자극된 라만 산란을 기반으로 한 비선형 현미경 구현

Engineering

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Summary

이 원고에서, 레이저 스캐닝 현미경과 SRS 실험 설정의 통합에 의해 얻어진 자극된 라만 산란(SRS) 현미경의 구현이 설명된다. SRS 현미경은 두 개의 펨토초(fs) 레이저 소스, Ti-Sapphire(Ti:Sa) 및 동기화된 광학 파라메트릭 발진기(OPO)를 기반으로 합니다.

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Ranjan, R., Indolfi, M., Ferrara, M. A., Sirleto, L. Implementation of a Nonlinear Microscope Based on Stimulated Raman Scattering. J. Vis. Exp. (149), e59614, doi:10.3791/59614 (2019).

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Abstract

자극 된 라만 산란 (SRS) 현미경 검사법은 근적외선 여기 광을 사용합니다. 따라서, 그것은 많은 다중 광자 현미경 화상 진찰 속성을 공유합니다. SRS 이미징 양식은 적절한 대역 통과 필터와 잠금 증폭기(LIA) 검출 체계가 있는 비스캔 된 전방 검출기를 장착하여 상업용 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 얻을 수 있습니다. 일반적인 SRS 현미경의 회로도 레이아웃은 다음을 포함합니다: 2개의 펄스 레이저 빔, (즉, 스캐닝 현미경으로 향하는 펌프 및 프로브), 이는 이미지 평면에서 공간과 시간 둘 다에서 중첩되어야 하고, 현미경 목표에 의해 집중되어야 합니다 x-y 평면을 가로질러 초점 지점을 래스터하는 두 개의 스캐닝 미러(SM)를 통해 샘플을 채취한다. 샘플과의 상호 작용 후, 전송된 출력 펄스는 상부 목표에 의해 수집되고 반전된 현미경에 삽입된 전방 검출 시스템에 의해 측정됩니다. 펌프 펄스는 광학 필터 스택에 의해 제거되는 반면, 시편의 초점 부피에서 발생하는 SRS 공정의 결과인 프로브 펄스는 포토다이오드(PD)에 의해 측정됩니다. PD의 판독은 변조 깊이를 추출하기 위해 LIA에 의해 복조됩니다. 2차원(2D) 이미지는 전방 검출 유닛을 현미경 스캐닝 유닛과 동기화하여 수득됩니다. 이 백서에서는 SRS 현미경의 구현이 설명되고 성공적으로 입증되었으며 직경 3 μm의 폴리스티렌 비드의 라벨이없는 이미지의 보고도 설명되고 성공적으로 입증되었습니다. SRS 현미경은 상업적으로 사용할 수 없으므로 이러한 특성을 활용하기 위해 집에서 만든 건설이 유일한 옵션입니다. SRS 현미경 검사법은 많은 분야에서 인기를 끌고 있기 때문에, SRS 현미경 구현의 이 신중한 설명은 과학 적인 사회를 위해 아주 유용할 수 있다는 것을 믿습니다.

Introduction

생명 과학 응용 분야에서 SRS 현미경 검사는 라벨없는 이미징을위한 강력한 도구로 부상했습니다. SRS 현미경 검사법의 기본적인 아이디어는 진동 콘트라스트의 강도와 몇 초 안에 이미지를 획득 하는 기능을 결합 하는 것입니다.

SRS는 두 레이저 빔 주파수 사이의 주파수 차이 (펌프 신호와 다른 주파수에서 스톡 스 신호)가 조사 된 샘플의 분자 진동과 일치하여 자극 된 라만 산란 및 상당한 원인이되는 프로세스입니다. 스톡스 신호가 증가합니다. 선형 라만 분광법과 달리 SRS는 들어오는 광장에 비선형 의존성을 나타내며 일관된 방사선을 생성합니다. SRS에는 두 가지 근본적인 장점이 있습니다: 1) 속도는 샘플 이동 또는 저하로 인해 발생하는 아티팩트에 덜 민감하게 만들고, 2) 우수한 신호 대 잡음 비(SNR)를 제공합니다. 또한, SRS는 자발적라만과 동일한 스펙트럼을 나타내고, SRS 신호는 1, 2,3,4, 화학적 결합의 농도에 선형적으로 비례한다. 5.

우리의 현미경에서, 펨토초 (fs) SRS 실험 설정은 빠른 거울 주사 장치가 장착 된 거꾸로 된광학 현미경과 통합된다 (그림 1)6,7,8. 이 현미경을 구현하기 위해 두 개의 펄스 레이저 소스가 사용됩니다. 첫 번째는 약 140 fs의 펄스 지속 시간, 80 MHz의 반복 속도 및 680-1080 nm 범위의 방출 파장을 가진 fs-Ti:Sa입니다. 두 번째, 프로브 빔으로 사용 및 Ti:Sa에 의해 펌핑, 펨토초 동기화 광학 파라메트릭 발진기 (SOPO), 약의 펄스 지속 시간 200 fs, 80 MHz의 반복 속도, 1000-1600 nm의 범위에서 방출 파장. Ti:Sa와 SOPO 빔 간의 최소 광자 에너지 차이는 2500cm-1입니다. 따라서, 레이저 시스템의 조합을 사용하여, 라만 스펙트럼의 고주파 C-H 영역(2800-3200 cm-1)만이6,7,8을탐색할 수 있다.

SRS 현미경을 설정하기 위해, 연속 단락에 설명되어 있는 3개의 중요한 문제점이 있습니다. 첫 번째는 고주파 변조 전달 방법의 구현이다(설명에 대한 프로토콜의 도 2 및 단계 2.1 참조). SRS 실험 조사에서 중요한 매개 변수는 시스템의 민감도입니다. SRS 신호는 여기 빔의 강도에 작은 변화로 감지; 따라서 레이저 강도 노이즈와 샷 노이즈로 인해 손상될 수 있습니다. 이 문제는 이 시스템을 고주파 변조 전달 방법과 통합하여 극복할 수 있습니다(자세한 내용은 프로토콜의 도 2 및 단계 2.1 참조). 이 방법에서는 전기 광학 변조기(EOM)를 사용하여 펌프를 조절합니다. 프로브 빔으로 전달된 변조는 광학 필터의 스택으로 펌프 빔을 차단한 후 PD에 의해 검출될 수 있다[자극된 라만 게인(SRG) 검출 모드]. PD 출력은 로우 패스 필터로 잠금 증폭기(LIA)에 연결되어 측정된 신호를 강등시됩니다. 빔의 변조 주파수를 1MHz 이상의 주파수로 증가시킴으로써 PD의 본질적 한계를 얻을 수 있습니다.

고려해야 할 두 번째 문제는 전방 검출을 수행하고 동시에 밝은 필드에서 현미경 관측을 보존 할 수있는 기계 마운트의 설치입니다. 또한, 이미지 의 생성 동안 기계적 진동으로 인한 노이즈를 감소시키고 검출 시스템의 정확한 재배치를 허용해야 한다(프로토콜의 도 3 및 2.2 단계 참조).

세 번째는 현미경의 스캔 헤드에 의해 모니터링되는 샘플 에 빔이 위치하여 위상 에 민감한 검출 방식에 의해 획득 된 신호의 동기화입니다. 이미지를 실현하기 위해 SM은 스캔 헤드 유닛에 연결된 현미경 컨트롤러(픽셀 클럭, 라인 동기화 및 프레임 동기화)에서 사용할 수 있는 세 가지 TTL 신호가 필요합니다. 동기화는 PCI 카드,3개의 TTL 신호 및 LIA6,7,8의출력 채널에서 전압 신호의 획득을 사용하여 제어함으로써 달성된다. 수제 소프트웨어가 개발되어 이전6,7,8,동기화 시스템의 하드웨어가 도 4에보고되는 동안 설명했습니다.

SRS 화상 진찰을 수행할 때 기본적인 절차는 현미경 정렬입니다. 그것은 연속된 단락에 설명된 네 단계의 과정을 통해 실현된다. 첫 번째는 두 빔의 공간 중첩입니다(프로토콜의 3.1 단계 참조). 이 실험 적인 설정에서, 두 빔은 공간적으로 이색 거울에 의해 결합되었다. 예비 단계는 각각 현미경에 도달할 수 있도록 OPO및 Ti:Sa의 정렬입니다. 그런 다음 OPO를 참조 빔으로 고려하고 위치 감지 검출기를 활용하면 Ti:Sa가 OPO에 공간적으로 중첩됩니다.

두 번째 중요한 측면은 두 빔의 시간적 중첩입니다(프로토콜의 3.2단계 참조). 펌프와 OPO 빔이 완벽하게 동기화되더라도OPO 하우징 내부에서 약간 다른 빔 경로를 따르기 때문에 OPO 출구에서 약 5 ns의 시간 지연과 5cm의 공간 차이가 있습니다. 따라서 Ti:Sa 및 OPO는 샘플에서 시간적 중복을 보장하기 위해 광학적으로 재시간을 재사용해야 합니다. 이는 일반적으로 미세 조정 가능한 광학 지연 라인으로 수행되며, 이 경우 Ti:Sa와 현미경 사이에 삽입됩니다(그림 1참조). 두 빔의 시간적 중첩을 얻기 위해 두 가지 기술이 사용됩니다. 첫 번째는 빠른 PD와 오실로스코프를 사용하여 수행되고 두 번째는 자동 및 교차 광학 상관 관계를 기반으로 합니다. 첫 번째 기술을 사용하여 두 빔의 거친 중첩(10ps의 불확실성)을 얻는 반면, 두 빔의 정확한 시간 적 중첩은 교차 상관레이터(1 fs의 해상도)를 사용하여 얻어집니다.

세 번째 중요한 양상은 현미경 내부의 두 빔의 정렬입니다 (프로토콜의 3.3 단계 참조). 샘플의 예비 백색광 관찰은 원하는 시야(FOV)를 분할할 수 있습니다. 그 후, 현미경의 측면 포트에 의해 현미경으로 들어가는 레이저 빔은 상부에 장착된 PD에 도달하기위해 정렬됩니다(그림 3). 그러나 올바른 이미지 수집을 위해서는 여러 매개변수(예: 픽셀 크기 및 픽셀 거주 시간)를 설정해야 합니다. 샘플링 주파수는 이미지의 모든 정보를 보존하기 위해 나이퀴스트의 정리에 의해 부과된 제약 조건을 준수해야 하며, 각 픽셀에서 측정된 픽셀과 SRS 값의 공간 좌표 간의 정확한 대응은 통합 시간입니다. LIA는 픽셀 거주 시간과 같거나 비교되어야 합니다.

현미경 정렬의 마지막 단계에서 공간 및 시간 정렬을 최적화하기 위해 수많은 테스트가 수행됩니다 (프로토콜의 3.4 단계 참조). 공간 중복을 최적화하기 위해 Ti:Sa 및 OPO 모두에 대한 다수의 전송 이미지(TI)를 획득합니다. TI에서는 단일 빔이 사용되고 샘플에서 전송된 빔 강도는 PD에 의해 측정됩니다. OPO에 의해 실현 TI의 경우, PD 출력 신호는 PCI 카드에 직접 연결되어, TI의 경우 TI에 의해 실현하는 동안: Ti:Sa, PD 출력 신호는 LIA에 연결되고 LIA의 아날로그 출력은 PCI 카드에 연결됩니다. 전송 이미지는 FOV, 조명, 현미경 목표의 초점 위치를 최적화하고 두 빔이 공간적으로 중첩되는지 확인하는 데매우 유용하다 6,7,8.

펌프 및 프로브 빔의 시간 적 중첩의 최적화는 3.3 fs 시간 이동에 해당하는 0.001 mm의 단계로 지연 라인을 스캐닝하고 직경 3 μm의 폴리스티렌 비드 샘플의 단일 지점에서 SRS 측정을 수행함으로써 얻어진다. SRS 신호의 진폭은 프로브 펌프 지연의 함수로서 LIA로부터값을 측정하고, 두 빔 6,7,8의정확한 시간적 중첩에 대응하는 최대를 제공한다. 결론을 내리기 전에 논의 된 모든 단계는 고품질 이미지를 얻기 위해 필수적이라는 점에 유의해야합니다.

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Protocol

1. 레이저 시스템 시작

  1. 냉각기의 온도가 20 °C 이하로 유지되는지 확인하십시오.
  2. 습도 제어 장치가 제대로 작동하고 습도가 약 40%의 값으로 유지되었는지 확인합니다.
  3. Ti:Sa 레이저를 켜고 설명서의 지침에 따라 엄격하게 설정합니다.
  4. 파장을 810 nm로 설정합니다.
  5. OPO 및 연결된 미니 컴퓨터를 켭니다. OPO 레이저를 제어하는 응용 프로그램을 실행합니다.
  6. OPO 상자의 출구에서 Ti:Sa 레이저 출력의 100%가 필요한 경우 우회를 선택합니다.
  7. OPO 상자의 출구에서 Ti:Sa 레이저 출력과 OPO 레이저 출력의 20%가 필요한 경우 바이패스를 해제합니다.
  8. Ti:Sa의 셔터를 열고 Ti:Sa 빔을 OPO 입력에 놓습니다.
  9. 신호 아웃 및 펌프 아웃을 클릭하여 OPO 출구에서 두 개의 레이저 빔을 놓습니다.
  10. 레이저 Ti: Sa 및 OPO가 안정화될 때까지 기다립니다(약 45-60분).
  11. 종이 검출기 카드를 사용하여 Ti:Sa 및 OPO 의 OPO 상자 출구에서 빔 스팟을 확인하고 전력 계측기를 사용하여 전원을 확인합니다.
  12. OPO 레이저 파장을 1076 nm로 조정합니다.
  13. 정렬을 수행하기 위해 각 레이저 빔에 대해 ~10 mW의 전력을 줄입니다.

2. 현미경 설정

  1. 고주파 변조 전달 방법 구현
    1. Ti:Sa 빔이 왜곡 없이 들어오고 나가지있도록 변조기의 광학 정렬 절차를 수행합니다.
    2. 함수 생성기를 켜고 TTL 신호(진폭 = 5V, 오프셋 = 2.5V, 주파수 = 5MHz)를 생성합니다.
    3. TTL 신호를 T 접합부를 사용하여 두 부분으로 나눈다. 하나는 EOM용이고 다른 하나는 잠금 증폭기(LIA)에 대해(그림 2참조).
    4. 오실로스코프로 모든 신호 레벨을 확인합니다.
    5. LIA를 켜고 발전기 출력 채널을 LIA의 참조 채널에 연결합니다.
    6. 발전기 출력 채널을 EOM의 고전압 전력 증폭기에 연결합니다.
    7. 앰프를 켜고 전압을 거의 최대 수준으로 설정합니다. EOM 의 출구에서 빔 전력을 모니터링합니다.
  2. PD를 고정하고 x 및 y 상대 모션을 할당하는 기계식 장착 통합
    참고 : 현미경을 사용하면 x 및 y 방향으로 모션 컨트롤이있는 마이크로 미터가 장착 된 외부 마운트가 도입됩니다.
    1. x 및 y 방향을 따라 이동이 허용되도록 두 개의 이동 변환 단계를 마운트합니다(그림 3참조).
    2. 적절한 높이의 Ø1.5" 포스트에서 스테이지를 수정합니다.
    3. 외부 마운트에 PD를 장착합니다.
    4. 마운트에 부착된 마이크로미터를 사용하여 PD 위치(x 및 y 좌표)를 조정하여 PD에서 빔 전력을 최대화합니다(그림 3참조).

3. 현미경의 정렬

  1. 빔의 공간 중첩
    참고: OPO 빔을 참조로 고려하고 위치 감지 검출기를 활용하는 Ti:Sa는 다음 절차에 따라 OPO에 중첩되어야 합니다.
    1. OPO와 Ti:Sa 레이저 빔을 정렬하여 둘 다 현미경에 도달합니다.
    2. 레이저 빔 위치 센서 감지기를 이색 미러 1과 미러 6 사이에 두 위치에 배치하고, 제 1 위치는 이색 거울 1에 가깝게 위치하고 두 번째 위치는 미러 6에 가깝습니다. 각 위치에 대해 센서를 사용하여 OPO 빔의 x 및 y 좌표를 감지합니다(그림 1참조).
    3. Ti:Sa 레이저 빔의 x 및 y 좌표가 센서 검출기의 두 위치에서 동일한 OPO인지 확인합니다. 일부 위치에서 Ti:Sa 및 OPO의 좌표가 일치하지 않는 경우 인접 미러의 기울기를 조정하여 차이를 보정합니다(그림 1참조).
    4. M6-M7 사이의 경로에 대한 OPO에 대하여 Ti:Sa 빔 위치를 정렬하는 동일한 절차를 따르십시오(그림 1참조).
  2. 빔의 시간적 동기화
    1. 빠른 포토다이오드 플러스 오실로스코프 사용:
      1. Ti:Sa 및 OPO 빔의 전파를 중지하고 OPO 빔 앞에 빠른 검출기를 배치합니다(M6와 M7 사이).
      2. Ti:Sa 레이저 박스에서 제공하는 트리거 신호를 채널 2의 오실로스코프와 연결합니다.
      3. 채널 1의 오실로스코프와 검출기 케이블을 연결하고 OPO 측두엽 프로파일을 시각화합니다.
      4. 최대값, 즉 t1에 해당하는 오실로스코프에 의해 측정된 시간(abscissa)을 기록합니다.
      5. OPO 빔을 중지하고 Ti:Sa 빔을 놓습니다.
      6. Ti:Sa 시간 프로파일을 시각화하고 최대값, 즉 t2에 해당하는 시간(abscissa)을 기록합니다.
      7. 두 빔을 중첩하기 위해 지연 선을 사용하여 t1-t2 간의 차이를 최소화합니다. 우리의 경우, 최소 측정 가능한 차이는 10 ps입니다.
      8. M6와 M7 사이에 있는 빠른 검출기를 제거합니다.
    2. 자동 상관 조정기의 사용 :
      참고: 그림 1에 표시된 회로도에서 자동 관독기는 빔의 광학 경로를 방해하지 않고 설치됩니다. 또한 M6와 M7 사이에 플립플롭 마운트(FFM/AM라고 함)에 빔을 도입하여 오토코렐레이터로 전환합니다.
      1. 오전을 뒤집어 빔을 자동 상관레이터로 향하게 합니다.
      2. Ti:Sa를 중지하고 OPO를 해제합니다.
      3. 자동 상관제의 빔 거리 조정 나사 마이크로미터를 정상 위치(8.35mm)로 설정합니다.
      4. 오토코렐레이터 컨트롤러의 전원을 켜고 이를 제어하는 개인용 컴퓨터에서 소프트웨어 응용 프로그램을 시작합니다.
      5. FFM/AM의 OPO 빔을 입력 미러에 오토코렐레이터에 투영합니다.
      6. 자동 상관기의 정렬 창에서 빔의 반사 스폿(용지 감지기 카드 사용)을 제어합니다.
      7. 노빔 또는 로우 빔 강도의 경우 FFM/AM의 위치와 방향을 최적의 범위로 조정하고 입력 미러(자동 코렐레이터에 장착)를 조정하여 레이저 펄스 신호를 최대화합니다. 자동 상관신호는 도 5a에도시된 바와 같이 얻어진다.
      8. FFM/AM에서 Ti:Sa 빔의 OPO 및 프로젝트를 중지하여 자동 상관레이터에 미러를 입력합니다. 3.2.2.6 단계와 3.2.2.7 단계를 반복합니다. 도 5b에도시된 바와 같이 자동 상관신호가 얻어진다.
      9. 빔 거리 조정 나사 마이크로미터를 교차 위치(7.30mm)로 설정합니다.
      10. 두 빔을 모두 놓습니다.
      11. 지연 선을 스캔하여 두 개의 빔 OPO 및 Ti:Sa 중첩을 가져옵니다. 도 6에도시된 바와 같이 교차 상관신호가 얻어진다.
      12. 빔이 M7에 도달하고 현미경의 머리를 스캔 할 수 있도록 거울 FFM / AM을 뒤집습니다.
  3. 현미경 정렬
    1. 백색광 현미경 관찰 수행:
      참고: 현미경 관찰에 앞서 현미경이 제대로 정렬되었는지 확인하십시오.
      1. 직경 3 μm의 폴리스티렌 비드가 분산되는 인산염 완충액으로 구성된 테스트 샘플을 준비합니다. 용액은 두 개의 유리 슬라이드의 샌드위치 안에 배치됩니다.
      2. 백색광의 현미경 및 전원 공급 장치를 켭니다. 백색광 아래에서 관찰할 수 있는 설명서를 따르십시오.
      3. 콘덴서를 사용하여 샘플을 비춥시됩니다. 빛을 수집하기 위해 60배의 목표를 사용합니다. 샘플을 스테이지에 놓습니다. 60x 현미경 대물렌즈의 초점 위치를 최적화합니다.
      4. 관심 있는 FOV를 선택합니다. 샘플의 CCD 이미지를 가져가라(그림 7).
      5. 백색광의 전원 공급 장치를 끕니다.
    2. 펨토초 레이저 빔과 현미경 정렬: OPO 및 Ti:Sa
      1. 이스케이프 버튼을 사용하여 콘덴서를 제거하여 60x 현미경 대물 렌즈를 일시적으로 후퇴시보입니다. 60x 현미경 대물 렌즈를 광학 경로에서 이동하여 노즈피스를 회전시다.
      2. 외부 기계 마운트를 사용하여 검출기를 현미경의 상부에 장착하십시오. 50Ω의 로우 패스 필터를 통해 검출기 출력을 오실로스코프에 연결하고 OPO 신호를 모니터링합니다.
      3. 스캐너 헤드를 제어하는 프로세서를 켭니다. OPO 빔을 현미경의 스캐너 헤드에 투영합니다.
      4. 현미경 내부의 빔 위치를 확인하고 빔의 위치가 중심 또는 중앙 근처에 있는지 확인하십시오.
      5. PD의 머리 내부빔의 위치가 중앙에 있는지 확인합니다.
      6. x-y 변환기를 사용하여 검출기로 측정된 전력을 최대화합니다.
      7. 빔을 OPO에서 Ti:Sa로 전환하고 티타늄 사파이어 레이저의 최대 신호도 얻을 수 있는지 확인합니다. THis는 두 빔이 모두 잘 정렬되어 있음을 나타냅니다.
      8. 빔 정렬을 완료하여 60x 현미경 대물 렌즈를 도입하고 노즈피스를 다시 회전시다.
      9. 현미경의 재초점 버튼을 사용하여 60x 현미경 대물 렌즈에 최종 초점을 되찾으려면 됩니다.
      10. 샘플을 건드리거나 방해하지 않고 응축기 대신 배율 40배로 목표를 배치합니다.
  4. 빔의 공간 및 시간 적 동기화 최적화
    1. 시간 동기화
      1. 현미경 전에 측정된 Ti:Sa 및 OPO의 전력을 두 빔 모두에 대해 30mW로 설정합니다. 펌프와 프로브가 비드의 진동 주파수와 공명이 되지 않도록 OPO의 파장을 이전 값과 다른 값으로 설정합니다.
      2. 두 빔(Ti:Sa 및 OPO)을 모두 방출하여 현미경으로 들어갑니다.
      3. 스캐닝 지연 라인 전산화 번역기를 실행하고 지연 라인의 각 위치에 대해 LIA에 의해 측정된 강도를 기록합니다. 지연 줄 스캔이 완료될 때까지 기다립니다. 얻어진 시간적 프로파일은 그림 8a에서시각화됩니다.
      4. 펌프와 프로브가 구슬의 진동 주파수와 공명이 되도록 OPO의 파장을 다시 1076 nm로 설정합니다. 반복 단계 3.4.1.3 (얻은 시간 프로파일은 도 8b에서시각화된다).
      5. 지연 라인에서 얻어진 중첩 빔 위치를 설정하여 SRS 이미지를 획득합니다.
    2. 빔의 공간 동기화
      참고: 투과 이미지는 현미경 목표의 FOV, 조명 및 초점 위치를 최적화하고 두 빔이 공간적으로 겹치는지 확인하는 데 유용합니다.
      1. OPO의 전송 이미지 획득
        1. Ti:Sa 빔을 중지하고 OPO 전력을 8mW로 줄입니다.
        2. 검출기 판독을 데이터 수집 카드에 연결합니다.
        3. 현미경 스캐닝 콘솔과 함께 데이터 수집 프로그램을 실행합니다.
        4. 파일을 저장하고 데이터를 처리하여 이미지를 가져옵니다. 그림 9a에표시된 대로 원시 이미지가 나타납니다.
      2. Ti:Sa의 전송 이미지 획득
        1. OPO 빔을 중지하고 Ti:Sa 전력을 2.5-4.5mW로 줄입니다.
        2. 데이터 수집 카드로 LIA 및 LIA 판독과 검출기를 연결합니다.
        3. 3.4.2.1.3 단계와 3.4.2.1.4 단계를 반복합니다. 그림 9b에표시된 대로 원시 이미지가 나타납니다.

4. SRS 이미지 획득

참고: 데이터를 저장하기 위해 전용 알고리즘이 구현되었습니다. 512 px x 512 px 및 256 px x 256 px의 수집 시간을 16, 8, 4 s 및 2s의 이미지 형식을 지원합니다.

  1. 40x 대물렌즈와 PD 사이에 필터 스택을 도입하여 펌프 펄스(Ti:Sa)를 제거하고 스토크스 신호(OPO)만 획득합니다.
  2. 펌프 신호를 8mW의 집중 전력으로 810 nm로 설정하고 프로브 신호를 8mW의 집중 전력으로 1076 nm로 설정하여 폴리스티렌의 전형적인 C-H 결합을 조사합니다(3054 cm-1의라만 시프트).
  3. 검출기를 LIA 및 LIA 판독데이터와 데이터 수집 카드에 연결합니다.
  4. 요구 사항에 따라 이미지 수집 픽셀 형식을 설정하고 수집 시간을 설정합니다.
  5. 현미경 컨트롤러를 제어하는 프로그램을 실행합니다.
  6. 현미경 제어기, 검출 시스템 및 DAQ 간의 동기화 역할을 하는 전용 알고리즘 프로그램을 실행합니다(그림 4참조).
  7. 수집이 완료되면 행렬 파일을 저장합니다.
  8. Raw 데이터 파일을 가져오고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 필요한 형식(일반적으로 .tif 형식으로 저장)으로 이미지를 저장합니다. 이미지는 그림 10에나와 있습니다.

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Representative Results

SRS 측정의 예(즉, 샘플의 단일 지점에서의 SRS 측정)는 7에 보고된다. 빔이 시간 또는 공간에서 중첩되지 않으면 얻어진 결과는 도 8a에보고된다. 오프 공진에서 LIA로 측정된 신호의 진폭은 0이고 LIA로 측정된 신호의 위상은 음수값과 양수 값 사이를 이동합니다. 반면, 빔이 공간에서 중첩되면, 적절한 범위에서 지연 선을 이동하면, 얻어진 결과는 도 8b에보고된다. LIA에 의해 측정된 신호는 빔이 시간에 완벽하게 중첩될 때 최대값에 도달하고 위상은 빔이 시간에 중첩되는 동안 고정값을 달성하기 시작합니다.

동일한 폴리스티렌 비드의 단일 빔(Ti:Sa 또는 OPO)을 사용하여 얻어진 흡수 이미지는 도 9a, b에서 6 μm의 스케일 바를 나타낸다. SRS 이미지를 획득하기 위해, 지연 선은 도 7b에서달성된 위치로 설정되고, 전형적인 SRG 이미지는 6 μm의 스케일 바와 함께 도 10에 도시된다.

Figure 1
그림 1: f-SRS 현미경 시스템의 개략적 레이아웃. OPO = 광학 파라메트릭 발진기; Ti:사 = 티타늄-사파이어 레이저; M1-M7 = 펨토초 광대역 미러; FFM / AM = 플립 플롭 미러 / 오토코렐레이터 미러;  DM1, DM2 = 이색 거울; DL = 지연 라인; AC = 자동 상관; EOM = 전기 광학 변조기; FG = 함수 생성기; GM = 갈보 미러; Obj1, Obj2 = 현미경 목표; PD = 포토다이오드; DAQ = 데이터 수집 시스템; PC = 개인용 컴퓨터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
도 2: 고주파 변조 전달 방법의 구성. 인세트 그림에서, 샘플 내부의 상호 작용 및 샘플 내부의 프로브 및 펌프의 상호 작용으로 인해 수정된 프로브 의 상호 작용 전에 두 개의 레이저 빔이 표현됩니다. 시간은 ns로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 기계적 장착 시스템으로 포토다이오드 마운트의 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 데이터 수집 시스템의 회로도. PD = 포토다이오이드, LIA = 잠금 증폭기, DS = 검출 시스템, MC = 현미경 제어, DAQ = 데이터 수집 시스템, PC = 개인용 컴퓨터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: OPO (a) 및 Ti:SA(b)의 자동 상관함수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: OPO 및 Ti:Sa의 상호 상관 함수입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
그림 7: 폴리스티렌 구슬의 CCD 이미지.

Figure 7
그림 8: 잠금 증폭기에 의해 측정된 SRS 신호의 진폭 및 위상: 공진(왼쪽) 및 공진(오른쪽) . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 9
그림 9: OPO (a) 및 Ti:Sa (b)에 의해 달성된 폴리스티렌 구슬의 전송 이미지. 배율 표시줄 = 16 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 10
그림 10: 폴리스티렌 구슬의 SRS 이미지. 배율 막대 = 12 μm.

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Discussion

SRS 현미경 검사법은 세포와 세포 건축에 근본적인 지질과 같은 복잡한 생물학 구조물의 연구 결과에서, 특히 새로운 고도에 라벨 자유로운 화상 진찰을 취했습니다. 지질은 생물학적 막의 생산과 같은 여러 생리학적 경로에 관여하며, 이들은 생합성 전구체 및신호 변환기(10)로서 작용한다. 지질은 또한 지질 방울에게 불린 전문화한 세포내 세포기관으로 포장됩니다 (LDs). 그들의 직경은 마이크로 미터11,12의수십 나노 미터의 수십에서 다양합니다. LDs 뿐만 아니라 지방에 풍부 하 게 참여- 그리고 스테로이드 생산 세포 뿐만 아니라 다른 세포 주에서 존재. LDs는 지질 저장과 같은 몇몇 생리적인 프로세스에서 협력합니다. 그(것)들은 일반적인 병리 (예를 들면, 변경한 콜레스테롤 물질 대사)13,14에서두드러지게 추천됩니다.

전통적으로, 지질의 가시화는 형광 현미경 검사법 및 중성 지질 특이적 염료 표지 된 고정 세포를 사용하여 달성된다10. 지질은 단백질 및 DNA에 비해 크기가 작기 때문에 형광단15,16을첨가할 때 구조적 및 기능적 변화와 원치 않는 아티팩트가 발생할 수 있다는 점에 유의해야 한다. SRS지질이 풍부한 구조를 연구하기 위한 강력한 것으로 나타났습니다. 지질은 C-H2 그룹에서 풍부하다. 따라서, 그들의 라만 스펙트럼에서 2845cm-1에서 C-H 결합 진동 상태와 관련된 상대적으로 단리된 피크는 세포 내부의 지질에 대한 독특한 시그니처를 제공한다. 불행히도, 분화 가능한 진동 시그니처는 유한하기 때문에 유사한 화학 결합을 공유하는 세포 내부의 다른 관련 종과 표적 생체 분자를 구별하는 것은 다소 어렵습니다. 그러나, 작은 라만 활성 진동 프로브(예를 들어, 알킨 및 안정동위원소)를 첨가하여 작은 생체분자(17)의이미징특이성을 얻을 수 있다.

생체 내 생체 및 생체 의학 응용 프로그램의 경우, 주어진 샘플에서 다양한 화학 종의 동시 매핑은 생체 분자쌍 (18,19)사이의 공동 분포 및 동적 상관 관계를 투자하는 데 필요합니다. 따라서, 여러 화학 적 대조를 얻기 위해 많은 노력이 이루어졌다. 다색 이미징의 가장 간단한 옵션에서, 샘플의 다른 라만 모드를 이미지화하기 위해, 펌프 빔 또는 스토크스 빔의 주파수는 순차스캔18로튜닝된다. 그러나, 파장 튜닝 접근법을 사용하면 상이한 라만 모드의 공동 지역화 정보의 손실이 발생할수 있으며, 특히 샘플이 동적 환경(18)에 있을 때.

비선형 여기의 결과로, SRS는 생물학적 샘플20내에서 선택된 화학 적 결합의 본질적인 3D 분해 기능을 제공합니다. 선택한 화학 결합 및 공간 분포의 볼륨 재구성은 z축을 따라 다른 초점 평면에서 SRS 이미지를 수집하여 간단히 달성할 수 있습니다. 이미지는 높은 공간 및 시간적 해상도로 획득되기 때문에 생물학적 샘플에 대한 다른 주요 정보(즉, 3D 구조, 화학 성분 등)를 얻을 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

IMM CNR의 V. Tufano는 귀중한 기술 지원과 니콘 인스트루먼트의 제품 전문가인 Giacomo Cozzi에게 유용한 토론과 지속적인 지원을 해 주셔서 감사합니다. 이 작품은 부분적으로 이탈리아 국립 운영 프로그램 PONa3 00025 (BIOforIU)와 유로 바이오 이미징 대규모 범유럽 연구 인프라 프로젝트에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acquisation tool Nikon Nikon C2Tool Acquisation supported tool
APE Pulse link control software APE- APE Pulse link control software software control
Autocorrelator APE APE PulseCheck USB 50 Autocorrelator
Detector Thorlabs Thorlabs DET10A Photodiode
Detector card Thorlabs Thorlabs VRC IR detector Card
Dichroic mirror Semrock Semrock FF875-Di01-25X36 Dichroic mirror
Dichroic mirror Semrock FF875-Di01-25x36 Dichroic mirror
EOM Conoptics (EOM CONOPTICS 3350-160 KD*P). Pockels cell
Fast detector Thorlabs Thorlabs DET025AL/M Photodiode
Fast mirror scanning unit Nikon C2 Microscpe scanning head
Femtosecond laser Ti:SA Coherent Coherent Chameleon Ultra II Chameleon Ultra II
Function generator TTi TG5011 AIM – TTi Function generator
Inverted optical microscope Nikon Eclipse TE-2000-E, Nikon Eclipse TE-2000-E, Nikon
Lock-in Amplifier Standford Research System SR844-200 MHz dual phase A lock-in amplifier from Stanford Research Systems
Notch filter, Semrock NF03-808E-25 Notch filter
Optical delay line Newport Newport M-ILS200CC Tunable optical delay line
Optical Parametric Oscillator Coherent Coherent Compact OPO Coherent Compact OPO
Oscilloscope WaveRunner 640Zi 4GHz OSC/LeCroy Digital Oscilloscope
PCI Card National instrument NI PCIe 6363 Data acquisation card
Position Sensors Detectors Newport Newport Conex PSD9 Position detector sensor
Power meter head Coherent PowerMax PM10, Laser power detector
Translation Stages Thorlabs Thorlabs PT1/M Meachnical Translation Stage with Standard Micrometer

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References

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