Uttrykk og rensing av Nuklease-gratis Oxygen renovasjons Protocatechuate 3, 4-Dioxygenase

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Protocatechuate 3, 4-dioxygenase (PCD) kan enzymatisk fjerne fritt diatomic oksygen fra et vandig system ved hjelp av sitt substrat protocatechuic syre (PCA). Denne protokollen beskriver uttrykket, rensing, og aktivitet analyse av dette oksygen rensing enzymet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Messer, R. K., Lopez Jr., M. A., Senavirathne, G., Yoder, K. E. Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase. J. Vis. Exp. (153), e59599, doi:10.3791/59599 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Enkelt molekyl (SM) mikroskopi brukes i studiet av dynamiske molekylære interaksjoner av fluoroforen merket biomolekyler i sanntid. Men fluorophores er utsatt for tap av signal via photobleaching av oppløst oksygen (O2). For å hindre photobleaching og forlenge fluoroforen levetid, er oksygen rensing systemer (OSS) ansatt for å redusere O2. Kommersielt tilgjengelige operativsystemer kan være forurenset av nukleaser som skader eller forringe nukleinsyre syrer, forvirrende tolkning av eksperimentelle resultater. Her detalj vi en protokoll for uttrykk og rensing av svært aktive Pseudomonas putida protocatechuate-3, 4-DIOXYGENASE (PCD) uten synlig nuklease forurensning. PCD kan effektivt fjerne reaktiv O2 arter ved konvertering av underlaget protocatechuic acid (PCA) til 3-carboxy-CIS, CIS-muconic acid. Denne metoden kan brukes i alle vandige systemer der O2 spiller en ødeleggende rolle i datainnhenting. Denne metoden er effektiv i å produsere svært aktiv, nuklease gratis PCD i sammenligning med kommersielt tilgjengelige PCD.

Introduction

Enkelt molekyl (SM) biofysikk er et raskt voksende felt endre måten vi ser på biologiske fenomener. Dette feltet har den unike evnen til å knytte grunnleggende lover i fysikk og kjemi til biologi. Fluorescens mikroskopi er en Biofysiske metode som kan oppnå SM følsomhet. Fluorescens brukes til å oppdage biomolekyler ved å koble dem til små organiske fluorophores eller kvante prikker1. Disse molekylene kan avgi fotoner når de er opphisset av lasere før photobleaching irreversibelt2. Photobleaching oppstår når fluorescerende etiketter gjennomgår kjemiske skader som ødelegger deres evne til å opphisse på ønsket bølgelengde2,3. Tilstedeværelsen av reaktive oksygen arter (ros) i vandig buffer er en primær årsak til photobleaching2,4. I tillegg kan ros skade biomolekyler og føre til feilaktige observasjoner i SM eksperimenter5,6. For å forebygge oksidativt skade, kan oksygen rensing systemer (oss) brukes3,7,8. Glukose oksidase/catalase (GODCAT) systemet er effektiv på å fjerne oksygen8, men det gir potensielt skadelige peroksider som mellom produkter. Dette kan være skadelig for biomolekyler av interesse i SM studier.

Alternativt vil protocatechuate dioxygenase (PCD) effektivt fjerne O2 fra en vandig oppløsning ved hjelp av dens substrat protocatechuic acid (PCA)7,9. PCD er en metalloenzyme som bruker negemovoj jern for å koordinere PCA og katalysere catechol ring åpnings reaksjonen ved hjelp av oppløst O210. Dette ett trinn reaksjon er vist å være en helhetlig bedre OSS for å forbedre fluoroforen stabilitet i SM eksperimenter7. Dessverre, mange kommersielt tilgjengelige OSS-enzymer, inkludert PCD, inneholder forurensende nukleaser11. Disse forurensninger kan føre til skade av nukleinsyre syre-baserte underlag som brukes i SM eksperimenter. Dette arbeidet vil belyse en kromatografi-basert rensing protokoll for bruk av rekombinant PCD i SM systemer. PCD kan grovt brukes på alle eksperiment der ROS er skadelige underlag som trengs for datainnsamling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. indusere PCD-uttrykk i E. coli

  1. Kombiner 1 μL pVP91A-pcaHG PCD-uttrykk plasmider (20 ng/μL, figur 1A) og 20 μL av E. coli BL21 (20 μL kommersielt tilgjengelige celler, > 2 x 106 CFU/μg plasmider) i et rør. Flick røret å mikse. Plasser røret på is 5 min.
  2. Sted transformasjon ved 42 ° c for 30 s. Så is 2 min.
  3. Tilsett 80 μL SOC Media (super optimal buljong med catabolite undertrykkelse: 2,5 mM KCl, 10 mM NaCl, 2% tryptone, 0,5% gjærekstrakt, 10 mM MgSO4, 10 mm MgCl2, 20 mm glukose). Rist på 225 omdreininger per min (rpm) 37 ° c for 1 time.
  4. Plate transformasjonen reaksjonen på LB amp agar (1L Luria buljong agar: 10 g NaCl, 10 g bacto-tryptone, 5 g gjærekstrakt, 15 g agar, 50 μg/mL Ampicillin; 25 mL per 10 cm diameter Petri parabol).
  5. Ruge platen, lokket vendt ned, ved 37 ° c for 16-18 h.
  6. Vaksinere 50 mL LB amp (1L LB: 10 g bacto-tryptone, 10 g NaCl, 5 g gjærekstrakt, 50 μg/mL Ampicillin) i en 250 mL Erlenmeyer kolbe med en koloni. Ruge ved 37 ° c for 16-18 h risting ved 225 RPM.
  7. Overfør 20 mL kultur til en 4 L kolbe med 1 L LB amp. Rist ved 225 RPM ved 37 ° c.
  8. Hver h måle kulturen OD600 (optisk tetthet ved 600 NM). Som kulturen OD600 nærmer 0,5, øke frekvensen av målinger til hver 15 min. Den ønskede tettheten av kulturen er 0,5 OD600.
  9. Overfør 4L kolbe til en kasse med is. Virvel flasken i isen bad for å redusere kultur temperatur.
    Merk: Tiden på isen bør holdes til et minimum, slik at cellene forblir metabolically aktiv. Ideelt cellene vil være på isen mindre enn 10 min.
  10. Vellykket induksjon av PCD kan observeres ved denaturering natrium natriumdodecylsulfat sulfat polyakrylamid gel elektroforese (SDS-side) analyse. Harvest 1 mL av uninduced kulturen i et rør. Snurr prøven 1 min ved 14 000 x g i en microfuge ved omgivelsestemperatur. Dekanter supernatanten.
    1. Solubilize de pelleted cellene i 150, μL PBS (fosfat bufret saltvann).
    2. Legg til et lik volum på 2X lasting fargestoff (1,2% SDS, 30% glyserol, 150 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,0018% bromophenol blå, 15% β-mercaptoethanol). Vortex prøven for å blande godt.
    3. Kok prøven i 3 min og Overfør til is. Prøven kan oppbevares i en-20 ° c fryser for fremtidig analyse.
      Merk: PBS er kommersielt tilgjengelig med eller uten CaCl2 og MgCl2. Mange laboratorier vil ha PBS uten CaCl2 og MgCl2 for Cell kultur metoder. Vi har ikke funnet noen forskjell med PBS med eller uten CaCl2 og MgCl2.
  11. Overfør 4 L kolbe til en inkubator ved 17 ° c med 180 RPM risting. Fortsett å overvåke OD600 hver 20 min.
  12. På 0,7 OD600 Legg isopropylalkohol-beta-D-THIOGALACTOPYRANOSIDE (ipth) til 0,5 mm siste konsentrasjon (0,25 M lagerløsning) og 10 mg/L ammonium jern (II) sulfat heksa hydrat (Fe (NH4)2(so4)2, 10 mg/ml lagerløsning). PCD gener pcaH og pcaG er indusert fra T5 ARRANGØREN ved tilsetning av ipth (figur 1A). Jernsulfat er bundet av PCD og kreves for katalysator ved å koordinere oksygen under catechol åpning.
  13. Rist kulturen ved 180 RPM ved 17 ° c i 18 timer.
  14. Plasser kulturen kolbe i isen som i 1,2. Harvest 1 mL av induserte celler for SDS-side som i 1,3.
  15. Hell bakteriell kultur til flasker som passer for sentrifugering. En 1 L kultur kan være sentrifugert i 4 250 mL konisk bunn flasker. Pellet kulturen ved 4 ° c i 20 min ved 3000 x g. Dekanter supernatanter. Kasser med bakteriell væske avfall på riktig måte.
  16. Pipet å resuspend pellets i 25 mL kald PBS (CaCl2 og MgCl2 er valgfritt) per 1 L kultur.
  17. Overfør blanding til 50 mL koniske rør (1 50 mL rør per 1 L kultur). Pellets cellene ved 3000 x g i 20 min ved 4 ° c. Dekanter supernatanten og kast dem på riktig måte.
  18. Resuspend cellene i 10 mL lyseringsbuffer (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 20 mM imidazole, 10% glyserol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin, og 87,1 μg/mL phenylmethylsulfonyl fluor (PMSF)) ved pipettering. Frys blanding med flytende nitrogen i en Dewar kolbe. Oppbevar prøve rørene i en-80 ° c fryser. Vi har renset PCD fra pellets lagret ved-80 ° c i ett år uten tilsynelatende tap av aktivitet.
  19. Sammenlign uninduced og induserte celler ved SDS-PAGE.
    Merk: Vi har ikke hatt noen problemer med induksjon av PCD-heterodimer. Vi anbefaler imidlertid å teste induksjon før du fortsetter med rensing i tilfelle noen reagens har utløpt uventet.
    1. Monter platene for SDS-PAGE (dimensjoner: 7,3 cm x 8,3 cm x 0,75 mm tykk). Den stabling gel er 1,5 mL 6% polyakrylamid (6% akrylamid, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8, 0,1% SDS, 0,1% ammonium persulfate, 0,001% TEMED). Løsnings gelen er 3,5 mL 12% polyakrylamid (12% akrylamid, 375 mM Tris-HCl, pH 8,8, 0,1% SDS, 0,1% ammonium persulfate, 0,001% TEMED). Sett inn en 10 brønn kam til stabling laget.
    2. Legg 10 μL av uninduced og induserte bakterie prøver. Last 4 μL av prestained molekylvekt markører for proteiner (figur 1B).
    3. Electrophorese gelen på 16,5 V/cm ca 1 t. Den bromophenol blå skal nå bunnen av gelen.
    4. Plasser gelen i Coomassie blå flekk (10% eddiksyre, 40% metanol, 0,1% Coomassie blå fargestoff) i en plast tub. Flekken skal helt dyppe gelen. Beis ved omgivelsestemperatur i 20 min. lett rotasjon under farging er valgfritt.
    5. Bytt ut oppløsningen med destain (10% eddiksyre, 40% metanol). Ruge ved omgivelsestemperatur med valgfri skånsom rotasjon til protein båndene er lett synlige.
    6. Skift ut destain med deionisert vann. Blant bakterie proteiner skal den induserte PCD-under enheter være synlig i induserte celler. Hexahistidine Tagged PCD delenhet pcaH har en molekylvekt på 28,3 kDa og pcaG-delenhet er 22,4 kDa. Hvis PCD-under enheter ikke er tydelige, skal det utføres en ny induksjon avledet fra en roman koloni.

2. nikkel affinitet kromatografi rensing av PCD

  1. Tine på is 1 50 mL tube indusert celler. Det kan ta 2-3 h til å tine prøven helt.
  2. Holde røret på isen, sonikere prøven ved 30% amplitude i 1 min, sykling 1 s på og av. Bruk en konisk mikrotip (diameter 0,125 tommer) sonicator. Maksimal effekt er 400 W og frekvensen er 20 kHz og per 1 L kultur pellet.
  3. Etter sonikering legger du til lysozyme til 0,2 mg/mL endelig konsentrasjon (10 mg/ml lagerløsning) og holder på isen i 30 min ved 4 ° c.
  4. Hell bakteriell lysat i en pre-kjølt polykarbonat flaske (dimensjoner: 25 mm x 89 mm). Flasken skal være kompatibel med en fast vinkel ultracentrifuge rotor. Andre rør og/eller slanger kan erstattes, men den endelige gravitasjon kraft bør opprettholdes.
  5. Sentrifuger for 60 min ved 120 000 x g ved 4 ° c. Cellular rusk vil danne en pellet. Supernatanten kan se gul ut.
    1. Pellet kan inkluderes i etterfølgende SDS-side analyse for å bestemme løselighet av PCD (figur 1B). Solubilize pellet ved virvlingen i 10 mL PBS. Overføring 150 til et 1,5 mL rør. Klargjør prøven for SDS-PAGE som i 1,3.
  6. Hell supernatanten på en kald 50 mL konisk slange. Legg merke til volumet. Forurensning av supernatanten med bakteriell DNA kan gi en viskøs prøve. Bakteriell genomisk DNA kan blokkere Kol onne flyten. Den ultracentrifugation trinn 2,2 bør gjentas til pellets bakteriell DNA. En pellet fra denne andre spin er kanskje ikke lett synlig eller kan være transparent.
  7. Gjør 500 mL ni buffer A (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, og 10% glyserol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin, og 87,1 μg/mL PMSF) og 500 mL ni buffer B (300 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% glyserol, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin, og 87,1 μg/mL PMSF, 250 mM imidazole, pH 8,0). Pass begge ni buffere gjennom 0,2 μm pore filtre.
  8. Prøven, buffere, og FPLC (rask protein flytende kromatografi) systemet er i et kjøleskap rom ved 4 ° c. Vask pumpen A med ni buffer A og pumpe B med ni buffer B. vask systemet med 20 mM imidazole (8% ni buffer B, 92% ni buffer A) inntil UV og konduktivitet stabiliseres. Vi strømmer rutinemessig buffere ved 5 mL/min med en 1,0 MPa trykk grense. Strømningshastigheten og trykkgrensen bør bestemmes av spesifikasjonene til FPLC-instrumentet som brukes.
  9. Forbered en kolonne med 1,5 mL nikkel-ladet harpiks (dimensjoner: 110 mm lang x 5 mm). Harpiks bindings kapasiteten er 50 mg/mL og tåler 1 MPa-trykk. En kolonne kan helles og lagres ved 4 ° c før rensing.
    Merk: Størrelsen på kolonnen kan økes proporsjonalt for å imøtekomme mer enn 1 50 mL rør av induserte celler hvis det kreves mer protein. Vi foretrekker en ny spalte for hver forberedelse for å sikre at ingen rester av proteiner forurenser vårt ønskede protein. Men, nikkel harpiks kan resirkuleres i henhold til produsentens instruksjoner.
  10. Fest kolonnen med nikkel-ladet harpiks til FPLC. Kjør 20 mL 92% ni buffer A og 8% ni buffer B (20 mM imidazole) ved 0,5 mL/min med en 0,5 MPa trykk grense gjennom kolonnen til likevekt. I sanntid bør FPLC måle A280 (280 NM UV absorbansen) samt ledningsevne. Hvis disse verdiene ikke har stabilisert etter at 20 mL volumet har passert gjennom kolonnen, må du strømme buffere til de har stabilisert.
  11. Legg prøven til kolonnen (~ 10 mL) ved 0,15 mL/min. Angi trykkgrensen til 0,5 MPa. Samle strømmen gjennom.
  12. Vask kolonnen med 20 mL ni buffer ved 20 mM imidazole (92% ni buffer A og 8% ni buffer B). Oppbevar vasken i en 50 mL slange for analyse. Vask kolonnen med 15 mL 50% ni buffer A og 50% ni buffer B (125 mM imidazole). Samle eluering i 19 fraksjoner av 0,8 mL volum. Vask kolonnen med 15 mL 100% ni buffer B. samle ytterligere 75 fraksjoner av 0,2 mL. Noen PCD heterodimer vil eluere i 50% ni buffer B vask, men flertallet av heterodimer vil eluere i 100% ni buffer B vask.
  13. Analyser innsamlede fraksjoner på 12% SDS-PAGE gels for å bekrefte tilstedeværelsen av PCD. Legg til like volumer på 2X lasting fargestoff til flyten gjennom, vask, og topp en280 fraksjoner. Kok i 3 min. Overfør til is. Pour 2 12% SDS-side gels (som i trinn 1,7). Gjenta gel-metoden som beskrevet i 1,7.

3. nuklease aktivitet analysen

  1. Basert på SDS-side analyse, identifisere nikkel affinitet fraksjoner som inneholder nesten ren PCD. Kombiner 5 μL kromatografi brøk og 500 ng 3 KB supercoiled plasmider pXba + i reaksjonsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,1 mm DTT) med et endelig volum på 50 μL.
    1. Ruge ved 37 ° c for 1 time
    2. Ta med en negativ kontroll (ingen tilsatt protein) og en positiv kontroll (kommersielt tilgjengelig PCD). Stopp reaksjonen med 10 μL stopp løsning (150 mM EDTA, pH 8,0, 0,6% SDS, 18% glyserol, 0,15% oransje G).
    3. Prøvene kan oppbevares i en-20 ° c fryser for å analyseres senere. Eventuelle supercoiled plasmider kan brukes i en nuklease analysen så lenge supercoiled og avslappet sirkel reaksjons produkter kan løses ved agarose gel elektroforese.
  2. Hell en 120 mL 1% agarose gel i 1X TAE etidiumbromid buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA, 0,5 μg/mL etidiumbromid bromide) i en gel støpt (dimensjoner: 15 x 10 cm). Bruk en 15 brønn kam (brønn dimensjoner: 5mm x 1,5 mm). Når gelen har satt, Senk den i 1X TAE etidiumbromid buffer.
  3. Analyser 30 μL av reaksjonene ved agarose gel. Electrophorese ved 10 V/cm ved omgivelsestemperatur i ca. 1 time. Den oransje G fargestoff fronten bør være på slutten av gelen.
  4. Bruk en fluorescens skanner for å umiddelbart avbilde det etidiumbromid bromide signalet fra gelen. Hvis en 3 KB plasmider ble brukt, den tregeste bandet vil være avslappet sirkler på ~ 3,5 kb, lineær DNA vil kjøre på 3 KB, og supercoiled plasmider vil ha den raskeste mobilitet på ~ 2 kB.
    1. Beregn det totale piksel volumet for hvert kjørefelt med bildeanalyse programvare.
    2. Bestem piksel volumet til de ulike DNA-artene, for eksempel supercoiled, lineære og nicked sirkler. Bruk disse verdiene til å bestemme prosentandelen av hver DNA-art. For eksempel viser økt tilstedeværelse av nicked sirkler knyttet til en brøk i forhold til negativ kontroll tilstedeværelsen av nuklease. Piksel volumet av nicked sirkler i et kjørefelt er delt på pikselverdien av totalt DNA. Bestem en prosent ved å multiplisere dette tallet med 100.
  5. Kombiner fraksjoner fra den andre eluering toppen som inneholder nesten ren PCD-heterodimer basert på SDS-PAGE-analyse, og har minimal til undetectable nuklease aktivitet. Vårt typiske samlede volum er ~ 2 mL.
  6. Legg prøven til en sentrifugal Filterenhet med 10 kDa molekylvekt grense. Sentrifuger i en svingende bøtte sentrifuger på 4000 x g for 40 min ved 4 ° c. Alternativt kan en 35 ° fast vinkel rotor brukes ved 7500 x g i 20 min ved 4 ° c.
    1. Gjenta sentrifugering til det endelige retentate volumet er 100-200 μL.
    2. Inverter filterenheten og gjenopprette retentate ved sentrifugering ved 1000 x g i 2 min ved 4 ° c.

4. størrelses ekskludering kromatografi rensing av PCD

  1. Gjør 250 mL størrelses utelukkelse kromatografi (SEC) kjører buffer (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% glyserol, 0,1 mM EDTA, 800 ng/mL Pepstatin, 1 μg/mL Leupeptin, og 87,1 μg/mL PMSF). Passere bufferen gjennom et 0,2 μm pore filter og oppbevares ved 4 ° c.
    Merk: Utfør alle trinnene i et nedkjølt rom ved 4 ° c. SEC rensing er valgfritt, men proteinet bør lagres i SEC kjører buffer. Hvis SEC-rensing utelates, samles retentate i 3.6.2. skal dialyzed mot 1 L av SEC buffer i 10 kDa MWCO (molekylær vekt avskåret) dialyse slange ved 4 ° c over natten.
  2. Likevekt en tverrbundet agarose SEC (størrelse utelukkelse kromatografi) kolonne (dimensjoner: 10 mm x 300 mm; 24 mL Bed volum; 25-500 μL prøvevolum; 1,5 MPa trykk grense; 2 x 106 da ekskluderings grense; 1 til 300 KDA-separasjon) med SEC-Buffer på 0,5 ml/min.
    Merk: Hvis du vil ha en alternativ størrelse SEC kolonner kan brukes.
  3. Legg de konsentrerte fraksjonene til en 200 μL volum injeksjon loop. Legg prøven på 0,5 mL/min til kolonnen. SEC-oppløsningen øker med mindre belastnings volum. Eluere med 23 mL SEC løpe buffer og samle 94 fraksjoner av 250 μL. SEC-kromatogram bør løse et enkelt A280 peak som er PCD-heterodimer. Vi finner at PCD elutes 8,9 mL. Eluering tidspunktet vil endres med alternative SEC-kolonner.

5. PCA oksidasjon og nuklease aktivitet analyser

  1. Reaksjoner på analysen både oksidasjon av PCA og nuklease aktivitet utføres i en 96-brønn flat bunnplate. Monter reaksjoner i en 96 brønn plate på is i et kjøle rom på 4 ° c for å forhindre for tidlig katalyse. Kombiner i et endelig volum på 50 μL: 130 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2, 0,1 mm DTT, 5 mm PCA, 10 ng/ml Supercoiled plasmider pXba +, og 10 μL av individuelle PCD SEC-fraksjoner.
    Merk: PCD SEC-fraksjoner bør legges til sist og umiddelbart før analysen, da proteinet vil begynne å katalyse på tidspunktet for tilsetning.
  2. PCD oksidasjon av PCA resulterer i redusert absorbansen av PCA ved 290 NM (A290). Overfør 96 brønn platen til plate holderen til en plate leser satt til en intern temperatur på 37 ° c. Trekk plateholderen inn i instrumentet og mål A290 ved 20 s intervaller for 1 time. La instrumentet riste platen 5 s før hver avlesning.
  3. Etter 1 time, Avslutt reaksjonene ved å legge til 10 μL stopp løsning (150 mM EDTA, pH 8,0, 0,6% SDS, 18% glyserol, 0,15% oransje G).
  4. Forbered, Last og Kjør en agarose gel som i trinn 3,2.
  5. Image og analysere agarose gel som i trinn 3,3.
  6. Velg brøker med flest oksidasjons aktiviteter fra PCA og ingen observert nuklease forurensning for langtidslagring ved-80 ° c. Mål A-280.
  7. Beregn den totale PCD-konsentrasjonen ved hjelp av A-280 og utryddelse koeffisienten (ε280) av 734 700 M-1cm-1.
  8. Snap fryse individuelle fraksjoner i flytende nitrogen. Oppbevares i en-80 ° c fryser. Alternativt kan du kombinere aktive, nuklease fraksjoner, alikvot og fryse på samme måte. Vår typiske avkastning er 1-2 mg PCD per L kultur. Vanlig bruk i et SM-eksperiment er 3 μg PCD. Vi har brukt PCD lagret ved-80 ° c i opp til 1 år uten nedgang i aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kommersielt tilgjengelig oksygen renovasjons-PCD er ofte forurenset med en DNA-nuklease. Forurensende nuklease aktivitet kan føre til falske resultater i fluorescerende studier, spesielt studier som analyserer DNA eller DNA samspill proteiner. Vi har funnet at rekombinant PCD, en heterodimer av hexahistidine merket pcaH og pcaG, kan uttrykkes i E. coli (figur 1). Heterodimer blir først renset av nikkel affinitet kromatografi (figur 2). PCD er eluert i 2 trinn av imidazole konsentrasjoner. Kromatografi fraksjoner analyseres av SDS-PAGE. Brøkdeler av nesten ren PCD er konsentrert og ytterligere renset av SEC (Figur 3). SEC-fraksjoner analyseres individuelt både for oksidasjons aktivitet fra PCA og nuklease aktivitet (Figur 4). Fraksjoner som viste høy oksidasjons aktivitet og ingen tilsynelatende nuklease aktivitet er analyseres for proteinkonsentrasjon og oppbevares i en-80 ° c fryser for eksperimentell bruk.

Figure 1
Figur 1: induksjon av PCD i E. coli. (A) PVP91A-pcaHG vises med pcaG-(α) og hexahistidine-kodede pcaH (β) PCD-under enheter. (B) representant SDS-side gel av PCD induksjon. Molekylære vekter er angitt til venstre. Mobilities av 28,3 kDa hexahistidine-merket pcaH og 22,4 kDa pcaG er til høyre. Uninduced e. coli (un), indusert E. coli (i), pellet følgende E. coli lyse og ultracentrifugation (P), supernatanten følgende ultracentrifugation skal lastes til en nikkel kolonne (S), representative brøk etter nikkel kromatografi (ni), og REPRESENTATIVE brøkdel følgende SEC (se). Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: nikkel affinitet kromatografi rensing av PCD. (A) kromatogram av nikkel affinitet KROMATOGRAFI av PCD. A280 vises i blått, og prosent konsentrasjonen av ni buffer B vises i rødt. Prøven ble lagt i en lav 20 mM imidazole konsentrasjon. Den sonore (FLW THR) viser løselig bakterielle proteiner som ikke binder til nikkel harpiks. Kolonnen ble vasket med 20 mL 20 mM imidazole buffer. En andre 15 mL vask ble utført med 125 mM imidazole. Eluering av PCD ble utført med 250 mM imidazole. Noen PCD-eluert i nærvær av 125 mM imidazole, men flertallet av proteinet eluert i 250 mM imidazole. (B) representative SDS-side analyse av nikkel affinitet fraksjoner. Lasten, sonore (FLW THR), og første vask viste vellykket induksjon av PCD, løselig bakterielle proteiner som ikke binder nikkel harpiks, og minimale proteiner observert under første vask, henholdsvis. Flere fraksjoner gjennom andre vask og eluering trinn vises. Fraksjoner fra den andre vasken inkluderte PCD-protein, men viste også synlig høyere molekylvekt forurensninger. Fraksjoner fra eluering trinnet syntes å være fri for forurensninger. Molekylære vekter vises til venstre. Mobilities av pcaH og pcaG er vist til høyre. (C) Agarose gel av nuklease analysen. Den nikkel affinitet kolonnen belastning, sonore, vask, og flere fraksjoner ble testet for nuklease aktivitet. En negativ kontroll (kontroll) er plasmider uten tilsatt protein. En positiv kontroll (PCDa) er en kommersielt tilgjengelig PCD som er kjent for å være forurenset med et DNA-nuklease. DNA-arter er angitt til høyre som små fragmenter (SF), supercoiled (SC), lineær (LN), nicked sirkel (NC), og nicked dimer (ND). (D) kvantifisering av de ulike DNA-artene som er observert i agarose gel nuklease-analysen. Det totale piksel volumet for hvert kjørefelt ble målt. Piksel volumet til hver DNA-Art ble bestemt og uttrykt som en prosentandel av det totale piksel volumet i kjørefelt. Den negative kontrollen var 81,7% supercoiled med 14,4% nicked sirkler. Den positive kontrollen viste en betydelig økning på 46,0% nicked sirkler. Lasten og sonore inneholdt bakteriell nukleaser som konverterte plasmider og forurensende bakterier DNA til små fragmenter. Den første vask på 20 mM imidazole også ut til å inneholde betydelig nuklease aktivitet, noe som resulterer i lineære og nicked sirkler. Brøk 4-7 fra andre vask ved 125 mM imidazole også vist signifikant nuklease aktivitet (spesielt, brøk 4 og 5 som genererte observert linearized plasmider). Fraksjoner 29-38 fra eluering trinn viste seg mer lik den negative kontrollen. I dette eksempelet ble brøker 29-38 valgt som kombinerte, konsentrerte og ytterligere renset av SEC. Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: SEC rensing av PCD. (A) KROMATOGRAM SEC av PCD fraksjoner etter nikkel affinitet kromatografi. A280 vises i blått og eluering fraksjoner er indikert. PCD eluert fra SEC som en enkelt synlig topp. (B) representant SDS-side analyse av SEC fraksjoner 33-48. Lasten er konsentrert PCD etter nikkel affinitet rensing. Brøker 33-48 span den tilsynelatende SEC peak. Ingen synlig forurensning ble observert. (C) Agarose gel av nuklease analysen. SEC-lasten og flere fraksjoner ble testet for nuklease aktivitet. En negativ kontroll (kontroll) er plasmider uten tilsatt protein. En positiv kontroll (PCDa) er en kommersielt tilgjengelig PCD som er kjent for å være forurenset med et DNA-nuklease. DNA-arter er angitt til venstre som supercoiled (SC), nicked sirkel (NC), og nicked dimer (ND). (D) kvantifisering av de ulike DNA-artene som er observert i agarose gel nuklease-analysen. Det totale piksel volumet for hvert kjørefelt ble målt. Piksel volumet til hver DNA-Art ble bestemt og uttrykt som en prosentandel av det totale piksel volumet i kjørefelt. Den negative kontrollen var 82,1% supercoiled med bare 13,7% nicked sirkler. Den positive kontrollen viste en betydelig økning på 64,8% nicked sirkler. SEC lasten viste ingen åpenbar nuklease aktivitet på grunn av klok valg av fraksjoner fra nikkel affinitet rensing. Tilsvarende fraksjoner 33-48 dukket opp som ligner på den negative kontrollen. Brøk 36 var for eksempel 82,5% supercoiled og 13,2% nicked sirkel. I dette eksempelet ble fraksjoner 36 og 37 valgt som kvantifisert, frosset og oppbevart i en-80 ° c fryser for fremtidig eksperimentell bruk. Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: PCA-og nuklease aktivitet av PCD SEC-brøker. Oksidasjon av PCA ble målt med A290. Som PCD oksidert et PCA-molekyl, ble A290 redusert. En PCA-oksidasjon ble målt hver 20 s for 1 time. En negativ kontroll uten tilsatt PCD-brøk (blå linje) viste ingen endring i A290, noe som indikerer at PCA-molekylet var stabilt. Data fra tre representative SEC-brøker (36 i rødt, 33 i oransje, 39 i gult) viser at renset PCD reduserte A290, noe som indikerer OKSIDASJON av PCA. Dette tallet er endret fra en tidligere publikasjon12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Oksygen rensing systemer er vanligvis inkludert i enkelt molekyl fluorescens mikroskopi å redusere photobleaching3,7,8. Disse mikroskopi teknikkene brukes ofte til å observere nukleinsyre syrer eller protein interaksjoner med nukleinsyre syrer1,13,14. Forurensning av OSSs med nukleaser kan føre til falske resultater.

Kommersielt tilgjengelige OSSs, inkludert GODCAT og PCD, har vist å inkludere signifikant nuklease forurensning11. Det er mulig å kjøpe PCD og bruke SEC for å fjerne nuklease forurensning11. Men prisen på kommersielt tilgjengelig PCD fra en leverandør økte 5 fold etter publiseringen av denne metoden. Denne metoden genererer en svært aktiv, nuklease, gratis PCD-heterodimer og kan tenkes utføres innen 1 uke. I vår erfaring er mengden av PCD generert av en 1 L-kultur (1-2 mg) tilstrekkelig for ett år med eksperimenter (3 μg/eksperiment) i et produktivt laboratorium med 2 fluorescerende bilde systemer.

Induksjon effektivitet er nøkkelen til suksessen til denne metoden. Hvis PCD-heterodimer ikke er effektivt indusert og tydelig ved SDS-PAGE, vil rensingen mislykkes. To alternative strategier kan prøves. Først forsøk induksjon fra en annen koloni på E. coli Transformation plate. For det andre har vi hatt tidligere suksess med BL21, men et alternativ E. coli belastning for uttrykk, for eksempel BL21 pLysS, kan prøves. Suksessen av PCA oksidasjons analysen er avhengig av minimal eksponering av underlaget til PCD før analysen starter. Det anbefales sterkt å montere 96 brønn plate reaksjoner på is i et kaldt rom og tilsett protein prøven umiddelbart før du legger platen til leseren.

Nikkel affinitet kromatografi kan være tilstrekkelig til å identifisere fraksjoner av ren PCD uten forurensende nuklease aktivitet. I dette tilfellet er det mulig å eliminere SEC rensing. Imidlertid bør nikkel kromatografi fraksjoner kombineres og dialyzed over natten ved 4 ° c i SEC kjører buffer. Glyserol som finnes i SEC-bufferen er viktig for lagring ved-80 ° c.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH GM121284 og AI126742 til KEY.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 βME
30% acrylamide and bis-acrylamide solution, 29:1 Bio-Rad 161-0156
Acetic acid, Glacial Certified ACS Fisherl Chemical A38C-212
Agar, Granulated BD Biosciences DF0145-17-0
AKTA FPLC System GE Healthcare Life Sciences AKTA Purifier: Box-900, pH/C-900, UV-900, P-900, and Frac-920
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit EMD Millipore UFC201024 10 kDa MWCO
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate Sigma F-2262
Ammonium Persulfate (APS) Tablets Amresco K833-100TABS
Ampicillin Amresco 0339-25G
Bacto Tryptone BD Biosciences DF0123173
BD Bacto Dehydrated Culture Media Additive: Bottle Yeast Extract VWR 90004-092
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) Sigma-Aldrich B6755-500G
Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126-25G
Coomassie Brilliant Blue Amresco 0472-50G
Costar 96–Well Flat–Bottom EIA Plate Bio-Rad 2240096EDU
DTT P212121 SV-DTT
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 500ML Sigma-Aldrich D8537-500ML PBS
Ethidium bromide Thermo Fisher Scientific BP1302
Glycerol Fisher Scientific G37-20
Granulated LB Broth Miller EMD Biosciences 1.10285.0500
Hi-Res Standard Agarose AGTC Bioproducts AG500D1
Imidazole Sigma-Aldrich I0250-250G
IPTG Goldbio I2481C25
Leupeptin Roche 11017128001
Lysozyme from Chicken Egg White Sigma-Aldrich L6876-1G
Magnesium Chloride Hexahydrate Amresco 0288-1KG
Microvolume Spectrophotometer, with cuvet capability Thermo Fisher ND-2000C
NaCl P212121 RP-S23020
Ni-NTA Superflow (100 ml) Qiagen 30430
Novagen BL21 Competent Cells EMD Millipore 69-449-3 SOC media included
Orange G Fisher Scientific 0-267
Pepstatin Gold Biotechnology P-020-25
PMSF Amresco 0754-25G
Protocatechuic acid Fisher Scientific ICN15642110 PCA
Sodium dodecyl sulfate P212121 CI-00270-1KG
SpectraMax M2 Microplate Reader Molecular Devises
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL Thermo Fisher Scientific 09-741-04
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 500mL Thermo Fisher Scientific 09-741-02
Superose 12 10/300 GL GE Healthcare Life Sciences 17517301
TEMED Amresco 0761-25ML
Tris Ultra Pure Gojira Fine Chemicals UTS1003
Typhoon 9410 variable mode fluorescent imager GE Healthcare Life Sciences
UltraPure EDTA Invitrogen/Gibco 15575
ZnCl2 Sigma-Aldrich 208086

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shera, E. B., Seitzinger, N. K., Davis, L. M., Keller, R. A., Soper, S. A. Detection of single fluorescent molecules. Chemical Physics Letters. 174, (6), 553-557 (1990).
  2. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90, (2), 448-454 (2014).
  3. Ha, T., Tinnefeld, P. Photophysics of fluorescent probes for single-molecule biophysics and super-resolution imaging. Annual Review of Physical Chemistry. 63, 595-617 (2012).
  4. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal: for Cell and Molecular Biology. 36, (2), 280-290 (2003).
  5. Davies, M. J. Reactive species formed on proteins exposed to singlet oxygen. Photochemical & Photobiological Sciences. 3, (1), 17-25 (2004).
  6. Sies, H., Menck, C. F. Singlet oxygen induced DNA damage. Mutation Research. 275, (3-6), 367-375 (1992).
  7. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, (5), 1826-1835 (2008).
  8. Harada, Y., Sakurada, K., Aoki, T., Thomas, D. D., Yanagida, T. Mechanochemical coupling in actomyosin energy transduction studied by in vitro movement assay. Journal of Molecular Biology. 216, (1), 49-68 (1990).
  9. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, (14), 6132-6138 (2010).
  10. Brown, C. K., Vetting, M. W., Earhart, C. A., Ohlendorf, D. H. Biophysical analyses of designed and selected mutants of protocatechuate 3,4-dioxygenase1. Annual Review of Microbiology. 58, 555-585 (2004).
  11. Senavirathne, G., et al. Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems. Nature Methods. 12, (10), 901-902 (2015).
  12. Senavirathne, G., Lopez, M. A. Jr, Messer, R., Fishel, R., Yoder, K. E. Expression and purification of nuclease-free protocatechuate 3,4-dioxygenase for prolonged single-molecule fluorescence imaging. Analytical Biochemistry. 556, 78-84 (2018).
  13. Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nature Communications. 7, 11409 (2016).
  14. Liu, J., et al. Cascading MutS and MutL sliding clamps control DNA diffusion to activate mismatch repair. Nature. 539, (7630), 583-587 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics