellerna i 10 mL lyseringsbuffert (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM Imidazol, 10% glycerol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin och 87,1 μg/mL fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF)) genom pipettering. Frys den resuspension med flytande kväve i en Dewar kolv. Förvara provrören i a-80 ° c frys. Vi har renat PCD från pellets som lagrats vid-80 ° c i ett år utan någon uppenbar förlust av aktivitet.
  19. Jämför de icke-inducerade och inducerade cellerna med SDS-PAGE.
    Anmärkning: Vi har inte haft några svårigheter med induktion av PCD heterodimer. Vi rekommenderar dock att du testar induktionen innan du fortsätter med reningen i händelse av att någon reagens har löpt ut oväntat.
    1. Montera plåtar för SDS-PAGE (mått: 7,3 cm x 8,3 cm x 0,75 mm tjock). Staplings gelen är 1,5 mL 6% polyakrylamid (6% akrylamid, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,1% SDS, 0,1% ammoniumpersulfat, 0,001% TEMED). Lösnings gelen är 3,5 mL 12% polyakrylamid (12% akrylamid, 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% SDS, 0,1% ammoniumpersulfat, 0,001% TEMED). Sätt i en 10 brunn kam till Staplings skiktet.
    2. Fyll på 10 μL av icke-inducerade och inducerade bakteriella prover. Fyll på 4 μL förfärgade molekylvikt markörer för proteiner (figur 1B).
    3. Elektroforese gelen vid 16,5 V/cm ca 1 h. Bromofenolblått ska nå botten av gelen.
    4. Placera gelen i Coomassie blå fläck (10% ättiksyra, 40% metanol, 0,1% Coomassie blå färgämne) i ett plast badkar. Fläcken bör helt doppa gelen. Fläck vid omgivningstemperatur under 20 min. skonsam rotation under färgning är valfritt.
    5. Byt ut lösningen mot destain (10% ättiksyra, 40% metanol). Inkubera vid rumstemperatur med valfri mild rotation tills protein banden är lätt synliga.
    6. Byt ut defläcken mot avjoniserat vatten. Bland bakterie proteinerna ska de inducerade PCD-subenheterna synas i de inducerade cellerna. Hexahistidine märkt PCD subenhet pcah har en molekylvikt på 28,3 kDa och pcag subenhet är 22,4 kDa. Om PCD-subenheterna inte är uppenbara, bör en ny induktion som härrör från en roman koloni utföras.

2. rening av PCD-kromatografi med nickel tillhörighet

  1. Tina på isen 1 50 mL tub av inducerade celler. Det kan ta 2-3 h att helt Tina provet.
  2. Hålla röret på isen, Sonikera provet vid 30% amplitud för 1 min, Cykling 1 s på och av. Använd en avsmalnande mikrotip (diameter 0,125 inches) Sonicator. Maximal effekt är 400 W och frekvensen är 20 kHz och per 1 L odlings pellets.
  3. Efter ultraljudsbehandling, tillsätt lysozym till 0,2 mg/mL slutlig koncentration (10 mg/ml stamlösning) och håll på is i 30 min vid 4 ° c.
  4. Häll bakterieflysatet i en färdigkyld polykarbonatflaska (mått: 25 mm x 89 mm). Flaskan bör vara kompatibel med en fast vinkel första rotor. Andra rör och/eller rotorer får bytas, men den slutgiltiga gravitationskraften bör bibehållas.
  5. Centrifugera för 60 min vid 120 000 x g vid 4 ° c. Cellulär skräp kommer att bilda en pellet. Supernatanten kan verka gul.
    1. Pelleten kan ingå i den efterföljande analysen av SDS-sidan för att fastställa en PCD-löslighet (figur 1B). Lössätt pelleten genom att vortexera i 10 mL PBS. Överför 150 μL till en 1,5 mL tub. Förbered provet för SDS-PAGE som i 1,3.
  6. Häll supernatanten på ett kallt 50 mL koniskt rör. Anteckna volymen. Kontaminering av supernatanten med bakterie-DNA kan ge ett trögflytande prov. Bakteriernas genomiska DNA kan blockera kolonnens flöde. Den ultracentrifugering steg 2,2 bör upprepas för att pellet bakteriens DNA. En pellet från denna andra spinn kanske inte är lätt synlig eller kan vara transparent.
  7. Gör 500 mL ni-buffert A (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 och 10% glycerol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin och 87,1 μg/mL PMSF) och 500 mL ni-buffert B (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% glycerol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin och 87,1 μg/mL PMSF, 250 mM Imidazol, pH 8,0). Passera båda ni buffertar genom 0,2 μm pore filter.
  8. Provet, buffertarna och FPLC-systemet (fast proteinvätskekromatografi) finns i ett kylrum vid 4 ° c. Tvätta pumpen A med ni buffert A och pump B med ni buffert B. Tvätta systemet med 20 mM Imidazol (8% ni buffert B, 92% ni buffert A) tills UV och konduktivitet stabiliseras. Vi flödar rutinmässigt buffertar vid 5 mL/min med en 1,0 MPa tryck gräns. Flödeshastigheten och tryck gränsen bör bestämmas med hjälp av specifikationerna för det FPLC-instrument som används.
  9. Förbered en kolonn med 1,5 mL nickel-laddad harts (mått: 110 mm lång x 5 mm). Hartsbindnings förmågan är 50 mg/mL och tål 1 MPa-tryck. En kolonn kan hällas och förvaras vid 4 ° c före rening.
    Anmärkning: Kolonnens storlek kan ökas proportionellt för att rymma mer än 1 50 mL tub av inducerade celler om mer protein krävs. Vi föredrar en fräsch kolonn för varje preparat för att säkerställa att inga kvarvarande proteiner förorenerar vårt önskade protein. Nickel hartser kan dock återvinnas enligt tillverkarens anvisningar.
  10. Fäst kolonnen med nickel-laddad harts till FPLC. Kör 20 mL 92% ni buffert A och 8% ni buffert B (20 mM Imidazol) på 0,5 mL/min med en 0,5 MPa tryck gräns genom kolonnen att equilibrate. I realtid bör FPLC mäta en280 (280 nm UV-absorbans) as well as conductivityen. Om dessa värden inte har stabiliserats efter 20 mL volym har passerat genom kolonnen, flöde buffertarna tills de har stabiliserats.
  11. Fyll på provet till kolonnen (~ 10 mL) vid 0,15 mL/min. Ställ in tryck gränsen till 0,5 MPa. Samla in flödet genom.
  12. Tvätta kolonnen med 20 mL ni-buffert vid 20 mM Imidazol (92% ni-buffert A och 8% ni-buffert B). Behåll tvätten i en 50 mL tub för analys. Tvätta kolonnen med 15 mL 50% ni buffert A och 50% ni buffert B (125 mM Imidazol). Samla upp elueringen i 19 fraktioner av 0,8 mL volym. Tvätta kolonnen med 15 mL 100% ni buffert B. samla ytterligare 75 fraktioner av 0,2 mL. Vissa PCD heterodimer kommer att eluera i 50% ni buffert b tvätta, men majoriteten av de heterodimer kommer eluera i 100% ni buffert B tvätta.
  13. Analysera insamlade fraktioner på 12% SDS-PAGE gels för att bekräfta närvaron av PCD. Lägg till lika volymer av 2X lastning färgämne till flödet genom, tvätta och Peak en280 fraktioner. Koka i 3 min. överföring till is. Häll 2 12%-geler (som i steg 1,7). Upprepa gel metoden enligt beskrivningen i 1,7.

3. nukleasaktivitet analys

  1. Baserat på SDS-PAGE analys, identifiera nickel affinitetsfraktioner som innehåller nästan ren PCD. Kombinera 5 μL kromatografifraktion och 500 ng 3 KB supercoiled plasmid pXba + i reaktionsbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,1 mm DTT) med en slutlig volym på 50 μl.
    1. Inkubera vid 37 ° c i 1 h.
    2. Inkludera en negativ kontroll (inget tillsatt protein) och en positiv kontroll (kommersiellt tillgänglig PCD). Stoppa reaktionen med 10 μL stopplösning (150 mM EDTA, pH 8,0, 0,6% SDS, 18% glycerol, 0,15% orange G).
    3. Proverna kan förvaras i en frys på-20 ° c som ska analyseras senare. Alla supercoiled plasmid kan användas i en nukleasanalys så länge som supercoiled och avslappnad cirkel reaktionsprodukter kan lösas genom agaros gel elektrofores.
  2. Häll en 120 ml 1% aguppstod gel i 1x Tae etidiumbromid buffert (40 mm Tris-acetat, 1 mm EDTA, 0,5 μg/ml etidiumbromid bromid) i en gel gjuten (mått: 15 x 10 cm). Använd en 15 brunn kam (väl mått: 5mm x 1,5 mm). När gelen har satt, doppa den i 1x Tae etidiumbromid buffert.
  3. Analysera 30 μL av reaktionerna från aguppkom gel. Elektroforese vid 10 V/cm vid omgivningstemperatur i ca 1 h. Den orange G Dye fronten bör vara i slutet av gelen.
  4. Använd en fluorescensskanner för att omedelbart avbilda etidiumbromid-signalen från gelen. Om en 3 KB plasmid användes, den långsammaste bandet kommer att vara avslappnad cirklar på ~ 3,5 KB, linjära DNA kommer att köras på 3 KB, och supercoiled plasmid kommer att ha den snabbaste rörligheten på ~ 2 kB.
    1. Beräkna den totala pixel volymen för varje körfält med bildanalysprogram.
    2. Bestäm pixel volymen av olika DNA-arter, såsom supercoiled, linjära, och Hack cirklar. Använd dessa värden för att bestämma procentandelen av varje DNA-art. Till exempel, ökad förekomst av Hack cirklar i samband med en bråkdel jämfört med den negativa kontrollen indikerar närvaron av Nuclease. Pixel volymen av Hack cirklar i ett körfält divideras med pixelvärdet av totalt DNA. Bestäm en procentsats genom att multiplicera detta nummer med 100.
  5. Kombinera fraktioner från den andra elutionstoppen som innehåller nästan ren PCD heterodimer baserat på SDS-PAGE analys och har minimal till omätbara nukleasaktivitet. Vår typiska poolade volym är ~ 2 mL.
  6. Ladda provet till en centrifugal filterenhet med en 10 kDa molekylvikt cutoff. Centrifugera i en svängig skopcentrifug vid 4000 x g för 40 min vid 4 ° c. Alternativt kan en 35 ° fast vinkel rotor användas vid 7500 x g i 20 min vid 4 ° c.
    1. Upprepa centrifugering tills den slutliga Mjölkretentat volymen är 100-200 μl.
    2. Vänd på filterenheten och återvinna Mjölkretentat genom centrifugering vid 1000 x g i 2 min vid 4 ° c.

4. kromatografi med storleks undantag rening av PCD

  1. Gör 250 mL-uteslutnings kromatografi (SEC) löpbuffert (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% glycerol, 0,1 mM EDTA, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin, och 87,1 μg/mL PMSF). Passera bufferten genom ett pore-filter på 0,2 μm och förvara vid 4 ° c.
    Anmärkning: Utför alla steg i ett kylrum vid 4 ° c. SEC rening är frivilligt, men proteinet bör lagras i SEC löpbuffert. Om SEC rening utelämnas, Mjölkretentat samlats i 3.6.2. bör dialyseras mot 1 L SEC-buffert i 10 kDa MWCO (molekylvikt avbröt) dialys slang vid 4 ° c över natten.
  2. Equilibrate en tvärbunden aguppstod SEC (storlek uteslutning kromatografi) kolonn (dimesions: 10 mm x 300 mm; 24 mL bädd volym; 25-500 μL provvolym; 1,5 MPa tryck gräns; 2 x 106 da uteslutnings gräns; 1 till 300 kDa separation) med SEC-Körningsbuffert på 0,5 ml/min.
    Anmärkning: Om önskat alternativ storlek SEC kolumner kan användas.
  3. Fyll på koncentrerade fraktioner till en 200 μL volym insprutnings slinga. Fyll på provet med 0,5 mL/min till kolonnen. SEC-upplösningen ökar med mindre belastnings volym. Eluera med 23 mL SEC-körningsbuffert och samla 94 fraktioner av 250 μL. SEC kromatogram bör lösa en enda en280 topp som är PCD heterodimer. Vi finner att PCD eluerar 8,9 ml. Elueringtimingen kommer att ändras med alternativa SEC-kolumner.

5. PCA oxidation och Nuklease aktivitet analyser

  1. Reaktioner på assay både oxidation av PCA och nukleasaktivitet utförs i en 96-väl platt bottenplattan. Montera reaktioner i en 96 väl tallrik på is i ett 4 ° c kallt rum för att förhindra för tidig katalys. Kombinera i en slutlig volym av 50 μL: 130 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 0,1 mm DTT, 5 mm PCA, 10 ng/ml supercoiled plasmid pxba +, och 10 μl av enskilda PCD SEC-fraktioner.
    Anmärkning: PCD SEC fraktioner bör läggas sista och omedelbart före analys som proteinet kommer att börja katalys vid tidpunkten för tillägg.
  2. PCD oxidation av PCA resulterar i minskad absorbans av PCA vid 290 Nm (A290). Överför 96-brunnen till Skylthållaren på en Plattläsare inställd på en innertemperatur på 37 ° c. Dra in plattan hållaren i instrumentet och mät en290 vid 20 s intervall för 1 h. Ha instrumentet skaka plattan 5 s före varje avläsning.
  3. Efter 1 h, avsluta reaktionerna genom att tillsätta 10 μL stopplösning (150 mM EDTA, pH 8,0, 0,6% SDS, 18% glycerol, 0,15% orange G).
  4. Förbered, lasta, och kör en aguppstod gel som i steg 3,2.
  5. Och analysera agaros gel som i steg 3,3.
  6. Välj bråk med den mest PCA oxidations aktiviteten och ingen observerad nukleasförorening för långtidsförvaring vid-80 ° c. Mät A280.
  7. Beräkna den totala PCD-koncentrationen med hjälp av A280 och utdöningskoefficienten (ε280) på 734 700 M-1cm-1.
  8. Snap frys enskilda fraktioner i flytande kväve. Förvara i a-80 ° c frys. Alternativt, kombinera aktiva, Nuclease-fria fraktioner, alikvot, och frysa på samma sätt. Vår typiska avkastning är 1-2 mg PCD per L kultur. Typisk användning i ett SM-experiment är 3 μg PCD. Vi har använt PCD lagrad vid-80 ° c i upp till 1 år utan minskad aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kommersiellt tillgängliga syre Scavenger PCD är ofta förorenat med en DNA-nukleas. Kontaminerande nukleasaktivitet kan leda till falska resultat i fluorescerande studier, särskilt studier som analyserar DNA eller DNA-samverkande proteiner. Vi har funnit att rekombinant PCD, en heterodimer av hexahistidine märkta pcaH och pcaG, kan uttryckas i E. coli (figur 1). Den heterodimer renas först genom nickel affinitetskromatografi (figur 2). PCD elueras i 2 steg av imidazolkoncentrationer. Kromatografifraktioner analyseras med SDS-PAGE. Delar av nästan ren PCD koncentreras och renas ytterligare genom SEC (figur 3). SEC fraktioner analyseras individuellt för både PCA oxidation aktivitet och nukleasaktivitet (figur 4). Fraktioner som visade hög oxidations aktivitet och ingen uppenbar nukleasaktivitet analyseras för proteinkoncentration och förvaras i a-80 ° c frys för experimentell användning.

Figure 1
Figur 1: induktion av PCD i E. coli. (A) PVP91A-pcaHG visas med pcag (α) och hexahistidine-märkta pcaH (β) PCD subenheter. (B) representativ SDS-Page gel av PCD induktion. Molekylvikter anges till vänster. De utbyten av 28,3 kDa hexahistidine-Tagged pcaH och 22,4 kDa pcaG är till höger. Icke-inducerad e. coli (UN), inducerad e. coli (in), pelleten efter e. coli lysis och ultracentrifugering (P), supernatanten efter ultracentrifugering som skall lastas till en nickelkolonn (er), representativ fraktion efter nickelkromatografi (ni) och representativ fraktion efter SEC (se). Denna siffra har modifierats från en tidigare publikation12. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: nickel affinitetskromatografi rening av PCD. (A) kromatogram av nickel affinitetskromatografi av PCD. A280 visas i blått och procent koncentrationen av ni-buffert B visas i rött. Provet lästes in i en låg 20 mM imidazolkoncentration. Flödet (FLW THR) visar de lösliga bakteriella proteiner som inte binder till nickel harts. Kolonnen tvättades med 20 mL 20 mM imidazolbuffert. En andra 15 mL tvätt utfördes med 125 mM Imidazol. Eluering av PCD utfördes med 250 mM Imidazol. Vissa PCD eluerade i närvaro av 125 mM Imidazol, men majoriteten av proteinet eluerade i 250 mM Imidazol. (B) representativ SDS-Page analys av nickel affinitetsfraktioner. Lasten, att (FLW THR), och första tvätten visade en lyckad induktion av PCD, de lösliga bakteriella proteiner som inte binder nickel harts, och de minimala proteiner som observerats under den första tvätten, respektive. Flera fraktioner under den andra tvätt och eluering steg visas. Fraktioner från den andra tvätten inkluderade PCD-protein men visade även detekterbara högre molekylära föroreningar. Fraktioner från elutionssteget verkade vara fria från föroreningar. Molekylvikter visas till vänster. För pcaH och pcaG visas till höger. C) aguppkom gel av nukleasanalys. Nickel tillhörighet kolumn belastning, flowthrough, tvätta och flera fraktioner testades för nukleasaktivitet. En negativ kontroll (kontroll) är plasmiden utan tillsatt protein. En positiv kontroll (PCDa) är en kommersiellt tillgänglig PCD som är känd för att vara förorenad med en DNA-nukleas. DNA-arter indikeras till höger som små fragment (SF), supercoiled (SC), linjär (ln), Hack Circle (NC), och Hack dimer (nd). D kvantifiering av de olika DNA-arter som observerats i agaros gelnuclease-analysen. Den totala pixel volymen för varje körfält mättes. Pixel volymen för varje DNA-Art fastställdes och uttrycks som en procentandel av den totala pixel volymen i körfältet. Den negativa kontrollen var 81,7% supercoiled med 14,4% Hack cirklar. Den positiva kontrollen visade en signifikant ökning av 46,0% Hack cirklar. Belastningen och att innehöll bakteriella nukleaser som konverterade plasmiden och kontaminerande bakterier DNA till små fragment. Den första tvätten vid 20 mm Imidazol verkade också innehålla signifikant nukleasaktivitet, vilket resulterade i linjära och Hack cirklar. Fraktioner 4-7 från den andra tvätten på 125 mM Imidazol visade också signifikant nukleasaktivitet (särskilt, fraktioner 4 och 5 som genererade observerade linearized Plasmid). Fraktioner 29-38 från elutionssteget verkade mer likt den negativa kontrollen. I det här exemplet valdes bråktal 29-38 för att kombineras, koncentreras och vidarerenas genom SEC. Denna siffra har modifierats från en tidigare publikation12. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: SEC rening av PCD. A) kromatogram av SEC av PCD fraktioner efter nickel affinitetskromatografi. A280 visas i blått och elueringfraktioner indikeras. PCD eluerade från SEC som en enda skenbar topp. (B) representativ SDS-Page analys av SEC fraktioner 33-48. Lasten är koncentrerad PCD efter nickel affinitetsrening. Bråktal 33-48 spänner över den skenbara SEC-toppen. Inga detekterbara föroreningar observerades. C) aguppkom gel av nukleasanalys. SEC-belastningen och flera fraktioner testades för nukleasaktivitet. En negativ kontroll (kontroll) är plasmiden utan tillsatt protein. En positiv kontroll (PCDa) är en kommersiellt tillgänglig PCD som är känd för att vara förorenad med en DNA-nukleas. DNA-arter anges till vänster som supercoiled (SC), Hack Circle (NC), och Hack dimer (nd). D kvantifiering av de olika DNA-arter som observerats i agaros gelnuclease-analysen. Den totala pixel volymen för varje körfält mättes. Pixel volymen för varje DNA-Art fastställdes och uttrycks som en procentandel av den totala pixel volymen i körfältet. Den negativa kontrollen var 82,1% supercoiled med endast 13,7% Hack cirklar. Den positiva kontrollen visade en signifikant ökning av 64,8% Hack cirklar. SEC-belastningen visade ingen uppenbar nukleasaktivitet på grund av omdömes gillligt val av fraktioner från nickel affinitetsrening. På samma sätt, fraktioner 33-48 verkade liknar den negativa kontrollen. Till exempel var bråk 36 82,5% supercoiled och 13,2% Hack cirkel. I detta exempel valdes fraktioner 36 och 37 till att kvantifieras, frysas och förvaras i a-80 ° c frys för framtida experimentell användning. Denna siffra har modifierats från en tidigare publikation12. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: PCA oxidation och nukleasaktivitet av PCD SEC-fraktioner. PCA oxidation mättes med en290. Som PCD oxiderade PCA-molekylen, minskade A290 . PCA oxidation mättes varje 20 s för 1 h. En negativ kontroll utan tillsatt PCD fraktion (blå linje) visade ingen förändring i en290, vilket indikerar PCA molekylen var stabil. Data från tre representativa SEC fraktioner (36 i rött, 33 i orange, 39 i gult) visar att renad PCD minskade A290, vilket indikerar oxidation av PCA. Denna siffra har modifierats från en tidigare publikation12. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Syre rensning system ingår vanligen i Single molekylens fluorescens mikroskopi att minska photoblekning3,7,8. Dessa mikroskopi tekniker används ofta för att observera nukleinsyror eller protein interaktioner med nukleinsyror1,13,14. Kontaminering av OSSs med nukleaser kan leda till falska resultat.

Kommersiellt tillgängliga OSSs, inklusive GODCAT och PCD, har visat sig innefatta betydande nukleaskontaminering11. Det är möjligt att köpa PCD och anställa SEC att ta bort Nuclease förorening11. Dock ökade priset på kommersiellt tillgänglig PCD från en leverantör 5 gånger efter offentliggörandet av denna metod. Denna metod genererar en mycket aktiv, Nuclease gratis PCD heterodimer och kan tänkas utföras inom 1 vecka. Enligt vår erfarenhet, är den mängd PCD som genereras av en 1 L kultur (1-2 mg) tillräckligt för ett års experiment (3 μg/experiment) i ett produktivt laboratorium med 2 fluorescerande avbildningssystem.

Induktions effektivitet är nyckeln till framgången för denna metod. Om PCD-heterodimer inte är effektivt inducerat och påtagligt av SDS-sidan kommer reningen att misslyckas. Två alternativa strategier kan prövas. Först, försök induktion från en annan koloni på E. coli omvandlings plattan. För det andra har vi haft tidigare framgångar med BL21, men ett alternativ E. coli stam för uttryck, såsom BL21 plyss, kan prövas. Framgången för PCA oxidation analysen förlitar sig på minimal exponering av substratet till PCD innan analysen påbörjas. Det är starkt rekommenderat att montera 96 väl plattan reaktioner på is i ett kallt rum och tillsätt proteinet provet omedelbart innan lastning plattan till läsaren.

Nickel affinitetskromatografi kan vara tillräcklig för att identifiera fraktioner av ren PCD utan förorenande nukleasaktivitet. I detta fall är det möjligt att eliminera SEC rening. Nickel-kromatografifraktioner bör dock kombineras och dialyseras över natten vid 4 ° c i SEC-körningsbuffert. Glycerolen som finns i SEC-körningsbufferten är viktig för lagring vid-80 ° c.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av NIH GM121284 och AI126742 till KEY.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 βME
30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 Bio-Rad 161-0156
Acetic acid, Glacial Certified ACS Fisherl Chemical A38C-212
Agar, Granulated BD Biosciences DF0145-17-0
AKTA FPLC System GE Healthcare Life Sciences AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore UFC201024 10 kDa MWCO
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma F-2262
Ammonium Persulfate (APS) Tablets Amresco K833-100TABS
Ampicillin Amresco 0339-25G
Bacto Tryptone BD Biosciences DF0123173
BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract VWR 90004-092
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) Sigma-Aldrich B6755-500G
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coomassie Brilliant Blue Amresco 0472-50G
Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate Bio-Rad 2240096EDU
DTT P212121 SV-DTT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML Sigma-Aldrich D8537-500ML PBS
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Granulated LB Broth Miller EMD Biosciences 1.10285.0500
Hi-Res Standard Agarose AGTC Bioproducts AG500D1
Imidazole Sigma-Aldrich I0250-250G
IPTG Goldbio I2481C25
Leupeptin Roche 11017128001
Lysozyme from Chicken Egg White Sigma-Aldrich L6876-1G
Magnesium Chloride Hexahydrate Amresco 0288-1KG
Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability Thermo Fisher ND-2000C
NaCl P212121 RP-S23020
Ni-NTA Superflow (100 ml) Qiagen 30430
Novagen BL21 Competent Cells EMD Millipore 69-449-3 SOC media included
Orange G Fisher Scientific 0-267
Pepstatin Gold Biotechnology P-020-25
PMSF Amresco 0754-25G
Protocatechuic acid Fisher Scientific ICN15642110 PCA
Sodium dodecyl sulfate P212121 CI-00270-1KG
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devises
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL Thermo Fisher Scientific 09-741-04
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL Thermo Fisher Scientific 09-741-02
Superose 12 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 17517301
TEMED Amresco 0761-25ML
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager GE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174, (6), 553-557 (1990).
  2. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90, (2), 448-454 (2014).
  3. Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
  4. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36, (2), 280-290 (2003).
  5. Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3, (1), 17-25 (2004).
  6. Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275, (3-6), 367-375 (1992).
  7. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, (5), 1826-1835 (2008).
  8. Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216, (1), 49-68 (1990).
  9. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, (14), 6132-6138 (2010).
  10. Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
  11. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12, (10), 901-902 (2015).
  12. Senavirathne, G., Lopez, M. A. Jr, Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
  13. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
  14. Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539, (7630), 583-587 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics